Nectários extraflorais em Luffa cylindrica (L.) M. Roem (Cucurbitaceae): anatomia e respostas morfofisiológicas em função do status nutricional e herbivoria. Poliana Fernandes Souza Lima Belo Horizonte - MG Fevereiro - 2016 Nectários extraflorais em Luffa cylindrica (L.) M. Roem (Cucurbitaceae): anatomia e respostas morfofisiológicas em função do status nutricional e herbivoria. Poliana Fernandes Souza Lima Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Biologia Vegetal do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Biologia Vegetal. Linha de pesquisa: Botânica - Morfologia Vegetal - Anatomia Vegetal Orientação: Prof. Dr. Élder Antônio Sousa e Paiva Belo Horizonte - MG Fevereiro – 2016 iii “Ensine sempre o que você aprendeu (...) Em um estado sombrio nós nos encontramos (...) e um pouco mais de conhecimento ilumina nosso caminho” (Mestre Yoda- Star Wars) iv AGRADECIMENTOS O árduo trajeto que leva à conclusão de uma dissertação de mestrado é uma experiência enriquecedora e cheia de superações. A cada novo obstáculo nos deparamos com barreiras quase intransponíveis, que se tornam muito mais simples na presença de pessoas especiais que, direta ou indiretamente, participam conosco desta jornada. Para aqueles que compartilharam deste momento, segue o meu muito obrigado. Muito obrigado ao povo brasileiro que, por meio dos muitos impostos e lutas, possibilitou que eu estivesse aqui, cursando uma universidade pública, gratuita e de qualidade. Meu muito obrigado ao Professor Orientador Élder Paiva, por sua paciência, carinho e ensinamentos, por acreditar em mim, me mostrar o caminho da ciência, e fazer parte da minha vida acadêmica nos momentos bons e ruins. Mas, principalmente, por ser o exemplo de profissional que sempre irá fazer parte da minha vida. À minha família que soube compreender minha ausência neste período. Em especial quero agradecer à minha mãe que esteve presente desde o momento da coleta até a apresentação dos resultados. Por seu apoio e amor incondicional. Aos Professores Cléber Cunha, Denise Trombert e Luzia Modolo por todo o incentivo, apoio e ideias que trocamos. Aos técnicos do Centro de microscopia pelo auxílio na obtenção das imagens de microscopia eletrônica de transmissão e varredura. Ao Professor Cléber Cunha e ao graduando Agnello Picorelli por todo seu auxílio e paciência no árduo caminho das ciências estatísticas. E principalmente ao Alberto Teixido, por toda sua dedicação e estímulo que acabou impulsionando este trabalho. Aos amigos, que fizeram desse momento um pouco mais leve com sua alegria e com palavras de incentivo e com momentos de reflexão científica (no bar). Ao Cláudio Rosmaninho e Neide Raphael, pelas desventuras gastronômicas que tornaram meus fins de semana um pouco mais divertidos e instrutivos. Ao Pedro Brandão, por saber deixar tudo mais leve, mais divertido. Por compartilhar comigo os momentos dramáticos desse percurso. Por saber ouvir os v intermináveis discursos sobre o projeto, o trabalho, os resultados. Por estar ao meu lado, colaborando e compartilhando todos os momentos. As minhas amigas: Camila, Maria Letícia, Priscilla, Solange e Thayse, por todo apoio no projeto e na vida. Por todos os litros de água deionizada que carregaram comigo, por todas as tabelas, gráficos, textos e lamentações que escutaram. Aos meus irmãos de coração: Bárbara Oliveira, Cintia Almeida, Glauber Romães, Mariana Araújo, Pedro (Jedi) Cornélio, Samantha Mourão, Saulo Romães, e tantos outros. Aos técnicos Wagner Afonso Rocha e Maria do Socorro Silva pelo apoio técnico excepcional. Agradeço ao querido Rodrigo Teixeira Ávila e ao professor Fábio Murilo DaMatta, do Laboratório de Metabolismo e Nutrição Vegetal da Universidade Federal de Viçosa, que auxiliaram nas análises de néctar. Aos colegas de laboratório pelo convívio e apoio. A todos os colegas e professores da pós-graduação em Biologia Vegetal pelo convívio e aprendizado. E, por fim, a todos aqueles que por um lapso não mencionei, mas que colaboraram para esta pesquisa: abraços fraternos a todos! “A gente só conhece bem as coisas que cativou - disse a raposa. - Os homens não têm mais tempo de conhecer coisa alguma. Compram tudo já pronto nas lojas. Mas como não existem lojas de amigos, os homens não têm mais amigos. Se tu queres um amigo, cativa-me!” O Pequeno Príncipe- Antoine de Saint-Exupéry vi SUMÁRIO Página RESUMO............................................................................................................................... 1 ABSTRACT............................................................................................................................. 2 INTRODUÇÃO GERAL............................................................................................................ 3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................................. 6 CAPÍTULO I – Anatomia, histoquímica e ultraestrutura dos nectários extraflorais de Luffa cylindrica (L.) M. Roem (Cucurbitaceae)........................... 9 Resumo............................................................................................................................ 10 Abstract............................................................................................................................ 11 Introdução........................................................................................................................ 12 Materiais e métodos......................................................................................................... 13 Resultados........................................................................................................................ 14 Localização............................................................................................................... 14 Anatomia e Histoquímica......................................................................................... 15 Caracterização ultraestrutural................................................................................. 16 Discussão......................................................................................................................... 23 Localização................................................................................................................ 23 Anatomia, Histoquímica e Caracterização ultraestrutural....................................... 24 Referências Bibliográficas................................................................................................ 26 CAPÍTULO II – As respostas estruturais e metabólicas dos nectários extraflorais de Luffa cylindrica (L.) M. Roem (Cucurbitaceae) variam com o status vii nutricional e herbivoria........................................................................................... 29 Resumo............................................................................................................................ 30 Abstract............................................................................................................................ 31 Introdução........................................................................................................................ 32 Materiais e métodos........................................................................................................ 34 Obtenção das plântulas......................................................................................... 34 Solução nutritiva..................................................................................................... 35 Herbivoria................................................................................................................ 35 Análise química do néctar....................................................................................... 36 Análise estatística.................................................................................................... 37 Resultados....................................................................................................................... 38 Discussão......................................................................................................................... 43 Referências Bibliográficas............................................................................................... 47 1 RESUMO 1 Nectários extraflorais (NEFs) são estruturas secretoras que estão comumente 2 envolvidos na defesa indireta da planta. Em Luffa cylindrica estas estruturas estão 3 presentes nas folhas, caules e nos frutos. Nas folhas os NEFs estão dispostos na face 4 abaxial do limbo e das estípulas, podendo ocorrer também no pecíolo e em folhas 5 modificadas como brácteas e bractéolas. Os nectários encontram-se funcionais e 6 atraem formigas desde os estágios iniciais de expansão dos órgãos aos quais estão 7 associados, sendo que a atividade secretora se estende até a senescência de tal 8 órgão. A diferenciação e o processo secretor dos NEFs podem ser induzidos por 9 herbivoria e/ou danos artificiais e, portanto, podem ser assim considerados como uma 10 resposta de defesa induzida. Neste trabalho foram estudadas a organização estrutural 11 e ultraestrutural dos NEFs; avaliou-se, ainda, os efeitos de diferentes status 12 nutricionais e de herbivoria no número de nectários e concentração de açúcares do 13 néctar. Plantas cultivadas em três diferentes concentrações de nutrientes (10, 50 e 14 100% de nutrientes na solução nutritiva) foram submetidas à herbivoria simulada 15 mantendo-se um grupo controle em cada tratamento. O néctar foi coletado em todos 16 os tratamentos para análise quantitativa dos açúcares. Após a expansão de dez folhas 17 pós herbivoria, área foliar foi mensurada e o número de nectários contabilizado. Houve 18 variação significativa no número de nectários para cada tratamento, principalmente no 19 grupo cultivado a 10% onde as plantas que sofreram herbivoria apresentaram menor 20 densidade de nectários que aquelas do grupo controle. Porém isso se deu em função 21 do aumento da área foliar naquelas que sofreram herbivoria. Os resultados sugerem 22 que Luffa cylindrica, sob déficit nutricional, investe mais na produção de tecido 23 fotossintetizante quando submetida ao ataque de herbívoros. Por outro lado, plantas 24 cultivadas com níveis adequados de nutrientes investem em um néctar com maior 25 quantidade de açúcares. 26 27 Palavras-chave: Luffa cylindrica, nectário extrafloral, néctar, anatomia vegetal, 28 nutrição, herbivoria. 29 2 ABSTRACT 1 Extrafloral nectaries (EFNs) are secretory structures commonly involved in the indirect 2 defence of plants. In Luffa cylindrica, these structures occur in leaves, stems and fruits. 3 In leaves, EFNs are present on the lower surface and the stipules, and can also occur 4 in the petiole and modified leaves such as bracts and bracteoles. EFNs are functional 5 and attract ants from the initial stages of the development of their associated organs 6 and the secretory activity is prolonged until the senescence of such organs. EFNs 7 differentiation and secretor process are generally induced by herbivory and/or artificial 8 damage and, consequently, are considered as a induced defence response. In this 9 work, the structural and ultrastructural organization of EFNs were studied; also, the 10 effects of different nutritional status and herbivory on the occurrence of nectaries 11 number and sugar concentration of nectar were analysed. Plants growing in three 12 different nutrient concentrations (10, 50 and 100% of nutrients in the nutritive solution) 13 were subjected to simulated herbivore, leaving a control group (i.e. without herbivory) 14 per nutrient concentration. Nectar was collected from all treatments to quantitative 15 analyses of sugars. Following the growth of ten leaves post-herbivory, leaf area was 16 measured and the nectary number was counted. There was significant variation in 17 nectary number per treatment, especially in plants growing at 10% with herbivory, 18 which showed less nectary density in relation to control plants. However, this pattern 19 was significantly related to leaf area increase in those plants suffering herbivory. The 20 results suggest that Luffa cylindrical allocates more resources in photosynthetic tissue 21 when subjected to herbivore attack under nutritional deficit. Likewise, plants growing 22 under suitable levels of nutrients invest in nectar containing a greater amount of 23 sugars. 24 25 Keywords: Luffa cylindrica, extrafloral nectary, nectar, plant anatomy, nutrition, 26 herbivory. 27 3 INTRODUÇÃO GERAL 1 As plantas possuem diversas estruturas secretoras atuando das mais diversas 2 formas. Os nectários são estruturas secretoras envolvidas na secreção de néctar e 3 podem ser classificados conforme sua posição, sendo florais aqueles presentes em 4 peças florais, e extraflorais aqueles presentes em órgãos não-reprodutivos (Schmid 5 1988). Há ainda a divisão em nectários nupciais e extranupiciais, aqueles que não 6 estão diretamente ligados à polinização (Delpino 1868-1875 apud Schmid 1988). 7 Nectários extraflorais (NEFs) apresentam grande diversidade estrutural, bem 8 como ampla ocorrência em vários táxons (Heil et al. 2000; Weber 2013) sendo mais 9 abundantes em comunidades tropicais que em temperadas (Oliveira et al. 1999). 10 Muitas vezes os NEFs são utilizados como caracteres distintivos, de grande valor 11 diagnóstico, como em Leguminosae, onde podem ser úteis, por exemplo, na distinção 12 de espécies e variedades do gênero Cassia (Bhattacharyya e Maheshwari 1971). 13 A família Cucurbitaceae possui várias espécies portadoras de nectários 14 extraflorais, entre elas Luffa cylindrica. Os NEFs de L. cylindrica foram estudados 15 inicialmente por Chakravarty (1948) que além de reportar a interação destas estruturas 16 com insetos, descreveu a organização anatômica em microscopia de luz. 17 Enquanto os nectários florais atuam mediando o processo de polinização 18 (Janzen 1966; Oliveira 1997), os NEFs estão comumente voltados para a defesa 19 indireta da planta e podem ser vistos como um tipo de defesa biótica, aquela que 20 representa uma associação de uma espécie com outra que, por sua presença e 21 atividade, irá promover a proteção (Bentley 1977; Del Claro 2012; Weber 2013). 22 Diversas espécies vegetais, distribuídas em pelo menos 109 famílias e 801 23 gêneros, produzem nectários extraflorais (Keeler 2016). Embora estes nectários não 24 estejam diretamente envolvidos na polinização, são visitados por diversos insetos (Heil 25 et al. 2001) e atuam como mediadores de interações simbióticas. Com estes nectários 26 a planta é capaz de atrair predadores como formigas e vespas, ambas defendendo-a 27 contra herbívoros (Heil e McKey 2003; Leitão et al. 2005). Além destes, outros insetos 28 visitam os NEFs, se alimentam do néctar, mas não fornecem proteção à planta, a 29 esses visitantes damos o nome de pilhadores de néctar (Heil et al. 2004). 30 De maneira geral, os nectários (tanto florais quanto extraflorais) consistem de 31 três componentes básicos: i) epiderme, que pode apresentar ou não estômatos ou 32 tricomas, por onde o néctar é liberado; ii) parênquima especializado que produz ou 33 armazena os solutos do néctar; iii) tecidos vasculares, usualmente com maior 34 4 proporção de floema (Fahn 2000; Paccini et al. 2003). Geralmente o néctar possui 1 mais açúcares se comparado ao fluido do floema, porém, quantidades similares de 2 aminoácidos e sais minerais são observadas estando, no entanto, sujeitas a variações 3 bióticas, temporais e espaciais (Baker et al. 1978; Heil et al. 2000). 4 Evidências indicam que o néctar é proveniente do floema, sendo modificado 5 pelo parênquima especializado do nectário (Fahn 1979), porém essa visão é muito 6 simplificada e discutível (Nicolson et al. 2007). Alguns autores sugerem que parte do 7 açúcar pode ter origem nos produtos da fotossíntese do próprio nectário ou, 8 provavelmente, em outros órgãos da planta, em que o amido pode ser um produto 9 intermediário de armazenamento (Nicolson et al. 2007). A hidrólise do amido 10 armazenado torna possível a alta produção de néctar em qualquer momento do dia 11 (Pacini et al. 2003), sendo bastante comum nos nectários florais. 12 A secreção dos NEFs é induzida por herbivoria e/ou danos artificiais e, 13 portanto, pode ser considerada uma resposta de defesa induzida. Essa resposta pode 14 se dar em nível anatômico, com a planta produzindo maior número de nectários, ou 15 em nível fisiológico, com a secreção de maior quantidade de néctar ou ainda de um 16 néctar de melhor qualidade (Heil et al. 2000). Algumas plantas são capazes de alterar 17 o volume e/ou composição do néctar, aumentando assim as chances de atrair 18 parceiros para uma relação mutualística (Stephenson 1982). O surgimento de novos 19 NEFs também é potencialmente induzido em resposta à herbivoria. A produção 20 adicional de NEFs pode resultar em maior quantidade de néctar disponível, o que 21 auxilia a planta no recrutamento de novos parceiros mutualísticos quando na presença 22 de herbívoros. Indução de NEFs em resposta de dano por herbivoria (simulada ou 23 natural) apenas é documentada em um número limitado de espécies (Pulice e Packer 24 2008), mas a cada dia, mais trabalhos tem surgido apontado novas espécies em que 25 essa relação ocorre. 26 A plasticidade fenotípica permite que as plantas produzam mais recompensas, 27 de modo que os benefícios sejam maximizados e os custos da produção minimizados 28 (Moran et al. 1992). Esta mesma plasticidade é, muitas vezes, dano-e-recurso 29 dependente (Mondor et al. 2006). Ou seja, quanto mais danos a planta sofrer, mais ela 30 investirá em proteção. O mesmo pode ser dito dos recursos, pois quanto mais 31 recursos, maior o investimento. 32 As formigas muitas vezes aumentam a sobrevivência da planta ao aumentar 33 seu fitnes por minimizar os danos causados por herbívoros (Heil et al. 2001). Alguns 34 autores acreditam que o dano inicial causado pelo herbívoro ativa uma via de 35 5 sinalização de octadecanoides que controlaria o fluxo dos nectários (Heil et al. 2001) 1 ou ainda, leva à secreção de compostos voláteis que atraem os predadores daquele 2 herbívoro sendo ainda são capazes de desencadear a mesma resposta em plantas 3 vizinhas, que não estavam sob ataque (Dicke et al. 1990). 4 Tanto o dano causado pelo herbívoro, quanto a herbivoria simulada causariam 5 o mesmo efeito (Heil et al. 2001), o incremento da produção de néctar. Isso indica que 6 não há uma molécula elicitora específica que desencadeie esta reposta, embora ainda 7 não se possa afirmar categoricamente que não haja uma via secundária que explique 8 esse processo (Heil et al. 2001). Apesar de a aplicação de ácido jasmônico exógeno 9 desencadear resposta semelhante, a produção de néctar é menor quando comparado 10 ao resultado obtido com a simulação de herbivoria (Heil et al. 2001). As respostas 11 químicas induzidas pela herbivoria são amplamente documentadas, porem menos 12 atenção é dada às respostas morfológicas induzidas, particularmente aquelas que 13 medeiam proteções mutualísticas (Pulice e Packer 2008). 14 Para a planta, investir em estruturas atrativas de defensores, como NEFs, tem 15 certo custo em termos energéticos. Toda essa energia e recurso poderiam ser 16 investidos em crescimento e reprodução. Visto isso, é esperado que a planta dispenda 17 mais energia nesse processo quando está em condições de estresse biótico e em um 18 ambiente que lhe forneça nutrientes suficientes (Kersch e Fonseca 2005). 19 Apesar dos estudos sobre a ecologia e anatomia dos nectários extraflorais de 20 Luffa cylindrica, inexistem dados acerca do processo de secreção de néctar nestes 21 nectários, bem como da organização ultraestrutural e das relações entre 22 características do protoplasto e síntese do néctar. Do mesmo modo, inexistem dados 23 acerca das respostas estruturais e metabólicas destes nectários sob o efeito de 24 diferentes concentrações nutricionais e herbivoria. Assim, este trabalho tem por 25 objetivos: 26 1) A caracterização anatômica estrutural, ultraestrutural e histoquímica 27 destes nectários; 28 29 2) Avaliar as respostas estruturais e metabólicas dos nectários 30 extraflorais de Luffa cylindrica em diferentes concentrações 31 nutricionais e sob efeito de herbivoria. 32 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1 Baker HG, Opler P, Baker I. 1978. A comparison of the amino acid complements of 2 floral and extrafloral nectaries. Botanical Gazette 139:322–332. 3 Bentley BL. 1977. Extrafloral nectaries and protection by pugnacious bodyguards. 4 Annual Review of Ecology and Systematics 8:407–427. 5 Bhattacharyya B, Maheshwari JK. 1971. Studies on extrafloral nectaries of the 6 Leguminales I. Papilionaceae, with a discussion on the systematics of the 7 Leguminales. Proceedings of the Indian National Science Academy 37:11–30. 8 Chakravarty HL. 1948. Extrafloral glands of Cucurbitaceae. Nature 162:576–577. 9 Del Claro C, Torezan-Silingardi HM. 2012. Ecologia das interações plantas-animais: 10 uma abordagem ecológico-evolutiva. 1ª ed. Rio de Janeiro, Technical Books. 11 Delpino F. 1886. Funzione mirmecofila nel regno vegetale. In: Memoire della R. 12 Accademia delle Scienze dell’Istituto di Bologna 7:215–392. 13 Dicke M, Sabelis MW, Takabayashi J, Bruin J, Posthumus MA. 1990. Plant 14 strategies of manipulating predator-prey interactions through allelochemicals: 15 prospects for application in pest control. Journal of Chemical Ecology 16:3091–16 3118. 17 Fahn A. 1979. Secretory tissues in plants. New York: Academic Press. 18 Fahn A. 2000. Structure and function of secretory cells. Advances in Botanical 19 Research 31:37–75. 20 Heil M, Fiala B, Baumann B, Linsenmair KE. 2000. Temporal, spatial and biotic 21 variations in extrafloral nectaries secretion by Macaranga tanarius. Functional 22 Ecology 14:749–757. 23 Heil M, Koch T, Hilpert A, Fiala B, Boland W, Linsenmair KE. 2001. Extrafloral 24 nectar production of the ant-associated plant, Macaranga tanarius, is an induced, 25 indirect, defensive response elicited by jasmonic acid. Ecology 38:1083–1088. 26 Heil M, McKey D. 2003. Protective ant-plant interactions as model systems in 27 ecological evolutionary research. Annual Review of Ecology and Systematics 28 34:425–453. 29 7 Heil M; Feil D; Hilpert A; Linsenmair KE. 2004. Spatiotemporal patterns in indirect 1 defence of a South-East Asian ant-plant support the optimal defence hypothesis. 2 Journal of Tropical Ecology 20:573–580. 3 Janzen DH. 1966. Coevolution of mutualism between ants and acacias in Central 4 America. Evolution 20:249–275. 5 Keeler KH. 2016. World list of plants with extrafloral nectaries. 6 http://bioscilabs.unl.edu/Emeriti/keeler/extrafloral/worldlistfamilies.htm. Acesso em 7 janeiro de 2016. 8 Kersch MF, Fonseca CR. 2005. Abiotic factors and the conditional outcome of an ant-9 plant mutualism. Ecology, 86:2117–2126. 10 Leitão CA, Meira RMSA, Azevedo AA, Araujo JM de, Silva KLF, Collevatti RG. 11 2005. Anatomy of the floral, bract, and foliar nectaries of Triumfetta semitriloba 12 (Tiliaceae). Canadian Journal of Botany 83:279–286. 13 Mondor EB, Tremblay MN, Messing RH. 2006. Extrafloral nectary phenotypic 14 plasticity is damage- and resource dependent in Vicia faba. Biology Letters 2:583–15 585. 16 Moran NA. 1992. The evolutionary maintenance of alternative phenotypes. American 17 Naturalist 139: 971–989. 18 Nicolson SW, Nepi M, Pacini E. 2007. Nectaries and nectar. Springer-Verlag, The 19 Netherlands. 20 Oliveira PS. 1997. The ecological function of the extrafloral nectaries: herbivore 21 deterrence by visiting ants and reproductive output in Caryocar brasiliense 22 (Caryocaraceae). Functional Ecology 11:323–330. 23 Oliveira PS, Rico-Gray V, Díaz Castelazo C, Castillo-Guevara C. 1999. Interactions 24 between ants, extrafloral nectaries and insects herbivores in neotropical coastal 25 sand dunes: herbivore deterrence by visiting ants increases fruit set in Opuntia 26 stricta (Cactaceae). Functional Ecology 13:623–631. 27 Pacini E, Nepi M, Vesprini JL. 2003 Nectar biodiversity: a short review. Plant 28 Systematics and Evolution 238:7–22. 29 Pulice CE, Packer AA. 2008. Simulated herbivory induces extrafloral nectary 30 production in Prunus avium. Functional Ecology 22:801-807. 31 8 Schmid R. 1988. Reprodutive versus extra-reprodutive nectaries – historical 1 perspective and terminological recommendations. Botanical Review 54:179–232 2 Stephenson AG. 1982. The role of the extrafloral nectaries of Catalpa speciosa in 3 limiting herbivory and increasing fruit production. Ecology 63:663–669. 4 Weber MG, Keeler KH. 2013. The phylogenetic distribution of extrafloral nectaries in 5 plants. Annals of Botany 111:1251–1261. 6 9 Capítulo 1 Anatomia, histoquímica e ultraestrutura dos nectários extraflorais de Luffa cylindrica (L.) M. Roem (Cucurbitaceae) 10 RESUMO 1 A bucha vegetal, Luffa cylindrica, apresenta nectários extraflorais (NEFs) na face 2 abaxial do limbo foliar, nas estípulas, nos frutos, etc. Neste trabalho foram estudadas a 3 estrutura e ultraestrutura dos NEFs presentes no limbo foliar. Amostras foliares foram 4 coletadas em indivíduos cultivados em hidroponia com nutrição completa, fixadas, 5 processadas para estudos em microscopia de luz e microscopia eletrônica de 6 transmissão e varredura segundo técnicas convencionais. Testes histoquímicos foram 7 realizados para a caracterização dos tecidos e conteúdos celulares. Os nectários, que 8 se apresentam na porção abaxial da lâmina foliar, estão embebidos no mesofilo. A 9 atividade secretora não se limita a uma fase do desenvolvimento da folha, sendo o 10 néctar liberado por toda a vida útil do órgão, cessando apenas na fase senescente, 11 quando os NEFs tornam-se não funcionais. Estes NEFs são compostos por um tecido 12 secretor, camada limítrofe e tecido subglandular. O tecido secretor é envolvido pela 13 camada limítrofe e apenas o tecido subglandular tem contato com os feixes 14 vasculares. No tecido secretor as células são pequenas, apresentam citoplasma 15 denso, núcleo volumoso, inúmeras mitocôndrias, plastídios, gotas de óleo dispersas 16 no citosol, dictiossomos e segmentos de retículo endoplasmático liso. A camada 17 limítrofe apresenta células justapostas, vacuoladas e citoplasma pouco denso. 18 Observa-se nesta camada a presença de diversos grânulos elétron-densos 19 interpretados aqui como precursores da síntese de lignina. O tecido subglandular 20 apresenta células maiores quando comparado aos demais tecidos, citoplasma pouco 21 denso, cloroplastos e mitocôndrias. O néctar é liberado para o meio externo através de 22 rupturas cuticulares e não apresenta quantidade significativa de lipídios em sua 23 composição. 24 Palavras-chave: Nectários extraflorais, Luffa cylindrica, anatomia, ultraestrutura 25 11 ABSTRACT 1 The sponge gourd, Luffa cylindrica, has extrafloral nectaries (EFNs) in the abaxial side 2 of the leaf blade, the stipules, the fruits, etc. In the present work, the structure and 3 ultrastructure of the EFNs located in the leaf blade was studied. Leaf samples were 4 collected from specimens cultivated in a hydroponic system with complete nutrition, 5 fixated, processed for studies in light microscopy, scanning and transmission electron 6 microscopy. Histochemical tests were performed to characterize the plant tissues and 7 cellular content. The nectaries, that were located in the abaxial side of the leaf blade, 8 are embedded in the mesophyll. The secretory activity does not limit itself to one 9 specific stage of the leaf development, with the nectar secreted throughout the entire 10 lifespan of the organ, stopping only in the senescent stage, when the EFNs become 11 non-functional. These EFNs are composed of a secretory tissue, a boundary layer and 12 a sub glandular tissue. The secretory tissue is surrounded by the boundary layer and 13 only the sub glandular tissue is in contact with the vascular bundle. In the secretory 14 tissue the cells are small, with a dense cytoplasm, bulky nucleus, several mitochondria, 15 plastids, oil drops dispersed in the cytosol, dictyosomes and sections of smooth 16 endoplasmic reticulum. The boundary layer has juxtaposing cells, with vacuoles and a 17 not very dense cytoplasm. Several electron-dense granules can be noted in this layer, 18 interpreted here as precursors of lignin biosynthesis. The sub glandular tissue displays 19 bigger cells when compared to the other tissues, not very dense cytoplasm, 20 chloroplasts and mitochondria. The nectar is externally secreted through cuticular 21 ruptures and does not contain significant amount of lipids in its composition. 22 Key words: Extrafloral nectaries, Luffa cylindrica, anatomy, ultrastructure 23 12 INTRODUÇÃO 1 Nectários são estruturas secretoras envolvidas na secreção de néctar que 2 podem ser classificados conforme sua posição, sendo florais aqueles presentes em 3 peças florais, e extraflorais aqueles presentes em órgãos não reprodutivos (Schmid 4 1988). Os nectários florais estão diretamente associados ao processo de polinização e 5 são responsáveis pela síntese do néctar ofertado aos polinizadores (Fahn 1979). Já os 6 nectários extraflorais (NEFs) são glândulas que secretam néctar, não estando 7 diretamente ligados à polinização. Estes nectários apresentam grande diversidade 8 estrutural, bem como ampla ocorrência em vários táxons (Heil et al. 2000; Weber 9 2013) sendo mais abundantes em comunidades tropicais que em temperadas (Oliveira 10 et al. 1999). Muitas vezes os NEFs são utilizados como caracteres distintivos, de 11 grande valor diagnóstico, como em Leguminosae, onde podem ser úteis, por exemplo, 12 na distinção de espécies e variedades do gênero Cassia (Bhattacharyya e Maheshwari 13 1971). 14 Diversas espécies vegetais, distribuídas em pelo menos 109 famílias e 801 15 gêneros, produzem nectários extraflorais (Keeler 2016) que, embora não estejam 16 diretamente envolvidos com a polinização, são visitados por diversos insetos (Heil et 17 al. 2001) e atuam como mediadores de interações simbióticas. Através destes 18 nectários, a planta é capaz de atrair predadores como formigas e vespas, ambas 19 defendendo-a contra herbívoros (Heil e McKey 2003; Leitão et al. 2005). Além destes, 20 outros insetos visitam os NEFs, se alimentam do néctar, mas não fornecem proteção à 21 planta, a esses visitantes damos o nome de pilhadores de néctar (Heil et al. 2004). 22 O néctar é o principal recurso ofertado pelas plantas como recompensa para a 23 polinização, sendo um recurso energético importante para diversos animais (Nicolson 24 et al. 2007). Evidências indicam que o néctar é proveniente do floema, sendo 25 modificado pelo parênquima especializado do nectário (Fahn 1979), porém essa visão 26 é muito simplificada e discutível (Nicolson et al. 2007). Alguns estudos propõem que o 27 açúcar pode ter origem nos produtos da fotossíntese do próprio nectário ou, 28 provavelmente, em outros órgãos da planta, em que o amido pode ser um produto 29 intermediário de armazenamento (Nicolson et al. 2007). A hidrólise do amido 30 armazenado torna possível a alta produção de néctar a qualquer momento do dia 31 (Pacini et al. 2003), sendo bastante comum nos nectários florais. 32 A família Cucurbitaceae é especialmente rica em espécies portadoras de 33 nectários extraflorais, entre elas Luffa cylindrica (Chakravarty 1948) que os apresenta 34 em forma de disco e localizados na lâmina foliar, estípulas, brácteas, bractéolas e 35 frutos (Agarwal e Rastogi 2010). Estes NEFs foram estudados inicialmente por 36 13 Chakravarty (1948) que, além de reportar a interação destas estruturas com insetos, 1 descreveu sua organização anatômica em microscopia de luz. Esta espécie é visitada 2 por insetos pertencentes a cinco diferentes ordens: Hemíptera, Díptera, Coleóptera, 3 Himenóptera e Lepidóptera, sendo as formigas o grupo mais expressivo (Agarwal e 4 Rastogi 2010). 5 Apesar dos estudos sobre a ecologia e anatomia dos nectários extraflorais de 6 Luffa cylindrica, inexistem dados acerca do processo de secreção de néctar nestes 7 nectários, bem como da organização ultraestrutural e das relações entre 8 características do protoplasto e síntese do néctar. O objetivo do presente trabalho 9 consiste em descrever os aspectos anatômicos, histoquímicos e ultraestruturais dos 10 NEFs encontrados na lâmina foliar de Luffa cylindrica. 11 MATERIAIS E MÉTODOS 12 Para os estudos anatômicos e ultraestruturais amostras foram obtidas de 13 indivíduos cultivados em hidroponia em casa de vegetação no campus da 14 Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) no período de dezembro de 2014 a 15 março de 2015. 16 Para microscopia de luz, fragmentos foliares contendo nectários extraflorais 17 foram coletados em folhas jovens totalmente expandidas, as amostras foram fixadas 18 em solução Karnovsky (Karnovsky 1965) por 24 horas, posteriormente desidratadas 19 em série etílica e incluídas em resina (2-hidroxi-etil)-metacrilato Leica®, conforme 20 indicações do fabricante. Cortes transversais e longitudinais, com 6 μm de espessura, 21 foram obtidos em micrótomo rotativo (Zeiss Hyrax M40) e corados com Azul de 22 Toluidina (0,05%, pH 6,8) (O’Brien et al. 1964). As lâminas histológicas foram então 23 montadas em resina sintética Entellan®. A observação foi feita em microscópio de luz 24 com câmera acoplada (Leica ICC50 HD), obtendo-se imagens digitais (software Leica 25 Aplication Suite LAS EZ). 26 Para microscopia eletrônica de transmissão as amostras foram fixadas em 27 solução Karnovsky (Karnovsky 1965) por 24 horas e pós-fixadas com tetróxido de 28 ósmio (1%, tampão fosfato 0.1 M, pH 7.2). Após serem fixadas, as amostras foram 29 lavadas em tampão e desidratadas em série cetônica. Posteriormente foi feita a 30 inclusão em resina Spurr®, segundo protocolo modificado de Roland (1978). Secções 31 semifinas foram obtidas em ultramicrótomo, montadas em lâminas para microscopia e 32 coradas com azul de toluidina (0,05%, pH 4,7) (O’Brien et al. 1964). Cortes ultrafinos 33 14 foram contrastados com acetato de uranila e citrato de chumbo e posteriormente 1 examinados em microscópio de transmissão Tecnai G2-12 - SpiritBiotwin FEI a 80kV. 2 Para observação ao microscópio eletrônico de varredura as amostras foram 3 fixadas em solução Karnovsky (Karnovsky 1965) por 24 horas, desidratadas em série 4 etílica, submetidas à secagem ao ponto crítico utilizando CO2 e metalizadas com ouro 5 (Robards 1978). As amostras foram examinadas ao microscópio eletrônico de 6 varredura modelo FEI Quanta 200. 7 Para a análise histoquímica os seguintes testes, com respectivos controles, 8 foram empregados: sudan red para lipídios (Pearse 1980), lugol para amido (Johansen 9 1940), azul de bromofenol para proteínas (Mazia et al. 1953), cloreto férrico para 10 compostos fenólicos, floroglucinol ácido para lignina (Johansen 1940) e NADI para 11 óleos essenciais e terpenos (David e Carde 1964). 12 Para detectar a presença de lipídios no néctar utilizou-se tiras de papel filtro 13 embebidas em néctar e posteriormente expostas ao vapor de tetróxido de ósmio por 14 60 segundos. Como grupo controle utilizou-se tiras de papel embebidas em óleo, 15 submetidas ao mesmo processo. Para detecção de quantidade significativa de 16 açúcares no exsudato, e assim comprovar se tratar mesmo de um nectário, a análise 17 química da secreção foi feita utilizando-se o método enzimático (Praxedes 2006). 18 RESULTADOS 19 Localização e atividade secretora 20 Os nectários extraflorais de Luffa cylindrica se encontram principalmente na 21 lâmina foliar (Fig. 1A), distribuídos aleatoriamente. Estas estruturas ocorrem, ainda, 22 nas estípulas e caule. O polo secretor, por onde o néctar é liberado, está voltado para 23 a face abaxial da folha (Fig. 1B), entretanto os nectários podem ser reconhecidos 24 também pela face adaxial, como pontos de coloração distinta (Fig. 1C). 25 Observou-se que a secreção de néctar ocorre nos estágios iniciais de 26 desenvolvimento da folha, ao longo dos processos de diferenciação e expansão, 27 perdurando por toda a fase funcional, até que os primeiros sinais de senescência 28 sejam observados. A secreção de néctar é abundante, quando na ausência de 29 formigas e em ambiente protegido. As gotas de néctar apresentam, em apenas 12 30 horas de acúmulo, volume superior ao ocupado pelo tecido secretor do nectário. A 31 secreção é contínua e, em condições de campo e na presença de insetos 32 forrageadores, o volume de néctar sobre o polo secretor é suficiente apenas para 33 15 deixar úmida a superfície do nectário. Formigas são os forrageadores mais comuns 1 (Fig.1D-E). 2 O néctar produzido acumula-se no espaço subcuticular, distendendo a cutícula 3 até o limite estabelecido pela camada limítrofe, criando ampla bolsa subcuticular (Fig. 4 2A-B). No polo secretor a epiderme é desprovida de estômatos e a cutícula mostrou-5 se íntegra e destituída de poros ou canais (Fig. 2B). Entretanto, dada a distensão 6 cuticular, foram observadas rupturas cuticulares (Fig. 2C) por meio das quais o néctar 7 extravasa, atingindo a superfície do nectário. Após a liberação do néctar a cutícula 8 acomoda-se novamente sobre as células secretoras; as rupturas raramente são 9 observadas neste estágio (Fig. 2D). 10 Anatomia e Histoquímica 11 Os NEFs presentes na lâmina foliar de Luffa cylindrica estão embebidos no 12 mesofilo, com o tecido secretor formando leve protuberância voltada para a porção 13 abaxial da folha (Fig. 3A). Estes NEFs consistem de uma região subglandular na qual 14 se observam tecidos vasculares (Fig. 3A-B), uma camada limítrofe e uma epiderme 15 pluriestratificada formando o tecido secretor, cuja camada externa é cuticulada. 16 O tecido subglandular apresenta células com citoplasma denso, núcleo 17 volumoso e amplos espaços intercelulares. Este tecido estabelece ainda o contato do 18 nectário com os feixes vasculares. 19 A camada limítrofe é unisseriada e formada por células justapostas, cujas 20 paredes celulares mostram-se ligeiramente espessadas e lignificadas (Fig. 3C-D); 21 nestas células a lignificação é mais evidente nas faces anticlinais. Testes 22 histoquímicos evidenciaram a presença de compostos fenólicos nas paredes celulares. 23 A camada limítrofe estabelece limite preciso entre o tecido secretor e o tecido 24 subglandular. Observou-se, ainda, que as células desta camada apresentam 25 incremento do vacuoma ao longo do desenvolvimento do nectário, mostrando 26 vacuoma desenvolvido quando completamente diferenciadas (Fig. 3C-D). 27 As células do tecido secretor apresentam núcleos volumosos e citoplasma 28 denso (Fig. 3B). De modo geral, este tecido é composto por aproximadamente cinco 29 camadas de células que, embora apresentem formas variadas, tendem a ser 30 predominantemente globosas. Foram observadas gotículas de natureza lipídica 31 dispersas no citoplasma. 32 16 No polo secretor as células epidérmicas que limitam a face externa do nectário 1 são justapostas e não diferem das camadas subjacentes, entretanto apresentam 2 cutícula íntegra e delgada (Fig. 3B). A integridade e caráter elástico da cutícula 3 tornam-se evidente quando do acúmulo de néctar no espaço subcuticular, ocasião na 4 qual a cutícula mostra-se distendida permitindo a formação de ampla bolsa 5 subcuticular (Fig. 3A-B). 6 Tabela 1: Caracterização histoquímica dos nectários extraflorais de Luffa cylindrica 7 Caracterização histoquímica Tecido Classe química Teste Mesofilo Subglandular Camada limítrofe Secretor Lipídeos totais Sudan Red ++ ++ + + Amido Lugol ++ + - - Proteínas Azul de Bromofenol ++ ++ + + Compostos fenólicos Cloreto férrico - - + + Lignina Floroglucina ácida - - ++ - Terpenos NADI - + - + (++) presença, positivo intenso, (+) presença em menor concentração, positivo com coloração 8 fraca, (-) ausência. 9 Caracterização ultraestrutural 10 O tecido subglandular apresenta células com citoplasma pouco denso e 11 amplos espaços intercelulares. Nestas células, as organelas predominantes são 12 mitocôndrias e plastídios, sendo nestes frequente a presença de grãos de amido, 13 geralmente solitários (Fig. 4A). No mesofilo, as células do parênquima clorofiliano 14 próximas aos NEFs apresentam cloroplastos com grãos de amido volumosos, 15 mitocôndrias e vacuoma desenvolvido (Fig. 4B). 16 A camada limítrofe apresenta células com vacuoma desenvolvido, paredes 17 celulares espessas e citoplasma pouco denso, o que a torna distinta dos tecidos 18 adjacentes. Há o acúmulo de grânulos elétron-densos nas paredes periclinais das 19 células desta camada (Fig. 4C). Estes mesmos grânulos são também observados 20 livres no citosol e dentro de vacúolos e plastídios (Fig. 4 F-H). Campos de pontoação 21 primários, nos quais plasmodesmos estabelecem contato, são frequentes tanto entre 22 células secretoras (Fig. 4D) quanto entre estas células e àquelas da camada limítrofe 23 (Fig. 4E). 24 17 O tecido secretor, uma epiderme secretora típica, apresenta células pequenas, 1 em sua maioria globosas, com citoplasma denso e paredes celulares delgadas. Neste 2 tecido é possível observar a presença de inúmeras mitocôndrias, plastídios, retículo 3 endoplasmático rugoso e dictiossomos (Fig. 5A-C). Gotículas de óleo foram 4 observadas na matriz citoplasmática da maioria das células do tecido secretor (Fig. 5), 5 por vezes ocupando área expressiva e sem clara associação com organelas tais como 6 retículo endoplasmático ou plastídios. Observou-se, a presença de etioplastos com 7 corpos prolamelares característicos (Fig. 5C), inúmeras vesículas dispersas no 8 citoplasma, e acúmulo gradual de substâncias no espaço periplasmático (Fig. 5 D-G) 9 em alguns casos comprimindo o protoplasto para um volume menor que metade do 10 espaço anteriormente ocupado (Fig. 5G). Foram observados ainda diversos grânulos 11 eletron-densos tanto no interior de plastídios quanto no espaço periplasmático. 12 18 Figura 1: Localização dos nectários extraflorais de Luffa cylindrica. (A) Visão geral da face abaxial da 1 lâmina foliar evidenciando os nectários extraflorais, note que estas estruturas podem ser vistas a olho 2 nu como pontos de coloração mais escura. (B) Detalhe da face abaxial evidenciando acúmulo de néctar 3 sobre o nectário (setas). (C) Visão geral da face adaxial, note que os nectários podem ser vistos mesmo 4 desta face (setas). (D) Formigas (setas) visitando nectário extrafloral presente na estípula. Em destaque, 5 gotícula de néctar sobre estípula. (E) Visão abaxial da folha, observe formiga (seta) visitando nectário 6 extrafloral. 7 19 Figura 2: Caracterização micromorfológica dos nectários extraflorais de Luffa cylindrica. (A) Face adaxial 1 da lâmina foliar evidenciando dois nectários extraflorais (nef) e diversos tricomas; o tracejado evidencia 2 os limites do nectário. (B) Detalhe do nectário extrafloral, observe distensão da cutícula sobre o polo 3 secretor para formação da bolsa subcuticular, note a delimitação formada pela camada limítrofe (cl) em 4 torno do tecido secretor (ts). (C) Detalhe da cutícula distendida sobre o polo secretor. Em detalhe a 5 ruptura cuticular. (D) Detalhe da cutícula acomodando-se novamente sobre o tecido secretor após 6 liberação do néctar. 7 20 Figura 3: Caracterização anatômica de nectários extraflorais em Luffa cylindrica (L.) M. Roem 1 (Cucurbitaceae). (A) Secção transversal de NEF localizado no limbo foliar, notar vascularização (fv) e 2 amplo espaço subcuticular (es), tecido secretor (ts), camada limítrofe (cl), tecido subglandular e feixe 3 vascular. (B) Nectário em secção transversal, notar cutícula espessa na região do polo secretor a camada 4 limítrofe em torno do tecido secretor. (C) Corte paradérmico mediano do nectário, observe a localização 5 da camada limítrofe, delimitando o tecido secretor. (D) Detalhe do corte paradérmico, observe a 6 camada limítrofe e o espessamento das paredes de suas células (setas). 7 21 Figura 4: Caracterização ultraestrutural dos nectários extraflorais de Luffa cylindrica. (A) Detalhe de 1 células do tecido subglandular, notar plastídios com grãos de amido isolados (setas). (B) Detalhe de 2 células do mesofilo, observe cloroplastos com grãos de amido (seta). (C) Visão geral dos tecidos: 3 subglandular à esquerda, camada limítrofe ao centro e tecido secretor à direita. Note grade densidade 4 citoplasmática do tecido secretor. Observe acúmulo de grânulos eletron-densos no espaço 5 periplasmático das células da camada limítrofe. Note ainda como as células do tecido subglandular são 6 maiores que aquelas da camada limítrofe e tecido secretor. (D) Detalhe de plasmodesmos (setas) em 7 secção transversal na face periclinal da camada limítrofe estabelecendo contato com células do tecido 8 secretor. (E) Secção mostrando parede celular na face de contato entre camada limítrofe e tecido 9 secretor, em vista frontal. Observe plasmodesmos que estabelecem contato entre células da camada 10 limítrofe e tecido secretor. (F) Detalhe de células da camada limítrofe evidenciando a síntese de 11 grânulos eletron-densos (*). Observe que estes grânulos se encontram dentro de plastídios (pl), livres no 12 citoplasma e no espaço periplasmático. Mitocôndria (mi). (G) Detalhe da camada limítrofe. Observe que 13 as vesículas contendo os grânulos se fundem à membrana celular liberando seu conteúdo. Observe 14 ainda o acúmulo de grânulos na parede. 15 22 Figura 5: Caracterização ultraestrutural do tecido secretor de nectários extraflorais de Luffa cylindrica. 1 (A) Visão geral do tecido secretor. Observe densidade citoplasmática e espaços intercelulares. Vacúolo 2 (va), plastídio (pa), mitocôndria (mi), núcleo (nu), gotículas de óleo (ol). (B) Detalhe evidenciando gota 3 de óleo no citoplasma. (C) Observe a presença de dictiossomos e plastídios com corpos prolamelares 4 característicos. Observe amplo vacúolo (va), retículo endoplasmático (er). (D-G) Visão geral do tecido 5 secretor. Observe gradual acúmulo de secreção no espaço periplasmático e compressão do protoplasto. 6 Observe grânulos elétron-densos ora no interior de plastídios (seta simples), ora no espaço 7 periplasmático (setas duplas) e gotas de óleo dispersas no citosol. 8 23 DISCUSSÃO 1 Localização e atividade secretora 2 A distribuição dos NEFs de L. cylindrica por toda a lâmina foliar, de modo 3 aleatório, resulta em um patrulhamento mais abrangente por parte das formigas em 4 busca de néctar, contribuindo para uma proteção mais eficaz. Padrão semelhante foi 5 encontrado por Agarwal e Rastogi (2010) que apontam ainda a correlação linear 6 positiva encontrada entre o número de nectários extraflorais e o tempo de 7 permanência das formigas no órgão. Esta é, portanto, uma importante estratégia de 8 defesa indireta. 9 A presença do polo secretor destes nectários na face abaxial, em detrimento 10 da face adaxial, assim como o observado em Hymenaea stigonocarpa (Paiva e 11 Machado 2006), pode ser interpretada como uma maneira eficaz de diminuir as perdas 12 de néctar por evaporação. Em Luffa cylindrica estes nectários foram encontrados não 13 apenas no limbo, mas também distribuídos em outras partes da folha como em 14 estípulas, e em folhas modificadas como brácteas e bractéolas. O mesmo foi 15 observado por Agarwal e Rastogi (2010) que apontam, ainda, a presença de nectários 16 frutos. 17 A fase secretora dos NEFs de Luffa cylindrica se inicia nos estágios iniciais de 18 desenvolvimento da folha, ao longo dos processos de diferenciação e expansão. O 19 fato destes nectários serem ativos logo no início da expansão foliar é benéfico para a 20 planta, pois tecidos jovens necessitam de grande proteção uma vez que defesas 21 químicas e físicas ainda não estão consolidadas. 22 A longa duração do período funcional que observamos ocorrer nos NEFs de L. 23 cylindrica difere do padrão que parece predominar na maioria das espécies portadoras 24 destas estruturas. Nectários extraflorais usualmente são ativos durante os estágios 25 iniciais de desenvolvimento dos órgãos aos quais estão associados, cessando a 26 secreção de néctar após completa diferenciação destes órgãos (Elias 1972), quando 27 defesas estruturais e químicas estão bem estabelecidas. O padrão encontrado nos 28 NEFs de L. cylindrica supostamente reflete a coevolução entre a espécie e os insetos 29 defensores que a patrulham, pois, mesmo portando defesas estruturais bem 30 estabelecias, a defesa biótica foi poupada, mantendo esse traço por toda a vida útil do 31 órgão ao qual o NEF está associado. O final do período de secreção observado em L. 32 cylindrica é semelhante ao que foi relatado em Pithecellobium macradenium, onde os 33 24 nectários cessam a atividade secretora apenas com o fim da vida útil do órgão em que 1 estão presentes (Elias 1972). 2 3 Anatomia, Histoquímica e Caracterização ultraestrutural 4 Os NEFs de Luffa cylindrica são complexos e formados por diferentes tipos 5 celulares. As células da porção secretora apresentam citoplasma bastante denso, com 6 riqueza de mitocôndrias, dictiossomos, retículo endoplasmático, o que é um claro 7 demonstrativo da alta atividade metabólica destas células (Fahn 1979). 8 A liberação de néctar para o meio externo provavelmente se dá através de 9 rupturas na cutícula, como foi observado nas imagens obtidas através da microscopia 10 eletrônica de varredura. O acúmulo dos produtos de secreção dentro do espaço 11 subcuticular promove grande pressão, favorecendo a ruptura da cutícula e permitindo 12 a passagem da secreção para o meio externo (Paiva 2016). Pode-se observar no 13 tecido secretor, intensa atividade de dictiossomos e retículo endoplasmático rugoso. 14 Há ainda gradual acúmulo de secreção no espaço periplasmático e no vacuoma que 15 concomitantemente vai se fundindo à membrana celular e liberando seu conteúdo no 16 espaço periplasmático. Devido a isso, o protoplasto apresenta-se comprimido e 17 ocupando menos que um terço do volume celular. A pressão gerada por esse 18 processo comprime os produtos de secreção, forçando-os contra a parede celular 19 resultado na exsudação da secreção para o meio externo, neste caso, para a bolsa 20 subcuticular (Paiva 2016). Em L. cylindrica o exsudato é liberado pelas células 21 secretoras para o espaço intercelular e, através de pequenos canais formados por 22 estes espaços, é encaminhado para o polo secretor, forçando a formação da bolsa 23 subcuticular. O contínuo acúmulo de secreção neste espaço acaba por resultar no 24 rompimento da cutícula e consequente extravasamento da secreção para o meio 25 externo. Estes são eventos cíclicos e a cutícula se recompõe a cada ciclo, permitindo 26 novo acúmulo e liberação (Paiva 2016). 27 As gotículas de óleo dispersas no citosol das células dos tecidos secretor e 28 subglandular foram identificadas, em sua maioria, como terpenos, porém, também 29 foram observadas gotículas lipídicas de natureza não terpenóide. Sugere portanto, que 30 estas células apresentam tanto lipídios como elemento de defesa, quanto lipídios 31 destinado à reserva energética. No teste de néctar utilizando vapores de ósmio não 32 observamos quantidade significativa de óleo sendo liberada com o exsudato. Ou seja, 33 este óleo não é usado pela planta como recompensa aos insetos defensores. Isso 34 25 poderia sugerir que os lipídios produzidos pelas células dos NEFs tem papel na 1 reconstrução da cutícula após o rompimento desta para o extravasamento do néctar. 2 A presença de feixe vascular nas imediações do tecido subglandular é 3 interpretada como indício da participação do floema no aporte de precursores do 4 néctar. A presença de cloroplastos no tecido subglandular indica que pode haver 5 também a participação deste tecido no processo de produção de açúcares que irão 6 suprir de carboidratos o nectário. No tecido secretor estes plastídios encontram-se 7 indiferenciados e observa-se inclusive a presença de etioplastos com corpos 8 prolamelares característicos. 9 A camada limítrofe apresenta células justapostas, paredes celulares espessas 10 e impregnadas com lignina. A presença deste composto sugere a formação de uma 11 barreira hidrofóbica, que impede o refluxo da secreção para o tecido subglandular. 12 Com isso, há o direcionando da passagem do exsudato para o meio externo. O 13 mesmo foi observado por Paiva e Machado (2006) e Fahn (2000). A camada limítrofe 14 atua de modo análogo à endoderme ou mesmo à estria de Caspary presente na célula 15 basal de tricomas secretores, sendo funcionalmente similares. Em Erythrina speciosa 16 (Fabaceae), por exemplo, a pressão causada pelo acúmulo de néctar na cabeça dos 17 tricomas secretores, como consequência do impedimento de refluxo pela estria de 18 Caspary, pode explicar o extravasamento pela cutícula (Paiva 2009). 19 Os grãos de amido observados nos tecidos subglandular e secretor são 20 menores que os encontrados no mesofilo adjacente. O fato de serem menores implica 21 em uma maior superfície específica, sendo este um indicativo da facilitação da 22 hidrólise, reforçando seu papel na síntese do néctar. Porém, o aporte de carboidratos 23 para o exsudato não proveria apenas da hidrólise de amido, mas também do floema 24 que se encontra adjacente ao tecido subglandular. 25 Os grânulos elétron-densos, encontrados nas paredes periclinais das células 26 da camada limítrofe, são interpretados aqui como precursores de lignina. Sendo uma 27 substância complexa, hidrofóbica, formada especialmente de fenólicos, a lignina não 28 tem biossíntese direta no citosol. Seu ciclo metabólico conta com vários passos, 29 catalisados por enzimas específicas (Taiz e Zeiger 2009). Sua síntese culmina em sua 30 deposição na parede celular, porém carecem estudos acerca da localização exata de 31 todos os passos de sua biossíntese (Boerjan 2003). Foi observado o possível 32 processo de liberação destes compostos fenólicos precursores de lignina. Ora 33 diretamente, sendo o composto liberado no citosol e encaminhado para a parede 34 celular, ora por meio da fusão dos vacúolos que os contêm, com a membrana celular, 35 ganhando assim o espaço periplasmático e sendo depositados na parede celular 36 26 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1 Agarwal VM, Rastogi N. 2010. Ants as dominant insect visitors of the extrafloral 2 nectaries of sponge gourd plant, Luffa cylindrica (L.) (Cucurbitaceae). Asian 3 Myrmecology 3:45–54. 4 Bhattacharyya B, Maheshwart JK. 1971. Studies on extrafloral nectaries of the 5 Leguminales I. Papilionaceae, with a discussion on the systematics of the 6 Leguminales. Proceedings of the Indian National Science Academy 37:11–30. 7 Boerjan W, Ralph J, Baucher M. 2003. Lignin biosynthesis. Annual Review of Plant 8 Biology 54:519–46. 9 Chakravarty HL. 1948. Extrafloral glands of Cucurbitaceae. 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Neste trabalho, noventa indivíduos de Luffa 5 cylindrica foram cultivados em diferentes concentrações de nutrientes na solução 6 nutritiva (10, 50 e 100%). Foram submetidos à herbivoria simulada metade dos 7 indivíduos cultivados em cada concentração, com o objetivo de avaliar os padrões de 8 resposta de defesa biótica tanto à herbivoria quanto ao status nutricional. Foram 9 avaliados a área foliar e o número e a densidade de nectários. O néctar secretado 10 pelos NEFs foi coletado e seu teor de açúcares avaliado. Observou-se interação 11 significativa entre nutrientes × herbivoria. Área foliar e número de NEFs aumentaram 12 nas plantas com o status nutricional elevado, porém na presença de dano foliar 13 observou-se maior crescimento foliar no grupo cultivado a 10%. Por ser o grupo com 14 recursos mais reduzido, quando sob efeito de herbivoria, respondeu de forma a 15 aumentar a área foliar, o que nos permite inferir a ocorrência de um efeito de 16 sobrecompensação, de modo a compensar os prejuízos causados pela ação dos 17 herbívoros. Plantas cultivadas com solução nutritiva completa e sob efeito da 18 herbivoria apresentaram maior densidade de nectários e maior concentração de 19 açúcares no néctar. Este estudo contribui para a compreensão de como o status 20 nutricional e a herbivoria influem nas defesas indiretas e induzidas das plantas. 21 Palavras chaves: área foliar, concentração de nutrientes, defesa indireta, 22 herbívoros, néctar, predadores. 23 31 ABSTRACT 1 Extrafloral nectaries (EFNs) are involved in symbiotic relationships between plants and 2 insects that, by their occurrence and activity, provide plant protection. The formation 3 and the secretory activity of EFNs are generally induced by herbivory, thus being 4 considered as an induced defence response. In this study, 90 plants of Luffa cylindrical 5 were grown under different nutrient concentrations (10, 50, 100%) in a nutritive 6 solution. The half of the plants per nutrient concentration was subjected to simulated 7 herbivory in order to examine the patterns of response of biotic defence by both 8 herbivory and nutritional status. Leaf area, number and density of nectaries were 9 analysed. Nectar secreted by EFNs was also collected and it sugar content was 10 subsequently determined. There was a significant interaction between nutrients and 11 herbivory. Leaf area and nectary number increased in plants with higher nutritional 12 status, but a greater leaf growth in plants growing to 10% of nutrients was detected 13 under leaf damage. The low-nutrient plants increasing leaf area under herbivory 14 pressure may be subjected to the overcompensation effect, thus balancing the costs 15 caused by herbivore incidence. Plants growing under a full nutrient concentration and 16 herbivory effect showed greater density of nectaries and higher sugar concentration. 17 This study contributes to the understanding of how nutrient status and herbivory 18 influence on induced indirect defence of plants. 19 20 Key words: leaf area, nutrient concentration, indirect defense, herbivores, 21 nectar, predators. 22 32 INTRODUÇÃO 1 As plantas têm que lidar com inimigos naturais, como herbívoros, que podem 2 consumir quantidades significativas de biomassa da planta e reduzir seu sucesso 3 reprodutivo (Crawley 1983; Coley e Barone 1996; Strauss et al. 2002). Devido a isso, 4 as plantas desenvolveram diversas estruturas e estratégias para se defender. Por 5 exemplo, diversos mecanismos atuam diretamente na defesa da planta, como 6 espinhos, tricomas, taninos ou látex, enquanto outros atuam ainda de forma indireta, 7 atraindo predadores naturais de herbívoros mediante uma resposta induzida pelo dano 8 causado por eles (Agrawal 1998; Karban e Baldwin 2007). Especialmente, as 9 estruturas que secretam de substâncias capazes de atrair predadores, constituem um 10 dos mecanismos mais habituais de defesa indireta induzida por herbívoros (Bentley 11 1977; Del Claro 2012; Weber 2013). 12 As plantas apresentam diversas estruturas secretoras, a maioria delas 13 desempenhando papel fundamental na defesa e desenvolvimento da planta. Algumas 14 destas estruturas possuem diversos mecanismos morfológicos e químicos que atuam 15 como resposta ao dano mecânico produzido por herbívoros (Stamp 2003; Heil 2008; 16 Nahas et al. 2012). A proteção indireta é uma defesa induzida que está envolvida na 17 atração de inimigos naturais dos herbívoros. Portanto, a atividade secretora promove a 18 proteção indireta da planta contra os herbívoros mediada pelos seus predadores (Heil 19 2008). Por exemplo, várias espécies de plantas se valem de estruturas como 20 domáceas e nectários extraflorais (NEFs) que atuam nesta atração de inimigos 21 naturais dos herbívoros (Pulice e Packer 2008; Hernández et al. 2013; Dáttilo et al. 22 2015). Diversas espécies vegetais, distribuídas em pelo menos 109 famílias e 801 23 gêneros, produzem nectários extraflorais (Keeler 2016) que atuam como mediadores 24 de interações simbióticas, sendo visitados por diversos insetos (Heil et al. 2001). Com 25 estes nectários a planta é capaz de atrair predadores como formigas e vespas, ambas 26 defendendo-a contra herbívoros (Leitão et al. 2005; Byk e Del Claro 2011; Del Claro 27 2012). 28 Nectários são estruturas secretoras envolvidas na secreção de néctar e podem 29 ser classificados conforme sua posição, sendo florais aqueles presentes em peças 30 florais, e extraflorais aqueles presentes em órgãos não reprodutivos (Schmid 1988). 31 Diferente dos nectários florais, presentes na estrutura da flor e atuando como 32 mediadores do processo de polinização (Oliveira 1997), os NEFs são glândulas 33 secretoras de néctar que ocorrem na superfície de órgãos não reprodutivos da planta 34 e não estando diretamente ligados à atração de polinizadores (Bentley 1977; Schmid 35 1988). Portanto, os NEFs estão comumente envolvidos na defesa indireta da planta 36 33 como um tipo de defesa biótica, aquela que representa a associação de uma espécie 1 com outra que, por sua presença e atividade, irá promover a proteção (Bentley 1977; 2 Del Claro 2012; Weber 2013). Essa função protetora se deve ao néctar, um valioso 3 recurso alimentar para diversos artrópodes. Sendo uma rica e nutritiva solução 4 açucarada, o néctar é responsável por mediar a relação das plantas com polinizadores 5 e defensores. Estes últimos conferem a redução da presença de herbívoros e 6 predadores de as sementes (Heil 2011). Deste modo, os NEFs e o néctar secretado 7 por eles são caraterísticas chaves no aumento do crescimento e sobrevivência das 8 plantas. 9 Independente de serem diretas ou indiretas, as defesas contra herbívoros 10 requerem investimento de recursos por parte da planta (McKey 1974; Strauss e 11 Agrawal 1999; Pulice e Packer 2008). Como os indivíduos lidam com uma limitada 12 disponibilidade de recursos, a alocação a uma certa estrutura ou função limita o 13 investimento em outras (Lloyd 1980; de Jong e Klinkhamer 2005). Desta forma, já que 14 o compromisso na alocação de recursos frente a um gasto desnecessário pode limitar 15 o investimento em crescimento e reprodução, as plantas com maiores defesas podem 16 ter um menor fitness na ausência de herbívoros (Bentley 1977; Strauss et al. 2002). O 17 dano por herbívoros é temporal e espacialmente variável e, portanto, se torna 18 imprevisível (Lowman 1985; Strauss et al. 2002). Em face dessa imprevisibilidade, a 19 seleção natural mediada por limitação de recursos tem favorecido a aparição das 20 defesas induzidas, aquelas que podem surgir a partir do momento do dano (Zangerl e 21 Rutledge 1996; Karban e Baldwin 2007). Sendo esta a única forma de se defender 22 apenas quando é preciso, só haverá gasto de recursos quando estritamente 23 necessário. 24 O número de NEFs por folha, cálice, brácteas e bractéolas mantém uma 25 correlação linear significativamente positiva com o tempo de patrulhamento de 26 formigas predadoras em Luffa cylindrica, sendo esta uma valiosa estratégia de defesa 27 indireta da planta (Agarwal e Rastogi 2010). O padrão de patrulhamento e a interação 28 de espécies de formigas com herbívoros apoia a teoria de defesa ideal. Esta teoria 29 sugere que as partes das plantas que são caracterizadas por um alto valor energético 30 e, com isso, maior risco de serem atacadas pelos herbívoros, apresentarão os mais 31 elevados níveis de defesa (McKey 1974). Sendo a produção de NEFs adicionais e a 32 secreção de néctar algo custoso em termos de recursos, esta resposta é normalmente 33 dano-recurso-dependente (Stamp 2003; Mondor et al. 2006). Portanto, poderíamos 34 avaliar experimentalmente se a disponibilidade de recursos e a presença de dano 35 mecânico afetam significativamente a resposta defensiva em termos de produção 36 adicional de NEFs. Evidências neste sentido proporcionariam apoio às predições dos 37 34 argumentos baseados na limitação de recursos e o seu investimento pontual sob a 1 presença de herbívoros, o que potencialmente explicaria a presença de menos NEFs 2 na ausência de danos e sob condições estressantes em termos de recursos. 3 A família Cucurbitaceae é especialmente rica em espécies portadoras de 4 nectários extraflorais, entre elas Luffa cylindrica (Chakravarty 1948) que os apresenta 5 em forma de disco e localizados na lâmina foliar, estípulas, brácteas, bractéolas e 6 frutos (Agarwal e Rastogi 2010). Esta espécie tem uma alta diversidade específica e 7 funcional de insetos herbívoros e seus predadores pertencentes a cinco diferentes 8 ordens: Hemíptera, Díptera, Coleóptera, Himenóptera e Lepidóptera (Blüthgen et al. 9 2003). Dentre as espécies mais frequentes, as formigas são com certeza o grupo mais 10 expressivo (Agarwal e Rastogi 2010). Buscando entender as relações entre status 11 nutricional e investimento em defesa, este trabalho teve como objetivo avaliar as 12 respostas estruturais e metabólicas de Luffa cylindrica cultivada em solução nutritiva 13 com diferentes teores de nutrientes e sob efeito de herbivoria. Especificamente, 14 testamos as seguintes hipóteses: 15 -Plantas com melhor status nutricional apresentam maior número de NEFs e 16 maior área foliar; 17 -Plantas sob efeito de herbivoria apresentarão menor área foliar, porém maior 18 número de NEFs, especialmente com melhor status nutricional 19 -Plantas com melhor status nutricional, ao sofrerem herbivoria, terão resposta 20 de defesa (área foliar, número de nectários e densidade de nectários) maior nas 21 primeiras folhas que se desenvolverem logo após o dano. 22 MATERIAL E MÉTODOS 23 Obtenção das plântulas 24 Noventa plântulas foram obtidas a partir da germinação de sementes. Para a 25 germinação foram utilizadas bandejas plásticas preenchidas com vermiculita e 26 regadas frequentemente de modo a manter a umidade do substrato. Quando as 27 plântulas apresentavam duas folhas, foram transferidas para potes com capacidade de 28 três litros preenchidos com solução hidropônica preparada segundo o proposto por 29 Hoagland e Arnon (1950) com algumas modificações nos sais utilizados mas 30 mantendo-se as concentrações molares (Tabela 1). Para facilitar o transplante, as 31 plântulas foram lavadas em água deionizada, de modo a retirar todos os sedimentos 32 35 das raízes. As plântulas foram então acondicionadas em potes plásticos revestidos 1 com tinta aluminizada, contendo três litros de solução nutritiva. 2 Solução nutritiva 3 Para avaliar se a produção de NEFs era dano e recurso dependente foram 4 utilizadas três diferentes concentrações da solução nutritiva, cada uma nutrindo 30 5 plântulas aleatoriamente selecionadas: 10%, 50% e 100% de nutrientes, sendo este 6 último, o grupo controle e no qual as plantas dispõem dos níveis adequados de 7 nutrientes minerais. Portanto, as soluções de 10 e 50% atuaram como uma redução 8 experimental dos recursos. Diariamente o volume da solução nos potes foi completado 9 com água deionizada, de modo a repor perdas por evaporação. Semanalmente a 10 solução era renovada de modo a se manter as condições experimentais de nutrição. 11 Tabela 1: Composição da solução nutritiva segundo Hoagland e Arnon (1950) 12 Composto Quantidade para o preparo de 1L de solução Estoque Alíquota da solução Estoque para o preparo da solução a 100% Ca(NO3)2 4H20 236 g 5 ml KNO3 101 g 5 ml MgSO4 7H2O 246,5 g 2 ml KH2PO4 136 g 1 ml FeSO4 7H20 7,45 g 2 ml EDTA 5,57 g 2 ml CuSO4 5H2O 0,079 g 1 ml ZnSO4 7H2O 0,215 g 1 ml MnSO4 0,76899 g 1 ml H3BO3 2,844 g 1 ml (NH4)6Mo7O24 0,0174 g 1 ml Herbivoria 13 Para avaliar se a produção de NEFs é dano dependente simulamos a 14 herbivoria 60 dias após o transplante das plântulas e em 15 plântulas para cada uma 15 das concentrações de solução nutritiva. Nesta simulação 15% da área foliar foi 16 36 removida com auxílio de um perfurador metálico. Portanto, por concentração de 1 solução nutritiva, 15 plântulas foram submetidas à herbivoria e outras 15 foram 2 mantidas como controle (Fig. 1). A área do limbo foi previamente estimada em 50 3 folhas de L. cylindrica. De posse da relação área foliar e comprimento da nervura 4 mediana nestas 50 folhas, estimou-se a área das folhas que sofreriam herbivoria a 5 partir do comprimento de sua nervura mediana. Desse modo, determinou-se a área 6 foliar e assim a quantidade de perfurações necessárias, de modo a eliminar 15% da 7 área do limbo em cada folha submetida à herbivoria simulada. 8 O número de folhas completamente expandidas em cada planta foi 9 contabilizado. Foram submetidos à herbivoria simulada 50% das folhas de cada 10 indivíduo, selecionando-se exclusivamente aquelas dispostas na porção distal do 11 eixo caulinar. As folhas jovens, ainda não expandidas, foram eliminadas da planta. 12 Dessa forma, garantimos que as 10 folhas expandidas que foram coletadas após o 13 experimento se desenvolveram sob os possíveis efeitos da herbivoria. Após o 14 desenvolvimento das plantas e a simulação da herbivoria, as dez folhas que se 15 expandiram foram coletadas. Nas plantas que não sofreram herbivoria coletou-se as 16 dez últimas folhas expandidas. A área foliar foi mensurada através do software 17 AxioVision SE64 (AxioVision Microscopy Software 2009, ZEISS, Alemanha) 18 Figura 1: Desenho experimental cruzado para avaliar o efeito do status nutricional e a herbivoria sobre a resposta estrutural e metabólica dos NEFs de Luffa cylindrica Análise química do néctar 19 O néctar secretado foi coletado em todos os NEFs de uma mesma folha, em 20 três diferentes indivíduos, de cada uma das concentrações nutricionais e tratamento 21 37 de herbivoria, totalizando assim 18 amostras. Para a coleta de néctar as formigas 1 foram excluídas da planta, as folhas foram previamente lavadas e ensacadas ao 2 anoitecer objetivando formar uma câmara úmida e impedir o acesso de pilhadores de 3 néctar. O néctar foi coletado na manhã seguinte, cerca de 12 horas após o isolamento 4 das folhas, com auxílio de tubo capilar. As amostras foram acondicionadas em 5 microtubos plásticos, congeladas e armazenadas em freezer a -10°C. 6 As análises do néctar foram realizadas no Laboratório de Nutrição e 7 Metabolismo de Plantas, Departamento de Biologia Vegetal – UFV (Viçosa, MG, 8 Brasil). Para tais análises foi utilizado o método enzimático para quantificação de 9 açúcares (Praxedes 2006). Foram utilizadas as seguintes enzimas: sacarose-fosfato 10 sintase (sacarose), frutose-1,6-bifosfatase (frutose) e ADP-glicose pirofosforilase 11 (glicose). Os ensaios foram executados em um leitor de placa “Elisa” e seguiram a 12 metodologia proposta por Praxedes (2006). Esta análise foi feita em um pequeno 13 tamanho amostral e por isso não foi analisada estatisticamente. 14 Análise estatística 15 Para determinar se a área foliar, o número de NEFs e sua densidade foram 16 alterados pelo status nutricional e o efeito da herbivoria, foram aplicadas três ANOVAs, 17 uma para cada variável resposta, considerando nutrientes e herbivoria (fatores fixos), 18 planta (fator aleatório) e a interação nutrientes × herbivoria como variáveis 19 independentes. Uma interação significativa indica um efeito diferencial da herbivoria 20 sobre a área foliar, o número de NEFs e a sua densidade dependendo da 21 concentração de nutrientes. Para calcular diferenças significativas entre concentrações 22 de nutrientes sob os tratamentos de herbivoria para cada variável resposta, as médias 23 foram comparadas usando post-hoc Tukey HSD. Os supostos de normalidade e 24 homogeneidade da variância foram testados usando os testes de Shapiro-Wilk e 25 Levene, respectivamente. Os dados para densidade de NEFs foram transformados 26 pela logaritmização. Naqueles dados cujo valor era menor que um, foi somado um 27 para que não se obtivesse resultado negativo após logaritmizar. 28 Para testar a variação temporal e assim determinar se existem picos de 29 resposta dentro de cada planta em termos de área foliar, número de NEFs e a sua 30 densidade, regressões lineares e curvilíneas (polinomial quadrática) foram analisadas 31 para cada tratamento (nutrientes e herbivoria). As dez folhas coletadas após o 32 experimento foram regressadas contra a área foliar, número de NEFs e a sua 33 densidade para cada status nutricional com e sem herbivoria. Além disso, t-tests de 34 38 amostras pareadas para cada tratamento (nutrientes e herbivoria) foram analisados 1 para avaliar diferenças na área foliar, número de NEFs e a sua densidade entre a 2 primeira e a última folha expandidas que foram coletadas após o experimento (ou seja, 3 as folhas 1 e 10). As médias dos valores de todos os indivíduos para cada folha foram 4 usadas (n=15 indivíduos para cada folha). No total, seis regressões e seis t-tests foram 5 analisados (10, 50 e 100% de solução de nutrientes com e sem herbivoria) para cada 6 variável resposta. Todas as análises foram realizadas em SPSS v22 (IBM SPSS 7 Statistics 2013; IBM Corp, Armonk, NY, USA). 8 RESULTADOS Os três tipos de respostas analisadas (área foliar, número de NEFs e 9 densidade de NEFs) variaram significativamente com o status nutricional, herbivoria e 10 planta. No entanto, todas as variáveis diferiram significativamente em resposta à 11 interação status nutricional × herbivoria (Tabela 2). Na ausência de herbivoria o 12 incremento da área foliar e número de NEFs foi proporcional ao aumento do status 13 nutricional, ou seja, as respostas em termos de tamanho e número aumentaram de 14 acordo com o aumento de nutrientes (Fig. 2). Conforme isso, a densidade de nectários 15 seguiu uma tendência a se manter estável entre as concentrações de nutrientes, 16 exceto para 50% (Fig. 2C). Quanto ao efeito da herbivoria, as respostas estruturais e 17 metabólicas foram significativamente dependentes do status nutricional (interação 18 nutriente × herbivoria significativo; Tabela 2, Fig. 2). Quando comparada aos efeitos 19 sem herbivoria, a área foliar aumentou significativamente à concentração de 10% mas 20 diminuiu à de 100% (Fig. 2A). O número de NEFs aumentou significativamente com o 21 aumento do status nutricional e sob o efeito de herbivoria, porém diminuiu em relação 22 à ausência de herbivoria nas concentrações de 50 e 100% (Fig. 2B). A densidade de 23 NEFs seguiu os padrões para a relação tamanho vs número, ou seja, aumentou 24 significativamente com o aumento do status nutricional e teve uma tendência a 25 diminuir quando comparado aos efeitos sem herbivoria (Fig. 2C). 26 Em relação à variação temporal, os resultados diferiram em função da variável 27 resposta analisada e o efeito do status nutricional e a herbivoria (Fig. 3). Com 28 herbivoria, a área foliar diminuiu temporalmente à concentração de 10%, mas 29 aumentou sem herbivoria, e teve pico de resposta à 50% de concentração de 30 nutrientes. Para 100% a área foliar segue uma distribuição estabilizadora sem 31 herbivoria, ou seja, primeiro aumenta e depois diminui (Fig. 3A-C). Portanto, a área 32 foliar entre a primeira folha e a última só diferiu significativamente com o status 33 nutricional de 10% (média ± DP: 21,34 ± 3,86 vs 28,90 ± 10,24, t-test1,14 pareado = -34 39 2,68, P = 0,018 sem herbivoria; média ± DP: 90,16 ± 21,40 vs 58,43 ± 16,26, t-test1,14 1 pareado = 4,92, P < 0,001 com herbivoria). Quanto ao número de NEFs, houve uma 2 tendência a aumentar sob o efeito de herbivoria, mas o incremento só foi significativo a 3 10% de nutrição (média ± DP: 37,80 ± 12,56 vs 48,00 ± 16,99, t-test1,14 pareado = -4 2,67, P = 0,018; Fig. 3D-F). Sem herbivoria, o número de NEFs também aumentou 5 significativamente a 10% de nutrição (média ± DP: 32,40 ± 5,78 vs 58,07 ± 6,16, t-6 test1,14 pareado = -12,29, P < 0,001; Fig. 3D) e à 100% de nutrientes, com uma 7 tendência significativa a atingir um pico de resposta (média ± DP: 72,27 ± 23,98 vs 8 92,00 ± 32,37, t-test1,14 pareado = -2,25, P = 0,041; Fig. 3F). Finalmente, a densidade 9 de NEFs é uma função da área foliar e o número de NEFs, onde só foi detectável uma 10 variação significativa na concentração de 10% de nutrientes (Fig. 3G). Sem herbivoria, 11 a variação temporal foi oscilante com valores significativamente maiores na folha 10 12 em relação à folha 1 (média ± DP: 1,57 ± 0,40 vs 2,21 ± 0,69, t-test1,14 pareado = -2,80, 13 P = 0,014). Com herbivoria, houve uma tendência significativa a aumentar a densidade 14 ao longo do tempo (média ± DP: 0,45 ± 0,21 vs 0,86 ± 0,34, t-test1,14 pareado = -4,78, 15 P < 0,001). 16 A concentração de açúcares no néctar extrafloral variou consideravelmente. Na 17 presença de herbivoria houve maior quantidade de açúcares secretados, exceto para 18 as plantas cultivadas a 50% de nutrientes, onde se observa decaimento. Na ausência 19 de herbivoria observa-se diminuição gradual de açúcares no néctar de acordo com o 20 aumento da concentração de nutrientes na solução nutritiva. As médias das 21 concentrações são mostradas na Figura 4. 22 40 Tabela 2: ANOVAs para o efeito do status nutricional, a herbivoria (fatores fixos), planta (fator 1 aleatório) e a interação do status nutricional X herbivoria (fator fixo) sobre a área foliar, 2 número de NEFs e densidade de NEFs em Luffa cylindrica. 3 Resposta Efeito g.l. Média quadrática F P Área foliar Nutriente 2 1,88x104 34,1 <0,001 Herbivoria 1 1,76x104 32,0 <0,001 Nutriente x herbivoria 2 3,12x104 225,0 <0,001 Planta 14 1,24x105 56,6 <0,001 Erro 880 5,50x102 Número de NEFs Nutriente 2 9,19x104 278,1 <0,001 Herbivoria 1 3,16x104 96,0 <0,001 Nutriente x herbivoria 2 1,00x104 30,5 <0,001 Planta 14 2,34x103 7,11 <0,001 Erro 880 3,29x102 Densidade de NEFs Nutriente 2 2,90x10 51,4 <0,001 Herbivoria 1 3,50x10 62,0 <0,001 Nutriente x herbivoria 2 2,77x10 49,0 <0,001 Planta 14 2,43 4,29 <0,001 Erro 880 0,56 41 Figura 2: Alterações na área foliar, número de NEFs e densidade de NEFs produzidos por Luffa 1 cylindrica em resposta à interação do efeito do status nutricional e herbivoria. Colunas 2 mostram as médias e barras o desvio padrão. Letras diferentes indicam diferenças 3 significativas entre tratamentos usando um post-hoc Tukey HSD (P < 0.05). 4 Figura 3: Magnitude e forma das regressões curvilíneas entre área foliar, número de NEFs e densidade de NEFs, e as dez folhas expandidas temporalmente que foram coletadas após o experimento em relação ao status nutricional (10%, esquerda, A, D e G; 50%, centro, B, E e H; 100%, direita, C, F e I). e presença ou ausência de herbivoria. 42 43 Figura 4: Concentrações de açúcares no néctar em resposta ao status nutricional, com (10c, 1 50c e 100c) e sem (10s, 50s e 100s) herbivoria. 2 DISCUSSÃO 3 Nós demostramos aqui que a produção de estruturas secretoras, tais como 4 NEFs, relacionadas à defesa indireta da planta e induzida por herbívoros é uma 5 resposta estrutural e metabólica dano-recurso-dependente em Luffa cylindrica, uma 6 espécie com uma alta interação biótica com diversos insetos herbívoros e seus 7 predadores. É bem conhecido que a indução do incremento de respostas defensivas 8 nas plantas implica custos diretos em termos de alocação de recursos e que, portanto, 9 a sua disponibilidade pode limitar a defesa e com isso, o sucesso reprodutivo dos 10 indivíduos. Também existem vários estudos que mostram que as defesas indiretas 11 relacionadas na atração de predadores aumentam com a incidência de herbívoros e, 12 portanto, são dependentes do dano. No entanto, pouco é conhecido sobre o efeito 13 combinado da disponibilidade de recursos e a presença/ausência de herbivoria na 14 produção de estruturas secretoras de defesa como os NEFs (Mondor et al. 2006). 15 Além disso, acrescentamos informações sobre a escassa pesquisa focada na variação 16 temporal das respostas estruturais e metabólicas relacionadas com a defesa indireta 17 induzida por herbivoria (Dáttilo et al. 2015 e suas referências). Nós discutimos o tipo e 18 a intensidade das respostas estruturais e metabólicas dos NEFs em função da 19 44 variação no status nutricional e a herbivoria em Luffa cylindrica e as suas implicações 1 ecológicas nas interações planta-herbívoro. 2 Em Luffa cylindrica a área foliar e número de NEFs por folha aumentaram com 3 o incremento de nutrientes na ausência de herbivoria. É esperado que plantas com 4 maior aporte de nutrientes apresentem maior área foliar, simplesmente pelo aumento 5 de recursos (Knops e Reinhart 1999; Fageria et al. 2009). Além disso, como não há 6 herbivoria, não existe pressão seletiva negativa sobre o tamanho foliar. Vários 7 trabalhos apontam que sob o efeito de herbivoria, as plantas apresentam menor 8 biomassa (revisado em Strauss et al. 2002). Era esperado que o número de NEFs 9 aumentasse, acompanhando o incremento de recursos (Stamp 2003; Mondor et al. 10 2006). Porém, não era esperado que houvesse aumento no número de NEFs 11 temporalmente na ausência de herbivoria, ou seja, não era esperado que, sem 12 herbivoria, a primeira folha apresentasse menos nectários que a folha décima folha de 13 um mesmo ramo. Então, interpretamos esse aumento no número de NEFs como uma 14 função da área foliar. Assim, com o aumento da área foliar, o número de nectários 15 tende a aumentar para manter a proporção de nectários/cm2 e assim a densidade se 16 mantem praticamente estável em quase todos os tratamentos. 17 Quando sob efeito de herbivoria, a área foliar só foi significativamente reduzida 18 a 100% de nutrição em relação à ausência de herbivoria e, em geral, a área foliar foi 19 maior nas plantas cultivadas a 10% de nutrientes quando comparadas às plantas 20 cultivadas a 50 e 100%. Estes resultados são só esperáveis em partes. A redução do 21 tamanho dos órgãos é provável acontecer sob pressões seletivas impostas por 22 inimigos da planta como os herbívoros (ver Strauss et al. 2002). No entanto, o maior 23 tamanho foliar a 10% de nutrição confronta as hipóteses iniciais de que este caráter se 24 reduz sob o efeito de herbivoria e que a alocação para crescimento seria tanto menor 25 quanto menor fosse a nutrição (Bentley 1977; Stamp 2003; Mondor et al. 2006). 26 Porém, o que observamos ocorrer nesta espécie pode ser interpretado como um efeito 27 da sobrecompensação. Este fenômeno ocorre quando as plantas apresentam maior 28 aptidão quando danificadas em comparação a plantas que não sofreram o dano (Paige 29 e Whitham 1987; Agrawal 2000). A sobrecompensação vai além dos conceitos de 30 resistência e tolerância, porque exige uma relação mutuamente benéfica entre plantas 31 e seus herbívoros (Agrawal 2000). Os benefícios para a planta podem se dar através 32 da liberação da dominância apical, fuga fenológica e até a promoção de crescimento 33 (Agrawal 2000). Foi justamente este último benefício da sobrecompensação que 34 observamos ocorrer no grupo cultivado a 10% da força nutricional. Quando sobre a 35 influência da herbivoria, as plantas sob stress nutricional responderam positivamente, 36 45 incrementando a área foliar. No entanto, vale lembrar que peso seco e comprimento 1 das plantas não foram avaliados neste trabalho. 2 Quanto ao número de NEFs sob o efeito de herbivoria, observamos redução 3 nas plantas cultivadas a 50 e 100% de nutrientes quando comparado ao grupo 4 controle sem herbivoria. Devido à maior disponibilidade de recursos, esperávamos que 5 as plantas cultivadas a 100% de nutrientes apresentassem o maior número de NEFs, 6 seguidas por 50 e 10%, respectivamente. Portanto, este resultado é difícil de explicar 7 baseado na teoria de dano-dependência para produção de NEFs relacionados na 8 defesa indireta induzida por herbívoros (Stamp 2003; Mondor et al. 2006). Porém, 9 duas possíveis explicações poderiam ser potencialmente viáveis para entender os 10 nossos resultados. Primeiro, sobre a mesma incidência de herbivoria (15% da área 11 foliar), os efeitos deletérios seriam os mesmos para todas as concentrações 12 nutricionais? Por dispor de menos recursos, o grupo de plantas cultivadas a 10% de 13 nutrientes sofreu maior prejuízo ao perder 15% da área foliar, assim, responderam de 14 forma mais concisa. Talvez, um dano de 15% da área foliar é ainda pequeno para as 15 plantas cultivadas a 50 e 100% de concentração de nutrientes e uma resposta maior 16 poderia acontecer com uma maior incidência de herbivoria. Nesse sentido, sugerimos 17 testar níveis diferentes de dano (25, 50 e 75% por exemplo) em trabalhos futuros, e 18 assim seria possível avaliar se a resposta será a mesma em diferentes concentrações 19 nutricionais. Segundo, a redução no número de NEFs observada nas plantas 20 cultivadas a 50 e 100% de status nutricional reflete o decaimento em termos de área 21 foliar. Quanto maior a área foliar, mais provável ter aumento no número de NEFs, pelo 22 simples fato de ter mais espaço. Como a herbivoria resultou em uma redução 23 significativa do tamanho foliar, consequentemente, reduziu-se o número de nectários 24 simplesmente por uma questão física de espaço disponível. 25 Um importante achado neste trabalho é a variação temporal nas respostas 26 relacionadas com a defesa indireta induzida por herbivoria. Neste sentido, nas plantas 27 cultivadas a 10% de nutrientes, a área foliar diminui temporalmente da primeira à 28 última das 10 folhas analisadas após o dano. Porém, na ausência de dano, observa-se 29 um incremento na área foliar. A 100% de nutrição e sem herbivoria observa-se uma 30 distribuição estabilizadora da área foliar, com aumento inicial seguido de decréscimo. 31 Acreditamos que estes resultados refletem a deficiência nutricional do grupo cultivado 32 a 10% de nutrientes. Na ausência de dano, a falta de recursos leva ao decaimento da 33 área foliar, o que apoia os argumentos baseados nos compromissos de alocação de 34 recursos em plantas (Lloyd 1980; de Jong e Klinkhamer 2005). Já a 100% de nutrição, 35 as plantas têm nutrientes em abundância e a curva estabilizadora talvez seja o reflexo 36 de um certo compromisso entre tamanho e número de folhas. 37 46 O número de NEFs tende a aumentar temporalmente quando as plantas 1 sofrem herbivoria. Porém, com 10% de nutrientes esse aumento foi maior. Há ainda 2 um pico de resposta nas plantas cultivadas a 100% de nutrição. Estes padrões são 3 esperáveis já que nas zonas apicais dos ramos, onde as folhas são mais jovens, são 4 mais susceptíveis de serem atacadas por herbívoros e, portanto, a planta otimiza a 5 alocação de recursos à produção de maior número de NEFs nas últimas folhas (Dáttilo 6 et al. 2015). Além disso, a incrementada resposta a 10% de nutrição concorda com a 7 possível teoria de sobrecompensação concretizada anteriormente para este status 8 nutricional sob o efeito de herbivoria (Agrawal 2000). Finalmente, picos de respostas 9 na atividade de NEFs foram detectados durante o desenvolvimento temporal das 10 folhas em outras espécies (e.g. Qualea multiflora, Calixto et al. 2015). Era mesmo 11 esperado que ao sofrerem herbivoria as plantas apresentassem maior número de 12 NEFs por folha, porém, o que chama-nos a atenção é a curva ascendente 13 apresentada pelas plantas cultivadas a 10% de nutrição e sem herbivoria pois lhes 14 falta nutrientes e o estímulo do dano. Contudo, ao se analisar a curva de área foliar 15 observa-se certa semelhança com a curva de número de nectários. Portanto, o que se 16 observa é apenas a manutenção da proporção de nectários por unidade de área. Com 17 o aumento espacial houve o aumento de área a ser defendida e com isso a 18 necessidade de se produzir maior número de nectários. 19 No tocante ao néctar, observamos a tendência de maiores quantidades de 20 açúcares totais no grupo de plantas cultivadas a 100% e sob efeito de herbivoria, 21 como era esperado. Já aquelas cultivadas a 100% de nutrição e sem dano foliar 22 apresentam o néctar mais pobre em açúcares dentro deste comparativo, o que apoia a 23 ideia de que estas plantas são aquelas sob menor risco real. O que nos chamou a 24 atenção é que as plantas cultivadas a 10% de força nutricional apresentaram néctar 25 com grande concentração de açúcares. De novo, a teoria de sobrecompensação 26 (Agrawal 2000) e o aumento de risco a perder fitness sob este baixo status de 27 recursos poderiam explicar este resultado. Um aumento na secreção de açúcares no 28 néctar é associado ao maior risco de ataque por herbívoros (Heil e McKey 2003). Além 29 disso, a qualidade do néctar também é um caráter de defesa, pois ao atrair formigas a 30 planta se beneficia da proteção fornecida por estas (Leitão et al. 2005; Pulice e Packer 31 2008; Byk e Del-Claro 2011; Del Claro 2012; Dáttilo et al. 2015). Dessa forma, as 32 plantas com deficiência nutricional, aquelas que não podem se dar ao luxo de perder 33 tecido fotossintético, investem na atração de insetos patrulheiros. Quando sofrem 34 herbivoria, intensificam esse apelo, secretando ainda mais açúcar no néctar. Este 35 resultado apoia a teoria de defesa ideal (McKey 1974; Dáttiro et al. 2015) uma vez que 36 47 plantas com recursos em abundância e sob os efeitos de dano foliar apresentam 1 maiores defesas a nível de açúcares no néctar. 2 Em conclusão, nosso trabalho contribui para a compreensão de fatores que 3 moldam a defesa indireta em plantas como o status nutricional e a herbivoria através 4 da plasticidade dos nectários extraflorais de Luffa cylindrica, mostrando que a resposta 5 de defesa a nível de NEFs é dano-recurso-dependente. Adicionalmente, 6 apresentamos evidência de que a dita resposta mostra variação temporal sob 7 diferentes status nutricionais e presença/ausência de herbivoria, um tópico 8 subvalorizado nos estudos de interações multi-tróficas planta-herbívoro-predador. Para 9 trabalhos futuros, sugerimos testar a interferência de níveis diferentes de dano 10 combinados com diferentes concentrações nutricionais. Sugerimos ainda avaliar com 11 mais detalhes a quantidade e a qualidade do néctar secretado pelas plantas em 12 diferentes concentrações nutricionais com ausência e presença de danos. Ainda, 13 nossos resultados contribuem para o conhecimento das implicações ecológicas e 14 evolutivas da combinação da disponibilidade de recursos e a ação da herbivoria sobre 15 o desenvolvimento de respostas induzidas das defesas indiretas das plantas. 16 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 17 Agarwal VM, Rastogi N. 2010. Ants as dominant insect visitors of the extrafloral 18 nectaries of sponge gourd plant, Luffa cylindrica (L.) (Cucurbitaceae). Asian 19 Myrmecology 3:45–54. 20 Agrawal AA. 1998. Induced responses to herbivory and increased plant performance. 21 Science 279:1201–1202. 22 Agrawal AA. 2000. Overcompensation of plants in response to herbivory and the by-23 product benefits of mutualism. Trends in Plant Science 5:309–313. 24 Bentley BL. 1977. 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