UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS ESCOLA DE VETERINÁRIA COLEGIADO DO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO MÉTODOS NÃO-LETAIS DE COLETA DE AMOSTRAS PARA O DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO POR Streptococcus agalactiae EM TILÁPIA DO NILO (Oreochromis niloticus) Guilherme Campos Tavares Belo Horizonte UFMG-EV 2014 2 GUILHERME CAMPOS TAVARES MÉTODOS NÃO-LETAIS DE COLETA DE AMOSTRAS PARA O DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO POR Streptococcus agalactiae EM TILÁPIA DO NILO (Oreochromis niloticus) Dissertação apresentada à Universidade Federal de Minas Gerais, Escola de Veterinária, como requisito parcial para obtenção de grau de Mestre em Ciência Animal. Área de Concentração: Medicina Veterinária Preventiva Orientador: Henrique César Pereira Figueiredo Coorientador: Carlos Augusto Gomes Leal Belo Horizonte – MG Escola de Veterinária da UFMG 2014 3 4 5 “O saber a gente aprende com os mestres e os livros. A sabedoria, se aprende é com a vida e com os humildes” Cora Coralina 6 AGRADECIMENTOS Minha busca, meus sonhos, minhas conquistas, foram plantados, inicialmente, dentro de mim e agradeço a Deus por proporcionar o crescimento de meus ideais. Aos meus pais que me deram a vida e compartilharam de meus sonhos e alegrias, acalentaram- me nos momentos de dúvida e decepção, motivaram-me quando pensei que não seria possível e ensinaram-me a ter autoconfiança, mesmo em frente aos mais duros desafios. Aos que amo: minhas irmãs e meus amigos do Tiradentes e da PUC. Agradeço por compreenderem minha ausência em vários momentos e por serem fonte de minha inspiração. Por compreenderem minhas falhas e limitações e por serem meus ouvintes mais prestimosos. Aos colegas do AQUAVET que caminharam ao meu lado e dividiram comigo o mesmo ideal. Agradeço pelo apoio nos momentos de desesperança, pela palavra solidária, pelos trabalhos que realizamos juntos e pela felicidade que, se não compartilhada, torna-se ilusória. Aos professores Henrique, Carlos, Raquel e Lilian, que além de me incutirem conhecimento, detêm a capacidade de transformar minha mente através da sabedoria. Meu agradecimento sincero. Aos amados peixes, fonte do meu maior aprendizado. Devoto a vocês o mais profundo respeito e amor. E finalmente agradeço a todos, incluindo os não citados, que me ajudaram de alguma forma. Mesmo as críticas, as duras palavras foram úteis para que eu chegasse até aqui mais forte. Encerro este capítulo tão importante de minha vida, confiante de que todo trabalho árduo foi válido e minha escolha profissional foi tomada baseada no amor aos seres viventes e assim persistirei. 7 SUMÁRIO LISTA DE TABELAS............................................................................................. 08 LISTA DE FIGURAS............................................................................................. 09 LISTA DE ABREVIATURAS............................................................................... 10 RESUMO................................................................................................................. 11 ABSTRACT............................................................................................................. 11 1. INTRODUÇÃO....................................................................................................... 12 2. REVISÃO DE LITERATURA............................................................................... 13 2.1. Aquicultura................................................................................................................ 13 2.2. Tilapicultura no Brasil e fatores predisponentes para a ocorrência de doenças...................................................................................................................... 14 2.3. Infecção por Streptococcus agalactiae em peixes..................................................... 14 2.4. Diagnóstico e Identificação de Streptococcus agalactiae em peixes........................ 18 2.5. Métodos não-letais de coleta de amostras para o diagnóstico de doenças infecciosas em peixes................................................................................................................... 19 3. MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................... 21 3.1. Delineamento Experimental...................................................................................... 21 3.2. Animais Experimentais............................................................................................. 22 3.3. Padronização de métodos não-letais de coleta de amostras...................................... 22 3.3.1. Métodos não-letais de coleta de amostras................................................................. 23 3.3.1.1. Biópsia Aspirativa de Rim Cranial............................................................................ 23 3.3.1.2. Punção Venosa.......................................................................................................... 23 3.4. Avaliação da eficiência dos métodos letais e não-letais de coleta para a detecção de Streptococcus agalactiae em tilápia do Nilo........................................................ 24 3.4.1. Bactéria e condições de cultivo................................................................................. 24 3.4.2. Infecção experimental............................................................................................... 24 3.4.3. Diagnóstico................................................................................................................ 24 3.4.3.1. Exame bacteriológico................................................................................................ 25 3.4.3.2. PCR espécie-específica............................................................................................. 25 3.4.3.2.1. Extração de DNA...................................................................................................... 25 3.4.3.2.2. PCR .......................................................................................................................... 25 3.4.4. Análise estatística...................................................................................................... 25 4. RESULTADOS........................................................................................................ 26 4.1. Viabilidade, segurança e sobrevivência dos peixes submetidos aos métodos não letais de coleta de amostras........................................................................................ 26 4.2. Eficácia dos métodos não-letais de coleta de amostras para o diagnóstico de portadores e infecções subclínicas por S. agalactiae em tilápias do Nilo................. 26 4.2.1. Infecção experimental............................................................................................... 26 4.2.2. Sensibilidade clínica dos diferentes métodos de diagnóstico.................................... 28 4.2.2.1. Sensibilidade e especificidade das técnicas de diagnóstico...................................... 28 4.2.2.2. Bacteriologia............................................................................................................. 29 4.2.2.3. PCR........................................................................................................................... 31 4.2.2.4. Bacteriologia X PCR................................................................................................. 32 5. DISCUSSÃO............................................................................................................ 33 6. CONCLUSÕES....................................................................................................... 40 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................. 40 8 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Resultados da bacteriologia e PCR obtidos durante a realização do experimento.... 28 Tabela 2 - Característica de performance da bacteriologia e PCR espécie-específica para a detecção de Streptococcus agalactiae a partir de amostras obtidas por métodos letais e não-letais....................................................................................................... 29 Tabela 3 - Isolamento e detecção de Streptococcus agalactiae em tilápia do Nilo infectadas experimentalmente a partir de diferentes tecidos coletados e diagnosticado por bacteriologia e PCR................................................................................................... 30 Tabela 4 - Comparação de tecido cerebral com as amostras de rim (obtidas por método letal e não-letal) e sangue em tilápia do Nilo infectadas experimentalmente com S. agalactiae e detectadas por bacteriologia................................................................. 30 Tabela 5 - Comparação do tecido renal, obtido por método letal, com amostras obtidas por métodos não-letais em tilápias do Nilo infectadas experimentalmente com S. agalactiae e detectadas por bacteriologia................................................................. 30 Tabela 6 - Comparação das amostras obtidas por métodos não-letais em tilápias do Nilo infectadas experimentalmente com S. agalactiae e detectadas por bacteriologia.............................................................................................................. 31 Tabela 7 - Comparação de tecido cerebral com as amostras de rim (obtidas por método letal e não-letal) e sangue em tilápia do Nilo infectadas experimentalmente com S. agalactiae e detectadas por PCR espécie-específica ................................................ 32 Tabela 8 - Comparação do tecido renal, obtido por método letal, com amostras obtidas por métodos não-letais em tilápias do Nilo infectadas experimentalmente com S. agalactiae e detectadas por PCR espécie-específica ................................................ 32 Tabela 9 - Comparação das amostras obtidas por métodos não-letais em tilápias do Nilo infectadas experimentalmente com S. agalactiae e detectadas por PCR espécie- específica .................................................................................................................. 32 Tabela 10 - Comparação da bacteriologia de cérebro com as amostras obtidas por método letal e não-letal em tilápia do Nilo infectadas experimentalmente com S. agalactiae e detectadas por PCR espécie-específica...................................................................... 33 9 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Mapa do Brasil mostrando os estados onde S. agalactiae já foi isolado em peixes......................................................................................................................... 16 Figura 2 - Fluxograma de execução do experimento de padronização dos métodos não-letais de coleta de amostras em Tilápia do Nilo................................................................. 21 Figura 3 - Fluxograma de execução do experimento de infecção experimental para a detecção de Streptococcus agalactiae em tilápia do Nilo por bacteriologia e PCR espécie- específica................................................................................................................... 22 Figura 4 - Procedimento de coleta de amostra de rim cranial por biopsia aspirativa em tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) ............................................................................... 23 Figura 5 - Procedimento de coleta de sangue por punção venosa da veia caudal em tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) .................................................................................... 23 Figura 6 - Tilápia do Nilo após ser submetida a biópsia aspirativa de rim cranial.................... 26 Figura 7 - Esfregaço de aspirado de rim cranial corado por panótico rápido e visualizado a 40x............................................................................................................................. 26 Figura 8 - Principais sinais clínicos observados em tilápias do Nilo infectadas experimentalmente com S. agalactiae....................................................................... 27 10 LISTA DE ABREVIATURAS µL Microlitro µm Micrometro AQUAVET Laboratório de Doenças de Animais Aquáticos, DMVP, EV-UFMG BHI Caldo Infusão cérebro coração CEUA-UFMG Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de Minas Gerais DL50 Dose letal 50% DNA Ácido desoxirribonucleico dNTPs Desorribonuleotídeo Trifosfatado EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético Sal dissódico EUA Estados Unidos da América EV/UFMG Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais FAO Organização das Nações Unidas para a Agricultura e Alimentação G Gauge H Hora hab. Habitantes HCl Ácido clorídrico Kg Quilogramas KOH Hidróxido de Potássio L Litros Mg Miligrama MgCl2 Cloreto de Magnésio mL Mililitros mM Milimolar Ng Nanogramas Nm Nanômetro oC Graus centigrados OMS Organização Mundial de Saúde PCR Reação em Cadeia da Polimerase pH Potencial hidrogeniônico qRT-PCR Reação da Transcrição Reversa seguida da Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real rpm Rotações por minuto RT-PCR Reação da Transcrição Reversa seguida da Reação em Cadeia da Polimerase S. agalactiae Streptococcus agalactiae S. dysgalactiae Streptococcus dysgalactiae S.iniae Streptococcus iniae THA Agar Todd Hewitt Tris Tris(hidroximetil)aminometano TSA Agar Triptona de Soja U Unidades UFC Unidade Formadora de Colônia 11 RESUMO A bactéria Streptococcus agalactiae tem se destacado como um dos principais agentes etiológicos de surtos de septicemia e meningoencefalite em pisciculturas ao redor do mundo. No Brasil, esse micro-organismo é um dos principais entraves sanitários para a tilapicultura. O objetivo deste estudo foi padronizar métodos não-letais de coleta de amostras para diagnosticar infecções por S. agalactiae em tilápias do Nilo, por meio de testes microbiológicos e moleculares. Para tanto, o estudo foi dividido em duas etapas. A primeira etapa consistiu na padronização dos métodos não- letais de coleta de amostras (biópsia aspirativa de rim cranial e punção venosa) em tilápias do Nilo. A segunda etapa consistiu na infecção experimental de tilápias do Nilo com a bactéria Streptococcus agalactiae SA 20-06, onde a sensibilidade clínica no exame bacteriológico e PCR foram comparadas a partir da obtenção de amostras por métodos letais e não-letais. Houve diferença estatisticamente significativa entre os métodos letais e não-letais para a detecção do patógeno para ambos métodos de diagnóstico. A frequência de diagnóstico foi significativamente maior para a detecção da bactéria em amostras de cérebro quando comparada com as demais amostras obtidas no experimento, independentemente do método de diagnóstico utilizado. Os métodos de coleta de amostras e de diagnóstico foram eficazes na detecção de peixes com doença clínica e portadores. Não houve diferença estatisticamente significativa entre bacteriologia e PCR para o diagnóstico de S. agalactiae a partir de amostras de cérebro. Os resultados obtidos sugerem que a biópsia aspirativa de rim cranial e a punção venosa podem ser usados como alternativas de coleta não-letal de amostras para a detecção de S. agalactiae em tilápia do Nilo, porém com desempenho inferior à bacteriologia de cérebro. Palavras-chave: biópsia aspirativa de rim, punção venosa, coleta não-letal, Oreochromis niloticus, Streptococcus agalactiae. ABSTRACT Streptococcus agalactiae has emerged as a major etiological agent of septicemia and meningoencephalitis outbreaks in fish farms around the world. In Brazil, this microorganism is a major health threat for Nile tilapia farms. The aim of this study was to standardize nonlethal sampling methods to diagnose infections caused by S. agalactiae in Nile tilapia, by microbiological and molecular tests. Therefore, the study was divided into two stages. The first step consisted in standardization of nonlethal sampling methods (kidney needle biopsy and venipuncture) in Nile tilapia. The second step consisted in infection experimental in Nile tilapia with Streptococcus agalactiae SA 20-06 and clinical sensitivity in bacteriological and PCR methods were measured from nonlethal and lethal sampling methods. There was statistically significant difference between lethal and nonlethal methods for detection of pathogen for both diagnostic methods. Diagnostic frequency was significantly greater for bacteria in brain samples detection compared with other samples obtained in present study, regardless of diagnostic method. Sample collection methods and diagnosis were effective for detecting sick fish and carrier. There was no statistically significant difference between bacteriology and PCR for diagnosis of S. agalactiae from brain samples. Results suggest that kidney needle biopsy and venipuncture can be used as nonlethal sampling methods for detection of S. agalactiae in Nile tilapia, but with less that brain bacteriology results. Keywords: kidney needle biopsy, venipuncture, nonlethal sampling, Oreochromis niloticus, Streptococcus agalactiae 1. INTRODUÇÃO A aquicultura é o ramo da produção animal que mais tem se desenvolvido nos últimos anos no Brasil e no mundo. Essa atividade caracterizada pelo cultivo de organismos aquáticos, especialmente peixes, tem sido considerada importante e promissora fonte de proteínas de origem animal para o consumo humano. A produção aquícola nacional atingiu no ano de 2011 o total de 628.704 toneladas, tendo como principais espécies produzidas a tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), o tambaqui (Colossoma macropomum) e o camarão marinho (Litopenaeus vannamei). A tilápia do Nilo é proveniente da África e foi introduzida no Brasil no século passado. Esses animais apresentam características zootécnicas e qualidade da carne propícias para o cultivo comercial. Porém um dos principais entraves para a expansão da tilapicultura no Brasil é a ocorrência de surtos de doenças infecciosas, principalmente as causadas por Streptococcus agalactiae. A infecção por S. agalactiae é uma enfermidade emergente para a piscicultura mundial. Esse patógeno Gram-positivo é responsável por casos de septicemia e meningoencefalite em peixes, principalmente em espécies de água quente de ambientes estuarinos, marinhos e de água doce. Os casos de infecção por S. agalactiae são verificados principalmente em peixes adultos mas pode ser reproduzida experimentalmente em alevinos e juvenis de tilápia do Nilo. Os principais fatores de risco para a ocorrência de surtos de infecção por S. agalactiae são o aumento da temperatura, manejo intensivo e altas densidades de estocagem. A transmissão da estreptococose por S. agalactiae ocorre de maneira direta entre peixes infectados e sadios, e indireta, através da água. Surtos dessa doença podem causar mortalidade de até 90% dos plantéis, principalmente na introdução da doença na propriedade. Surtos de estreptococose por S. agalactiae em tilápia do Nilo foram relatados em 11 Estados brasileiros pela equipe do AQUAVET – Laboratório de Doenças de Animais Aquáticos da Universidade Federal de Minas Gerais. O diagnóstico da estreptococose é baseado no isolamento e identificação da bactéria por métodos fenotípicos e moleculares. O isolamento é realizado a partir de amostras de tecido do sistema nervoso central, rim, fígado e baço de peixes moribundos, após a eutanásia dos animais. A eutanásia de peixes é um procedimento inviável para realização em larga escala dentro de uma propriedade comercial e para a avaliação de reprodutores de alto valor zootécnico em programas de monitoramento da doença por causar prejuízo econômico ao produtor. Adicionalmente, a ocorrência de peixes portadores da infecção dentro de uma propriedade pode ser uma importante fonte de infecção. A detecção de peixes portadores é importante para evitar a manutenção do agente nas fazendas, transmissão da doença para outras propriedades e sua reintrodução através da aquisição de novos animais. Os métodos de diagnóstico que têm sido utilizados para a detecção de S. agalactiae como bacteriologia e PCR espécie- específica, a partir de isolados obtidos de tecido cerebral e renal, são eficientes, porém não foram realizados estudos comprovando a eficácia do diagnóstico a partir de amostras coletadas por métodos não-letais. Não existem métodos não-letais de coleta de amostras padronizados para o diagnóstico da estreptococose em tilápias e para outras espécies de peixes. Assim sendo, a padronização de protocolos de diagnóstico envolvendo a coleta de amostras por métodos não-letais associados às técnicas de diagnóstico é uma demanda essencial de monitoramento da infecção por S. agalactiae para o desenvolvimento e implementação de futuros programas de controle e erradicação dessa doença em uma propriedade. 13 O objetivo desse estudo foi padronizar métodos não-letais de coleta de amostras (biópsia aspirativa de rim cranial e punção venosa) para o diagnóstico da infecção por Streptococcus agalactiae em tilápias do Nilo por bacteriologia e PCR espécie-específica. 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Aquicultura A produção de pescado mundial em 2010, segundo a Organização das Nações Unidas para a Agricultura e Alimentação (FAO) ultrapassou 168 milhões de toneladas, incluindo a pesca e aquicultura. A aquicultura é o ramo da produção animal que mais tem se desenvolvido nos últimos anos no mundo, sendo uma alternativa de maior viabilidade para a crescente demanda por pescados (FAO, 2012; MINISTÉRIO DA PESCA E AQUICULTURA, 2013). O Brasil é uma das maiores potências mundiais para a produção de peixes, já que possui um imenso território, com mais de dois terços ocupando a região tropical e possuindo ricas bacias hidrográficas. Neste contexto, pode se destacar a Bacia Amazônica, que é responsável por aproximadamente 20% do total de água doce não congelada do mundo (BARROS et al., 2009). Com o seu vasto litoral e inúmeros rios, o Brasil concentra uma das maiores reservas de peixes do mundo, sendo que em 2011, a produção aquícola e pesqueira alcançou volume superior a um 1,4 milhão de toneladas, sendo cerca de 44% de participação da aquicultura (628.704 toneladas) (MINISTÉRIO DA PESCA E AQUICULTURA, 2013). A produção aquícola nacional vem crescendo em média 21,1% ao ano, e as principais espécies de peixes produzidas no Brasil são: tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), tambaqui (Colossoma macropomum), tambacu (Colossoma macropomum x Piaractus mesopotamicus), as carpas (Cyprinus sp.) e pacu (Piaractus mesopotamicus) (MINISTÉRIO DA PESCA E AQUICULTURA, 2013). O Brasil ocupava em 2010 o 14º lugar no ranking mundial de produção aquícola, representando 0,8% da produção mundial (FAO, 2012). É o segundo país em importância na aquicultura América Sul, estando abaixo somente do Chile. Comparada às demais atividades nacionais, como a avicultura, suinocultura e bovinocultura, a aquicultura vem apresentando crescimento superior às demais atividades, que apresentam taxas de crescimento pouco maiores que 5% ao ano (OSTRENSKY et al., 2007). A carne de pescado é um importante alimento da dieta das populações de muitos países e contribui com cerca de um quarto da oferta de proteína de origem animal, além de ser fonte importante de emprego, lucro e renda em alguns países (SANTOS, 2011; GONÇALVES et al., 2008). O incremento no consumo de pescado aumentou nas últimas décadas devido às diversas qualidades nutricionais benéficas, cada vez mais estudadas, que esta carne apresenta. Dentre tais qualidades estão, por exemplo, o alto teor proteico, a presença de vitamina A e D, íons importantes como cálcio e fósforo, os ácidos graxos insaturados como ômega 3 e 6, encontrado em algumas espécies e que estão relacionados à diminuição da incidência de doenças cardiovasculares (SANTOS, 2011; GONÇALVES et al., 2009; SILVA et al., 2013). Apesar das estatísticas mostrarem expansão do setor aquícola brasileiro, o consumo de pescado per capita não tem apresentado crescimento na mesma proporção, sendo a carne menos consumida no país (CARVALHO e LEMOS, 2009). O consumo per capita mundial em 2009 foi aproximadamente de 18,4 kg ao ano, dados mais recentes demonstraram que no Brasil, em 2010, houve consumo de, aproximadamente, 9,75 kg/hab./ano, sendo 14 que o recomendando pela Organização Mundial de Saúde (OMS) são 12 kg/hab./ano (FAO, 2012; MINISTÉRIO DA PESCA E AQUICULTURA, 2013; OSTRENSKY et al., 2007; SANTOS, 2011;). O consumo nacional de pescados é ainda baixo devido aos altos preços do produto final, aos hábitos alimentares da população, que valorizam o consumo da carne bovina e à falta de qualidade, diversidade e praticidade oferecidas pelos produtos comercializados nacionalmente (BOMBARDELLI et al., 2005; OSTRENSKY et al., 2007; SONODA, 2006). 2.2. Tilapicultura no Brasil e fatores predisponentes para a ocorrência de doenças Dentre as espécies de peixes cultivados no Brasil, a que possui maior produção e importância na aquicultura nacional é a tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus). Esta espécie, proveniente da África, foi introduzida no Brasil por apresentar rusticidade, grande adaptação a diferentes tipos de ambientes e sistemas de produção, ser resistentes a enfermidades, suportar variações de temperatura e baixos níveis de oxigênio dissolvidos na água, se reproduzir facilmente, ter rápido crescimento e baixo custo de produção, além de ser uma carne de excelente qualidade nutricional com elevado valor proteico (RODRIGUES, 2007). A produção de tilápias em nosso país, em 2011, ultrapassou 253 mil toneladas/ano, sendo o Ceará e o Paraná os principais estados produtores. A expansão significativa dos cultivos de tilápia no Brasil é decorrente da utilização de tanques-rede nos grandes reservatórios nos Estados de São Paulo, Paraná, Bahia, Alagoas, Ceará e Minas Gerais (MINISTÉRIO DA PESCA E AQUICULTURA, 2013). Com a crescente popularização na tilapicultura em nosso país, observa-se aumento no número de produtores e maior intensificação nos sistemas de produção. O mais antigo e tradicional sistema de produção praticado no Brasil é o da criação de tilápias em tanques escavados, sistema este, que apresenta disponibilidade de alimento natural associado ao maior espaço físico, conferindo a esta espécie maior conforto e resistência a enfermidades. O sistema intensivo em tanques-rede, porém, é o mais comum no território nacional, sendo caracterizado por criações de altas densidades e alta renovação de água (BOZANO e CYRINO, 1999). Neste sistema, as tilápias são submetidas a estresse físicos e ambientais derivados do manejo, seja por classificação, transferência ou transporte dos animais, além da baixa qualidade de água. O manejo inadequado, associado a uma baixa qualidade de água, resulta na queda de resistência do animal aos patógenos oportunistas e o aparecimento de doenças, inclusive as de origem bacteriana, associadas ao aumento da mortalidade e queda de produção (KUBITZA, 2005). Um dos principais entraves para a expansão da tilapicultura no país é a ocorrência de surtos de doenças infecciosas, principalmente os causados por Streptococcus agalactiae (MIAN et al., 2009; PEREIRA et al., 2010). Essa bactéria ocasiona prejuízos significativos à produção, devido às altas mortalidades ocasionadas, bem como, redução no desempenho produtivo dos lotes e elevação do custo de produção das pisciculturas. 2.3. Infecção por Streptococcus agalactiae em peixes Pertencente à família Streptococcaceae, o gênero Streptococcus abrange uma ampla gama de espécies bacterianas associadas a processos infecciosos em seres humanos e animais, bem como, micro-organismos saprófitos ou não patogênicos. Atualmente, 104 espécies e 20 subespécies bacterianas são descritas como pertencentes a esse gênero (LPSN, 2014). Os Streptococcus são cocos Gram-positivo, com diâmetro de 0,5-2,0 µm, 15 organizados em pares ou cadeia lineares curtas, catalase negativos, não móveis e não formadores de esporos (AUSTIN e AUSTIN, 2007). Além das características fenotípicas, o tipo de hemólise e a sorotipagem baseada na antigenicidade de polissacarídeos capsulares, denominados de Grupos de Lancefield, têm sido empregadas para caracterizar as diferentes espécies de Streptococcus (SHEWMAKER et al., 2007). Seis espécies têm sido descritas como os principais agente etiológicos causadores de septicemia e meningoencefalite em peixes: Streptococcus parauberis (DOMEÉNECH et al., 1996), Streptococcus agalactiae (MATA et al., 2004), Streptococcus dysgalactiae (NOMOTO et al., 2004), Streptococcus iniae (AGNEW e BARNES, 2007), Streptococcus phocae (GIBELLO et al., 2005; ROMALDE et al., 2008), Streptococcus ictaluri (SHEWMAKER et al., 2007). No Brasil, S. agalactiae, S. dysgalactiae e S. iniae foram descritos como agentes causadores de septicemia e meningoencefalite em tilápia do Nilo (SALVADOR et al., 2003; SALVADOR et al., 2005; MIAN et al., 2009; NOBREGA-NETTO et al., 2011; FIGUEIREDO et al., 2012). S. agalactiae é uma das principais espécies bacterianas do gênero Streptococcus. Único representante do grupo B de Lancefield, tem importância médica e veterinária, e tem sido caracterizado como agente etiológico de doenças desde 1887 (BISHARAT et al., 2004). Esta bactéria é β-hemolítica em ágar sangue e apresentam-se como células esféricas ou ovoides, Gram-positivo, catalase-negativo que crescem em cadeia em meio líquido e algumas linhagens podem produzir pigmento laranja ou amarelo. Bactéria imóvel, não formadora de esporos, anaeróbia facultativa e produz ácido lático como produto final do metabolismo de carboidratos (NIZET, 2002; PEREIRA et al., 2013). S. agalactiae é um micro-organismo amplamente encontrado colonizando o trato digestório e genitourinário de seres humanos e animais (MAIONE et al., 2005). Esta bactéria também pode ser encontrada na glândula mamária de ruminantes, ocasionando mastite (BROCHET et al., 2006). Diferenças entre isolados de seres humanos e animais já foram descritas, sendo que a maioria das linhagens de seres humanos é hemolítica e não utiliza a lactose como fonte de energia. Porém, já foi descrito que linhagens isoladas de bovinos não produzem hemólise em ágar sangue e utilizam a lactose (YILDIRIM et al., 2002). Adicionalmente, linhagens isoladas de peixes também já foram descritas como não hemolíticas (FIGUEIREDO et al., 2006). S. agalactiae acomete principalmente seres humanos, bovinos e peixes, mas pode também estar associada a casos de doenças em várias outras espécies, como por exemplo: aves, camelos, caninos, equinos, felinos, anfíbios, hamster, camundongos, primatas, golfinhos, crocodilos, camarões, dentre outros (KEEFE, 1997; BERRIDGE et al., 2001; EVANS et al., 2002; MAIONE et al., 2005; EVANS et al., 2006; BISHOP et al., 2007; HASSON et al., 2009). Esta bactéria é considerada a principal causadora de septicemia e meningite em neonatos humanos, responsável por morbidade em gestantes e idosos, além de causar óbito em adultos imunocomprometidos (MAIONE et al., 2005; JOHRI et al., 2006). Adicionalmente, quadros de mastite clínica e subclínica em bovinos são ocasionadas por esse patógeno, sendo impactante para a bovinocultura leiteira (KEEFE, 1997). S. agalactiae tem se destacado como patógeno emergente para a piscicultura mundial, sendo relatados surtos no Japão, China, Vietnã, Tailândia, Kuwait, Irã, Israel, Egito, Austrália, Malásia, Indonésia, Filipinas, Irlanda, Estados Unidos, Honduras, Costa Rica, Colômbia e Brasil (AMAL et al., 2012; BOWATER et al., 2012; ELDAR et 16 al., 1994; EVANS et al., 2002; EVANS et al., 2008; HERNANDEZ et al., 2009; MIAN et al., 2009; PLUMB et al., 1974; SUANYUK et al., 2005; YE et al., 2011; RUANE et al., 2013). Taxas elevadas de morbidade e mortalidade são observadas em surtos por S. agalactiae em fazendas de peixes de água doce, marinhos e de ambiente estuarino (EVANS et al., 2002; MIAN et al., 2009). Casos de infecção por S. agalactiae foram descritas em mais de 20 espécies de peixes incluindo dourada (Sparus auratus), tainha (Liza klunzingeri), truta arco-íris (Oncorhyncus mykiss), sereia (Trachinotus blochii), pampo-prateado (Pampus argenteus), garoupa (Epinephelu slanceolatus), “golden shiner” (Notemigonus crysoleucas), menhaden-escamudo (Brevoortia patronus), “gulf killifish” (Fundulus grandis), “ya-fish” (Schizothorax prenanti), “doctor fish” (Garra rufa), “zebrafish” (Danio rerio), “barcoo grunter” (Scortum barcoo) pintado-da-amazônia (Pseudoplatystoma facium x Leiarius marmoratus) e tilápia (Oreochromis spp.) (ROBINSON e MEYER, 1966; PLUMB et al., 1974; RASHEED e PLUMB, 1984; NOGA, 2000; EVANS et al., 2002; DUREMDEZ et al., 2004; SALVADOR et al., 2003; HERNANDEZ et al., 2009; AMAL et al., 2012; BOWATER et al., 2012; GENG et al., 2012; ITSARO et al., 2012; MIAN et al., 2009; PATTERSON et al., 2012; GODOY et al., 2013; LIU et al., 2013; RUANE et al., 2013). No Brasil, o primeiro relato de estreptococose por S. agalactiae em peixes foi em 2003, onde foram identificados surtos da doença em tilapiculturas no norte do Paraná (SALVADOR et al., 2003). Desde então, infecções causadas por S. agalactiae foram relatadas em tilapiculturas nos estados do Paraná, São Paulo, Espírito Santo, Bahia. Minas Gerais e Ceará (FIGUEIREDO et al., 2006; MIAN et al., 2009). Segundo dados da casuística do AQUAVET, surtos de doenças em peixes também já ocorreram nos estados de Santa Catarina, Mato Grosso, Pernambuco, Alagoas e Goiás (Figura 1). S. agalactiae é considerado o principal risco sanitário para criações comerciais de tilápia do Nilo no país. Altas taxas de mortalidade têm sido verificadas em surtos da doença nesta espécie, sendo o aumento da temperatura da água (acima de 27ºC) e manejo intensivo (altas densidades de estocagem) os principais fatores de risco para ocorrência de surtos por este patógeno (MIAN et al., 2009). Medidas de manejo tais como processos de seleção e classificação também têm sido caracterizados como desencadeadores de surtos em tilápias do Nilo cultivadas em tanques-rede. Figura 1. Mapa do Brasil mostrando os estados onde S. agalactiae já foi isolado em peixes 17 A transmissão da infecção por S. agalactiae ocorre por contato direto entre peixe infectado e peixe sadio, e por contato indireto, através da bactéria presente na água, permitindo que a doença se manifeste gradativamente nos diferentes sistemas de produção (KUBITZA, 2000; FIGUEIREDO et al., 2007a). Os casos da infecção por S. agalactiae são comumente observados em peixes com peso corporal a partir de 50 gramas, acometendo principalmente adultos em fase da engorda, com peso médio de 500 gramas (FIGUEIREDO et al., 2007a). A infecção por S. agalactiae causa doença septicêmica, sendo capaz de invadir e multiplicar em diferentes órgãos do peixe acometido. Contudo, acredita-se que o cérebro seja órgão de predileção, por causar meningoencefalite que, consequentemente, culmina em sinais clínicos de natação errática e perda de equilíbrio. Outros sinais que podem ser observados em peixes infectados são: anorexia, melanose, taquipnéia, excitabilidade, rigidez dorsal, corpo levemente curvado, exoftalmia uni ou bilateral, opacidade de córnea uni ou bilateral, hemorragia difusa no tegumento e ascite (KUBITZA, 2000; EVANS et al., 2002; PASNIK et al., 2005 FIGUEIREDO et al., 2007a; MIAN et al.,2009). Internamente podem ser observados: acúmulo de liquido sero-sanguinolento na cavidade celomática, fígado pálido e esplenomegalia (KUBITZA, 2000). Em tilápia, as principais alterações observadas decorrentes da infeção por S. agalactiae são pericardite, epicardite, miocardite, endocardite, meningite e septicemia (CHEN et al., 2007). Recentemente, casos crônicos de estreptococose tem sido reportados, em tilápias do Nilo com presença de nódulos amarelo ou vermelho escuro na musculatura próximo às vértebras. Esse achado clínico sugere que a bactéria seja eliminada do sangue e dos tecidos infectados pelo sistema imune do hospedeiro e que as bactérias remanescentes migrem para a musculatura por ser uma região de resposta imunológica fraca (LI et al., 2013). A antibioticoterapia oral em peixes é um dos principais métodos para controle de infecções por S. agalactiae. No Brasil, os antibióticos a base de florfenicol e oxitetraciclina podem ser utilizados para conduzir uma intervenção terapêutica em surtos dentro de uma piscicultura comercial (PADUA et al., 2012). A administração de florfenicol é efetivo contra diversos tipos de bactérias e possui boa estabilidade na água, porém não há dados avaliando a eficácia deste fármaco contra a infecção por S. agalactiae em tilápia do Nilo (FIGUEIREDO et al., 2007b). O antibiótico a base de Oxitetraciclina é amplamente utilizado em pisciculturas brasileiras e possui eficácia contra bactérias Gram-positivo e Gram-negativo (RIGOS et al., 2003). Em estudos realizados pela equipe do AQUAVET foi avaliada a eficácia terapêutica da oxitetraciclina contra infecção por S. agalactiae. Este antibiótico reduziu significamente a mortalidade de alevinos de tilápia do Nilo que iniciaram a administração do fármaco 24 horas antes da infecção, uma e 24 horas pós-infecção quando comparados ao grupo que não utilizou o antibiótico. Apesar da redução da mortalidade, foi possível reisolar a bactéria em amostras de cérebro e rim de peixes aparentemente saudáveis dos grupos tratados com o antibiótico, o que caracteriza estado de portador da infecção. Em outras palavras, o antibiótico pode não controlar a infecção e a bactéria pode permanecer viável nos diferentes órgãos do peixe, resultando na manutenção do patógeno numa piscicultura (FARIA, et al., 2014). Adicionalmente, como a anorexia é uma das primeiras alterações fisiológicas induzidas pela infecção, a antibioticoterapia é limitada, pois, evita a ocorrência da doença em peixes não infectados, elimina a doença nos peixes com quadro inicial de infecção, porém não cura os peixes com sinais clínicos (HEUER et al., 2009). 18 O controle da infecção por S. agalactiae pode ser realizado através da manutenção adequada das condições ambientais, realização de tratamentos táticos com antibióticos, descarte de animais mortos e/ou com sinais clínicos de doença neurológica, arraçoamento adequado e realização de testes laboratoriais para certificar que os peixes estão isentos deste agente bacteriano (KUBITZA, 2000; FIGUEIREDO et al., 2007b). A vacinação é uma alternativa para a prevenção e controle das infecções por Streptococcus nas pisciculturas. Diversas vacinas têm sido desenvolvidas contra diferentes Streptoccocus patogênicos para peixes, sendo que, atualmente, no mundo já existem vacinas comercializadas contra S. iniae e S. agalactiae (SHOEMAKER et al., 2010). No Brasil, foi lançada a vacina bacterina AQUAVAC Strep Sa, pela MSD Saúde Animal, a qual está sendo comercializada desde 2012. Em ensaios experimentais, essa bacterina demonstrou ser segura e capaz de induzir efetiva proteção em tilápia do Nilo desafiadas com S. agalactiae biotipo II (SALVADOR, 2012). Porém, ainda há necessidade de mais estudos sobre as relações entre variabilidade genética, perfil antigênico e capacidade de proteção contra desafio heterólogo induzido por essa vacina. Portanto, esta vacina comercial deve ser testada frente as várias outras amostras de bactérias isoladas no país para melhor verificação da sua efetividade. 2.4. Diagnóstico e Identificação de Streptococcus agalactiae em peixes O diagnóstico e a identificação do agente infeccioso podem ser realizados através da associação de sinais clínicos com os achados laboratoriais. Devido à ampla gama de hospedeiros susceptíveis e sinais clínicos genéricos verificados nos casos de infecções em peixes pelas diferentes espécies do gênero Streptococcus, o diagnóstico laboratorial é indispensável para a determinação do agente etiológico envolvido (MATA et al., 2004; FIGUEIREDO e LEAL, 2012). O diagnóstico de estreptococose por S. agalactiae em peixes é baseado no isolamento e identificação do micro- organismo. Peixes moribundos devem ser coletados e encaminhados vivos ou refrigerados para os laboratórios de diagnóstico (FIGUEIREDO et al., 2007a). Os órgãos de predileção para a coleta de material para a realização de exames bacteriológicos variam de acordo com a doença e bactéria associada ao processo. Em geral, doença causada por S. agalactiae está associada a quadros de septicemia e meningoencefalite, sendo indicados a coleta do sistema nervoso central e órgãos altamente vascularizados ou que desempenham funções imunológicas, como rim, fígado e baço (NOGA, 2000). No laboratório, o diagnóstico pode ser realizado por bacteriologia ou por métodos moleculares (KUBITZA, 2000; FIGUEIREDO et al., 2007a). O diagnóstico da infecção por S. agalactiae, em peixes afetados tipicamente envolve análise bacteriológica com posterior identificação, porém isso requer tempo para definição do diagnóstico, resultando no incremento do potencial para o surto da doença (EVANS et al., 2010; ITSARO et al., 2012). A bacteriologia é realizada a partir do cultivo de órgãos coletados de forma asséptica em meios de cultivo como ágar sangue, ágar BHI (“Brain Heart Infusion”), TSA (Triptona de Soja) e THA (Todd-Hewitt). Após o período de incubação, a identificação primária do agente infeccioso é baseado na avaliação da morfologia das colônias por microscopia óptica (coloração pelo método de Gram), tipo de hemólise, padrão de antígenos capsulares (grupo de Lancifield) e testes bioquímicos (catalase e oxidase, por exemplo) (GLAZUNOVA et al., 2009). A utilização de kits comerciais para identificação fenotípica de Streptococcus agalactiae como o RAPID32 e API 20 Strep apresentam boa aplicabilidade, acurácia na análise e economia do tempo (FIGUEIREDO e LEAL, 2012). Com o desenvolvimento e popularização de técnicas moleculares para 19 identificação de micro-organismos e diagnóstico de doenças, foi possível a realização de reações de PCR para identificação de S. agalactiae com iniciadores espécie-específicos ou universais para genes conservados associadas ao sequenciamento e à análise filogenética (AGNEW e BARNES, 2007). Para que um laboratório de diagnóstico possa identificar adequadamente a bactéria Streptococcus agalactiae é preciso que haja uma combinação dos métodos fenotípicos, como o uso de kits de caracterização bioquímica, prova sorológica para determinação do Grupo Lancefield, e de métodos moleculares que permitam a realização de PCR e o sequenciamento do DNA para a construção de árvores filogenéticas (FIGUEIREDO e LEAL, 2012). 2.5. Métodos não-letais de coleta de amostras para o diagnóstico de doenças infecciosas em peixes O diagnóstico da infecção por Streptococcus agalactiae é baseado no isolamento e identificação da bactéria por métodos fenotípicos e moleculares, sendo o isolamento realizado a partir de amostras de tecidos de peixes doentes após a eutanásia destes (FIGUEIREDO e LEAL, 2012). Porém, a eutanásia de animais para monitoramento sanitário é inviável para realização em larga escala e para a avaliação de reprodutores (CUTRIN et al., 2005), que podem ser fontes de infecção importantes na dinâmica epidemiológica da doença nas pisciculturas. Procedimentos envolvendo métodos não-letais de coleta de amostras e testes microbiológicos e moleculares têm sido utilizados para diagnosticar infecções virais (GAHLAWAT et al., 2004; DRENNAN et al., 2007; CORNWELL et al., 2013) e doenças bacterianas (NOGA et al., 1988; CIPRIANO, et al., 1996; WHITE et al., 1996; ALTINOK et al., 2001) em reprodutores e alevinos de diferentes espécies de peixes. Esses métodos geralmente são usados para o diagnóstico de infecções crônicas e envolvem a coleta de fluidos corporais, produtos de excreção, sangue e outros tecidos como pele, escamas, e nadadeiras (WASKO et al., 2003). Porém muitos patógenos não são encontrados nos fluidos como são nos órgãos internos (NOGA et al., 1988). As vantagens dos métodos não-letais de coleta de amostras para detectar patógenos de peixes incluem benefícios econômicos de não ter que submeter à eutanásia um reprodutor de alto valor zootécnico dentro de um lote, potencial para aumentar o número de amostras para tentar detectar baixos níveis de infecção, habilidade para avaliar a doença em espécies ameaçadas de extinção, permitir a utilização de um mesmo animal em diferentes momentos de coleta e beneficiar o bem-estar animal com a redução do número de peixes submetidos à eutanásia (QUINN e STEVENSON, 2012; CORNWELL et al., 2013). A coleta de amostra é um fator crítico para a acurácia do diagnóstico. Se a amostra não for coletada adequadamente ou se a manipulação desta após a coleta for inapropriada ou não enviada adequadamente ao laboratório de diagnóstico, os resultados dos testes podem não refletir o status de doença do peixe amostrado (ZAINATHAN et al., 2013). Os principais métodos não-letais de coleta de amostras utilizadas para o diagnóstico de doenças infecciosas em peixes envolve punção venosa e biópsias (NOGA et al., 1988; ALTINOK et al., 2001; CORNWELL et al., 2013). A punção venosa é um método comum de coleta de amostra utilizada para realização de testes bioquímicos e hormonais em peixes, inclusive em tilápias do Nilo. Adicionalmente, o sangue obtido por esta forma de coleta de amostras pode ser utilizada para o diagnóstico de doenças e monitoramento da saúde em peixes. A veia 20 caudal é o sítio preferencial para a coleta de sangue (BROWN, 1993). GIRAY et al. (2005) ao avaliarem o sangue para diagnóstico do vírus da anemia infecciosa do salmão usando RT-PCR, verificaram que a amostra obtida por punção venosa foi igualmente sensível quando comparada com as amostras renais obtidos de salmão (Salmo salar) com sinais clínicos ou sem sinais clínicos. LOPEZ-VASQUEZ et al. (2006) utilizando o sangue de truta- marrom (Salmo trutta) em ensaios com nested RT-PCR para o diagnóstico do vírus da septicemia hemorrágica viral, obtiveram maior sensibilidade no método não-letal quando comparado com o diagnóstico a partir de órgãos internos. Para a detecção do vírus da necrose pancreática infecciosa, GAHLAWAT et al. (2004) demonstraram que a utilização de leucócitos a partir do sangue colhido pode ser um método não-letal para portadores dessa enfermidade por ter sido mais sensível que o método letal por coleta de amostra renal (padrão de diagnóstico deste vírus) em alabote-do-Atlântico (Hippoglossus hippoglossus) infectados experimentalmente. LOPEZ-JIMENA et al. (2010), a partir de amostras de sangue obtidas de pargo-legítimo (Pagrus pagrus) e pargo-sêmola (Pagrus auriga) obtiveram diagnóstico negativo em todas as amostras avaliadas por RT-PCR, porém, por nested-PCR e hibridização subsequente com dot-blot foi capaz de detectar o vírus da necrose pancreática infecciosa em 100% das amostras de pargo- sêmola e 94,4% em pargo-legítimo. O diagnóstico de doenças bacterianas a partir de amostras de sangue foi estudado por diferentes autores. ALTINOK et al. (2001) usaram sangue de 42 trutas arco-íris infectadas naturalmente e experimentalmente para detectar a presença de Yersinia ruckeri por PCR. A metodologia utilizada detectou nove indivíduos positivos. A PCR realizada a partir da amostra de sangue foi capaz de detectar mais peixes infectados que o isolamento em meio de cultivo. EVANS et al. (2002) realizaram testes bacteriológicos a partir de amostras de cérebro, olho, rim cranial, intestino e sangue obtidas de tainhas (Liza klunzingeri) coletadas na baia do Kuwait e dourada (Sparus auratus) cultivada em tanques-rede. A frequência de detecção de S. agalactiae observada para a amostra de sangue foi de 71% em tainhas e 0% em dourada, evidenciando, dessa forma, a septicemia bacteriana em tainhas que apresentavam doença clínica. A biópsia é um método não-letal de coleta de amostras que consiste na remoção de uma amostra de células e/ou tecidos dos peixes, sendo esse material utilizado para análise microscópica e para utilização em métodos de diagnóstico de doenças infecciosas (NOGA, 2000). Alguns patógenos não são detectados tão facilmente no sangue quanto são nos órgãos internos, sendo isso relatado para patógenos bacterianos de peixes em que o rim é usualmente o órgão utilizado para o isolamento. O rim de peixes é um longo órgão localizado ventralmente à coluna vertebral, é composto por tecido hematopoiético, excretório e linfoide. Possui consistência similar à medula óssea de mamíferos. Para obtenção de tecido renal por método não-letal é necessário a realização de bíópsia aspirativa com agulha fina (NOGA et al., 1988; NOGA, 2000). A biópsia de rim cranial foi utilizada para a detecção de patógenos bacterianos causadores de doenças em peixes. NOGA et al. (1988) encontraram sensibilidade e especificidade de 88% e 93%, respectivamente, no exame bacteriológico para a detecção de Yersinia ruckeri em trutas arco-íris a partir de amostras de biopsia de rim cranial. WHITE et al. (1996), para determinar o status de infecção por Renibacterium salmoninarum em reprodutores de trutas cultivados em raceways, fizeram uso de coleta de amostra por biópsia de rim cranial. A metodologia foi 21 capaz de detectar quatro peixes positivos para a infecção em dez peixes amostrados. As amostras obtidas por estes autores foram adequadas para a realização de diagnóstico pelas técnicas de imunoflourescência indireta, imuno-histoquímica e exame histopatológico. O diagnóstico de infecção viral a partir de amostras obtidas por biópsia de rim cranial foi objetivo de estudo realizado por KORSNES et al. (2009). Estes autores determinaram que a biópsia de rim cranial é o melhor método para detectar a persistência da infecção de betanodavírus por qRT-PCR em alabote-do-atlântico (Hippoglossus hippoglossus). Devido à grande variação anatômica entre as diferentes espécies de peixes, uma metodologia de biópsia de acordo com a espécie se torna necessário para a obtenção de tecido a ser utilizado em análises microscópicas e métodos de diagnósticos de enfermidades em peixes, além de causar uma injúria mínima e evitar infecção pós-coleta (TRESISE et al., 2013). Não existe descrição, na literatura científica, de coleta de amostras em tilápia do Nilo por biópsia. 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1. Delineamento Experimental Os ensaios experimentais foram realizados em duas etapas. A primeira etapa consistiu na padronização dos métodos de coleta de amostras (Figura 2). Após comprovada a viabilidade e segurança das técnicas de coletas de amostras em tilápia do Nilo, foi realizada a segunda etapa, mediante infecção experimental, para testar a eficiência dos métodos de coleta no diagnóstico da infecção por S. agalactiae utilizando técnicas bacteriológicas e moleculares (Figura 3). Figura 2. Fluxograma de execução do experimento de padronização dos métodos não-letais de coleta de amostras em Tilápia do Nilo. Resultados Avaliação Diária Período Experimental Coleta de Amostras Grupos Experimentais Etapa 1 Padronização de Coleta de Amostras Grupo Manipulado Biópsia Aspirativa de Rim Cranial e Punção Venosa 7 dias Sobrevivência, Apetite e Sinais Clínicos Técnicas não-letais viáveis e seguras Sim Etapa 2 Não Alteração do método de coleta Grupo Controle 22 Figura 3. Fluxograma de execução do experimento de infecção experimental para a detecção de Streptococcus agalactiae em tilápia do Nilo por bacteriologia e PCR espécie-específica. 3.2. Animais experimentais Para a realização do experimento, um lote constituído de 100 juvenis de tilápia do Nilo com peso médio de 100 gramas foram adquiridos de pisciculturas comerciais e mantidos sob condições laboratoriais durante 20 dias para adaptação antes do experimento. Os peixes foram alojados em aquários de vidro de 57 L, com fluxo contínuo e taxa de renovação de 0,5 L de água/h. Os peixes foram mantidos sob fotoperíodo de 12:12h luz/escuridão e a temperatura da água de 28°C. Os peixes foram alimentados duas vezes ao dia com ração comercial com 32% de proteína bruta, na quantidade correspondente a 2% do peso vivo/dia. Uma amostra de cinco peixes do lote, coletada de forma aleatória, foi submetida a exame bacteriológico e PCR espécie-específica (MATA et al., 2004) para determinar a existência de infecção prévia por S. agalactiae. Adicionalmente foi realizado exame bacteriológico e parasitológico para garantir a higidez do lote frente a outros micro-organismos patogênicos para peixes como Flavobacterium columnare, Aeromonas hydrophila, Francisella noatunensis subsp. orientalis, Ichthyophthirius multifillis, Trichodina sp. e Epistylis sp. Antes de qualquer manipulação, os peixes foram sedados por imersão em solução de benzocaína na dose de 10 mg/mL de água. Para o exame bacteriológico fragmentos de cérebro e rim foram coletados de forma asséptica, plaqueados em ágar sangue (triptona de soja com sangue equino a 5%), ágar Hsu-Shotts modificado (MHS) e ágar cistina coração suplementada com solução de hemoglobina bovina (CHAH) e incubados a 28ºC por 48 horas. Para o exame parasitológico foram realizadas a coleta de muco de superfície e de brânquia e espalhados em lâmina de vidro em camada fina para observação de parasitos ao microscópio óptico. 3.3. Padronização de métodos não-letais de coleta de amostras Para a realização da primeira etapa do experimento, foram avaliadas as coletas de amostras de tecido renal e sangue por métodos não-letais como biópsia aspirativa e punção venosa. Para determinar a viabilidade, segurança e sobrevivência dos peixes aos métodos submetidos, adultos de tilápia do Nilo com peso médio de 150,1 ± Métodos de Diagnóstico Coleta de Amostras Período Experimental Grupos Experimentais Etapa 2 Infecção Experimental Grupo Desafiado 15 dias Biópsia Aspirativa de Rim Cranial e Punção Venosa Bacteriologia e PCR Grupo Controle 23 32,3 gramas foram selecionados após o período de adaptação. A alimentação foi suspensa 24 horas antes da realização dos ensaios experimentais. Para a realização do ensaio experimental foram utilizados 40 peixes, sendo 30 peixes utilizados para a coleta de amostras por métodos não-letais e 10 peixes para grupo controle. Todos os peixes foram sedados por imersão em solução de benzocaína (10 mg/mL) e manipulados quando observado que estes apresentavam apenas movimentos operculares. Os peixes foram submetidos aos métodos de coleta de amostra por biópsia aspirativa de rim cranial e punção venosa, como descrito no item 3.3.1, exceto grupo controle. Os peixes foram monitorados (inspeção dos aquários e fornecimento de ração) três vezes ao dia por um período de sete dias pós-coleta para avaliação da sobrevivência aos métodos de coletas submetidos, apetite e/ou sinais clínicos. Todos os procedimentos desta etapa foram realizados de acordo com as normas da Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA-UFMG). 3.3.1. Métodos não-letais de coleta de amostras 3.3.1.1. Biópsia Aspirativa do Rim Cranial A metodologia para biópsia aspirativa do rim cranial de tilápia foi adaptada do procedimento descrito por NOGA et al. (1988) para salmonídeos. Os peixes foram capturados, sedados com benzocaína e contidos. A partir da cavidade opercular, caudalmente ao último arco branquial, uma seringa de 1 mL e agulha 22G foi introduzida no sentido ventro-dorsal e, em seguida, direcionada crânio-caudalmente com angulação aproximada de 45°, até atingir o parênquima do rim cranial, localizado ventralmente à coluna vertebral (Figura 4). Foi coletado aproximadamente 0,2 mL de tecido renal. O conteúdo de parênquima renal de cada aspirado foi confirmado microscopicamente por esfregaço em lâmina de vidro e corado por Panótico Rápido. Figura 4. Procedimento de coleta de amostra de rim cranial por biopsia aspirativa em tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus). 3.3.1.2. Punção Venosa A metodologia de coleta de sangue de tilápias foi realizada de acordo com o procedimento descrito por ALTINOK et al. (2001) para trutas. Com o peixe contido, amostras de sangue foram coletadas por punção venosa da veia caudal (Figura 5), em volume aproximado de 0,5 mL, com seringa descartável de 1 mL e armazenadas em tubos de 1,5 mL, sem anticoagulante. Figura 5. Procedimento de coleta de sangue por punção venosa da veia caudal em tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus). 24 3.4. Avaliação da eficiência dos métodos letais e não-letais de coleta para a detecção de Streptococcus agalactiae em tilápia do Nilo. 3.4.1. Bactéria e condições de cultivo A amostra Streptococcus agalactiae SA 20- 06 foi utilizada para o ensaio de infecção experimental. A amostra foi previamente isolada de caso clínico de estreptococose em tilápias do Nilo e identificada por métodos fenotípicos e moleculares (MIAN et al., 2009). Esta amostra tem sido estudada sobre diversos aspectos de virulência, possui a DL50 previamente determinada, bem como a sua sequência genômica completa (MIAN et al., 2009; GODOY et al., 2013; PEREIRA et al., 2013). Esta amostra pertence ao banco de bactérias do AQUAVET- Laboratório de Doenças de Animais Aquáticos (EV/UFMG) e estava armazenada a -80ºC até a sua utilização. A amostra SA 20-06 foi descongelada e cultivada em ágar sangue de ovino 5% por 48h a 28°C. Posteriormente, uma colônia foi inoculada em caldo BHI (“Brain Heart Infusion”), incubada a 28ºC sob agitação (100 rpm) por 18 horas. O inóculo foi ajustado a uma absorbância de 0,053 a densidade óptica de 600 nm e a contagem bacteriana foi realizada através do método de semeadura por espalhamento, de acordo com o descrito por HARTMAN (2011). O inóculo correspondeu a 1,7 x 108 UFC/mL. 3.4.2. Infecção experimental Os peixes foram infectados experimentalmente para avaliar a capacidade de diagnóstico da infecção por S. agalactiae em tilápias do Nilo a partir de amostras coletadas por métodos não-letais. Foram testadas a associação de métodos não-letais de coleta de amostras e testes microbiológicos e moleculares. Para isso, tilápias do Nilo com peso médio de 170,3 ± 36,77 gramas foram selecionados após o término da primeira etapa do experimento (item 3.3). Para a realização deste ensaio experimental foram utilizados 50 peixes, sendo 45 peixes desafiados com a bactéria e 5 peixes para grupo controle. Os peixes foram sedados por imersão em solução de benzocaína (10mg/L) e manipulados quando observado que estes apresentavam apenas movimentos operculares. O desafio foi realizado por via intraperitoneal, de acordo com o procedimento descrito por MIAN et al. (2009), com 0,1 mL de inóculo bacteriano em caldo BHI, na dose final de 1,7 x 106 UFC/peixe. No grupo controle foi administrado 0,1 mL de BHI estéril. Os peixes desafiados foram monitorados (inspeção dos aquários e fornecimento de ração) três vezes ao dia por um período de 15 dias para avaliação da sobrevivência, apetite e/ou visualização de sinais clínicos. Foram realizadas as coletas de rim cranial e sangue por biópsia aspirativa e punção venosa em peixes moribundos (peixes apenas com movimentos operculares e em decúbito lateral), à medida que estes desenvolviam doença clínica, e ao final do experimento nos peixes desafiados remanescentes e no grupo controle. Posteriormente a coleta de sangue e aspirado renal, os peixes moribundos e/ou remanescentes foram submetidos à eutanásia por imersão em solução de benzocaína (250mg/L) e amostras de tecido cerebral e de rim cranial foram coletados de cada peixe após a necropsia e utilizadas para avaliar a eficiência dos métodos microbiológicos e moleculares, comparando a eficácia do diagnóstico de estreptococose a partir de amostras obtidas por métodos letais e não- letais. Todos os procedimentos desta etapa foram realizados de acordo com as normas da Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA-UFMG). 3.4.3. Diagnóstico Para o diagnóstico de infecções por Streptococcus agalactiae, as amostras 25 coletadas foram utilizadas no exame bacteriológico e PCR. O exame bacteriológico foi realizado imediatamente após a coleta, assim como, as amostras para a realização da PCR que foram submetidas imediatamente à extração do DNA bacteriano. 3.4.3.1. Exame bacteriológico Para o diagnóstico bacteriológico fragmentos de cérebro e rim foram coletados de maneira asséptica, plaqueados em ágar sangue (triptona de soja com sangue equino a 5%) e incubados a 28ºC por 48 horas. As amostras coletadas por métodos não-letais foram inoculadas em ágar sangue (5% sangue ovino) e incubadas a 28ºC por 48 horas. Os isolados foram caracterizados sorologicamente através do kit Slidex Latex Agglutination (BioMerieux, França), e confirmados por PCR espécie-específica. 3.4.3.2. PCR espécie-específica 3.4.3.2.1. Extração de DNA Das amostras bacterianas obtidas por cultivo em ágar sangue, por métodos não-letais e letais, foram coletadas colônias e diluídas em 200 µL de solução de lise (20mg/ml lisozima; 20 mM Tris-HCl, pH 8.0; 2 mM EDTA e 1.2% Triton X-100) e incubadas overnight. O DNA bacteriano foi extraído utilizando o kit para extração de tecidos e sangue “DNeasy Tissue and Blood” (Qiagen, EUA), de acordo com as recomendações do fabricante. O DNA bacteriano dos tecidos coletadas por métodos não-letais e letais durante o experimento foi extraído a partir da utilização de dois kits: “DNeasy Tissue and Blood” (Qiagen, EUA) e o extrator automático de tecidos e sangue “Maxwell® 16 Tissue DNA Purification” (Promega, EUA), ambos de acordo com as recomendações do fabricante. A quantidade de DNA extraído foi quantificado por espectrofotometria com Nanodrop® (Thermo Scientific). As amostras de DNA foram armazenadas a - 20ºC até a sua utilização. 3.4.3.2.2. PCR O diagnóstico por PCR foi realizado de acordo com o descrito por MATA et al. (2004), com algumas modificações. A reação foi realizada com o Kit Hot Start Taq Polymerase (Qiagen, EUA) e consistiu de 1x PCR buffer (10x), 0,25 mM de dNTPs, 2,0 mM de MgCl2, 1,0 μM dos primers Sdi61 (AGGAAACCTGCCATTTGCG) e Sdi252 (CAATCTATTTCTAGATCGTGG) e, 1,5 U Taq polimerase para um volume final de 25 μL de reação. Foram utilizados 100 ng de DNA template (2 μL). A amplificação foi realizada através do processo descrito a seguir: 1 ciclo a 94°C por 15 minutos; 25 ciclos - 94°C por 1 minuto, 55°C por 1 minuto e 72°C por 90 segundos; e a extensão final a 72°C por 5 minutos. A PCR foi realizada em termociclador Veriti 96-well (Applied Biosystems, EUA). Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,5%, revelados com brometo de etídeo e imagens obtidas com o sistema de fotodocumentação L-PIX (Loccus Biotecnologia, Brasil). 3.4.4. Análise estatística Sensibilidade e especificidade foram calculados para os diferentes métodos de diagnóstico utilizando a bacteriologia de cérebro como padrão (LALKHEN e McCLUSKEY, 2008). As diferenças nas sensibilidades clínicas dos testes foram avaliadas pelo teste de McNemar, sendo considerado significativo p < 0,05 (CLEOPHAS e ZWINDERMAN, 2011). A mensuração da congruência entre os diferentes testes foram avaliados pelo método Cohen Kappa, tendo como interpretação do valor obtido a seguinte relação: 0,00 a 0,20 indica fraca congruência; 0,21 a 0,40 indica congruência razoável; 0,41 a 0,60 indica moderada congruência; 0,61 a 0,80 indica boa congruência; e de 0,81 a 1,00 indica excelente congruência (VIERA e 26 GARRETT, 2005). As análises foram realizadas usando software R (R Foundation for Statistical Computing, Áustria). As análises estatísticas foram realizadas apenas nos peixes desafiados com a bactéria S. agalactiae. 4. RESULTADOS 4.1. Viabilidade, segurança e sobrevivência dos peixes submetidos aos métodos não-letais de coleta de amostras Os peixes adquiridos de piscicultura comercial para a realização do experimento adaptaram com sucesso às condições laboratoriais submetidas. Não houve mortalidade de peixes durante o período de adaptação e não foram isoladas bactérias patogênicas nas tilápias, assim como, nenhum parasito externo foi observado à microscopia óptica. Os métodos não-letais de coleta de amostras em tilápia do Nilo foram padronizados com sucesso. Não houve mortalidade dos peixes submetidos aos métodos não-letais de coleta de amostras. Foi observado que após a biópsia aspirativa de rim cranial os peixes apresentavam uma zona de pigmentação escura no corpo (Figura 6) próximo ao local de coleta da amostra, que desaparecia em torno de 12 horas pós-coleta. Durante o monitoramento destes peixes, observou-se que minutos após a coleta de amostras os mesmos se encontravam letárgicos, não alterando este estado com o oferecimento de ração. Progressivamente, num período entre sete e 24 horas após a coleta, todos os peixes apresentaram apetite normal, semelhante ao grupo controle, mantendo a normorexia até o final do período de avaliação experimental. Nenhum peixe mostrou sinal visível de infecção no local onde foi realizada a coleta de amostras por biópsia aspirativa ou punção venosa. Adicionalmente, todas as amostras obtidas por biópsia aspirativa foram confirmadas por microscopia a presença de tecido renal (Figura 7). Figura 6. Tilápia do Nilo após ser submetida a biópsia aspirativa de rim cranial. Área de hiperpigmentação observada no local da coleta de amostra (seta). Figura 7. Esfregaço de aspirado de rim cranial corado por panótico rápido e visualizado a 40x. Seta branca. Eritroblasto; Seta azul. Pró-eritrócito; Seta vermelha. Melanomacrófago. 4.2. Eficácia dos métodos não-letais de coleta de amostras para o diagnóstico da infecção por S. agalactiae em tilápias do Nilo 4.2.1. Infecção experimental Os peixes infectados experimentalmente com S. agalactiae começaram a apresentar sinal clínico cerca de 20 horas pós-infecção. Nos dois primeiros dias pós-infecção foram observados sete peixes moribundos, dos 45 peixes infectados com a bactéria, dos quais 27 foram realizadas as coletas de amostras por métodos não-letais (rim cranial e sangue) e letais (cérebro e rim cranial). Estes peixes apresentaram natação errática seguida por paralisia, com movimentos operculares lentos. Quadro semelhante foi observado no sexto dia pós-infecção em um peixe, que além dos sinais clínicos supracitados também foi possível observar ascite e hemorragia de nadadeira peitoral (Figura 8). Apenas dois peixes foram encontrados mortos durante o período experimental de 15 dias, não sendo possível a realização da coleta de amostras de forma não-letal, excluindo assim estes animais das análises estatísticas. Os demais peixes sobreviveram até o final da avaliação, sendo observado que quatro peixes apresentaram sinais clínicos brandos da doença e 31 peixes estavam aparentemente hígidos. De maneira geral, os sinais clínicos observados foram: anorexia, letargia, melanose, opacidade de córnea uni e bilateral, ascite, perda de equilíbrio, movimentos bucais acelerados, hemorragia de nadadeiras, natação errática e paralisia (Figura 8). Nenhum sinal clínico foi observado no grupo controle. Figura 8. Principais sinais clínicos observados em tilápias do Nilo infectadas experimentalmente com S. agalactiae. A. Peixe com ascite e nadadeira hemorrágica; B. Peixes no fundo do aquário e um com opacidade de córnea (seta); C. Peixe com perda de equilíbrio; D. peixe com paralisia bucal. B D A C 28 Os resultados da bacteriologia e PCR espécie-específica obtidos durante a realização do experimento estão apresentados na Tabela 1. Os métodos de diagnóstico foram capazes de detectar S. agalactiae em tilápia do Nilo com sinais clínicos, principalmente moribundos (marcados com asterisco na Tabela 1), e sem sinais clínicos (Tabela 1). O reisolamento e a detecção da bactéria por biologia molecular em amostras de cérebro, rim cranial (coletado por método letal e biópsia aspirativa) e sangue de peixes aparentemente saudáveis proporcionou a caracterização de peixes em estado de portador da infecção. Um total de 12 peixes foram diagnosticados como portadores da infecção por S. agalactiae (Tabela 1). Não houve detecção da bactéria em nenhum peixe do grupo controle submetido aos métodos bacteriológicos e moleculares. 4.2.2. Sensibilidade clínica dos diferentes métodos de diagnóstico 4.2.2.1. Sensibilidade e especificidade relativas das técnicas de diagnóstico A sensibilidade e especificidade relativas calculadas para os diferentes métodos de diagnóstico a partir de amostras obtidas por métodos letais e não-letais estão presentes na Tabela 2. O método mais acurado para a detecção de S. agalactiae foi a bacteriologia realizada a partir de amostras letais sendo considerado, portanto, padrão para a realização do cálculo de sensibilidade e especificidade. O segundo método mais sensível foi PCR espécie-específica também com amostras letais (sensibilidade, 85,71%, especificidade 95,45%). As amostras obtidas por métodos não-letais apresentaram sensibilidade mais baixa, quando comparada as amostras letais, sendo a bacteriologia mais acurada (sensibilidade, 57,14%, especificidade 100%) que a PCR (sensibilidade, 38,10%, especificidade 90,91%). Tabela 1. Resultados da bacteriologia e PCR obtidos durante a realização do experimento. Bacteriologia PCR Letal Não- Letal Letal Não- Letal Peixes C R B S C R B S 1* + + + + + + + + 2* + + + + + + + + 3* + + + + + + + + 4* + + + + - - - - 5* + + + - + + - - 6 + + - - + - - - 7 - - - - - - - - 8 - - - - - - - - 9 - - - - - - - - 10 + + + + + - - - 11 - - - - - - - - 12 + + + + - + - - 13 - - - - - - - - 14* + + + + + + + + 15* + + + + + + + + 16* + + + + + + + + 17* + + + + + - - - 18 + + - - - - + - 19 - - - - - - - - 20 + + - - + - - - 21 + + - - + - - - 22 - - - - - - - - 23 - - - - - + - - 24 - - - - - - - - 25 + - - - + - - - 26 - - - - - - - - 27 - - - - - - - - 28 - - - - - - - - 29* + + + + + + + + 30* + - - - + - - - 31 - - - - - - - - 32 - - - - - - - - 33 + - - - + - - - 34* - - - - - - - - 35 - - - - - - - + 36 - - - - - - - + 37 - - - - - - - - 38 - - - - - - - - 39 - - - - - - - - 40 - - - - - - - - 41 - - - - - - - - 42 + - - - + - - - 43 + + - - - - - - 44 - - - - - - - - 45 - - - - - - - - 46 - - - - - - - - 47 - - - - - - - - 48 - - - - - - - - TOTAL 21 17 12 11 17 10 8 9 C: Cérebro R: Rim B: Biópsia Aspirativa de Rim Cranial S: Sangue *: Peixes que apresentaram sinal clínico 29 Tabela 2. Característica de performance da bacteriologia e PCR espécie-específica para a detecção de Streptococcus agalactiae a partir de amostras obtidas por métodos letais e não-letais. Método de Diagnóstico/ Método de coleta de amostra % Sensibilidade % Especificidade Bacteriologia/Letal 100 100 Bacteriologia/Não-letal 57,14 100 PCR/Letal 85,71 95,45 PCR/Não-Letal 38,10 90,91 4.2.2.2. Bacteriologia A frequência de detecção S. agalactiae por bacteriologia obtidos para as diferentes amostras coletadas estão apresentados na Tabela 3. Todos os isolados obtidos aglutinaram quando testados com o kit Slidex Latex Agglutination demonstrando que os isolados eram Streptococcus do grupo B de Lancifield. Adicionalmente, todos os isolados foram confirmados como S. agalactiae através de PCR espécie- específica. A frequência de detecção nas amostras de cérebro foi significativamente maior que as demais obtidas (Tabela 3). Não houve diferença estatisticamente significativa entre as amostras de cérebro e rim (coletada por método letal) (p = 0,1336), porém houve diferença estatística entre cérebro e as demais amostras coletadas por método não-letal (p < 0,05) para a detecção do patógeno (Tabela 4). Foi observada excelente congruência para a detecção da doença entre a amostra de cérebro e rim (obtidas por método letal) por bacteriologia. A congruência foi moderada entre a amostra de cérebro com as amostras obtidas por métodos não-letais (aspirado renal e sangue) (Tabela 4). Não houve diferença estatisticamente significativa entre as amostras de rim cranial obtido tanto por método letal quanto coletada de forma não-letal (p = 0,0736) porém houve diferença estatística entre rim cranial (coleta letal) e sangue (p = 0,0412) para a detecção da bactéria por bacteriologia (Tabela 5). A congruência entre as amostras de tecido renal obtida por método letal com ambas amostras obtidas por métodos não-letais (aspirado renal e sangue) para a detecção de S. agalactiae foi boa (Tabela 5). Não houve diferença estatisticamente significativa entre aspirado renal e sangue (p = 1) para detecção por bacteriologia (Tabela 6). O aspirado renal e sangue apresentaram excelente congruência entre si para a detecção de S. agalactiae (Tabela 6). O diagnóstico de S. agalactiae por bacteriologia em peixes moribundos e com sinais clínicos brandos após infecção experimental estão presentes na Tabela 1. Os isolados obtidos a partir das amostras de cérebro, rim (coleta letal), aspirado renal e sangue de peixes moribundos e com sinais clínicos brandos demonstraram 11 (91,6%), 10 (83,3%), 10 (83,3%) e 9 (75%) peixes positivos no diagnóstico por bacteriologia. Não houve diferença estatisticamente significativa entre as amostras para a detecção do patógeno por bacteriologia em peixes com doença clínica (p > 0,05). O diagnóstico de S. agalactiae por bacteriologia em peixes portadores da infecção após desafio experimental estão presentes na Tabela 1. Os isolados obtidos de cérebro e rim (coleta letal) em peixes sem sinais clínicos demonstraram que 10 (32,2%) e 7 (22,6%) eram positivos para a infecção por S. agalactiae. Já os isolados obtidos de aspirado renal e sangue, nestes peixes, demonstraram que 2 (6,4%) e 2 (6,4%) peixes eram positivos para o patógeno quando detectados por bacteriologia respectivamente. Houve diferença estatisticamente significativa entre as 30 amostras obtidas de forma letal e as coletadas de forma não-letal (p < 0,05) para a detecção de S. agalactiae por bacteriologia em peixes portadores da infecção. Tabela 3. Isolamento e detecção de Streptococcus agalactiae em tilápia do Nilo infectadas experimentalmente a partir de diferentes tecidos coletados e diagnosticado por bacteriologia e PCR. Tabela 4. Comparação de tecido cerebral com as amostras de rim (obtidas por método letal e não- letal) e sangue em tilápia do Nilo infectadas experimentalmente com S. agalactiae e detectadas por bacteriologia. Tabela 5. Comparação do tecido renal, obtido por método letal, com amostras obtidas por métodos não-letais em tilápias do Nilo infectadas experimentalmente com S. agalactiae e detectadas por bacteriologia. Rim (letal) McNemar χ2 Kappa Congruência Positivo Negativo Total (valor de p) Aspirado Renal Positivo Negativo Total 12 5 17 0 26 26 12 31 43 5 (0,0736) 0,74 Boa Sangue Positivo Negativo Total 11 6 17 0 26 26 11 32 43 6 (0,0412) 0,69 Boa Nº de amostras detectadas positivas/testadas Frequência Absoluta de Positivos (%) Bacteriologia Cérebro 21/43 48,8 Rim Cranial 17/43 39,5 Aspirado Renal 12/43 27,9 Sangue 11/43 25,5 PCR Cérebro 17/43 39,5 Rim Cranial 10/43 23,2 Aspirado Renal 8/43 18,6 Sangue 9/43 20,9 Cérebro McNemar χ2 Kappa Congruência Positivo Negativo Total (valor de p) Rim Positivo Negativo Total 17 4 21 0 22 22 17 26 43 4 (0,1336) 0,81 Excelente Aspirado Renal Positivo Negativo Total 12 9 21 0 22 22 12 31 43 9 (0.0076) 0,58 Moderada Sangue Positivo Negativo Total 11 10 21 0 22 22 11 32 43 10 (0,0044) 0,53 Moderada 31 Tabela 6. Comparação das amostras obtidas por métodos não-letais em tilápias do Nilo infectadas experimentalmente com S. agalactiae e detectadas por bacteriologia. 4.2.2.3. PCR A extração de DNA dos tecidos coletados de forma letal e não-letal foram realizados de acordo com os protocolos estipulados pelos fabricantes dos kits “DNeasy Tissue and Blood” (Qiagen, EUA) e “Maxwell® 16 Tissue DNA Purification” (Promega, EUA). Porém a detecção de S. agalactiae por PCR espécie-específica foi superior a partir do DNA extraído no extrator automático. Portanto, os resultados demonstrados neste presente estudo correspondem a detecção do patógeno nos tecidos obtidos do experimento e extraídos com “Maxwell® 16 Tissue DNA Purification”. Os resultados da frequência de detecção de S. agalactiae por PCR espécie-específica obtidos durante a realização do experimento são apresentados na Tabela 3. Não houve diferença estatisticamente significativa entre cérebro e rim (coleta letal) para a detecção do patógeno por PCR (p = 0,0704). Houve diferença estatística entre cérebro e as amostras coletadas de forma não letal (p < 0,05). A congruência entre as amostras de cérebro e rim (coleta letal) e entre cérebro e aspirado renal foi moderada. Já a congruência entre cérebro e sangue foi razoável (Tabela 7). Não houve diferença estatisticamente significativa entre as amostras de tecido renal obtidas por método letal e não-letal (p = 0,61) e, entre tecido renal (coleta letal) e sangue (p = 1), para a detecção de S. agalactiae por PCR espécie-específica. Ambos testes apresentaram boa congruência entre si (Tabela 8). Não houve diferença estatisticamente significativa entre as amostras coletadas por métodos não-letais (p = 0,56) para detecção por PCR espécie- específica. As amostras de aspirado renal e sangue apresentaram boa congruência entre si (Tabela 9). O diagnóstico de S. agalactiae por PCR em peixes moribundos e com sinais clínicos brandos após infecção experimental estão presentes na Tabela 1. A PCR foi capaz de detectar 10 (83,3%) e 8 (66,6%) peixes positivos a partir de amostras de cérebro e rim (coleta letal), respectivamente, de peixes moribundos e com sinais clínicos brandos. A partir de amostras de aspirado renal e sangue de peixes com doença clínica, a PCR detectou 7 (58,3%) peixes positivos em cada amostra. Não houve diferença estatisticamente significativa entre as amostras para a detecção do patógeno por PCR espécie- específica em peixes com doença clínica (p > 0,05). O diagnóstico de S. agalactiae por PCR em peixes portadores da infecção após desafio experimental estão presentes na Tabela 1. A PCR foi capaz de detectar 7 (22,6%) e 2 (6,4%) peixes positivos a partir de amostras de cérebro e rim (coleta letal), respectivamente, de peixes sem sinais clínicos. A partir de amostras de aspirado renal e sangue de peixes sem sinais clínicos, a PCR detectou 1 (3,2%) e 2 (6,4%) peixes positivos respectivamente. Houve diferença estatisticamente significativa entre cérebro e as demais amostras (rim, aspirado renal e sangue) para a detecção do patógeno por PCR em peixes aparentemente hígidos porém portadores da infecção (p < 0,05). Aspirado Renal McNemar χ2 Kappa Congruência Positivo Negativo Total (valor de p) Sangue Positivo Negativo Total 11 1 12 0 31 31 11 32 43 1 (1,0000) 0,94 Excelente 32 Tabela 7. Comparação de tecido cerebral com as amostras de rim (obtidas por método letal e não- letal) e sangue em tilápia do Nilo infectadas experimentalmente com S. agalactiae e detectadas por PCR espécie-específica. Tabela 8. Comparação do tecido renal, obtido por método letal, com amostras obtidas por métodos não-letais em tilápias do Nilo infectadas experimentalmente com S. agalactiae e detectadas por PCR espécie-específica. Rim (letal) McNemar χ2 (valor de p) Kappa Congruência Positivo Negativo Total Aspirado Renal Positivo 7 1 8 1 Negativo 3 32 35 (0,6171) 0,72 Boa Total 10 33 43 Sangue Positivo 7 2 9 0,20 Negativo 3 31 34 (1,0000) 0,66 Boa Total 10 33 43 Tabela 9. Comparação das amostras obtidas por métodos não-letais em tilápias do Nilo infectadas experimentalmente com S. agalactiae e detectadas por PCR espécie-específica. 4.2.2.4. Bacteriologia X PCR A frequência de diagnóstico positivo a partir de amostras colhidas por métodos letais e não-letais e avaliadas por PCR espécie- específica, foi significamente menor quando comparada a bacteriologia (Tabela 3). Não houve diferença estatisticamente significativa entre os métodos de diagnóstico para a detecção de S. agalactiae a partir de amostras de cérebro (p = 0,1336), porém houve diferença estatística entre bacteriologia de cérebro e PCR das outras amostras obtidas no experimento (rim, aspirado renal e sangue) para o diagnóstico de S. agalactiae (p < 0,005). Foi observado uma excelente congruência entre bacteriologia e PCR a partir de amostras de cérebro, porém as demais amostras apresentaram congruência razoável (Tabela 10). Cérebro McNemar χ2 (valor de p) Kappa Congruência Positivo Negativo Total Rim Positivo 8 2 10 4,45 Negativo 9 24 33 (0,0704) 0,42 Moderada Total 17 26 43 Aspirado Renal Positivo 7 1 8 7,36 Negativo 10 25 35 (0,0153) 0,41 Moderada Total 17 26 43 Sangue Positivo 7 2 9 5,33 (0.0433) 0,36 Razoável Negativo 10 24 34 Total 17 26 43 Aspirado Renal McNemar χ2 (valor de p) Kappa Congruência Positivo Negativo Total Sangue Positivo 7 2 9 0,33 Negativo 1 33 34 (0,5637) 0,78 Boa Total 8 35 43 33 Tabela 10. Comparação da bacteriologia de cérebro com as amostras obtidas por método letal e não-letal em tilápia do Nilo infectadas experimentalmente com S. agalactiae e detectadas por PCR espécie-específica. Bacteriologia de Cérebro McNemar χ2 (valor de p) Kappa Congruência Positivo Negativo Total PCR Cérebro Positivo 17 0 17 4 Negativo 4 22 26 (0,1336) 0,81 Excelente Total 21 22 43 PCR Rim Positivo 9 1 10 9,31 Negativo 12 21 33 (0,0055) 0,38 Razoável Total 21 22 43 PCR Aspirado Renal Positivo 8 0 8 13 (0,0008) 0,38 Razoável Negativo 13 22 35 Total 21 22 43 PCR Sangue Positivo 7 2 9 9 (0,0059) 0.25 Razoável Negativo 14 20 34 Total 21 22 43 5. DISCUSSÃO A biópsia aspirativa de rim cranial e a punção venosa demonstraram ser métodos aplicáveis à coleta não-letal de amostras em tilápias do Nilo, destinadas ao diagnóstico microbiológico. Não houve mortalidade nos peixes submetidos a tais procedimentos, nem infecção local após a coleta das amostras, o que demonstra que essas técnicas podem ser usadas para obtenção de tecido renal e sangue de tilápias de forma segura, permitindo a sobrevivência dos peixes após o procedimento. NOGA et al. (1988), ao avaliarem a segurança da coleta de rim cranial por biópsia em trutas, observaram mortalidade em quatro de 150 peixes (2,6%), 24 horas após serem submetidos ao procedimento. WHITE et al. (1996) realizaram a coleta de rim cranial em dez reprodutores de truta arco-íris e neste procedimento, um peixe morreu imediatamente após a coleta e o outro morreu após 7 dias (20% de mortalidade). Portanto, o presente estudo apresentou resultado de mortalidade semelhante ao obtido por NOGA et al. (1988) e foi superior ao obtido por WHITE et al. (1996). Mortalidades podem ser observadas durante a realização da biópsia aspirativa de rim cranial decorrente de contenção inadequada, imperícia e tempo de exposição ao ar. Um peixe contido inadequadamente se debate durante o procedimento, o que gera lesões por traumas e perfurações pela agulha. A imperícia, ou a falta de capacidade específica para a realização da coleta da amostra, pode resultar em lesões da coluna espinhal e/ou nervos adjacentes após a introdução da agulha na tentativa de atingir o parênquima renal. LUZ et al. (2012) testaram diferentes tempos de exposição ao ar em larvas e alevinos de tilápias do Nilo e observaram que houve uma diminuição progressiva de sobrevivência do peixe com o aumento do tempo de exposição submetido. Portanto, ao manipular peixes com objetivo de realizar coleta de amostras, deve-se executar o procedimento em menor tempo de exposição ao ar possível. Dessa forma, é estritamente necessário que haja um treinamento prévio para a execução do procedimento de biópsia visando uma coleta rápida e segura para os peixes. Neste estudo foi observado zona de hiperpigmentação no corpo do peixe, próximo a região submetida à biópsia. Este 34 sinal clínico também foi observado por NOGA et al. (1988) e citado por eles como indicativo de lesão neurológica em trutas. Entretanto, neste estudo, essa zona de hiperpigmentação desapareceu em torno de 12 horas após a coleta da amostra renal e os peixes, neste intervalo de tempo, já começaram a apresentar sinais de apetite. A hiperpigmentação transiente é comum na tilápia do Nilo e está relacionada à resposta adrenérgica ao estresse agudo, resposta imune e inflamatória de injúria local e para diferenciação de hierarquia social (FERNANDES e VOLPATO, 1993; AGIUS e ROBERTS, 2003; GULZAR et al., 2013). Essa mudança da coloração do tegumento da tilápia é basicamente derivada da mobilização intracelular de grânulos de pigmento presentes em cromatóforos, que são células especializadas em sintetizar e armazenar pigmentos, e que estão distribuídos por toda epiderme e derme desta espécie de peixe. A concentração e dispersão do pigmento geralmente é mediado por neurotransmissores e hormônios que modulam a coloração corporal como por exemplo, hormônio concentrador de melanina, hormônio estimulador de alfa- melanócito, melatonina e catecolaminas (OLIVEIRA et al., 1996). A injúria local provocada pelo procedimento de coleta de amostra ativa dois eixos neuroendócrinos: HSC (hipotálamo – sistema nervoso simpático – célula cromafim) que estimula a liberação de catecolaminas pelas células cromafins, presentes no rim cranial de tilápias e HHI (hipotálamo – hipófise – célula inter- renal) que estimula a produção e liberação de cortisol pelas células inter-renais, também presentes no rim cranial de tilápias (OBA et al., 2009). Cortisol e catecolaminas são liberados na corrente sanguínea e iniciam uma série de efeitos secundários nos peixes, através da ativação adrenérgica, principalmente sobre a circulação sanguínea, respiração, osmorregulação e metabolismo (CASTRO e FERNANDES, 2009), como também media a agregação e dispersão de melanóforos no tegumento das tilápias (GULZAR et al., 2013). Portanto, sugere-se que a hiperpigmentação observada no presente estudo após a realização de biópsia aspirativa de rim cranial seja decorrente da resposta adrenérgica ao estresse agudo causado pela captura, hipóxia (decorrente do tempo de exposição ao ar) e à injúria local provocada pelo método de coleta de amostra nos peixes. A letargia observada nos peixes após a realização da coleta de amostra pode ser decorrente do estresse agudo provocado pela manipulação do peixe, que rompeu a homeostase dos animais com o ambiente em que estavam, pela inexistência do efeito redutor de estresse com a utilização do anestésico à base de benzocaína, tempo de exposição ao ar para a coleta de aspirado renal e sangue, como também pelo tempo de retorno da sedação à qual os peixes foram submetidos. Sabe-se que o estresse agudo causado pela manipulação dos peixes resulta num rápido aumento dos níveis de lactato plasmático e muscular, diminui o pH sanguíneo e a concentração de oxigênio no sangue, eleva a glicemia e a concentração de amônia plasmática (OBA et al., 2009; INOUE et al., 2011). Não foram feitas determinações sanguíneas de hematócrito e hemoglobina, assim como, mensuração da glicose, amônia e lactato para verificação do estresse nos peixes submetidos à sedação e ao procedimento de coletas de amostras padronizadas neste estudo. O tempo de exposição à benzocaína foi inferior aos dez minutos sendo bem tolerada pelas tilápias, que não apresentaram dificuldade respiratória decorrente desta exposição. Após a redução da concentração de benzocaína no organismo do peixe e o restabelecimento da homeostase foi observado o desaparecimento da zona de hiperpigmentação do local de coleta de amostras, assim como os peixes voltaram a alimentar adequadamente e com comportamento semelhante ao grupo controle. 35 As amostras obtidas por biópsia aspirativa em tilápia do Nilo foram confirmadas ser de origem renal a partir da avaliação microscópica de cada esfregaço, onde foi possível visualizar a presença de melanomacrófagos e eritrócitos imaturos, que são normalmente encontradas no tecido hematopoiético de peixes. Os melanomacrófagos também foram visualizados nos estudos realizados por NOGA et al. (1988) e WHITE et al. (1996). A punção venosa é uma metodologia comumente utilizada para obtenção de sangue de tilápias para avaliação de parâmetros hematológicos e bioquímicos, eficácia vacinal e atividade bactericida às diferentes enfermidades (PASNIK et al., 2005; SOTO et al., 2010; SILVA et al., 2012). Este procedimento geralmente não causa mortalidade nos peixes, sendo uma metodologia de fácil e rápida execução. A coleta de sangue foi realizada adequadamente, não sendo observado infecções secundárias decorrente da metodologia de coleta. Como a coleta de sangue por punção venosa foi realizada simultaneamente à biópsia aspirativa de rim cranial, não houve distinção das alterações comportamentais decorrentes de cada método não-letal realizado. Para avaliação da eficácia dos métodos não- letais de coleta de amostras para o diagnóstico da infecção por S. agalactiae em tilápias do Nilo, um ensaio de infecção experimental foi conduzido com este patógeno. A amostra utilizada neste ensaio experimental foi a Streptococcus agalactiae SA 20-06, que em estudos prévios do próprio AQUAVET (MIAN et al., 2009) mostrou ser uma amostra extremamente virulenta para as tilápias do Nilo, na qual baixa dose infectante (6,14 x 101 UFC) foi capaz de induzir mortalidade de aproximadamente 100% dos peixes infectados. Porém, em outros estudos desenvolvidos pela equipe do AQUAVET, com dados recentes e ainda não publicados, observou-se redução da virulência desta amostra bacteriana e, consequentemente, a redução da mortalidade observada. Acredita- se que essa redução da virulência seja decorrente do efeito de passagens seriadas em meio de cultivo. Fato semelhante ocorre na evolução do patógeno ao campo onde, após a introdução de S. agalactiae em uma propriedade comercial, a bactéria é capaz de provocar mortalidade elevada, porém, nos surtos subsequentes ocorre uma redução da taxa de mortalidade devido à resistência adquirida dos peixes ao patógeno e pela utilização de antibioticoterapia pelos produtores, assim que visualizam animais com sinais clínicos (FIGUEIREDO et al, 2007a). Sabe-se que a administração de antibiótico à base de oxitetraciclina é capaz de induzir estado de portador da infecção em tilápias, acarretando na persistência de S. agalactiae na fazenda produtiva (FARIA et al., 2014). A redução da virulência da amostra SA 20-06 foi importante para a escolha desta amostra na realização dos ensaios experimentais, já que as outras amostras de S. agalactiae com DL50 previamente estabelecidos (MIAN et al., 2009) apresentam alta virulência em experimentos in vivo. Com a utilização da amostra SA 20-06 era desejável a observação de peixes aparentemente saudáveis, peixes doentes com anorexia e peixes com sinais clínicos da doença, após a infecção experimental, o que poderia não acontecer caso fosse utilizada uma outra amostra dessa espécie bacteriana. Os peixes infectados experimentalmente com S. agalactiae apresentaram sinais clínicos semelhantes aos relatados nos diferentes surtos da doença no mundo em tilápias, como natação errática, ascite, hemorragia de nadadeira, paralisia bucal e opacidade de córnea, dentre os outros citados nos resultados (AMAL et al., 2013; HERNANDEZ et al., 2009; MIAN et al., 2009; PASNIK et al., 2008; YE et al., 2011). A doença se manifestou de forma aguda em alguns peixes, sendo necessário à realização dos métodos não-letais de coleta de amostras 36 antes que esses viessem ao óbito. Adicionalmente, após a coleta das amostras, estes peixes foram submetidos à eutanásia para obtenção de tecido cerebral e renal. A coleta de sangue e tecido renal por métodos não-letais em peixes moribundos foi justificada para que se tentasse provar o quadro de septicemia aguda e detecção do patógeno, nestas amostras, na fase inicial da doença. No presente estudo, a bacteriologia e PCR espécie-específica para o diagnóstico da infecção por S. agalactiae em tilápia do Nilo, a partir de amostras colhidas por métodos letais e não-letais, foram realizados. A frequência de amostras positivas para o diagnóstico de S. agalactiae a partir de amostra cerebral foi significativamente superior para a detecção da bactéria quando comparada com as demais amostras obtidas no experimento, independentemente do método de diagnóstico utilizado. Dentre os sítios coletados, os resultados obtidos neste estudo sugerem a utilização do cérebro como órgão de eleição para a realização do diagnóstico de estreptococose em peixes por bacteriologia e/ou PCR, já que não houve diferença estatística de detecção do patógeno entre os métodos de diagnóstico. Estudos prévios foram capazes de detectar S. agalactiae por bacteriologia a partir de amostras de cérebro, rim e sangue de peixes naturalmente infectados (EVANS et al., 2002; HERNANDEZ et al., 2009), porém não compararam a eficiência de detecção do patógeno entre as amostras coletadas de forma letal e não-letal. O presente estudo é o primeiro a realizar essa comparação para a detecção de S. agalactiae em peixes. Técnicas de diagnóstico para a detecção de S. agalactiae em peixe são usualmente baseadas em isolamento bacteriano em meio de cultivo. Neste ensaio experimental observamos uma sensibilidade clínica de 48,8% para a avaliação do método letal associado à bacteriologia. Dentre os métodos de diagnóstico avaliados com amostras oriundas de técnicas letais e não-letais, a bacteriologia foi a mais sensível. Provavelmente, a alta sensibilidade é decorrente do isolamento da bactéria a partir de amostra cerebral, que parece ser órgão de predileção deste agente infeccioso. Porém, o isolamento bacteriano em meio de cultivo é um procedimento que requer tempo para obtenção de diagnóstico definitivo, o que possibilita um aumento do número de indivíduos infectados dentro de uma propriedade. Técnicas de biologia molecular para o diagnóstico desse patógeno foram desenvolvidas, como PCR espécie-específica e nested-PCR, que permitem maior sensibilidade no diagnóstico da infecção em menor tempo de execução (MATA et al., 2004; JIMENEZ et al., 2011). A partir dessa afirmação, foi avaliada a sensibilidade de detecção de S. agalactiae a partir de PCR espécie-específica e observamos que este método de diagnóstico quando associado ao método letal de coleta de amostras foi menos sensível que a bacteriologia (44,18%). A redução da sensibilidade desta técnica de diagnóstico em relação a bacteriologia pode ser decorrente da baixa carga bacteriana presente no tecido amostrado, reduzindo, dessa forma, a detecção do patógeno pela técnica molecular. Dentre as amostras obtidas por métodos não-letais, a detecção de S. agalactiae por bacteriologia apresentou sensibilidade clínica superior (27,90%) a PCR (23,25%). Não há estudos comparando a eficiência da técnica de PCR S. agalactiae espécie-específica e bacteriologia para amostras obtidas por biópsia aspirativa de rim cranial e punção venosa em peixes, porém a baixa detecção por PCR, observada no presente estudo, pode ser decorrente da baixa carga bacteriana nos peixes infectados, da sensibilidade analítica, presença de inibidores de PCR e problemas de extração de ácidos nucléicos dos tecidos amostrados. A partir dos resultados obtidos para a detecção e isolamento de S. agalactiae nas amostras coletadas de forma letal e não-letal 37 em tilápias do Nilo infectadas experimentalmente, foi possível observar a equivalência do diagnóstico da infecção em peixes com doença clínica e a superioridade da bacteriologia em relação à PCR para o diagnóstico da doença em peixes portadores da infecção. Isso pode ter ocorrido devido ao quadro de infecção aguda, onde as bactérias atingem rapidamente a corrente sanguínea e se disseminam por todos os órgãos internos, sendo possível, dessa forma, detectar a infecção por S. agalactiae em amostras de sangue, cérebro e tecido renal de peixes moribundos. Porém, com a cronicidade da infecção, há uma redução da carga bacteriana presente na circulação sanguínea e nos órgãos internos, o que reduziu o diagnóstico da infecção nos peixes que permaneceram vivos até o final do período experimental. MATA et al. (2004) determinaram a sensibilidade analítica de 250 células ou genoma equivalente para detecção de S. agalactiae por PCR espécie-específica. Este valor demonstra o tão sensível a metodologia de PCR é para o diagnóstico da doença. Ao realizar a reação de PCR para a detecção de S. agalactiae nos isolados obtidos dos peixes desafiados experimentalmente, observou-se que 100% dos isolados eram S. agalactiae. Porém, quando realizado a reação de PCR a partir de amostras clínicas, neste caso, as amostras coletadas de forma letal e não-letal, não houve uma equivalência nos resultados obtidos por bacteriologia e PCR. Apesar de MATA et al. (2004) terem determinado a sensibilidade analítica in vitro da técnica de PCR para a detecção de S. agalactiae, estes autores não determinaram a sensibilidade analítica da técnica em amostras clínicas, nem compararam a sensibilidade clínica da PCR à bacteriologia, o que reforça a importância deste presente estudo. A presença de inibidores de PCR, geralmente provenientes do próprio material coletado, proporciona erros na interpretação de resultados e obtenção de animais falso- negativos, principalmente em amostras sanguíneas (VILJOEN et al., 2005; ZOYSA et al., 2012). Estes inibidores podem se ligar diretamente ao DNA, podem afetar a ação da Taq-DNApolimerase ou reduzir a disponibilidade de íons Mg2+. A presença do grupo heme, hemoglobina, lactoferrina e imunoglobulinas presentes nas amostras de sangue e aspirado renal poderiam atuar como inibidores de PCR e proporcionar resultados negativos para peixes positivos por bacteriologia, porém, os kits de extração de DNA utilizados, neste estudo, são considerados aplicáveis de utilização em amostras sanguíneas, minimizando a presença de inibidores de PCR (KHOKHAR et al., 2012; DHALIWAL, 2013). DHALIWAL (2013) ressalta que a escolha correta do kit de extração pode ser crucial para a otimização e para a execução de um experimento. A sensibilidade de detecção por PCR mostrou-se diferente para cada um dos tipos de kits de extração de DNA utilizados neste estudo. A detecção de S. agalactiae a partir de amostras de sangue e aspirado renal foi nula quando utilizado o kit “DNeasy Tissue and Blood” para a extração manual de ácidos nucléicos, enquanto que, ao utilizar o extrator automático com o kit “Maxwell ® 16 Tissue DNA Purification” foi possível uma frequência absoluta de 18,6% de peixes positivos para a infecção a partir de aspirado renal e 20,9% a partir de sangue. Estudos prévios compararam a extração manual e automática de ácidos nucléicos a partir de sangue total e tecidos fixados em parafina (KHOKHAR et al., 2012), como também, para a detecção e quantificação de Leptospira em sangue de ser humano (BOURHY et al., 2011). KHOKHAR et al. (2012) demonstraram que o extrator automático apresentou concentração e qualidade de DNA superior às amostras extraídas com sílica. Enquanto que BOURHY et al. (2011) demonstraram uma performance similar entre os métodos manual e automático para extração de DNA a partir de sangue total, permitindo a detecção de Leptospira interrogans em todas as amostras avaliadas. 38 Não há na literatura científica estudos que comparem a detecção de S. agalactiae a partir de extração de DNA manual e automática de tecidos. No presente estudo a média de concentração (ng/µL), pureza e qualidade (A260/A280) do DNA total a partir da extração automática (220,08; 1,82) foi maior quando comparada a extração manual (84,66; 2,06), corroborando com os resultados obtidos por KHOKHAR et al. (2012). Porém, ao realizar a detecção de S. agalactiae por PCR espécie- específica, foi observado equivalência de resultados apenas entre as amostras de cérebro e rim, coletadas de forma letal, de peixes moribundos quando avaliada a forma de extração às quais estas amostras foram submetidas. Apesar da alta concentração do DNA total extraído das amostras coletadas neste estudo, acredita-se que devido à presença da parede celular espessa de peptideoglicano, presente na bactéria S. agalactiae, possa não ter sido rompida pela utilização dos kits de extração e permitido a adequada extração do DNA bacteriano. Portanto, estudos futuros visando a otimização da extração de DNA bacteriano em amostras de sangue e aspirado renal se tornam necessários para a validação do protocolo de diagnóstico da infecção por S. agalactiae a partir de amostras coletadas de forma não-letal. Estudos prévios compararam a eficiência de detecção de Streptococcus agalactiae por diferentes métodos de diagnóstico. HERNANDEZ et al. (2009) compararam a eficiência da microbiologia, histopatologia e imunoperoxidase indireta para o diagnóstico de S. agalactiae em tilápia vermelha (Oreochromis sp.) naturalmente infectadas e verificaram uma sensibilidade clínica de 30,8% para o exame bacteriológico e 100% para as outras metodologias de diagnóstico. LEAL (2011) comparou a detecção de S. agalactiae por bacteriologia, PCR espécie- específica e PCR em tempo real em tilápia do Nilo infectadas experimentalmente e obteve sensibilidade clínica de 50% para a bacteriologia, 63,3% para PCR espécie- específica e 93,3% para a PCR em tempo real. A sensibilidade clínica do presente estudo foi superior ao observado por HERNANDEZ et al. (2009) e semelhante àquele obtido por LEAL (2011) para o diagnóstico de S. agalactiae por bacteriologia (48,8% de peixes diagnosticados positivos por esta metodologia). Porém, a sensibilidade clínica da detecção do patógeno por PCR espécie-específica foi inferior ao observado por LEAL (2011) (51,1% de peixes positivos). JIMENEZ et al. (2011) avaliaram a detecção da bactéria S. agalactiae por nested-PCR em peixes doentes e em tecidos congelados e fixados em parafina, concluindo que esta é a melhor metodologia para a detecção do patógeno. LEAL (2011) desenvolveu uma PCR em tempo real que mostrou sensibilidade clínica similar ao nested-PCR desenvolvido por JIMENEZ et al. (2011) e superior à PCR espécie-específica desenvolvida por MATA et al. (2004). Nested-PCR e PCR em tempo real são métodos de diagnóstico promissores e que deverão ser avaliados em estudos futuros para a detecção de S. agalactiae associados às amostras coletadas de forma não-letal padronizadas neste estudo. Os métodos de diagnóstico foram eficazes na detecção de peixes com doença clínica, não havendo diferença estatisticamente significativa entre as formas de obtenção de amostras, e apresentando boa concordância entre as amostras obtidas de forma letal e não-letal, independentemente do método de diagnóstico utilizado. Este resultado sugere que os métodos não-letais de coleta de amostras podem ser utilizados para a detecção de S. agalactiae. Porém a utilização de peixes doentes em programas de monitoramento sanitário, com coleta de amostras por métodos não-letais, é dependente do estágio de progressão da doença. Peixes com quadro de doença neurológica não revertem este estado, sendo necessário a sua eliminação nos plantéis 39 assim que visualizados. Porém, peixes em fase inicial de infecção podem ser submetidos à coleta de amostras por métodos não-letais para a realização do diagnóstico da enfermidade e ser instituído tratamento com antibiótico após confirmação do agente bacteriano envolvido. Essa medida terapêutica pode evitar a contaminação de outros peixes, assim como, tentar reverter o quadro de doença clínica em peixes em fase inicial da doença. O entendimento sobre a capacidade de um patógeno em induzir estado de portador em um hospedeiro é essencial para delineamento das formas de controle e prevenção de uma doença. Em condições naturais, EVANS et al. (2002) obtiveram peixes portadores da infecção por S. agalactiae através da detecção de bacteriologia positiva em peixes sem sinais clínicos. Em condições experimentais, FARIA et al. (2014) induziram o estado de portador da infecção em tilápias, através da utilização de oxitetraciclina, como tratamento profilático e terapêutico da infecção por S. agalactiae. O presente estudo foi capaz de identificar 12 peixes portadores da infecção quando testados por bacteriologia e/ou PCR. A detecção de portadores da infecção por S. agalactiae foi significativamente menor quando comparada aos peixes com quadro de doença clínica, independentemente da forma de coleta de amostra e método de diagnóstico utilizado. Em peixes portadores, as amostras obtidas por métodos não-letais foram capazes de detectar S. agalactiae, porém com sensibilidade clínica muito menor ao comparar com a bacteriologia de cérebro. Os resultados obtidos neste presente estudo corroboram a hipótese de que estado de portador ocorre em tilápia e que isso pode ter impacto nas fazendas, decorrente da manutenção da bactéria no sistema de produção. Adicionalmente, cabe ressaltar que há uma diversidade genética considerável entre as amostras de S. agalactiae que causam doenças em peixes e que diferentes linhagens podem ter também diferentes habilidades de induzir estado de portador (GODOY et al., 2013; ROSINSKI-CHUPIN, 2013). Estudos futuros com o objetivo de avaliar a capacidade de indução do estado de portador da infecção por S. agalactiae, a partir de amostras geneticamente distintas da SA 20-06, poderão ser realizadas. Previamente a esse estudo, somente um método de coleta não-letal em tilápia do Nilo, para a detecção de agente parasitário a partir de amostra de muco branquial, foi desenvolvido (EK-HUCHIM et al., 2012). A padronização da biópsia aspirativa de rim cranial e punção venosa nesta espécie, realizada neste estudo, visa auxiliar produtores e técnicos dos serviços veterinários oficiais para o controle e prevenção das infecções por S. agalactiae nas tilapiculturas brasileiras, bem como possibilitar o monitoramento de plantéis em futuros programas nacionais de controle dessa enfermidade. A frequência de amostras detectadas positivas por coleta não-letal foi significativamente mais baixa que as obtidas por coleta letal, independentemente do método de diagnóstico utilizado. Porém, dentre as amostras coletadas por técnicas não-letais, a frequência de detecção de S. agalactiae a partir de aspirado renal foi maior que o sangue na bacteriologia, porém, na PCR, a frequência de detecção no sangue foi superior ao aspirado renal. Os resultados obtidos por este estudo sugerem que a biópsia aspirativa de rim cranial e a punção venosa podem ser usados como metodologias efetivas de coleta não-letal de amostras biológicas para a detecção de S. agalactiae em peixes com doença clínica e peixes aparentemente saudáveis em fase inicial de infecção. Não houve diferença estatisticamente significativa entre as duas amostras, sendo elas igualmente eficazes para a detecção do patógeno. Uma excelente congruência entre as técnicas não-letais foi observada quando utilizadas para a detecção por bacteriologia. A congruência entre estas 40 amostras foi boa pela técnica de PCR espécie- específica. A coleta de sangue, por ser menos traumática e laboriosa que a biópsia aspirativa de rim cranial, pode ser a opção de escolha em programas de monitoramento sanitário em tilapiculturas comerciais para a detecção de S. agalactiae. Adicionalmente, cabe ressaltar que a biópsia aspirativa foi estatisticamente eficaz para a detecção do patógeno quando comparada à eficiência de diagnóstico por bacteriologia e PCR, a partir de rim, coletado de forma letal. Este resultado reforça a afirmação de que o tecido coletado por biópsia aspirativa é mesmo de origem renal e que esta forma de coleta não-letal de amostra também pode ser utilizada em programas de diagnóstico da doença. Portanto, este estudo sugere que a associação de coleta de sangue e aspirado renal devem ser utilizados para a detecção de S. agalactiae em programas de monitoramento sanitário, assim como, metodologia alternativa de coleta de amostras para futuros estudos de detecção de outros patógenos infecciosos em tilápias. Em suma, as amostras obtidas por métodos não-letais são alternativas promissoras mas não substituem o cérebro como amostra de eleição para o diagnóstico de S. agalactiae. A partir dos resultados obtidos neste estudo, a bacteriologia associada à métodos não- letais de coleta de amostras é uma metodologia promissora para detecção de peixes portadores da infecção por S. agalactiae, o que permitiria o estabelecimento de programas específicos de monitoramento da estreptococose nos plantéis brasileiros, sem a necessidade de submeter peixes à eutanásia, principalmente reprodutores, e garantiria a comercialização de tilápias saudáveis. Porém, para um programa de monitoramento sanitário eficiente para S. agalactiae, a partir da baixa sensibilidade de detecção observada neste estudo para as amostras coletadas de forma não-letal, se torna necessário o ajuste do número de animais a serem submetidos à punção venosa e biópsia aspirativa de rim cranial, sendo o tamanho da amostra calculado a partir da prevalência da doença no local e a sensibilidade de diagnóstico da metodologia utilizada, com o objetivo de aumentar a probabilidade de detecção de no mínimo um peixe positivo e subsequente eliminação do mesmo do plantel (SIMON e SCHILL, 1984). Essa medida também pode ser adotada para emissão de certificação sanitária na piscicultura, atestando a ausência do patógeno nos peixes produzidos em uma determinada propriedade, a partir de coletas de amostras periódicas. 6. CONCLUSÃO As técnicas de biópsia aspirativa e punção venosa foram viáveis e seguras para a obtenção de amostras de rim e sangue, em tilápias do Nilo. Tais amostras foram eficientes na detecção da infecção por Streptococcus agalactiae, por bacteriologia e PCR espécie-específica em peixes com doença clínica e em portadores. A associação da coleta não-letal de amostras e os métodos de diagnóstico podem ser utilizados em programas de monitoramento sanitário para S. agalactiae desde que a amostragem seja ajustada aos valores de sensibilidade e especificidade determinados por este estudo. 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AGIUS, C.; ROBERTS, R. J. Melano- macrophage centres and their role in fish pathology. J. Fish Dis., v. 26, n. 9, p. 499- 509, 2003. AGNEW, W.; BARNES, A. C. Streptococcus iniae: An aquatic pathogen of global veterinary significance and challenging candidate for reliable vaccination. Vet. Microbiol., v. 122, n. 1-2, p. 1–15, 2007. ALTINOK, I.; GRIZZLE, J. M.; LIU, Z. Detection of Yersinia ruckeri in rainbow trout blood by use of the polymerase chain 41 reaction. Dis. Aquat. Org., v. 44, n. 1, p. 29- 34, 2001. AMAL, M. N. 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