(1) Universidade Federal de Minas Gerais Instituto de Ciências Biológicas Programa de Pós-Graduação em Parasitologia Perfil da suscetibilidade a deltametrina em populações de Triatoma sordida (Hemiptera: Reduviidae) do Estado de Minas Gerais procedentes de áreas com infestação persistente por Grasielle Caldas D`Ávila Pessoa Belo Horizonte Agosto de 2012 (2) Perfil da suscetibilidade a deltametrina de populações de Triatoma sordida (Hemiptera: Reduviidae) do Estado de Minas Gerais em áreas com infestação persistente por Grasielle Caldas D`Ávila Pessoa Orientação: Dra. Liléia Diotaiuti Belo Horizonte Agosto de 2012 Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Parasitologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito final para a obtenção do título de doutor(a) em Ciências. (3) Colaborações: Bernardino Vaz de Melo – SES/MG Letícia Sena Dias – LATEC - CPqRR / FIOCRUZ Dr. Ademir J. Martins – LAFICAVE – IOC/FIOCRUZ Dra. Denise Valle – LAFICAVE – IOC / FIOCRUZ Dra. Marcela Lencine Ferraz – SES / MG iii (4) Ao meu grande exemplo de vida, fé e superação, minha mãe. iv (5) “Ninguém sabe tudo assim como ninguém ignora tudo. O saber começa com a consciência do saber pouco. É sabendo que se sabe pouco que uma pessoa se prepara para saber mais....o homem como ser histórico, inserido num permanente movimento de procura, faz e refaz, constantemente o seu saber.” (Paulo Freire) v (6) Agradecimentos A Deus pelas inúmeras possibilidades de amadurecimento que me foram ofertadas durante estes quatro anos de caminhada contribuindo para o meu progresso intelectual, espiritual e emocional. A Dra. Liléia Diotaiuti, idealizadora deste projeto, pela oportunidade de ingressar na pesquisa junto a equipe do Laboratório de Triatomíneos e Epidemiologia da Doença de Chagas -LATEC orientando este trabalho pautado pela confiança, incentivo, ensinamentos e principalmente, compreensão e amizade. A Dra. Marcela Lencine Ferraz e Dr. Bernardino Vaz de Mello, da SES/MG, pela logística das coletas de campo e ensinamentos. Aos agentes de saúde que não mediram esforços para realizar todo o trabalho operacional de forma otimizada sob o sol escaldante do norte de Minas e Triângulo Mineiro, em especial ao Sr. Aparício Oliveira, da Gerência Reginal de Saúde de Montes Claros. A Dra. Denise Valle e ao Dr. Ademir M. Santos, bem como a toda sua equipe, em especial a Msc. Priscila Vianna por todos os ensinamentos, perserverança, dedicação e paciência junto ao estudos bioquímicos e da diversidade do gene do canal de sódio. Ao Dr. Nilton Barnabé, Msc.Paula F. Fernandes, Dra. Carlota J. Belisário, Dra. Elisa Neves Viana, Letícia Sena Dias e Elisângela Monteiro Cóser pela colaboração nos trabalhos com os microssatélites. A Dra. Marcela Lencine Ferraz, Dr.Flávio Múcio, Dr. Marcos Horácio pelos aconselhamentos e pontuações junto ao processo de qualificação. Ao Dr. Marcelo Resende e Dr. Ademir M. Santos pela revisão desta tese. Ao Adelmison de Azevedo pela enorme ajuda com a alimentação e manutenção das colônias de triatomíneos. Aos amigos do LATEC/ CPqRR-FIOCRUZ, do l.aboratório de Ecologia Química - LABEq ICB-UFMG e do Laboratório de Fisiologia e Controle de Vetores - LAFICAVE / IOC- FIOCRUZ, minha segunda família, pelo acolhimento diário, pelos momentos de convivência e acima de tudo pelo amadurecimento em coletividade. Agradeço de forma muito especial a vi (7) Letícia Sena Dias, a Carlota Belisário, a Priscila Vianna e ao Diogo Belinato, pelo companheirismo, pelas palavras de incentivo, pela troca de experiência e amizade sincera construída neste período. As minhas alunas e colegas de profissão nos estudos com inseticida, Nathália Trevizani, Letícia Sena Dias, Marinely B. Gomes, Josiane V. Lopes, Tamara dos Santos, Mariana Reis, Gabriela Salazar, Renata Santos e Julia Campos, pelo aprendizado na convivência diária e trabalhos desenvolvidos em parceria. Ao Dr. Edelberto Santos Dias, Dr. Gustavo Paz e Josiane Valadão Lopes pelos ensinamentos e trocas de experiências nos estudos com flebotomíneos. Ao Programa de Pós-Graduação em Parasitologia da UFMG pela oportunidade e apoio no curso de doutoramento, em especial a Sumara e Sibele pelo carinho e apoio constantes. Aos mestres, em especial ao Dr. Alan Lane de Melo, Dra. Mariângela Carneiro e Dr. Carlos Maurício pelos ensinamentos, mas acima de tudo pelo exemplo de humanização do ensino. Ao Centro de Pesquisa René Rachou - CPqRR e ao Instituto Oswaldo Cruz - IOC, pelo apoio institucional e pela oportunidade de desenvolver este trabalho em um dos mais conceituados pólos de pesquisa em saúde do país. Ao Conselho Nacional de Pesquisa - CNPq, BAYER e CPqRR/FIOCRUZ pelo apoio financeiro. A todos os meus amigos, em especial ao Luiz Araújo, ao meus familiares, em especial aos meus pais, DÀvila e Fátima e a minha irmã, Flávia pela paciência e compreensão nos momentos em que precisei estar ausente e pelo apoio incondicional. A todos, muito obrigada! vii (8) Resumo Os relatos cada vez mais frequentes de populações triatomínicas com razões de resistência elevadas tem causado grande impacto, desafiando cientistas e sanitaristas na busca de novas alternativas para o controle vetorial. Considerando os casos de resistência de triatomíneos já reportados, é possível que o uso intensivo de inseticidas no Brasil por mais de 30 anos tenha favorecido o aparecimento de novos focos em regiões ainda mais amplas. Deste modo, justifica-se a importância de se investigar este fenômeno levando-se em consideração as condições ambientais nas quais ele se encontra inserido bem como variabilidade genética destes insetos e sua capacidade de alteração na linha do tempo na presença do ativo químico. O objetivo deste trabalho foi caracterizar o perfil de suscetibilidade/resistência de populações de T. sordida de áreas com infestação persistente da região do Triângulo Mineiro e do Norte de Minas Gerais ao piretróide deltametrina. A População utilizada como linhagem referência de suscetibilidade é proveniente de Uberaba. Os ensaios biológicos quali e quantitativos foram conduzidos de acordo com PESSOA (2008) e os bioquímicos de acordo com VALLE et al., (2006) com modificações. A caracterização da estrutura genética das populações foi desenvolvida por meio do estudo de microssatélites por técnica de transposição. As características ambientais e operacionais foram avaliadas por meio de questionário próprio. As variáveis climatológicas (umidade relativa, pluviosidade, temperatura e insolação) foram obtidas por meio de dados disponíveis no Banco de Dados Metereológicos para Ensino e Pesquisa - BDMEP. As análises dos bioensaios quantitativos revelaram RR50 que variaram de 0,44 a 6,5. De acordo com critério de categorização do status da suscetibilidade/resistência proposto pela OPAS (2005), apenas 1% das populações foi classificada como resistente a deltametrina (TsCJB; RR50: 6,50), enquanto que de acordo com critério de ZERBA & PICOLLO (2002), este valor sobe para 55,5%. Os bioensaios qualitativos revelaram um percentual de mortalidade à Dose Diagnóstica que variou de 43,3% a 100%, sendo 61,2% das populações classificadas como resistentes à deltametrina. Os resultados obtidos nos bioensaios qualitativos e quantitativos não se mostraram correspondentes, reforçando a necessidade de ensaios de campo. A padronização dos ensaios bioquímicos revelou que estes devem ser realizados com insetos de mesma geração e idade, com n amostral de 135 espécimes. A análise dos ensaios bioquímicos utilizando somente o percentil 99 se mostrou deficiente, justificando a necessidade de um teste estatístico em paralelo, a ser escolhido de acordo com o tipo de distribuição dos resultados obtidos. A análise das populações de interesse revelou alteração na maioria das populações para todas as enzimas (alfa-EST, beta-EST, pnpa-EST, OFM e ACHE), exceto de GST. Não foi observada correlação entre as RR encontradas e os resultados do testes bioquímicos. Não foi observada diferença no padrão das localidades com triatomíneos classificados como resistentes ou suscetíveis em relação a: constituição do intradomicílio, tipo viii (9) de ecótopos peridomiciliares, a disponibilidade de esconderijos, e uso de inseticidas pelo próprio morador. Somente na localidade de Barriguda foi relatada utilização das matas no entorno para coleta de lenha. Verificaram-se diferenças nos parâmetros climatológicos insolação, temperatura e pluviosidade em todo o município (p< 0,05). O histórico de infestação das UD`s e carga de inseticida utilizada revelou-se mais elevado em Barriguda, Jataí II e Jataí I, sendo T. sordida (94,5%) a espécie de triatomíneo predominante capturada. O município de Coração de Jesus conta atualmente com três agentes de saúde, com pouco tempo de experiência profissional, não treinados para as atividades de borrifação que afirmam trabalharem em concordância com as preconizações do MS. Os estudos com microssatélites revelaram uma grande diversidade genética. A análise do FST possibilitou inferir sobre um fluxo de insetos entre as localidades de Jataí I, Jataí II, Boa Vista, com isolamento independente das populações de Barriguda e Bom Jesus. De forma geral, o uso de inseticidas para diversos fins, possíveis falhas operacionais principalmente devidas à falta de capacitação e supervisão dos agentes de saúde, somados a uma degradação irregular do inseticida determinada pelas condições ambientais, pode selecionar indivíduos resistentes justificando a persistência da infestação na região. A diversidade de RR observada dentro da mesma localidade, o fluxo genético observado nos ensaios moleculares, a abundância e diversidade de esconderijos e os diferentes perfis bioquímicos encontrados permitem inferir, inclusive, que a resistência pode estar sendo subestimada. Palavras-chave: resistência a inseticida, piretróides, deltametrina, Triatominae, T. sordida, bioensaios, enzimas detoxificativas, microssatélites. ix (10) Abstract High insecticide resistance ratios on triatominic populations have been frequently reported, causing impact on vector control strategies and challenging scientists and sanitarists on the quest for novel alternatives concerning vector control. Considering the already reported cases of triatomine resistance, it is possible that the intensive use of insecticides in Brazil for over 30 years caused the emergence of new foci in wider geographic areas. Thus, the investigation of the related phenomenon is justified by its importance. Moreover it is necessary to consider the environmental conditions on which the resistance is inserted, the insects genetic variability and the resistance timeline evolution after exposure to chemical assets. The aim of the present study was to characterize the pyrethroid deltamethrin susceptibility/resistance profile of Triatoma sordida (Stål, 1859) populations from areas with persistent infestation on the Triangulo Mineiro and on northern Minas Gerais. The qualitative and quantitative bioassays were conducted according to PESSOA (2008) and biochemical assays according to VALLE et al., 2006) with modifications. The genetic characterization of triatomine populations was developed through microsatellites transposition technique. The operational and environmental characteristics were assessed through questionnaires. The climatic variables (relative humidity, pluviosity, temperature and solar radiation) were obtained from BDMEP. The quantitative bioassay analyzes showed RR50 ranging from 0.44 to 6.5. According to the criterion of categorization status of susceptibility / resistance proposed by PAHO (2005), only 1% of the population was classified as resistant to deltamethrin (TsCJB; RR50: 6.50), whereas according to ZERBA & PICOLLO (2002) criterion, the value rises to 55.5%. Qualitative bioassays revealed a DD (diagnostic dose) mortality ranging from 43.3% to 100%, with 61.2% of the population classified as deltamethrin resistant. The results in qualitative and quantitative bioassays were not related, emphasizing the need of field trials. The standardization of biochemical assays showed that these must be performed with insects of the same generation and age, with a sample of 135 specimens. The analysis of biochemical assays using only the 99 percentile proved to be deficient, justifying the need of a parallel statistical test, to be chosen according to the statistical distribution of the results. The analysis of triatomine populations showed alterations in most of them for all the enzymes (alpha-EST, beta-EST, PNPA-EST, OFM and ACHE), except GST. No correlation was found between the RR values and the biochemical tests results. Localities with triatomines classified as resistant or susceptible presented similar patterns when considered: intradomiciliary constitution, types of peridomiciliary ecotopes, availability of hiding places, and use of insecticides by the resident. Only on the Barriguda locality was reported the collecting of firewood in surrounding vegetation by residents. Differences in the climatic variables (solar radiation, temperature and rainfall) were verified throughout the municipality (p <0.05). Premises infestation history and used insecticide charge showed to be higher at Barriguda, Jataí Jataí I and Jataí II. Triatoma sordida was the predominant species x (11) captured (94.5%). The municipality of Coração de Jesus currently has three health workers with little time of professional experience, not trained to insecticide spraying activities in accordance to ministry of health recommendations. Microsatellites analysis revealed a high genetic diversity. The FST analysis allowed infer the existence of interchange among insect’s populations between Jataí I, II Jataí, Boa Vista localities, and an independent isolation of Barriguda and Bom Jesus populations. Considering the stated results, the use of insecticides for various purposes, possible operational failures mainly due the lack of training and supervision of health workers, in combination with insecticide irregular degradation caused by environmental conditions, may contribute for selection of resistant individuals justifying the persistence of infestation in region. The diversity of RR observed within the same locality, the genetic flow observed in molecular assays, the abundance and diversity of hiding places and different biochemical profiles allow to infer that insecticide resistance may be underestimated. Keywords: insecticide resistance, pyrethroids, deltamethrin, Triatominae, T. sordida, bioassays, detoxifying enzymes, microssatelites. xi (12) Lista de símbolos e abreviaturas µg ia./m2 - Microgramas de ingrediente ativo por metro quadrado µm - Micrômetros ACE - Acetilcolinesterase ACTH - Iodeto de acetilcolina AIDS - Síndrome da Imunodeficiência Adquirida alfa-NA Esterase alfa AMOVA - Análise de Variância Molecular AVAI - Anos de Vida Ajustado à Incapacitação BHC - Hexaclorobenzeno Beta-NA - Esterase beta BDMEP - Banco de Dados Metereológicos para Ensino e Pesquisa CB - Carbamatos CGLAB - Coordenação Geral de Laboratórios de Saúde Pública CIB - Comissão Intergestores Bipartite CIT - Comissão Intergestores Tripartite cm - Centímetros CN - Controle Negativo CPqRR - Centro de Pesquisa Rene Rachou DC - Doença de Chagas DDT - Dicloro-difenil-tricloroetano DENERu - Departamento Nacional de Endemias Rurais DL50 - Dose letal 50% DL95 - Dose letal 95% DL99 - Dose letal 99% DNA - Ácido desoxirribonucleico DTNB - 5,5`-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid) EST - Esterases FE - Fenilpirazóis FUNASA - Fundação Nacional de Saúde GABA - Acido Gama-aminobutírico GPS - Sistema de Posicionamento Global GRS - Gerência Regional de Saúde GST - Glutationa-S-Transferase GSH - L glutationa reduzida HE - Heterozigosidade esperada HO - Heterozigosidade observada IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística INCONSUL - Iniciativa do Cone Sul INERu - Instituto Nacional de Endemias Rurais INMET - Instituto Nacional de Metereologia IPA - Iniciativa do Pacto Andino IPCA - Iniciativa dos Países da América Central JHE - Esterases do Hormônio Juvenil Kdr - Resistência Knockdown do inglês “Knockdown resistance” LATEC - Laboratório de Triatomíneos e Epidemiologia da Doença de Chagas LRS - Linhagem referência de suscetibilidade m - Metros M - Molar m2 - Metros quadrados mg - Miligrama mg ia./m2 - Miligramas de ingrediente ativo por metro quadrado mm - Milímetros MS - Ministério da Saúde NADPH - Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato xii (13) Cont. Lista de símbolos e abreviaturas ng i.a./ninfa - Nanogramas de ingrediente ativo por ninfa tratada ng ia./m2 - Nanogramas de ingrediente ativo por metro quadrado ng/µL - Nanogramas por microlitro nm - Nanômetros NAV - Canal de sódio regulado por voltagem OC - Organoclorados ºC - Graus Célsius OFM - Oxidase de Função Mista OP - Organofosforados OPAS - Organização Panamericana de Saúde PA - Pesquisa Ativa p99 - Percentil 99 pb - Pares de Base PBO - Butóxido de piperonila PCDCh - Programa de Controle da Doença de Chagas PCR - Reação em Cadeia da Polimerase PI - Piretróides PPA - Análise do padrão pontual do ingles “Point Pattern Analysis” pNPA- EST - Esterase PNPA rpm - Rotações por minuto RR50 - Razão de Resistência 50% RR95 - Razão de Resistência 95% SES/MG - Secretaria Estadual de Saúde de Minas Gerais SNC - Sistema Nervoso Central SNM - Serviço Nacional de Malária SSR - Repetição de Sequências Simples do inglês “Simple Sequences Repeats” SUCAM - Superintendência de Campanhas de Saúde Pública SUCEN - Superintendência de Controle de endemias TMBZ - 3,3`,5,5`-tetramethyl-benzidine dihydrochloride SVS - Secretaria de Vigilância em Saúde UDs - Unidades Domiciliares UR - Umidade Relativa VE - Vigilância Epidemiológica WHO - Organização Mundial de Saúde do inglês “World Health Organization” xiii (14) Lista de figuras 1 - Fêmea de Triatoma sordida Stål 1859 2 - Mapa político do Estado de Minas Gerais. Destacados os diferentes municípios de captura de T. sordida estudadas neste projeto 3 - Acondicionamento dos insetos em insetário (A); limpeza quinzenal das colônias para retirada dos ovos (B), acondicionamento dos ovos em placas de petri para acompanhamento diário da eclosão dos mesmos(C) e acompanhamento diário da idade das ninfas para a realização dos bioensaios (D). 4 - Registro diário dos experimentos (A); seringa Hamilton acoplada a dispensador automático (B), separação dos triatomíneos com idade adequada para realização dos ensaios biológicos (C). 5 - Aplicação tópica do inseticida nos triatomíneos (A), acondicionamento dos insetos pós-tratamento para subsequente registrode mortalidade (B). 6 - Acondicionamento dos espécimes no gelo para processamento incial (A), acondicionamento individual dos espécimes em eppendorf com auxílio de um pistilo acoplado a homogeneizador mecânico (B), maceração dos triatomíneos (C); distribuição das amostras pré-centrifugação nas placas dispostas gelo para realização dos ensaios de ACHE e OFM (C); centrifugação a 4ºC (E); distribuição das amostras pós-centrifugação nas placas para demais ensaios (F); realização dos ensaios bioquímicos em temperatura ambiente (G); exemplo de ensaio colorimétrico (H); leitura dos ensaios em espectofotômetro (I). 7 - Distribuição das localidades de acordo com o status da suscetibilidade/ resistência proposto pela OPAS (2005) – A e ZERBA &PICOLLO (2002) – B. 8 - Perfil de inclinação da reta dose resposta para populações de T. sordida, em escala logarítmica (aplicação tópica de 0,2µL de deltametrina, solubilizada em acetona, no dorso de abdômen de ninfas I da geração F1 - cinco dias de idade, jejum - peso 1,2±0,2 mg – registro de mortalidade com 72 horas.) Localidades amostradas: A: Santo Hipólito; B: Buenópolis, C: Várzea da Palma; D: Ibiaí; E: Coração de Jesus; F: Montes Claros 9 - Figura 10. Perfil de inclinação da reta dose resposta para populações de T. sordida, em escala logarítmica (aplicação tópica de 0,2µL de deltametrina, solubilizada em acetona, no dorso de abdômen de ninfas I da geração F1 - cinco dias de idade, jejum - peso 1,2±0,2 mg – registro de mortalidade com 72 horas.) Localidades amostradas: A: Francisco Sá; B: Porteirinha, C: Serranópolis de Minas; D: Monte Azul; E: Mamonas ; F: Espinosa. 10 - Perfil de inclinação da reta dose resposta para populações de T. sordida, em escala logarítmica (aplicação tópica de 0,2µL de deltametrina, solubilizada em acetona, no dorso de abdômen de ninfas I da geração F1 - cinco dias de idade, jejum - peso 1,2±0,2 mg – registro de mortalidade com 72 horas.) Localidades amostradas: A: São joão da Ponte; B: Brasília de Minas, C: Luislândia; D: Icaraí de Minas; E: São Franciso; F: Japonvar. 11 - Perfil de inclinação da reta dose resposta para populações de T. sordida, em escala logarítmica (aplicação tópica de 0,2µL de deltametrina, solubilizada em acetona, no dorso de abdômen de ninfas I da geração F1 - cinco dias de idade, jejum - peso 1,2±0,2 mg – registro de mortalidade com 72 horas.) Localidades amostradas: A: Lontra; B: Ibiracatu; C: Vazerlândia; D: Januária; E: Cônego Marinho; F: Montalvânia. 12 - Perfil de inclinação da reta dose resposta para populações de T. sordida, em escala logarítmica (aplicação tópica de 0,2µL de deltametrina, solubilizada em acetona, no dorso de abdômen de ninfas I da geração F1 - cinco dias de idade, jejum - peso 1,2±0,2 mg - registrode mortalidade com 72 horas.) Localidades amostradas: A: São João das Missões; B: Buritis; C: Gurinhatã; D: Limeiro do Oeste; E: Frutal; F: Manga. xiv (15) 13 - Perfil de inclinação da reta dose resposta para populações de T. sordida, em escala logarítmica (aplicação tópica de 0,2µL de deltametrina, solubilizada em acetona, no dorso de abdômen de ninfas I da geração F1 - cinco dias de idade, jejum - peso 1,2±0,2 mg - registrode mortalidade com 72 horas.) Localidades amostradas: A: Barrigura – em vermelho análise feita em 2007 e em azul, em 2009. B: localidades do entorno de Barriguda. 14 - Distribuição das localidades de estudo de acordo com o status de suscetibilidade/resistência a deltametrina popostro por WHO (1981). Categorização da mortalidade das populações de T.sordida frente a dose diagnóstica 1xDL99 da LRS. Em vermelho as populações resistentes a deltametrina e em verde, as suscetívieis. 15 - Média das temperaturas (máxima e mínima) e insolação do município de Coração de Jesus, do período de 1970 a 2009. 16 - Média da precipitação e umidade relativa do ar do município de Coração de Jesus, do período de 1970 a 2009, incluindo-se intensidade do fenômeno El Nino e La Nina (fraca 100, moderada 200 e forte 300). 17 - Loci Tb 8124 (A) e T.infest_ms42 (B) visualização em gel de acrilamida corado com nitrato de prata. Nota: controles negativos - CN 18 - Quantificação da atividade das enzimas: esterases (com substratos: alfa, beta e pnpa), acetilcolinesterase (atividade total – AchE e inibida – AchI), GST e OFM em ninfas I de T. sordida das gerações F1 e F2 (1 dia de idade - jejum - peso 1,2±0,2 mg - população LRS). 19 - Quantificação da atividade das enzimas: esterases (com substratos: alfa, beta e pnpa), acetilcolinesterase (atividade total – AchE e inibida – AchI), GST e OFM em ninfas I da geração F1 de T. sordida com 1, 3 e 5 dias de idade ( jejum - peso 1,2±0,2 mg - população LRS). 20 - Quantificação da atividade das enzimas: esterases (com substratos: alfa, beta e pnpa), acetilcolinesterase (atividade total – AchE e inibida – AchI), GST e OFM em ninfas I da geração F1 de T. sordida com amostragem de 45, 90 e 135 espécimes (1 dia de idade - jejum - peso 1,2±0,2 mg - população LRS). 21 - Quantificação da atividade das enzimas: esterases (com substratos: alfa, beta e pnpa), acetilcolinesterase (atividade total – AchE e inibida – AchI), GST e OFM em ninfas I da geração F1 de T. sordida com 5 dias de idade ( jejum - peso 1,2±0,2 mg). 22 - Análise do percentil 99 referente a quantificação da atividade enzimática relacionada com a resistência a inseticida em populações de T. sordida provenientes do município de Coração de Jesus. As cores representam o percentual de indivíduos da população com atividade enzimática acima do percentil 99 da LRS: verde – até 15%, amarelo – entre 15 e 50% e vermelho – acima de 50%. Estes valores correspondem à alteração enzimática na população classifica, respectivamente, como ausente, baixa e alta. xv (16) Lista de tabelas 1 - Mutações indetificadas no gene NAV de insetos relacionados à resistência a inseticidas 2 - Codificação das diferentes populações de T. sordida procedentes do Estado de Minas Gerais, 2012 3 - DL50, DL95, RR50, RR95 e Slope da linhagem referência de suscetibilidade (em vermelho) e das populações de campo de T. sordida a deltametrina, ranquiados em ordem crescente de RR50 4 - DL50, DL95, RR50, RR95 e Slope da linhagem referência de suscetibilidade e das populações T. sordida coletadas nas localidades de entorno de Barriguda (município de Coração de Jesus) ranquiados por RR50 em ordem crescente. 5 - Mortalidade das populações de T. sordida em resposta à dose diagnóstica (DD) 1xDL99 da linhagem referência de suscetibilidade. Total amostrado por população de 30 espécimes. 6 - Percentual de mortalidade das populações de T. sordida circunvizinhas de Barriguda (Coração de Jesus) em resposta às dose diagnósticas (DD) 1xDL99 da linhagem referência de suscetibilidade ranquiados em ordem crescente de % de mortalidade. 7 - Caracterização das UD´s em relação a idade média, constituição das paredes, teto e piso das mesmas. 8 - Caracterização das UD´s em relação a criação de animais domésticos e uso de inseticidas com vistas ao controle de pragas em suas criações. 9 - UD`s nas quais o morador relatou uso de inseticidas com vistas ao controle de pragas domésticas, especificando local de uso. 10 - UD`s nas quais se verifica cultivo de grãos, legumes, frutas ou hortaliças. 11 - UD`s nas quais os montes de lenha, amontoados de tijolos e telhas, cercas e depósitos de máquinas estão presentes no peridomicílio. Distância média entre tais anexos e o intradomicílio em metros e, idade média dos mesmos em anos. 12 - UD`s nas quais os galinheiros, chiqueiros e currais estão presentes no peridomicílio. Distância média entre tais anexos e o intradomicílio em metros e, idade média dos mesmos em anos e material de construção utilizado. 13 - UD`s nas quais os paióis estão presentes no peridomicílio. Distância média entre tais anexos e o intradomicílio em metros, idade média dos mesmos em anos e material de construção utilizado. 14 - UD`s nas quais os fornos de barro estão presentes no peridomicílio. Distância média entre tais anexos e o intradomicílio em metros e, idade média dos mesmos em anos. 15 - UD`s positivas, UD`s trabalhadas, Triatomíneos capturados por UD e Carga de inseticida aplicado por UD em todas as localidades de interesse. 16 - Cargas de inseticidas utilizadas pelo PCDCh nas localidades de interesse no período de 2004 a 2010. 17 - Variabilidade genética dos 10 loci de microssatélites em populações de T. sordida. 18 - Variação genética apresentada pelos 10 loci de microssatélites nas populações de T. sordida 19 - Relação dos alelos observados nos 10 loci de microssatélites nas populações de T. sordida estudadas. Destacados em vermelho os loci exclusivos. 20 - AMOVA para as amostras de T. sordida estudadas através dos 10 loci de microssatélites. 21 - FST pareado entre as amostras de T. sordida estudadas, calculados através dos 10 loci de microssatélite xvi (17) Sumário Página 1. Introdução 19 1.1 Doença de Chagas 20 1.2 Importância epidemiológica de Triatoma sordida 22 1.3 Controle Vetorial da doença de Chagas 24 1.4 Resistência a Inseticidas 31 1.5 Toxicologia de inseticidas 35 1.5.1 Classificação dos inseticidas 35 1.5.1.1 Inseticidas organoclorados 36 1.5.1.2 Inseticidas organofosforados 36 1.5.1.3 Inseticidas carbamatos 36 1.5.1.4 Inseticidas piretróides 36 1.5.1.5 Fenilpirazóis e Ciclodienos 37 1.5.2 Toxicodinâmica 37 1.5.2.1 Acetilcolinesterase 38 1.5.2.2 Canal de sódio regulado por voltagem 39 1.5.2.3 Receptores do ácido Gama-aminobutírico 40 1.5.3 Toxicocinética 41 1.5.3.1 Esterases 42 1.5.3.2 Oxidases de função múltipla 42 1.5.3.3 Glutationa S – Transferase 43 1.6 Estruturação genética de populações naturais avaliada por microssatélite 44 2. Justificativa 46 3. Objetivos 50 3.1 Objetivo Geral 51 3.2 Objetivos Específicos 51 4. Material e Métodos 52 4.1 Inseticida e diluente 53 4.2 Material biológico e área de amostragem 53 4.3 Definição do perfil de suscetibilidade das populações de campo de T. sordida: bioensaios quantitativos 59 4.4 Definição da taxa de mortalidade das populações de campo de T. sordida à dose diagnóstica: bioensaios qualitativos 61 4.5 Caracterização ambiental das localidades de estudo do município de Coração de Jesus 62 4.6 Estruturação genética das populações de T. sordida utilizando marcadores microssatélites 63 4.7 Quantificação da atividade de enzimas relacionadas com a detoxificação de inseticidas nas populações de T. sordida 65 4.7.1 Determinação da geração ideal dos triatomíneos para quantificação de atividade de enzimas relacionadas com a detoxificação de inseticidas 67 4.7.2 Determinação da idade ideal dos triatomíneos para quantificação de atividade de enzimas relacionadas com a detoxificação de inseticidas 67 4.7.3 Determinação do número amostral ideal para quantificação de atividade de enzimas relacionadas com a detoxificação de inseticidas 68 5. Resultados 69 5.1 Perfil de suscetibilidade das populações de T. sordida estudadas ao piretroide deltametrina 70 5.2 Taxa de mortalidade das populações de T. sordida estudadas em resposta à dose diagnóstica 83 5.3 Caracterização ambiental do município de Coração de Jesus - MG 87 xvii (18) 5.3.1 Caracterização das condições climáticas da região de interesse 87 5.3.2 Caracterização das unidades domiciliares avaliadas 89 5.3.3 Histórico de infestação triatominica e uso de inseticidas na região de interesse 94 5.3.4 Caracterização das atividades prestadas pelos agentes de campo 98 5.4 Ensaios moleculares de genética de população 99 5.5 Quantificação da atividade de enzimas relacionadas a detoxificação de inseticidas nas populações de T. sordida 103 5.5.1 Determinação da geração ideal dos triatomíneos para quantificação da atividade enzimática relacionada com detoxificacao de inseticidas 103 5.5.2 Determinação da idade ideal dos triatomíneos para quantificação da atividade enzimática relacionada com detoxificação de inseticidas 103 5.5.3 Determinação do número amostral ideal dos triatomíneos para quantificação da atividade enzimática relacionada com a detoxificação de insticidas 104 5.5.4 Perfil da quantificação da atividade de enzimas relacionadas com a detoxificação de inseticidas nas populações de T. sordida estudadas 111 6. Discussão 115 7. Conclusões 129 8. Considerações Finais 132 9. Referências Bibliográficas 134 10. Anexos 155 10.1 Anexo 1: Relatos na literatura da ocorrência de resistência de triatomíneos a inseticida. 156 10.2 Anexo 2: Mapa de conjunto das localidades de estudo de Coração de Jesus 168 10.3 Anexo 3: Questionário aplicado aos moradores das localidades de interesse visando descrever a unidade domiciliar bem como o possível uso de inseticida com fins domésticos e agrícolas. 169 10.4 Anexo 4: Questionário aplicado aos agentes de saúde que trabalham nas localidades de interesse visando detectar possíveis falhas operacionais no campo. 173 10.5 Anexo 5: Loci de microssatélites descritos para T.brasiliensis (Tb), T.dimidiata (TD), T.infestans (Tinfest_ms) e T.pseudomaculata (Tp). 176 10.6 Anexo 6: Protocolo para quantificação de atividade de enzimas relacionadas com a resistência a inseticidas testadas para T. sordida 177 10.7 Anexo 7: Análise Probit da Linhagem Referência de Suscetibilidade de T. sordida. 180 xviii (19) Introdução (20) 1.1 Doença de Chagas Causada pelo Trypanosoma cruzi Chagas 1909, a doença de Chagas (DC) é considerada uma enfermidade tropical, endêmica da América Latina e incluída na lista das doenças negligenciadas pela World Health Organization (WHO). A distribuição geográfica da infecção chagásica humana, incluindo reservatórios silvestres e vetores, se estende desde os Grandes Lagos da América do Norte até o sul da Argentina e do Chile (COURA & DIAS, 2009) sendo exceções as espécies do gênero Linchosteus e o complexo Rubrofasciata (SCHOFIELD & GALVAO, 2009). De enzoontia à antropozoonose, processo este resultante da ação antrópica, a DC é uma enfermidade dependente das variáveis de natureza primariamente econômicas, comumente associada a condições precárias de vida, mais diretamente relacionadas aos tipos de habitações favoráveis a colonização dos triatomíneos (SILVEIRA, 2000). Por este motivo é considerada uma doença marginalizada, a qual é atribuída pouca, ou mesmo, nenhuma prioridade política. Ainda hoje é um sério problema de saúde pública representando a principal causa de lesões cardíacas em jovens e adultos economicamente produtivos (MONCAYO & SILVEIRA, 2009). Estima-se que a enfermidade de Chagas acomete cerca de 12 a 14 milhões de pessoas em larga extensão na América Latina, englobando 15 países, com aproximadamente outras 28 milhões expostas ao risco de contaminação (WHO, 2002; SCHOFIELD et al., 2006; MONCAYO & SILVEIRA, 2009). No Brasil, acredita-se que cerca de um milhão e novecentas mil pessoas estejam infectadas (RASSI-JÚNIOR et al., 2010). A DC é caracterizada por uma fase aguda, assintomática ou sintomática, podendo evoluir para um quadro clínico crônico. A fase aguda é marcada por uma intensa parasitemia no sangue periférico. No início da infecção podem se manifestar reações locais causadas pela penetração do T. cruzi - chagoma de inoculação e/ou sinal de Romaña - geralmente acompanhadas por processo febril, atrelado ou não de poliadenia, hepatomegalia, esplenomegalia, cefaléia, dores musculares e articulares, anorexia, vômito, diarréia e também insuficiência cardíaca. Ressalta-se que muitas vezes nesta fase o paciente se apresenta assintomático, acompanhado apenas de febre, o que dificulta o diagnóstico médico. Já a fase crônica, caracterizada por diminuição da parasitemia periférica, pode ser categorizada em cinco formas: indeterminada, sintomática, cardíaca, digestiva e neurológica, sendo a primeira a mais comum (TEIXEIRA, 2007). Para o tratamento apenas dois fármacos estão disponíveis - Nifurtimox e Benzonidazol - cujo uso frequentemente ocasiona o aparecimento de efeitos colaterais inviabilizando sua utilização como droga ideal (URBINA & DOCAMPO, 2003). O percentual de cura destas drogas se apresenta em torno de 60-80% nos casos agudos e, de 10-20% nos crônicos. Um dos principais motivos associados a estas variações nos padrões de cura, são as diferentes (21) suscetibilidades do parasita a estes medicamentos. Em estudos preliminares recentes, SOUZA et al. (2010) demonstraram a eficácia do selênio como uma terapia adjuvante para alterações cardíacas já estabelecidos pela infecção por T. cruzi. Atualmente, no Brasil, somente o Benzonizadol está disponível para o tratamento. Mais de 200 espécies de reservatórios silvestres já foram encontradas infectadas por T. cruzi, dentre elas: marsupiais, carnívoros, quirópteros, lagomorfos, roedores e primatas não humanos. Nesse contexto, a DC pode apresentar dois ciclos epidemiológicos distintos: o silvestre e o doméstico. O primeiro ciclo é estritamente enzoótico no qual o parasito circula entre os triatomíneos e em um grande número de reservatórios naturais. No segundo ciclo, doméstico e antropozoonótico, o parasito circula entre o homem e seus animais domésticos por intermédio de um vetor sinantrópico (BARRETTO, 1979; LAINSON et al., 1979). Existe ainda um terceiro ciclo, de caráter peridoméstico, no qual mamíferos como os gambás associam o ciclo silvestre ao doméstico (FORATTINI, 1980; CARCAVALLO, 1985; MORENO & CARCAVALLO, 1999). A principal forma de transmissão em vastas áreas da América Latina é a vetorial, sendo dela dependentes as demais, tais como a transplacentária e a oral (GRANT et al., 1987; KIRCHHOFF et al., 1987; WHO, 1991; SCHOFIELD, 1994; DIAS, 2006; COURA & DIAS, 2009). Esta última forma de trasmissão tem sido registrada com bastante frequência, em áreas anteriormente indenes para transmissão da doença de Chagas humana. Desde as primeiras descrições de casos humanos da DC na Amazônia por SHAW e colaboradores em 1969 ocorreram até o ano 2000, cerca de 205 casos, sendo 178 agudos. Dentre esses 178, cerca de 67 casos apresentaram-se na forma de microepidemias familiares por transmissão oral, geralmente associada ao consumo de suco de açaí contaminado (NÓBREGA et al., 2009). Observa-se um novo cenário epidemiológico nestas áreas com padrões distintos de transmissão: transmissão oral, na qual triatomíneos infectados possivelmente são triturados contaminando diversos alimentos, principalmente o suco de açaí (PEREIRA et al., 2009); transmissão vetorial associada à ocupação profissional (COURA et al., 1994); e transmissão vetorial sem domiciliação. Recentemente tem sido atribuída atenção especial à transmissão vertical da doença de Chagas em países não endêmicos, nos quais estima-se que o número de pessoas infectadas distribuídas entre os quatro continentes (América do Norte, Europa, Ásia e Oceania) seja superior a 390 mil indivíduos (COURA & VIÑAS, 2010; RASSI-JR et al., 2010). Na Europa, a incidência de casos de DC parece estar relacionada ao intenso fluxo migratório de latinoamericanos chagásicos para estas regiões (DEVELOUX et al., 2010). Neste contexto, para COURA & VIÑAS (2010), os principais mecanismos de transmissão do T. cruzi estão ligados a transfusão sanguínea, transmissão vertical e transplante de órgãos. (22) Pelo exposto, considerando o grande número de reservatórios animais do T. cruzi, atrelado a ausência de drogas que possam ser utilizadas em larga escala, verifica-se a impossibilidade do controle na perspectiva do esgotamento das fontes de infecção. A inexistência de imunizantes não permite que se faça o controle pela proteção da população suscetível. Deste modo, resta como alternativa o controle do vetor por meio do emprego regular e sistematizado de inseticidas de ação residual nas habitações infestadas (controle químico) associado à melhoria das mesmas, de modo a tornar a unidade domiciliar (UD) refratária à colonização pelos triatomíneos (controle físico) (VILLELA et al., 2005). 1.2. Importância epidemiológica de Triatoma sordida Os triatomíneos pertencem a ordem Hemiptera, subfamília Triatominae e são conhecidos popularmente no Brasil como barbeiros, bicho de parede, furão, cascudo, percevejão, piolho de piassava, gandério, bicimo, chupão, fincão, bicudo, procotó e vum vum. Possuem hábito alimentar hematófago, embora já tenha sido relatado na literatura o coprofagismo e a hemolinfagia (LENT & WIGODZINSKY, 1979; SANDOVAL et al., 2000). São insetos hemimetábolos e possuem cinco estádios ninfais antes de chegar a fase de adulto sendo que em todos são capazes de transmitir o T. cruzi ao hospedeiro vertebrado (mamíferos). Até o momento foram descritas 141 espécies de triatomíneos distribuídas em seis tribos e 18 gêneros (GALVÃO et al., 2003; COSTA et al.., 2006; GALVÃO & ANGULO, 2006; BÉRENGER & BLANCHET, 2007; COSTA & FELIX, 2007; MARTÍNEZ et al., 2007). A espécie alvo deste trabalho foi Triatoma sordida, Stål 1859. Trata-se de uma espécie de porte mediano, com comprimento aproximado de 14-19 mm nos machos e 15-20 mm nas fêmeas. Exibe coloração variando entre marrom-claro e escuro, com manchas amarelo-palha na cabeça, pronoto, escutelo, hemiélitros, patas e conexivo. Este último se apresenta claro com manchas escuras que se assemelham a notas musicais (figura 1). Fonte: Cyro J. Soares Figura 1. Fêmea de Triatoma sordida Stål 1859. (23) T. sordida apresenta como centro de dispersão as áreas de cerrado brasileiras estendendo- se a Bolívia, Paraguai, Argentina e Uruguai (FORATTINI, 1980). Possui uma ampla valência ecológica que lhe permite habitar vários ecótopos e utilizar diversas fontes alimentares (FORATTINI et al., 1975; DIOTAIUTI et al., 1993). No ambiente silvestre, T. sordida é encontrado embaixo de cascas e dentro de ocos de árvores secas e esparsadas, típicas da região de cerrado (FORATINNI et al., 1971a ; DIOTAIUTI et al., 1993), podendo secundariamente ser encontrado na copa de palmeiras (BARRETTO et al., 1969). Trata-se de uma espécie nativa do país e, portanto, não erradicável. T. sordida é encontrado em baixas densidades no meio silvestre e com menor frequência quando a cobertura florestal se mostra mais ampla (FORATTINI et al. 1971b ; DIOTAIUTI et al., 1993). O meio natural não é considerado estável para as populações do vetor pela existência de predadores, competição com outros triatomíneos, escassez do encontro de populações de hospedeiros apropriados e seus ninhos, levando-os inclusive a se alimentarem de répteis (DIOTAIUTI et al., 1993). Quando o meio natural é degradado, estes apresentam a tendência de buscar ecótopos mais estáveis tais como o peridomícilio, que oferece abrigo, alimento e condições microclimáticas necessárias para o desenvolvimento de suas populações (FORATTINI et al., 1971b; DIOTAIUTI et al., 1993; SCHOFIELD et al., 1999). Esta espécie de triatomíneo está frequentemente associada ao peridomicílio e seus anexos sendo, portanto, nestas situações, um transmissor secundário da doença de Chagas. Sua marcada ornitofilia a faz um vetor menos importante que Panstrongylus megistus e Triatoma brasiliensis ainda que tanto quanto Triatoma pseudomaculata (SILVEIRA et al., 1993). Sobre os padrões de dispersão da espécie, FORATTINI et al. (1971b) formularam a hipótese que esta possa ocorrer por meio de dispersão passiva, em montes de lenha, de uma unidade domiciliar para outra. O encontro de ninfas desta espécie entremeadas a penas de pardais sugere dispersão por aves. FORATTINI et al. (1975) afirmam que a mobilidade de T. sordida é considerável e condiz com sua grande valência ecológica. Apresenta altas taxas de dispersão ativa e o período de invasão das casas por adultos é principalmente no final do primeiro semestre (FORATTINI et al., 1974). De acordo com um levantamento realizado em 1940 no Estado de Minas Gerais, a espécie P. megistus representava 79,8% dos triatomíneos capturados, T. sordida 9,7% e Triatoma infestans 9,3%, com taxas de infecção pelo T. cruzi de 41,3% , 6,0% e 15%, respectivamente. Em 1951, a situação não apresentava mudança substancial, exceto pelo avanço do T. infestans para o oeste do Estado (DIOTAIUTI et. al., 1997). Em 1979, a infecção global dos triatomíneos era de 6,6% e a espécie prevalente era o T. infestans (64,6%). Com a (24) implantação das atividades de controle, em 1989, chegou-se a uma quase eliminação desta espécie no Estado, e a uma significativa redução na população intradomiciliar de triatomíneos, o que resultou numa taxa global de infecção de 0,6%. As capturas de T. sordida, no entanto, já em 1985, mostravam uma forte tendência de elevação, sendo em 1989 cerca de quatro vezes maior que a referida para o ano de 1979 (DIOTAIUTI et. al., 1995 a,b). DIOTAIUTI et al. (1998) avaliando as ações de controle no município de Porteirinha, Minas Gerais, revelaram que dentre as 406 UD`s pesquisadas, cerca de 142 (34,9%) estavam infestadas por T. sordida, sendo que os ecótopos mais freqüentemente infestados foram montes de madeira, cercas, árvores, montes de telha, galinheiros e chiqueiros, em ordem decrescente. Atualmente, no Brasil, T. sordida é a espécie de triatomíneo mais capturada no ambiente artificial, sendo encontrada em Minas Gerais, Goiás, Bahia e sul do Tocantins. No Brasil Central é a espécie que representa maior risco para a transmissão natural da DC (SILVEIRA, 2000). Recentemente, em Macaúbas, Bahia, foram registrados sete casos agudos de DC, dos quais dois pacientes evoluíram para óbito. A investigação entomológica incriminou T. sordida como potencial vetor responsável pela ocorrência dos casos. Foi encontrada uma população intradomiciliar na pia da cozinha, local onde eram armazenados os alimentos que, provavelmente foram contaminados e ingeridos pelos moradores da residência (DIAS et al., 2008). A espécie também está associada à recente ocorrência de transmissão humana ao sul do Estado de Tocantins (Comunicação pessoal – Dra. Liléia Diotaiuti). 1.3. Controle vetorial da doença de Chagas As primeiras tentativas profiláticas para o controle dos triatomíneos no Brasil ocorreram na década de 20, porém, sem resultados muito satisfatórios. Ensaios incluindo pó de piretro, cianogás, lança-chamas e soda cáustica foram realizados, contudo, todas estas técnicas não foram adotadas de forma sistematizada considerando a impossibilidade de seu uso em larga escala bem como seu pouco efeito residual no ambiente (DIAS, 2002). De fato, até a década de 40 pouco se avançou na perspectiva do controle dos vetores da DC. Neste contexto, o surgimento dos inseticidas sintéticos representou uma nova possibilidade para o controle vetorial (DIAS et al., 2002). O marco inicial do controle da DC no Brasil foi a criação do “Centro de Estudos e Profilaxia da Doença de Chagas” pela Fundação Oswaldo Cruz no ano de 1943 em Bambuí (área endêmica em Minas Gerais) – sob coordenação do Dr. Henrique Aragão e chefia do Dr. Emanuel Dias (DIAS et al., 1952). Nesta época foram testados os primeiros inseticidas efetivos contra o vetor domiciliado e realizados novos inquéritos soroepidemiológicos e (25) eletrocardiográficos. Os grandes programas regionais de controle só adquiriram expressividade nos anos 60, em São Paulo, e ao final da década de 70 no país como um todo. Os primeiros inseticidas utilizados no controle de triatomíneos no Brasil foram os organoclorados (OC) (PINCHIN et al., 1980). Em 1942 foram realizados os primeiros ensaios biológicos ao Dicloro-Difenil-Tricloroetano (DDT). LENT & OLIVEIRA (1944) demonstraram em ensaios de campo que a ação tóxica deste ativo químico se processava mais rapidamente em adultos do que em formas jovens, com lenta penetração do produto no tegumento das ninfas, sem ação ovicida, protegendo as unidades domiciliares de reinfestações triatomínicas por um período de três a quatro meses. DIAS & PELLEGRINO (1948), em parceria com o Departamento Nacional de Endemias Rurais (DENERu), realizaram ensaios de suscetibilidade de triatomíneos com o DDT aspergido em superfície de barro, avaliando também o efeito residual do produto em diferentes concentrações e em diferentes substratos assim como a logística de aplicação em grande escala, nas vizinhanças de Uberaba/MG. Foi constatada sua ineficiência para o controle triatomicida. Em paralelo ao fracasso do DDT, ensaios de melhoria habitacional e educação sanitária foram incentivados. Neste momento o hexaclorobenzeno (BHC) começou a ser aventado como uma possibilidade no controle químico dos triatomíneos no Brasil. Em 1947, BUSVINE & BARNES verificaram, em condições de laboratório, intensa mortalidade de Rhodnius prolixus expostos a este inseticida, contudo, o mesmo apresentou pequena ação residual. DIAS & PELLEGRINO (1948) em ensaios de campo realizados na localidade de Água Comprida no município de Bambuí/MG, comprovaram que esse inseticida, quando aplicado na dose de 1,0 g de ingrediente ativo/m2, em no mínimo dois ciclos de borrifações intervalados por 30-60 dias, preservava o domicílio de infestações por triatomíneos até cinco meses após o tratamento. Como resultado deste e de outros trabalhos em 1950, Emannuel Dias conduziu a primeira grande campanha utilizando o BHC e o tiofosfato para o controle triatomínico junto ao Serviço Nacional de Malária (SNM), em 125 municípios de Minas Gerais. Foi preconizado um reconhecimento geográfico inicial, com borrifação seletiva, sendo que nas localidades rurais nas quais a maior parte das casas, pelo tipo de construção, favoreciam a colonização intradomiciliar dos triatomíneos, recomendava-se a cobertura integral. Foi realizado um primeiro expurgo em dois ciclos com curto intervalo de tempo, em áreas contíguas, seguindo-se de uma etapa de consolidação e vigilância (DIAS, 1957). Ressalta-se que as extensas campanhas em Minas Gerais utilizando o BHC (pó molhável: 500 mg i.a. /m2), aplicado em toda a extensão e profundidade de cada fresta ou rachadura, no intra e peridomicílio foram responsáveis pela redução em 90% da população triatomínica após quatro meses de tratamento (PINTO & BICALHO,1952). Estas experiências foram utilizadas para delinear o planejamento municipal do controle vetorial da DC, no que se (26) refere aos aspectos administrativos, operacionais e metodológicos para as atividades de rotina (SALGADO & PINTO, 1952; BUSTAMANTE & CARVALHO, 1957). No Brasil, em meados de 1954, o SNM decidiu testar o dieldrin como uma possibilidade de substituição ao BHC. Os ensaios realizados em duas localidades de Anápolis (Goiás), revelaram a ocorrência de intoxicações graves não só nos aplicadores, mas também nos animais domésticos. Deste modo, devido à elevada toxicidade somado ao alto custo, sua utilização foi descartada (PERLOWAGORA-SZUMLEWICZ, 1956). Nos anos 50 o Instituto Nacional de Endemias Rurais (INERu), criado na década anterior para o controle geral de endemias, se tornou a instituição responsável pela investigação da doença de Chagas, cujo controle passou a estar a cargo do Departamento Nacional de Endemais Rurais (DENERu), seguido em 1967 pela Superintendência de Campanhas de Saúde Pública (SUCAM) e, em 1991 pela Fundação Nacional de Saúde (FUNASA) (DIAS, 2002). Entre 1950 e 1975, as atividades de controle se mostraram pontuais e descontínuas em decorrência de um aporte insuficiente de recursos para dar atendimento a toda a extensa área com transmissão vetorial, exceto em São Paulo. Descontinuidades político-administrativas também contribuíram para este quadro. Certamente, muitos casos de doença de Chagas ocorreram nesse período, contribuindo significativamente para a alta prevalência de chagásicos crônicos que hoje demandam atendimento (SCHOFIELD et al., 2006). Em 1959, os carbamatos (CB) foram introduzidos no Brasil. O propoxur foi o único inseticida deste grupo que recebeu real atenção visando o controle dos barbeiros. Sua ação tóxica contra triatomíneos foi investigada, tendo sido demonstrada sua eficácia e propriedade ovicida (SHENONE et al., 1972). Outro carbamato que mereceu destaque foi o bendiocarb, que associado ao propoxur foi recomendado no passado pela WHO para o combate triatomínico (PINCHIN et al., 1984). Em 1973, o malathion foi avaliado em estudos de campo e laboratório por solicitação do INERu, tendo uso recomendado principalmente por apresentar ação ovicida (SHERLOCK & MUNIZ, 1975; SHERLOCK et al., 1976). Contudo, além de sua baixa persistência no ambiente, este produto exigia aplicações em dosagens mais altas do que as utilizadas para os organoclorados BHC e dieldrin. Outros organofosforados (OP) que foram testados com sucesso para o controle de triatomíneos no Brasil, mas que não foram utilizados na prática foram o fenitrotion, o clorpirifós e o pirimifós-metila (FOX et al., 1966). A partir de 1964 foi introduzido as atividades de controle no país o conceito de “arrastão”, que significou o tratamento com inseticida em todas unidades domiciliares da área de interesse. Em 1968, diferentemente do restante do país, São Paulo adotou a metodologia do (27) “expurgo seletivo” de focos residuais, na qual somente as UDs positivas para a presença de triatomíneos eram borrifadas, o que significava otimização de tempo, recursos, trabalho, além de reduzir a contaminação ambiental e promover a educação sanitária despertando o interesse dos moradores pelas borrifações (PEDREIRA de FREITAS, 1963; WANDERLEY et al., 2006) Em 1977/78 as ações de controle foram sistematizadas e estruturadas na forma de programa com alcance nacional, no qual foi priorizado de início o controle da transmissão primária vetorial em toda área endêmica do Brasil concentrando o máximo dos esforços no combate ao T. infestans. A manutenção de um índice de infestação domiciliar que inviabilizasse a transmissão em áreas com predominância de espécies de maior valência ecológica, tais como P. megistus, T. brasiliensis, T. sordida, T. pseudomaculata, dentre outras (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 1980) também foi priorizada. O modelo de controle da DC foi normatizado para o Brasil tendo como componentes quatro fases sucessivas de trabalho: i) fase preparatória; ii) fase de ataque; iii) fase de avaliação (consolidação) e iv) fase de vigilância epidemiológica (DIAS et al., 2002). Ao final da década de 70, o Programa de Controle da Doença de Chagas (PCDCh) alcançou bons índices de execução e impacto, com uma cobertura de aproximadamente 60% em atividades de pesquisa entomológica e borrifação (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 1980). Entre 1979 e 1985, com a priorização do PCDCh, foram atualizadas as informações sobre a distribuição dos triatomíneos e a prevalência da infecção humana. Foram promovidos inquéritos entomológicos e sorológicos, por amostragem, em todo o país. Com base nas informações obtidas foram redesenhadas as áreas endêmicas, identificadas aquelas de maior risco e, a partir daí, priorizadas as ações de controle (DIAS et al., 2002). No Brasil, o inquérito sorológico nacional realizado entre 1975 e 1980, por amostragem da população rural, residente em área endêmica e não endêmica para DC, indicou uma soroprevalência média para o país de 4,2%. Em escolares de 7 a 14 anos, residentes de municípios da área endêmica, a soro-reatividade era de aproximadamente 0,2%, entre 1986 e 1991. T. infestans, encontrado inicialmente em 711 municípios, estava reduzido a 98 municípios, acompanhado de diminuída densidade triatomínica (SILVEIRA & VINHAES, 1998). Na década de 80, a área endêmica original da DC compreendia 18 países, nos quais T. infestans (países do Cone Sul) e R. prolixus (países Andinos e da América Central) eram as espécies mais adaptadas ao domicílio. A prevalência humana pela infecção de T. cruzi era de 17 milhões de casos, com cerca de 100 milhões de pessoas expostas ao risco de contaminação, representando aproximadamente 25% de toda a população da América Latina (DIAS, 2009). No mesmo período, 36% do território brasileiro era considerado endêmico para a DC. Essa área correspondia a 2.493 municípios distribuídos nos Estados de Alagoas, Bahia, Ceará, Espírito (28) Santo, Distrito Federal, Goiás, Maranhão, Minas Gerais, Mato Grosso do Sul, Mato Grosso, Paraíba, Pernambuco, Piauí, Paraná, Rio Grande do Norte, Rio Grande do Sul, Sergipe e Tocantins (MONCAYO & SILVEIRA, 2009). Em 1983, o PCDCh alcançou a totalidade das áreas com triatomíneos domiciliados e o controle vetorial foi exercido em caráter pleno. O programa foi priorizado com recursos financeiros de um fundo social do governo federal denominado FINSOCIAL, que representou um acréscimo orçamentário de aproximadamente 45%, destinados para a contratação de recursos humanos e aquisição de insumos. Com esse complemento orçamentário, o programa atingiu, pela primeira vez, cobertura integral da área endêmica do país (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 1985). A partir de 1986, devido ao surgimento de epidemias de Dengue, observou-se uma redução nas atividades de combate aos triatomíneos, contudo, a borrifação foi mantida em amplas áreas do país (NOGUEIRA et al., 1999; SCHATZMAYR, 2000; BARBOSA da SILVA et al., 2002). Neste mesmo período, verificou-se a eficácia de vários piretróides (PI) com comprovada ação triatomicida, sendo a partir de então adotados no PCDCh (DIOTAIUTI et al., 1994; DIAS, 2002). Paralelamente à eliminação dos focos intradomiciliares, a infestação peridomiciliar assumiu maior importância e se tornou o maior desafio a ser enfrentado no controle vetorial, considerando como elementos importantes no combate triatomínico: a conservação da unidade domiciliar, o manejo/ordenação do peridomicílio e a detecção de exemplares em baixas densidades. Surgem os primeiros trabalhos sobre vigilância epidemiológica, tanto de forma passiva e participada, envolvendo a comunidade, quanto de forma ativa e institucional, iniciada em São Paulo (DIAS E GARCIA 1976; ROCHA & SILVA, 1979). Entre as décadas de 80 e 90, o PCDCh se estendia a 2450 municípios da área endêmica. No ínicio da década de 80, no Estado de Minas Gerais, relatórios oficiais indicavam que T. infestans era responsável por 64,6% dos triatomíneos capturados pelo PCDCh, seguido por T. sordida e P. megistus. Em 1989, após nove anos de borrifação, verificou-se uma redução de 68% na quantidade de exemplares de T. infestans capturados e um aumento no índice de T. sordida, seguido por P. megistus (FUNASA, 1995). Neste mesmo período, São Paulo alcançou a eliminação virtual do T. infestans e da transmissão vetorial decorrente desta espécie (DIAS, 2002). Ressalta-se que entre as décadas de 50 a 90 várias alternativas biológicas para o controle triatomínico foram testadas, contudo sem sucesso. Dentre elas, tem-se uso de nematóides, fungos e himenópteros predadores de ovos (DIAS & SCHOFIELD, 1999). Na década de 90, segundo o Banco Mundial, o peso relativo da DC, comparado com (29) outras enfermidades transmissíveis endêmicas da América Latina e Caribe, e medido por “Anos de Vida Ajustado à Incapacitação” (AVAI), só era inferior ao conjunto das enfermidades diarréicas, doenças respiratórias e da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) (DIAS, 2000, 2001). Análise dos PCDCh revelou que entre 1975 e 1995 teriam sido prevenidas 2.339.000 novas infecções e 337.000 óbitos por doença de Chagas, o equivalente a 11.486.000 AVAI. Estes números indicam ganho da ordem de US$ 17,00 para cada US$1,00 aplicado nas atividades de controle, o que classifica a DC na categoria das intervenções com alta efetividade (AKHAVAN, 1998). Sob essa perspectiva em 1991, Argentina, Bolívia, Brasil, Paraguai e Uruguai, apoiados pela Organização Panamericana de Saúde (OPAS), criaram uma Comissão Intergovernamental conhecida como a Iniciativa do Cone Sul (INCOSUL) com vistas a erradicar a infestação domiciliar por T. infestans e interromper a transmissão do T.cruzi por via transfusional (SCHOFIELD et al., 2006). Em 1997, foram estabelecidas mais duas iniciativas: a Iniciativa do Pacto Andino (IPA), composta pela Colômbia, Equador, Peru e Venezuela, e a Iniciativa dos Países da América Central (IPCA), formada por El Salvador, Guatemala, Honduras, Nicarágua, Belize, Costa Rica, México e Panamá. Em ambos os casos, foram priorizadas a eliminação de R. prolixus e Triatoma dimidiata, junto com Rhodnius pallescens no Panamá e Rhodnius equadoriensis no Norte do Peru (DIAS, 2002). A FUNASA, enquanto órgão do Governo Federal, no ano de 1999, acompanhou o processo de descentralização do PCDCh. Este, assim como outros programas de combate a endemias, foi reformulado com a redefinição das atribuições dos diferentes níveis de governo no planejamento e execução do mesmo. Com a publicação da portaria de n.° 1.399, do Ministério da Saúde de 15 de dezembro de 1999 e, posteriormente, da portaria de n.° 1.172, do Ministério da Saúde de 15 de julho de 2004, a execução de ações diretas do PCDCh passou a ser pactuada e desempenhada pelos muncicípios, cabendo aos níveis regional e estadual a fiscalização das ações, e ao nível federal o financiamento e a complementação de atividades deficitárias dos Estados. Tais pactuações foram metas estabelecidas entre os três níveis de gestão por meio das Comissões Interegestores Bipartite (CIB) e Comissões Intergestores Tripartite (CIT) baseadas na classificação de risco para a transmissão da DC. Cabe a CIB e a CIT estipular um percentual mínimo de UDs que devem ser visitadas em cada um dos municípios e nas quais se procederia uma busca ativa (Pesquisa Ativa – PA) de triatomíneos. Também prevê a borrifação de todas as UDs que apresentem foco triatomínico, seja esse confirmado por meio de PA ou de atendimento às notificações (BRASIL, 1999; BRASIL, 2004). Entre 1980 e 2000 verificou-se uma progressiva eliminação do T. infestans em vários Estados brasileiros somada a uma redução significativa nos índices de infestação intradomiciliar por triatomíneos em todo o país. Neste momento apareceram como desafios a manutenção da (30) vigilância epidemiológica e o controle triatomínico no âmbito peridomiciliar, local onde se encontravam os principais focos residuais (DIAS, 2002). Em 2005, em decorrência de 24 casos de infecção humana por T. cruzi via oral em Santa Catarina, foi realizada uma redefinição das áreas de risco embasada em variáveis entomológicas, ambientais, demográficas e de morbidade com objetivo de readequar os antigos modelos de vigilância epidemiológica aos novos padrões de transmissão (CONSENSO BRASILEIRO EM DOENÇA DE CHAGAS, 2005). Atualmente, o PCDCh está inserido dentro da Secretaria de Vigilância em Saúde (SVS) do Ministério da Saúde (MS). Passados 19 anos após a criação do INCOSUL as estratégias de controle da DC contribuíram para a redução significativa do índice de incidência que, na década de 90, registrava 700.000 novos casos por ano e, em 2006 diminuiu para 41.500 casos. As mortes foram reduzidas de 45.000 para 12.500 e o número de países endêmicos, de 18 para 15 (WHO, 2006). O controle nos bancos de sangue atingiu 100% de cobertura e o índice de infestação das casas por T. infestans foi reduzido de 166.000 insetos capturados para pouco mais de 40 exemplares em 2005, o que corresponde a uma redução de infestação de 99,7% para essa espécie (DIAS, 2006; FERREIRA & SILVA, 2006; MONCAYO & SILVEIRA, 2009). Deste modo, em 2006 o Brasil recebeu da OPAS a “Certificação Internacional de Eliminação da Transmissão da doença de Chagas por T. infestans” (DIAS, 2006). Contudo, ressalta-se que considerando a diversidade da fauna triatomínica brasileira com espécies nativas de comprovada importância epidemiológica, a vigilância epidemiológica (VE) é ferramenta fundamental para a manutenção nos níveis de controle vetorial obtidos até então, bem como a reduzida taxa de novos casos. Pelo exposto, é possível concluir que o controle químico dos triatomíneos tem se mostrado factível e eficaz, quando executado com apuro técnico e rigor metodológico e operacional necessários. Contudo, contradizendo as expectativas de alguns pesquisadores, em 2008 o encontro de três populações de T. sordida de Minas Gerais com suscetibilidade alterada a deltametrina alertou para a necessidade em se desenvolver estudos referentes ao potencial genético da resistência de triatomíneos a inseticidas de modo a definir a frequência com que este fenômeno vem ocorrendo, as áreas afetadas bem como identificar os mecanismos envolvidos (PESSOA, 2008). Desde novembro de 2009, a legislação que define diretrizes para a Vigilância em Saúde e seus diversos constituintes, dentre elas a Vigilância Epidemiológica, é a Portaria de n.° 3.525, que pautada nas diretrizes do Pacto pela Saúde, delineia o papel da VE e determina a sua inserção no contexto da Atenção Básica à Saúde. Em relação as portarias anteriores também foi alterado o processo de certificação dos municípios que até então era realizado por meio de uma (31) comprovação da capacidade técnica do mesmo para conduzir as ações de VE, sendo substituída pela adesão ao Pacto pela Saúde (BRASIL, 2009). Hoje, existem quatro grandes desafios referentes a doença de Chagas: i) a sustentabilidade dos níveis de controle atingidos, uma vez que com a descentralização das ações de controle da DC para a gestão municipal poderá ocorrer uma redução da prioridade das ações; ii) a perda de reconhecimento da importância da doença; iii) os novos padrões de transmissão cada vez mais comuns no Norte do país e iv) os relatos recentes, contudo cada vez mais constantes, de resistência a inseticida. 1.4. Resistência a inseticidas Nas últimas décadas, o controle químico de populações de insetos com importância em saúde pública tem sido prejudicado pela emergência de populações com elevados níveis de resistência a inseticida destacando-se: Blattella germanica (ZHAI & ROBINSON, 1992; ANSPAUGH et al., 1994; LEE et al., 2000), Pediculus humanus capitis (LEE et al., 2003; VASSENA et al., 2003), Cimex hemipterus e Cimex lectularius (LOFGREN et al., 1958; MYAMBA et al., 2002), Haematobia irritans (GUGLIELMONE et al., 2002), Anopheles sacharovi (HEMINGWAY et al., 1992), Anopheles arabiensis (MATAMBO et al., 2007), Anopheles gambiae (BROOKE et al., 2006), Anopheles funestus (HARGREAVES et al., 2000), Culex tritaeniorhynchu (TAKAHASHI & YASUTOMI, 1987; KARUNARATNE & HEMINGWAY, 2000), Culex quinquefaciatus (MAGNIN et al., 1988; BISSET et al., 1991; BRACCO et al., 1999), Aedes aegypti (GEORGHIOU et al., 1987; RAWLINS & WAN, 1995; KUMAR et al.,2002; BRENGUES et al.,2003; LIMA et al.,2003; BRAGA et al., 2004; PEREIRA da CUNHA et al., 2005; VALLE et al., 2006; BRAGA & VALLE, 2007; MARTINS et al., 2008; CHANG et al.,2009; MARTINS et al., 2009). A resistência a um inseticida se traduz em uma diminuição da mortalidade observada na população submetida a um tratamento constante. Trata-se de uma característica, que se manifesta com o predomínio de indivíduos que toleram doses letais sobre indivíduos chamados sensíveis nas primeiras aplicações do produto, ocasionando pressão de seleção nas populações. Este fenômeno tem como base a variabilidade genética de populações naturais, a partir da qual, por pressão do inseticida, determinados fenótipos podem ser selecionados e, consequentemente, aumentarem em frequência (TABASHNIK & ROUSH, 1990). Até recentemente, a resistência de triatomíneos a inseticida era considerada pontual e com pouca probabilidade de ocorrer já que o ciclo destes insetos é bastante longo, apresentando menor oportunidade de selecionar indivíduos resistentes (BROWN & PAUL, 1971; CHAMP & DYTE, 1976; GORLA & SCHOFIELD 1989; SCHOFIELD 1989; PACHECO et al., 1990; (32) GORLA 1991; GORLA 1994). A primeira evidência bem documentada deste fenômeno foi a de populações venezuelanas de R. prolixus ao dieldrin, no Estado de Trujillo. Durante 1976 e 1977, populações de R. prolixus e Triatoma maculata revelaram resistência ao dieldrin e ao propoxur (GONZÁLEZ-VALDIVIESO et al., 1971; COCKBURN, 1972; NOCERINO & HERNANDEZ, 1986). Na Venezuela, NELSON & COLMENARES (1979) relataram populações de R. prolixus, provenientes da localidade de Santo Domingo, resistentes ao dieldrin e ao BHC. Na Colômbia, FOX et al. (1966) encontraram populações de R. prolixus com indicativo de resistência ao dieldrin e ao malathion. Populações de T. infestans do sul do Peru demonstraram alta sobrevivência ao dieldrin FOX et al. (1966). VASSENA et al., (2000) relataram população brasileira de T. infestans resistente a deltametrina (razão de resistência - RR 7,0), β-ciflutrina (RR 3,6) e a cipermetrina (RR 3,3) e de R. prolixus venezuelana resistente a cipermetrina (RR 12,4). Na Argentina, VASSENA & PICOLLO (2003) registraram níveis de resistência incipiente a deltametrina em quatro amostras de T. infestans procedentes das províncias de Catamarca (RR 2,6), San Luis (RR 3,0), Mendoza (RR 3,8) e Salta (RR 5,6) atribuída ao aumento da atividade de esterases e oxidases de função mista GONZÁLEZ- AUDINO et al. (2004). PICOLLO et al. (2005) demonstraram resistência a deltametrina em T. infestans provenientes de El Chorro (RR 99,0), La Toma (RR 86,9), El Sauzal (RR 50,5), e Salvador Mazza (RR 133,1) atribuída ao aumento de esterases (SANTO-ORIHUELA et al. 2008). TOLOZA et al. (2008) relataram resistência em ovos de T. infestans oriundas de Salvador Mazza (RR 114,28). No Brasil, PESSOA (2008) relatou níveis de resistência incipiente a deltametrina em populações de Triatoma sordida capturadas nos municípios de Presidente Juscelino (RR50 5,5), Bocaiúva (RR50 6,2) e Coração de Jesus (RR50 6,8), no Estado de Minas Gerais. GERMANO et al. (2010) avaliaram a suscetibilidade de populações de T. infestans da região do Gran Chaco, coletadas na Bolívia, Argentina e Paraguai a deltametrina e ao fipronil. As populações argentinas se mostraram altamente resistentes a deltametrina (RR50 247,7 a 541,6) diferentemente das bolivianas (RR50 0,9 a 133,1) e paraguaia (RR50 3,7). Com relação ao fipronil um perfil diferente foi observado, com altos valores de resistência para Bolívia (RR50 0,19 a 92,7) e baixos para Argentina (RR50 1,09 a 1,9). ACEVEDO et al. (2011) relataram populações dos vales andinos bolivianos de T. infestans resistentes a deltametrina (RR50 1,9 a 17,4) e ao fipronil (RR50 0,5 a 139,2). A persistência atual de T. infestans e a transmissão contínua da doença de Chagas nos vales Andinos e no Gran Chaco na Bolívia tem sido questionadas considerando que são exatamente as regiões nas quais populações silvestres destes vetores têm sido encontradas. Essas observações poderiam indicar uma possível relação entre os dois acontecimentos (NOIREAU, 2009). AMELOTTI et al, (2011) estudando uma população de insetário de T. infestans, avaliou a suscetibilidade de ninfas geradas por fêmeas individuais, com idades distintas, a deltametrina. (33) Foi observado que as fêmeas mais velhas geravam proles mais suscetíveis enquanto as mais jovens, proles mais resistentes. Os autores, partindo de tal observação, inferiram que os resultados dos bioensaios para verificação do status de suscetibilidade destes vetores a inseticidas podem variar dependendo da estação do ano, na qual a coleta dos insetos for realizada considerando a dinâmica do ciclo de vida destes insetos em concordância com condições ambientais. A dinâmica da evolução da resistência depende da biologia populacional da espécie em estudo, do nível de exposição a um inseticida e de como que estes fatores serão influenciados pela quantidade de indivíduos sem contato com o inseticida somado ao fluxo gênico entre as populações da área tratada e não tratada. Numerosos estudos sobre a herança da resistência a inseticidas para piretróides demonstram que este fenômeno é herdado de maneira autossômica, com distintos graus de dominância ou recessividade incompleta. GERMANO et al., (2010) demonstraram em estudos realizados com T. infestans, que se trata de um caráter herdado de maneira autossômica e semidominante. Quanto ao número de genes envolvidos no fenômeno da resistência, existem evidências que indicam ser este poligênico. A resistência a inseticidas é o resultado de alguma modificação que pode afetar características fisiológicas ou comportamentais dos insetos. Independente do caráter mono ou polifatorial da resistência, os mecanismos responsáveis por ela podem ter origem comportamental, fisiológica e/ou bioquímica além da modificação do sítio alvo (BROGDON & MCALLISTER, 1998). A resistência de origem comportamental se refere a capacidade do inseto em evitar a presença do inseticida, por meio de modificações genéticas nos receptores periféricos dos estímulos e/ou nos sistemas centrais de processamento dos mesmos (LINES et al., 1987; MBOGO et al., 1996; MATHENGE et al., 2001). Compostos do tipo DDT e PI podem induzir mudanças comportamentais nos insetos como, por exemplo, redução da proporção de mosquitos que entram nas habitações e mudança no período de maior atividade dos mesmos (HEMINGWAY et al., 2004). LOKWOOD et al. (1984) e ROBERTS & ALECRIM (1991) relataram alteração comportamental de Anopheles darlingi em resposta ao DDT na Amazônia. Dois meses após a aplicação do produto foi observada seleção de fêmeas que entravam nas habitações, efetuavam o repasto sanguíneo, contudo, saiam rapidamente sem pousar nas paredes. Sabe-se também que vários insetos podem evitar contato, por exemplo, com plantas tóxicas típicas de seu nicho ecológico. Esse tipo de mecanismo pode ser determinado geneticamente (como a escolha por sítio de postura) ou pode ser resultado de um processo de aprendizagem (como a escolha, por larvas, de plantas não tóxicas, ou ainda de um estágio da planta em que a toxina se encontra em baixos níveis – ou mesmo ausente) (DEPRÉS et al., (34) 2007). A resistência de origem fisiológica se relaciona com a redução da penetração do inseticida por alteração da cutícula do inseto e/ou na armazenagem/excreção do inseticida (APPERSON & GEORGHIOU, 1979). O espessamento da cutícula dos espécimes e/ou a alteração de algumas de suas características fisicoquímicas, podem ocasionar diminuição de permeabilidade e consequente, redução da taxa de penetração (GEORGHIOU, 1994), podendo conduzir a resistência a vários xenobióticos. A taxa de penetração no tegumento varia consideravelmente entre as espécies e os estádios de vida. Segundo BRAGA & VALLE (2007a,b) este mecanismo normalmente está associado a um baixo nível de resistência atrelado a outros mecanismos. Tais alterações podem contribuir para a ocorrência de resistência cruzada. MOUGABURE CUETO et al. (2005) investigaram a atividade inseticida de 1-dodecanol sobre o desenvolvimento da cutícula em R. prolixus e T. infestans. As ninfas I recém eclodidas (1-3 horas de idade) foram mais sensíveis que as mais velhas (24-36 horas de idade) indicando a cutícula como uma importante variável na intoxicação dos triatomíneos e uma primeira barreira a ser vencida pelo inseticida para o encontro do mesmo com seu sítio alvo. Ensaios realizados com adultos não revelaram diferenças da atividade inseticida quando o efeito da barreira da cutícula foi anulado. Recentemente, PEDRINI et al. (2009) demonstraram por microscopia eletrônica de varredura que populações resistentes de T. infestans apresentavam maior espessura do exoesqueleto (32,1 ± 5,9 µm), quando comparadas com populações suscetíveis (17,8 ± 5,4 µm), sugerindo o mecanismo de penetração como o participante pela resistência de populações naturais argentinas de T. infestans a deltametrina. Os mecanismos bioquímicos da resistência se fazem perceber por um aumento significativo da atividade de enzimas detoxificativas, em especial, oxidases de função mista (OFM) e esterases (EST) (RANSON et al., 2002; ZERBA, 2002; HEMINGWAY et al., 2004). Trata-se de uma resistência bastante plástica uma vez que estas enzimas tem funções parcialmente redundantes somado ao fato de serem codificadas por superfamílias gênicas (RANSON et al., 2002). WOOD et al., (1982) e SILVORI et al. (1997) estudando T. infestans encontraram correlação entre os níveis de expressão de GST e a resistência a inseticida. CASABÉ & ZERBA (1981) relataram resistência de T. infestans a organofosforados devido ao aumento da atividade de esterases. VASSENA et al. (2000) atribuíram a resistência de T. infestans à deltametrina a um aumento da atividade detoxificativa de oxidases de função mista. AUDINO et al. (2004) atribuíram as esterases uma possível causa de resistência de T. infestans ao piretróide (35) deltametrina. SANTO-ORIHUELA et al., (2011) incriminaram o aumento da atividade de esterases (avaliadas com os substrados alfa e pNPA) como mecanismo causal da resistência a deltametrina em populações argentinas de T. infestans. Alterações nos sítios alvo (canal de sódio, acetilcolinesterases e receptores GABA) foram relatadas como mecanismo causal de resistência a inseticidas (DEVONSHIRE & MOORES, 1984; BROGDON & MCALLISTER, 1998). Uma característica da resistência é que os indivíduos resistentes apresentam um custo adaptativo, ou seja, são menos aptos que os suscetíveis quando o produto químico não é utilizado. Este menor valor adaptativo dos indivíduos resistentes pode estar associado a uma menor viabilidade total, menor fecundidade, maior tempo para o desenvolvimento, menor competitividade para o acasalamento, maior suscetibilidade para os inimigos naturais, etc, sendo assim, o restabelecimento da suscetibilidade pode ser observado em situção em que um determinado produto não é utilizado por um certo período de tempo (GEORGHIOU, 1972). Em contrapartida, existem mecanismos de resistência que podem ter um efeito positivo no fitness dos insetos. A expressão de GST, porexemplo, pode influenciar na longevidade de Drosophila melanogaster, provavelmente devido a proteção de tecisod contra espécies reativas de oxigênio (MCELWEE et al.,2007; RIVIERO et al., 2010). A imigração de indivíduos suscetíveis de áreas não tratadas para as tratadas pode contribuir na diminuição da frequência do alelo resistente (OBARA, 2010). A rapidez com que este restabelecimento se processa depende de vários fatores, dentre estes, a espécie de inseto, o produto químico, o mecanismo de resistência, e o ecossistema (GEORGHIOU, 1972). 1.5. Toxicologia de inseticidas 1.5.1. Classificação dos inseticidas São consideradas inseticidas as substâncias químicas utilizadas para matar insetos, sendo sua descoberta, isolamento, síntese, avaliação toxicológica e quantificação de impacto ambiental um vasto tópico de pesquisas no mundo inteiro (MARICONI, 1963). As principais classes de ativos químicos utilizados no controle de vetores de doenças são: os organoclorados, organofosforados, carbamatos, piretróides e fenilpirazóis (FE). (36) 1.5.1.1. Inseticidas organoclorados Os organoclorados são inseticidas que contém, principalmente cloro, hidrogênio e carbono em sua composição, apresentando estabilidade química elevada atribuída a existência de várias ligações dos tipos H-C, C-Cl e C-C nas moléculas. São classificados em quatro grupos: difenilalifáticos, hexaclorociclohexano, ciclodienos e policloroterpenos (D`AMATO et al., 2002; WARE & WHITACRE, 2004; BLOOMQUIST, 2009). Os produtos mais conhecidos e amplamente utilizados pertencentes a este grupo são o DDT e o BHC. 1.5.1.2. Inseticidas organofosforados Os inseticidas organofosforados derivam do ácido fosfórico e sua classificação depende dos átomos que estão unidos diretamente ao fósforo central. As subclasses mais importantes são a dos fosfatos que apresenta um oxigênio ligado a um átomo de fósforo; dos fosforotionatos ou fosforoditioatos, que apresentam enxofre; dos fosforoamidotionatos, que tem um átomo de nitrogênio, e fosfonato, que tem um átomo de carbono ligado ao fósforo central da molécula. Estes inseticidas são subdivididos em três grupos: alifáticos, derivados de fenil e heterocíclicos. Os ativos químicos mais comumente conhecidos pertencentes a este grupo são malathion, parathion, fenitrothion e temephos. 1.5.1.3. Inseticidas carbamatos Os inseticidas carbamatos são ésteres de ácido carbâmico. Tratam-se de produtos solúveis em solventes orgânicos, inodoros, sistêmicos para as plantas, além de instáveis o que lhes confere uma rápida degradação no meio ambiente com persistência de um a três meses. Os mais utilizados em saúde pública são: o propoxur, o carbaril e o bendiocarb (CECCHINE et al., 2000). 1.5.1.4. Inseticidas piretróides Os piretróides são compostos sintéticos derivados das piretrinas naturais cuja variação está baseada na modificação na estrutura das piretrinas de tipo I e II. A maioria dos piretróides possuem dois ou três centros quirais, o que leva ao aparecimento de quatro a oito isômeros geométricos e ópticos determinando diferenças na atividade biológica (ZLOTKIN, 1999). Os piretróides mais estáveis foram obtidos mediante substituição dos centros fotolábeis dos compostos originais por derivados sintéticos com maior fotoestabilidade e uma menor toxicidade para mamíferos. São exemplos de ativos químicos deste grupo a lambdacialotrina, (37) cipermetrina, alfa-cipermetrina e deltametrina. 1.5.1.5. Fenilpirazóis e ciclodienos Os fenilpirazóis (FE) pertencem a uma classe química que possui grande atividade inseticida e cuja efetividade diferencial é determinada pela adição de diversos substituintes. O modo de ação destes compostos é similar ao dos inseticidas policlorocicloalcanos bloqueando os canais de cloro dependentes do ácido gama-aminobutírico (GABA). Este efeito de envenenamento sobre o sistema nervoso central se produz mediante o antagonismo com o neurotransmissor GABA. Normalmente, quando o GABA é liberado na porção terminal da fenda pré-sináptica se une a um receptor proteico pós-sináptico que contem intrinsicamente um canal de íon de cloro. Quando o GABA se une a seu receptor, os canais se abrem e os íons de cloro fluem para dentro da fenda póssináptica. Esta permeabilidade do cloro pode hiperpolarizar (tornar mais negativo) a membrana fazendo com que seja mais difícil alcançar o limiar para disparo do impulso nervoso. A otimização dos fenilpirazóis e compostos afins para atividade inseticidas levou ao desenvolvimento do fipronil (BLOOMQUIST, 1996). Os inseticidas ciclodienos, como clordano, aldrin e dieldrin, surgiram após a Segunda Guerra Mundial. A maioria deles é persistente e estável no solo; e estável, quando exposta à luz solar ou ultravioleta. Por essas características, foram usados principalmente como inseticidas para o controle de térmitas e outros insetos cujas fases larvares alimentam-se nas raízes de plantas. Os ciclodienos inibem o receptor de ácido gama-aminobutírico (GABA), que, após ligação do neurotransmissor, aumenta a permeabilidade dos neurônios aos íons cloreto. Ao contrário do DDT e dos HCH, os ciclodienos apresentam uma correlação positiva entre temperatura e toxicidade. Ressalta-se que apesar do avanço industrial na síntese de diferentes análogos dos inseticidas, com conseqüente aumento da complexidade de suas moléculas, não houve ainda nenhuma mudança no sítio alvo de ação dessas substâncias, que continuam sendo desenhadas para interferir no receptor de GABA, no canal de sódio ou sobre a atividade da enzima acetilcolinesterase (ACE). 1.5.2. Toxicodinâmica A interação das moléculas de inseticidas com seus sítios de ação e suas conseqüências é o objeto de estudo da toxicodinâmica (STARK & BANKS, 2003). Os diversos tipos de inseticidas atuam no sistema nervoso central dos insetos, contudo, de acordo com suas propriedades químicas, apresentam sítios de ação específicos. Existem três (38) principais alvos: a enzima ACE (alvo dos OP e CA) codificada pelo gene Ace; o canal de sódio (alvo de PI e OC tipo DDT) codificado pelo gene NAV; e os receptores GABA (alvo dos FE) codificado pelo gene Rdl. Mudanças em resíduos de aminoácidos em sítios específicos modificam a sensibilidade do sítio-alvo comprometendo a ligação do inseticida com o mesmo, diminuindo ou anulando assim seus efeitos (BROGDON & McALLISTER, 1998). 1.5.2.1. Acetilcolinesterase A acetilcolinesterase (ACE) faz parte da superfamília das Serino-esterases, exibindo em seu sítio catalítico uma tríade formada por resíduos de serina, histidina e glutamato. A maior parte das ACEs é ativa na forma de dímeros e possui reação rápida: uma única enzima hidrolisa cerca de 104 moléculas de substrato por segundo (SOREQ & SEIDMAN, 2001). Trata-se de uma enzima essencial no sistema nervoso de todos os animais, estando presente nas membranas pós-sinápticas, e seu principal papel é interromper a transmissão nervosa, reduzindo a concentração de acetilcolina na fenda sináptica, hidrolisando-a em colina e acetato, produtos que não mais estimulam o neurônio pós-sináptico. No caso de resistência a inseticidas organofosforados e carbamatos verifica-se uma alteração ou diminuição à sensibilidade da acetilcolinesterase (VILLATE & BACHMANN, 2002). Esses inseticidas não serão mais capazes de inibir à ACE permitindo a interrupção normal do estímulo. Em insetos, além do envolvimento da ACE na neurogênese em Drosophila melanogaster (HUCHARD et al., 2006), muito pouco se sabe sobre suas funções. Comparação de sequências e análises filogenéticas indicam que a maioria dos insetos apresenta dois genes ace, denominados ace-1 e ace-2 (WEILL et al., 2002; KAKANI et al., 2011). O papel fisiológico de cada um deles ainda não está claro. Ace-1 está relacionado com a resistência a inseticida na maioria dos insetos, com exceção das moscas uma vez que estas perderam este gene ao longo da sua evolução (WEILL et al., 2002; HUCHARD et al., 2006). A mutação “clássica” de ace-1 em mosquitos que confere resistência a inseticida é a G119S que consiste na substituição de uma glicina por uma serina (WEILL et al., 2003). O fato de estar presente em pelo menos duas espécies de Anopheles e de Culex (WEILL et al., 2004; LABBÉ et al., 2007) sugere grande conservação estrutural e funcional (HUCHARD et al., 2006). Estudos desenvolvidos com populações de Culex pipiens em Montpellier, França, indicaram que a mutação só é vantajosa na presença do ativo químico e na época da borrifação, com diminuição do fitness destes mosquitos, referida pelos autores como um “custo” da resistência, quando na ausência do inseticida (LENORMAND et al., 1999; LENORMAND & RAYMOND 2000; LEBBÉ et al., 2007). Há indícios de que as mutações estejam próximas ao sítio catalítico da enzima. (39) Outras substituições no gene ace-1 associadas com resistência a inseticidas em mosquitos são: F331W, em Culex tritaeniorhynchus, que consiste na substituição de uma fenilalanina por um triptofano (HEMINGWAY et al., 2004; NABESHIMA et al., 2004) e a substituição de uma fenilalanina por uma valina na posição 290 verificada em uma população de C. pipiens da Ilha do Chipre (ALOUT et al., 2008). Recentemente, a resistência a inseticidas também foi associada à deleção de três glutaminas na região C-terminal da cadeia peptídica da enzima ACE, longe de seu sítio calatítico (KAKANI et al., 2011). Até o momento, em triatomíneos não existem relatos de mutações na acetilcolinesterase relacionados com a resistência a inseticidas. 1.5.2.2. Canal de sódio regulado por voltagem No incício da década de 50, poucos anos após o início da utilização do DDT como inseticida, foram descritas linhagens de moscas domésticas resistentes. Estes insetos, ao serem expostos ao DDT, ou não sofriam paralisia seguida de morte ou apresentavam uma paralisia momentânea seguida de total recuperação motora. O fenótipo ficou conhecido como Kdr (do inglês Knockdown resistance) (BUSVINE & BARNES, 1957; MILANI, 1954). Desde a introdução dos piretróides, foram observados insetos resistentes exibindo o fenótipo kdr, por pressão seletiva prévia exercida pelo DDT, caracterizando-se em resistência cruzada entre estes compostos (HEMINGWAY & RANSON, 2000). O mecanismo de resistência kdr ocorre devido a uma redução na sensibilidade do alvo ao inseticida, de 10 a 20 vezes. Linhagens Kdr de algumas espécies podem ter aumento de até 100x na resistência, efeito que é denominado super- kdr. Os alelos que conferem resistência kdr e super-kdr são recessivos e podem persistir em baixos níveis na população (DAVIES et al., 2007). Cerca de três décadas após a identificação do efeito Kdr, estudos eletrofisiológicos em células ou tecidos neuronais sugeriram que os sítios de ação dos piretróides seriam os canais de sódio dependentes de voltagem (NAV). Estes trabalhos indicavam que a resistência cruzada entre piretróides e DDT poderia estar relacionada a este canal (PAURON et al., 1989). Paralelamente foi clonado e sequenciado o gene paralytic (para) de D. melanogaster, que está situado no locus relacionado a alterações de comportamento e paralisia a altas temperaturas semelhantes aquelas produzidas por piretróides e DDT (Knockdown) (LOUGHNEY et al., 1989). Comparações com sequências de vertebrados revelaram que para é homólogo a genes codificantes de NAV (LOUBHNEY & GABETZKYM, 1989). Em seguida, ficou também evidenciado em uma linhagem de moscas domésticas resistentes ao DDT, que o locus homólogo ao para estava fortemente ligado ao fenótipo Kdr (WILLIAMSON et al., 1993; KNIPLE et al., 1994). Esta evidência se estendeu a outras espécies de insetos pragas ou vetores. A primeira mutação identificada com ligação ao fenótipo Kdr foi a substituição de uma (40) leucina por uma fenilalanina (Leu1014Phe) no segmento S6 do domínio II do gene NAV de Musca domestica (INGLES et al., 1996), e em vários outros modelos biológicos (tabela 1). Tabela 1. Mutações identificadas no gene NAV de insetos relacionadas à resistência a inseticidas. Espécies Mutações identificadas Referências Aedes aegypti I1011M I1011M +G923V I1011M+L982T V1016I I1011V; V1016I; V1016G Martins et al. (2005) Brengues et al. (2003) Brengues et al. (2003) Martins et al. (2009) Saavedra-Rodrigues et al. (2007); Rajatileka et al. (2008) Anopheles gambiae L1014F L1014S Martinez-Torrez et al. (1998) Ranson et a.l (2000); Pinto et al. (2006) Bemisia tabaci M918V; L952I Morin et al. (2002) Blatella germanica L1014F L1014F+M918T L1014F+E435K+C785R L1014F+D59G+C785R+ P1999L Miyazaki et al. (1996); Dong (1997) Martinez-Torres et al. (1997) Liu et al. (2000) Liu et al. (2000) Boophillus microplus F1538I He et al. (1999) Ctenocephalides felis T929C; T929V Bass et al. (2004) Culex pipiens L1014F; F1014S Martinez-Torrez et al. (1999ª) Culex quinquefasciatus L1014F Xu et al. (2005) Drosophila melanogaster I253N; A1410V; A1494V,M1524I Pittendrigh et al. (1997) Frankliniella occidentalis T929C; T929V Forcioli et al. (2002) Helicoverpa armigera D1549V+E1533G Head et al. (1998) Heliothis virescens L1014H V410M D1549V+E1533G Park & Taylor (1997) Park et al. (1997) Head et al. (1998) Haematobia irritans L1014F+M918T Guerrero et al. (1997) Leptinotarsa decemlineata L1014F Lee et al. (1999b) Musca domestica L1014F;L1014F+M918T Ingles et al.(1996); Miyazaki et al. (1996); Williamson et al. (1996); Martinez-Torres et al. (1997); Davies et al. (2007) Myzus persicae L1014F Martinez-Torrez et al. (1999b) Pediculus capitis T929I+L932F Lee et al. (1999b) Plutella xylostella L1014F+T929I L1014F+M918T Schuler et al. (1998) Martinez-Torres et al. (1997) Triatoma infestans L1014F Fabro et al. (2012) FABRO et al. (2012) partindo do genoma de R. prolixus clonaram e sequenciaram a região IIS6 do canal de sódio de T. infestans. Em um estudo com dez ninfas de primeiro estádio suscetíveis e resistentes a deltametrina (RR 35,7), foi observado respectivamente genótipo e fenótipo selvagem e substituição no sítio 1014 de uma leucina por uma fenilalanina. 1.5.2.3. Receptores do ácido Gama-aminobutírico Nos insetos, os receptores do ácido gama-aminobutírico estão presentes nas junções neuromusculares e no SNC. Em condições normais, esses receptores desencadeiam o mecanismo inibitório que restabelece o estado de repouso do SNC. Após a transmissão normal (41) de um impulso nervoso ocorre a ligação de GABA ao seu receptor pós-sináptico provocando um aumento da permeabilidade da membrana e conseqüentemente a entrada de íons cloreto (HEMINGWAY & RANSON, 2000). Os inseticidas ciclodienos e policloroterpenos, assim como as avermectinas, atuam sobre os receptores GABA impedindo a entrada de íons cloreto para o meio intracelular, antagonizando o efeito “inibitório” de GABA e provocando impulsos espontâneos que geram convulsões, paralisia e morte. A resistência ocorre pela diminuição da sensibilidade dos receptores de GABA aos inseticidas (HEMINGWAY & RANSON, 2000). 1.5.3. Toxicocinética A toxicocinética é a ciência que estuda a interação entre o inseto e o inseticida, contemplando os mecanismos de absorção, penetração, armazenamento, metabolização e excreção (STARK & BANKS, 2003). A partir do primeiro contato do inseto com o inseticida, o mesmo será interiorizado através dos mecanismos de penetração, ingestão e/ou inalação pelos espiráculos. A penetração é o mecanismo mais comum, uma vez que a maioria dos inseticidas sintéticos apresentam características lipofílicas (MATSUMURA, 1963; GRISSON et al., 1989). Alguns autores afirmam que a velocidade com que determinados inseticidas atingem o sítio alvo é favorecida pelas rotas de penetração via espiráculos (GEROLT, 1965, 1969; SUGIURA et al., 2008). Logo após a entrada do ativo químico é disparado um processo de biotransformação responsável por sua transformação em outra substância com propriedades diferentes da droga original, com características mais hidrofílicas passíveis de serem eliminadas (GOODMAN & GILMAN, 2006). Tais reações são catalizadas por um sistema multienzimático no qual as principais enzimas participantes são as esterases, oxidases de função mista e glutationas S- transferases (SHEEHAN et al., 2001). Neste processo, três fases estão envolvidas: a fase I (de modificação química da molécula exógena), a fase II (de conjugação) e a fase III (compartimentalização e/ou excreção dos metabólitos não tóxicos gerados) (FROVA, 2006). As enzimas de fase I, como as OFM e EST, introduzem um grupo reativo polar na molécula de inseticida, por reações de oxidação e hidrólise, respectivamente. Os produtos resultantes dessa reação podem ser excretados diretamente ou sofrer reações de conjugação (Fase II – enzima GST), até se tornarem moléculas solúveis passíveis de serem eliminados. Todas essas enzimas agem de maneira integrada, diminuindo a quantidade do xenobiótico e seu tempo de permanência no organismo do inseto (SHEEHAN et al., 2001). O aumento na atividade das enzimas detoxificativas pode resultar de uma série de alterações (HEMINGWAY & RANSON, 2000; HEMINGWAY et al., 2004; LI et al., 2007), (42) que incluem: amplificação gênica, expressão gênica alterada e mudança estrutural. 1.5.3.1. Esterases As esterases apresentam dobramento alfa/beta, incluindo as lipases, colinesterases, fosforotriesterases e proteases, dentre outras. É uma família bastante versátil, compreendendo proteínas com funções muito especializadas, com grande seletividade por substratos (como ACE e hormônio juvenil esterase) e outras menos específicas, com preferência por diferentes substratos (NARDINE & DIJKSTRA, 1999; HOTELIER et al., 2004; MONTELLA et al., 2012 ). Em geral, a atividade das EST depende de uma tríade catalítica constituída por um resíduo de serina, um de histidina e um glutamato ou aspartato. O processo pelo qual estas enzimas clivam ligações éster envolve a formação e degradação de um complexo “acil-enzima”. Inicialmente ocorre a formação de um intermediário enzima-substrato. A porção alcoólica deste é liberada resultando na formação do complexo “acil-enzima”. A hidrólise posterior deste complexo libera a porção ácida do substrato e regenera a enzima (GLYNN 1999, WHEELOCK et al., 2005; SATOH & HOSOKAWA 2006). Existem evidências de que as esterases participam de processos endógenos, que ocorrem naturalmente nos insetos, como por exemplo o processamento de sinais relacionados com a percepção de cairomônios e feromônios (OAKESHOTT et al., 2010). É bem descrito na literatura o papel dessas enzimas na regulação dos títulos de hormônio juvenil nos estádios larval e pupal dos insetos (ANSPAUGH & ROE, 2005; ANAND et al., 2008), sendo conhecidas por Esterases do Hormônio Juvenil (JHE). 1.5.3.2. Oxidases de função múltipla As oxidases de função múltipla (também conhecidas como citocromo P450 monooxigenase, monooxigenase polisubstrato, proteína heme tiolato) formam uma superfamília de enzimas, presente em todos os organismos aeróbicos (SCOTT, 1999; HEMINGWAY & RANSON, 2000), podendo ser encontradas no retículo endoplasmático e nas mitocôndrias (FEYEREISEN, 1999). As OFM se ligam ao oxigênio molecular e recebem elétrons do agente redutor de nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) para introduzir um átomo de hidrogênio no substrato e reduzir o outro átomo à molécula de água (BERGÉ et al., 1998). Nos insetos, essas enzimas estão envolvidas com a resistência a pesticidas, tolerância a toxinas de plantas, síntese e degradação de hormônios esteróides reguladores do crescimento, (43) hormônios juvenis e com os do metabolismo de feromônios (BERGÉ et al., 1998). Além da capacidade das OFM promoverem resistência e tolerância a inseticidas e aleloquímicos, elas podem também estar envolvidas com a bioativação de alguns inseticidas OP administrados na forma de pró-inseticidas (FUKUTO, 1990; FEYREISEN, 1999). Há também indícios de que as OFM participem do processamento de sinais relacionados com a recepção e biossíntese de odores (MAILBÉCHE-COISNE et al., 2005; OAKESHOTT et al., 2010). 1.5.3.3. Glutationa S-Transferase Nos insetos, até o presente momento foram identificados somente GSTs citosólicas e microssomais, sendo as primeiras as mais importantes por concentrar um maior número de enzimas com capacidade de detoxificar xenobióticos, dentre eles os inseticidas. Apesar da divergência nas sequências dos nucleotídeos, todas as proteínas GST apresentam níveis significativos de conservação estrutural, exibindo uma organização dimérica e de dobramento tridimensional (FROVA, 2006). A função primária da glutationa-S-transferase consiste na catálise da conjugação glutationa, um tripeptídeo endógeno com algum substrato lipofílico, formando um produto mais solúvel e não tóxico, de maneira que este seja mais facilmente excretado ou compartimentalizado pelas enzimas da Fase III da biotransformação. A atividade de conjugação das GSTs pode ainda conferir resistência aos inseticidas OP através da atividade dehidroclorinase (HOLLINGWORTH, 1969; SHEENAN et al., 2001; ENAYATI et al., 2005; LI et al., 2007). Trata-se de uma superfamília de proteínas multifuncionais que desempenham papéis fundamentais na detoxificação celular de uma grande variedade de compostos endógenos e exógenos. Em plantas e animais são as principais enzimas da fase II dos processos de detoxificação metabólica, atuando, inclusive na detoxificação de inseticidas (RODRIGUEZ et al., 1999; DING et al., 2003; ENAYATI et al., 2005; FROVA 2006; LUMJUAN et al., 2007; STRODE et al., 2008; KASAI et al., 2009). Estas enzimas parecem também estar envolvidas com a biossíntese de hormônios esteróides e a degradação de aminoácidos aromáticos (HAYES et al., 2005, FROVA 2006). LUMJUAN et al., (2007) descreveram a capacidade da GST de se ligar a hematina, sugerindo função protetora no intestino médio do mosquito Aedes aegypti, por meio da redução da toxicidade do heme ingerido durante o repasto sanguíneo. Alguns autores sugerem ainda a participação desta enzima na resposta adaptativa ao estresse celular (HUNAITI et al., 1995; SINGH et al., 2000; PONGJAROENKIT et al., 2001, FROVA 2006; LI et al., 2007). (44) 1.6. Estruturação genética de populações naturais avaliada por microssatélites Marcadores moleculares são proteínas ou seqüências de DNA polimórficas que podem ser usados como indicadores de variação do genoma. Neste contexto se inserem os microssatélites também conhecidos por “simple sequences repeats” (SSR). Os microssatélites são regiões do genoma de organismos eucariontes que possuem repetições de 2 a 6 nucleotídeos em cadeia. Distribuídos aleatoriamente no genoma, em uma densidade de aproximadamente 1 microssatélite a cada 10 a 15Kb, dependendo da espécie, são caracterizadas por um elevado polimorfismo (taxa de mutação estimada em 10-2 a 10-3, por locus por gameta por geração), contudo, são flanqueados por seqüências únicas e por isso podem ser amplificados por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR) (LI et al., 2002; 2004, OLIVEIRA et al., 2006). O número de repetições, o tipo de repetição, a sequência flanqueadora e a recombinação são fatores que influenciam na evolução dos microssatélites. Há padrões específicos de distribuição dos diferentes modelos repetitivos nos diferentes tipos de sequências: codantes, não codantes, íntrons e regiões intergênicas. Esses padrões ainda variam entre táxons, em termos da frequência de microssatélites e de tipos de repetições preferenciais. Esta especificidade pode ser explicada, em parte pela interação de mecanismos evolutivos por meio da seleção diferencial em regiões do genoma nas diferentes espécies (ZHU et al., 2000; LI et al., 2002). Cada microssatélite, independentemente do elemento repetitivo constitui um locus genético altamente variável, multialélico e que lhe proporciona conteúdo informativo a cerca da dinâmica de populações. Cada segmento amplificado de tamanho diferente (geralmente de várias dezenas até algumas centenas de pares de bases - pb) representa um alelo diferente do mesmo locus. Esta variabilidade tem como conseqüência a geração de alelos polimórficos que podem ser utilizados em uma variedade de estudos genéticos populacionais, em sistemática e no mapeamento genômico. Por este motivo, toda população pode ser utilizada como referência para estudos de ligação e mapeamento genético, sendo que a escolha não precisa ser embasada na maximização da distância genética, mas sim, visando a população mais informativa do ponto de vista das características biológicas de interesse. Dada a sua alta taxa de mutação, em alguns casos podem ser utilizados como uma ferramenta para o estudo dos meios pelos quais a taxa de mutação genômica global pode ser afetada por fatores externos (SCHOTTERER, 2000). Na área da entomologia, os microssatélites vêm sendo utilizados principalmente para o estudo de genética populacional. Podem ser úteis nos estudos de epidemiologia e controle das enfermidades fornecendo informações importantes sobre o fluxo gênico, a capacidade do vetor em invadir o peridomicílio e o intradomicílio e o entedimento para o processo de domiciliação; bem como avaliação taxonômica dos vetores. Neste contexto torna-se importante a realização de (45) uma análise multifatorial que também contemple estudos eco-epidemiológicos. Recentemente tais marcadores tem sido empregados em estudos macro e microgeográficos com populações triatomínicas (HARRY et al.,1998; ANDERSON et al., 2002; GARCIA et al., 2004; MARCET et al., 2006; PEREZ DE ROSAS et al., 2007; RICHER et al., 2007; HARRY et al., 2008; PEREZ et al., 2008; PIZARRO et al., 2008; FITZPATRICK et al., 2009; HARRY et al.,, 2009; DIAS et al., 2011). Ressalta-se que existem diversos trabalhos científicos que padronizaram a utilização dessa ferramenta, para as seguintes espécies: Rhodnius pallescens (HARRY et al.,1998), R. prolixus (FITZPATRICK et al., 2008; HARRY et al., 2008 a), T. dimidiata (ANDERSON et al., 2002), T. infestans (GARCIA et al., 2004; MARCET et al., 2006) e T. pseudomaculata (HARRY et al., 2008b). GIORDANO et al. (2005) sugerem que os microssatélites podem ser uma ferramenta sensível e eficaz para discernir a estrutura genética das populações e fornecer informações sobre reinfestações subseqüentes às borrifações do inseticida. Uma desvantagem quanto à utilização deste tipo de marcador diz respeito à prospecção dos iniciadores para os loci desejados, que são caras e trabalhosas. Uma alternativa viável é utilizar loci previamente isolados de espécies proximamente relacionadas, chamada de amplificação cruzada, o que possibilita sobrepor a informação genética de uma espécie para outra (PENTEADO et al., 2011). Deste modo, como não existe tal ferramenta molecular padronizada para estudos com T. sordida, este trabalho se propôs a testar marcadores desenvolvidos para espécies afins que possam ser utilizadas para a de interesse. (46) Justificativa (47) Os relatos cada vez mais frequentes de populações triatomínicas com razões de resistência elevadas tem causado grande impacto, desafiando cientistas e sanitaristas na busca de novas alternativas para o controle vetorial. Considerando os casos de resistência de triatomíneos já reportados na literatura (anexo 1), é possível que o uso intensivo de inseticidas no Brasil por mais de 30 anos tenha favorecido o aparecimento de novos focos em regiões ainda mais amplas. Deste modo, justifica-se a importância de se investigar este fenômeno levando-se em consideração as condições ambientais nas quais ele se encontra inserido bem como a variabilidade genética destes insetos e sua capacidade de alteração na linha do tempo na presença do ativo químico. Na plenária do “I Seminário sobre técnicas e ferramentas de controle das doenças transmitidas por vetores (SVS-MS, 2003)” e do “II Seminário internacional sobre técnicas e ferramentas de controle das doenças transmitidas por vetores – recomendações (SVS-MS, outubro 2006)” foi discutido que “em muitas localidades, programas de controle de diferentes agravos estão sendo executados de forma simultânea e sem articulação entre si, o que pode contribuir para o aumento indiscriminado e indesejado da resistência a inseticidas. Foi fortemente sugerida a integração das decisões de manejo dos diferentes programas, de forma a garantir o controle racional das endemias/epidemias”. Deste modo, o aprimoramento dos programas de avaliação do impacto das medidas de controle sobre as endemias/epidemias, como um espaço técnico científico de discussão sobre formas alternativas de controle, assume que: • o monitoramento da resistência dos vetores aos inseticidas é componente importante, já uma preocupação do Ministério da Saúde e dos técnicos em geral, a ser encarado de maneira objetiva e continuada, de forma institucionalizada e com prioridade; • o tema não deve ser considerado como uma atividade em separado, mas deve fazer parte do contexto e das macro políticas do controle dos vetores e da enfemidades pertinentes. Neste aspecto é prioridade o reforço de grupos de entomologia em geral, com formação e capacitação de massa crítica, treinamento em diferentes níveis, abertura e incentivo a investigação; e ainda: “os programas em curso não devem ser herméticos e isolados entre si, cada vez mais sendo oportuno e desejável que se integrem e possam compartilhar diferentes tarefas, insumos, informações e tecnologias”. Dentro desta perspectiva, em 2005, foi realizada uma reunião em Brasília com alguns pesquisadores da área da doença de Chagas por iniciativa da própria Secretaria de Vigilância em Saúde/MS/PCDCh. Foi consolidado um projeto, creditado por autoridades do setor nacional da saúde, com amarras institucionais, com vistas ao monitoramento da resistência de triatomíneos a inseticidas. O estudo foi encaminhado, contudo não foi aprovado. (48) A continuidade deste processo foi concretizada em 2009, em uma reunião solicitada à SVS pelo Laboratório de Referência em Triatomíneos e Epidemiologia da doença de Chagas – LATEC - CPqRR/ FIOCRUZ. Participaram possíveis representantes de laboratórios que poderiam integrar a rede de monitoramento da resistência: coordenação do PCDCh, gerências estaduais de saúde do Ceará e Minas Gerais, da Superintendência de Controle de Endemias de São Paulo (SUCEN) e Coordenação Geral de Laboratórios (CGLAB/MS). Em dezembro de 2010, para dar início ao funcionamento da rede de monitoramento, foi realizado um workshop para definir a estrutura da rede, critérios para credenciamento dos laboratórios, definição de competências/habilidades e administração dos recursos. Em 2011 foi aprovado um orçamento no valor de R$200.000,00 destinado a estruturação dos laboratórios credenciados, capacitação de recursos humanos, estudos de campo para o entendimento dos resultados de laboratório em condições não controladas e, produção de material didático. Contudo, até o presente momento este recurso não foi liberado. O trabalho aqui proposto é considerado por ROCHA & SILVA (1979) como medida estratégica para o controle destes insetos, podendo auxiliar o PCDCh na eleição de medidas factíveis e eficazes no controle da transmissão vetorial da enfermidade de Chagas. Segundo a “Reunión Latino-americana de Monitoreo de Resistencia a Insecticidas en Triatominos” (OPAS, 2005), realizada no Panamá, o monitoramento da resistência de triatomíneos a inseticida poderá ter desdobramentos importantes, tais como incentivar: • a recuperação das atividades entomológicas de modo a avaliar as aplicações dos inseticidas nos programas de controle de vetores e, consequentemente otimizar as estratégias de controle químico; • a incorporação do monitoramento e manejo da resistência de triatomíneos a inseticidas, segundo metodologia descrita por PESSOA (2008), como parte das atividades previstas nas iniciativas de interrupção da transmissão vetorial da enfermidade de Chagas; • a formação de recursos humanos ao nível operativo e técnico que permitam implementar programas de monitoramento e manejo de resistência de triatomíneos a inseticidas; • o apoio e o fortalecimento dos centros regionais colaboradores da OPAS/WHO, para que atuem formando recursos humanos e validando os procedimentos de monitoramento e manejo de resistência a inseticidas; • os governos dos países latinoamericanos a incluir no custeio dos programas de controle de vetores de Chagas, recursos destinados a implementação de programas de monitoramento e manejo da resistência de triatomíneos a inseticidas (atividades de laboratório e de campo); (49) • o fortalecimento dos grupos latinoamericanos locais e regionais de entomologia, para interagir em rede, a fim de melhorar e desenvolver os programas de monitoramento e manejo de resistência de triatomíneos a inseticidas, com o apoio da OPAS e outros organismos nacionais e internacionais; • a criação, com o apoio e colaboração da OPAS/WHO de um comitê de pesquisadores para o seguimento e atualização dos programas de monitoramento e manejo de resistência a inseticidas, cujos resultados orientem as estratégias de controle em campo; • a geração de documentos técnicos similares para o monitoramento e manejo da resistência a inseticidas em outros vetores de importância médica. Deste modo, com a realização deste projeto, a FIOCRUZ amplia o seu papel no âmbito do Sistema Nacional de Vigilância em Saúde e contribui para uma melhor efetividade das ações de controle de duas importante doenças no contexto epidemiológico no país. (50) Objetivos (51) 3.1 Objetivo Geral • Caracterizar o perfil de suscetibilidade/resistência de populações de T. sordida (Stål, 1859) de áreas com infestação persistente do Estado de Minas Gerais ao piretróide deltametrina. 3.2 Objetivos específicos • Determinar a mortalidade a Dose Diagnóstica, as doses letais, slope e as razões de resistência de populações de T. sordida a deltametrina; • Padronizar ensaios bioquímicos para a quantificação de enzimas detoxificativas de inseticida em triatomíneos; • Definir o perfil de atividade de enzimas detoxificativas para as populações de T. sordida; • Definir a estrutura genética de populações de T.sordida, por meio de marcadores microssatélites; • Caracterizar as variáveis físicas das UD`s, a qualidade das atividades de borrifação pelos agentes de saúde, o uso de inseticida para os diversos fins, as variáveis climáticas relacionadas a degradação do inseticida e informações entomológicas da área de estudo. (52) Materiais e métodos (53) 4.1. Inseticida e diluente O inseticida utilizado nos bioensaios foi a deltametrina [(S) – α – ciano – 3 – fenoxibenzil (1R) – cis – 3 – (2,2 – dibromovinil) – 2,2 dimetil ciclopropano carboxilato] com grau de pureza de 99,1% (grau técnico), fornecido pela Bayer®, Brasil e acetona P.A (CH3)2CO, da VETEC®. 4.2 Material biológico e área de amostragem Os triatomíneos foram coletados nas unidades domiciliares de áreas endêmicas do Estado de Minas Gerais, nas quais o PCDCh se manteve ininterrupto nos últimos 30 anos. As coletas foram realizadas em colaboração com as Gerências Regionais de Saúde responsáveis, supervisionadas pela Secretaria Estadual de Saúde de Minas Gerais - SES/MG aos cuidados da Dra. Marcela Lencine Ferraz. A escolha dos municípios para este estudo foi embasada no índice de captura de T. sordida do ano de 2008, fornecido pela SES/MG, tendo sido selecionados aqueles que apresentaram altas taxa de infestação. Ressalta-se que a escolha das localidades ficou a critério dos agentes de saúde de modo a contemplar regiões nas quais foram observadas dificuldades no controle das populações triatomínicas com o uso de inseticidas. A captura dos insetos, realizada em 2009, foi manual, sem a utilização de desalojantes. Foram recebidos um total de 103 populações triatomínicas, originárias de 30 municípios de Minas Gerais (figura 2) da região do Triângulo Mineiro e Região Norte Minas. Ressalta-se que o número de insetos mínimo para a realização dos bioensaios foi de 70 insetos, de acordo com preconização da OPAS (2005). Figura 2. Mapa político do Estado de Minas Gerais. Destacados os diferentes municípios de captura de T. sordida estudados neste projeto. (54) O Triângulo Mineiro é uma área de colonização antiga, desbravada no final do século passado pelos bandeirantes em busca de ouro e pedras preciosas. A região assumiu grande importância econômica com a introdução do gado zebu, tendo sua paisagem natural sofrido profundas transformações nas décadas de 40 e 50 para a formação de áreas de pastagem. Somente a partir da década de 70 a agricultura passou a ter importância com o desenvolvimento de técnicas que permitiriam a cultura de soja em regiões do cerrado (GOODLAND & FERRI. 1979). Atualmente essa região sedia grandes projetos agroindustriais, contudo, ainda assim, a principal atividade econômica do Triângulo é a pecuária, representada, principalmente, por grandes criadores de gado. O Norte de Minas é uma das regiões mais pobres do Estado, em muitos aspectos semelhante ao nordeste do país, com extensas áreas de transição entre o cerrado e a caatinga. Inúmeros foram os projetos de colonização (irregulares, descontínuos e sem qualquer comprometimento ecológico) implantados na área, resultando em intervenções ambientais descontroladas e estimulando a imigração desassistida de grandes contingentes humanos procedentes de áreas de alta prevalência da DC. Na década de 80, a cultura de algodão expandiu-se, representando quase que a totalidade do investimento agrícola na região. O desmatamento só não atingiu a totalidade da área pela falência da cultura devido a introdução de pragas e falta de financiamento. Dependentes do processo da monocultura aí implantado, o fracasso com a plantação de algodão serviu de estímulo para a migração da população para os centros urbanos. Para a população rural remanescente restou a possibilidade de utilização das matas residuais para a produção de carvão vegetal, ou venda da terra e de mão de obra para o reflorestamento com eucalipto, crescente nos últimos anos na área (IBGE, 1992). Sob o aspecto ecológico pode-se considerar que o Triângulo Mineiro sofreu profundas alterações ambientais há mais tempo, e hoje apresente maior equilíbrio entre as suas populações naturais. No Norte de Minas, por outro lado, estas intervenções tem se intensificado nas últimas décadas, resultando em grande pressão sobre as populações de T. sordida, justificando-se o seu aumento em ecótopos artificiais nessa região e maior estabilidade das suas taxas de captura no triângulo. A linhagem referência de suscetibilidade utilizada neste estudo foi uma população de T. sordida (Uberaba/MG) – TsREF, procedente do insetário do LATEC, com início de criação em 1992, sem aporte de material externo e nenhum contato com inseticida. Todas as populações triatomínicas foram mantidas no insetário do LATEC, em condições de temperatura e umidade relativa controladas (25ºC ± 1ºC; 60% ± 10% UR). Os insetos foram acondicionados em frascos transparentes de polietileno, devidamente identificados (15 cm diâmetro e 20 cm de altura), com fundo recoberto com folhas de papel de filtro para a retenção da umidade produzida pelas fezes e urina dos mesmos. Uma sanfona vertical de cartolina foi (55) utilizada para aumentar a superfície interna do frasco de modo a permitir maior movimentação dos triatomíneos e facilitar a alimentação destes. A abertura dos frascos foi vedada com pano de malha fina preso por esparadrapo e elástico. A alimentação foi ofertada duas vezes por semana utilizando camundongos (Mus musculus) anestesiados com Tionembutal. A cada 15 dias, os ovos das diferentes populações foram retirados e acondicionados em placas de petri devidamente identificadas (figura 3). Feito isso foram armazenadas e acondicionados em estufa com umidade, temperatura e fotoperíodo controlados (70%, 28ºC ± 1ºC e 12:12 h (claro:escuro), com objetivo de tornar simultânea a eclosão das ninfas. Diariamente as eclosões das ninfas foram registradas visando a obtenção da geração F1 padronizada em relação ao tamanho, idade cronológica e fisiológica, para posterior realização dos ensaios biológicos (figura 3). As diferentes populações de T. sordida foram codificadas com orientação pelas iniciais do nome da espécie estudada, seguida pelo município de origem e pela localidade amostrada (tabela 2) . A população utilizada como LRS recebeu terminação “REF”, após as iniciais do nome da espécie – TsREF. Figura 3. Acondicionamento dos triatomíneos em insetário (A); limpeza quinzenal das colônias para retirada dos ovos (B), acondicionamento dos ovos em placas de petri para acompanhamento diário da eclosão dos mesmos (C) e acompanhamento diário da idade das ninfas para a realização dos bioensaios (D). A B C D (56) Tabela 2. Codificação das diferentes populações de T. sordida procedentes do Estado de Minas Gerais, 2012. Município Localidade Sigla Coordenada Fuso E N Brasília de Minas Capim de Cheiro TsBMCC UTM 23S 560858 8207883 Buenópolis Saco da Cachoeira TsBSC UTM 23S 586878 8023628 Buenópolis Espinho TsBE UTM 23S 587031 8023818 Buenópolis Boa Vista II TsBBV2 UTM 23S 587012 8023946 Butiris Bananeira TsBB UTM 23S 348195 8272392 Buritis Mangues TsBM UTM 23S 348009 8272691 Buritis Mandassaia TsBMA UTM 23S 348181 8272689 Cônego Marinho Cabeceira do C. Marinho TsCMCC UTM 23S 560679 8309956 Cônego Marinho Cruz dos Araújos TsCMCA UTM 23S 561159 8316090 Cônego Marinho Sapé TsCMS UTM 23S 561932 8315253 Coração de Jesus Barriguda TsCJB UTM 23S 568084 8154673 Coração de Jesus Boa Vista I TsCJBV1 UTM 23S 568027 8154542 Coração de Jesus Borrachudo TsCJBO Graus - 16° 24' 47'' S 44° 21' 05''O Coração de Jesus Bom Jesus TsCJBJ UTM 23S 568658 8155323 Coração de Jesus Córrego da Água Branca TsCJCAB Graus - 16° 25' 02'' S 44° 15' 12''O Coração de Jesus Jataí I TsCJJ1 UTM 23S 567639 8155460 Coração de Jesus Jataí II TsCJJ2 Graus - 16° 32' 53'' S 44° 22' 15''O Espinosa Lagoa dos Patos TsELP UTM 23S 730208 8347383 Espinosa Melada TsEM UTM 23S 72516 8351121 Espinosa Mimoso TsEMI Graus - 15° 02' 36'' S 42° 48' 24''O Francisco Sá Arroz TsFSA UTM 23S 61132 8177581 Francisco Sá Algodão 1º TsFSA1 Graus - 16° 08' 11'' S 43° 23' 06''O Francisco Sá Baixa Fria TsFSBF Graus - 16° 20' 39'' S 43° 32' 42''O Frutal A. Nunes Cruz TsFANC Graus - 19° 57' 28'' S 49° 10' 57''O Frutal Buriti I TsFB1 Graus - 20° 06' 17'' S 48° 50' 23''O Frutal Guilherme F. Correa TsFGFC Graus - 19° 51' 31'' S 49° 00' 17''O Frutal João Correa TsFJC Graus - 19° 53' 20'' S 48° 48' 21''O Frutal Matão TsFM Graus - 20° 01' 13'' S 49° 20' 45''O Frutal São Mateus TsFSM Graus - 19° 51' 21'' S 49° 09' 05''O Gurinhatã Cachoeirão TsGC Graus - 19° 06' 11'' S 49° 52' 12''O Gurinhatã Alceu Mendes TsGAM Graus - 18° 58' 51'' S 49° 45' 08''O Gurinhatã Cor da Mata TsGCM Graus - 19° 18' 43'' S 49° 48' 18''O Gurinhatã Vicente Coelho TsGVC Graus - 19° 12' 38'' S 49° 40' 14''O Ibiaí Butirizinho Gamela TsIBG UTM 23S 509174 8135783 Ibiaí Várzea de Baixo TsIVB Graus - 16° 47' 32'' S 44° 48' 16''O Ibiracatu Alforges TsIA UTM 23S 597503 8276089 (57) Cont. tabela 2. Codificação das diferentes populações de T. sordida procedentes do Estado de Minas Gerais, 2012. Município Localidade Sigla Coordenada Fuso E N Ibiracatu Barras TsIB Graus - 15° 47' 21'' S 44° 09' 29''O Ibiracatu Capim Vermelho TsICV Graus - 15° 36' 24'' S 44° 02' 12''O Icaraí de Minas Araçá TsIMA Graus - 16° 09' 25'' S 44° 41' 21''O Icaraí de Minas Bebedouro TsIMB UTM 23S 504646 8203285 Icaraí de Minas Cabeceira TsIMC UTM 23S 513962 8210058 Januária Cabeceira TsJC Graus - 15° 27' 05'' S 45° 02' 30''O Januária Barra da Lapa TsJBL UTM 23S 546988 8278351 Januária Barreiro 4 TsJB4 UTM 23S 545639 8278975 Japonvar Desejado TsJD UTM 23S 566436 8234226 Japonvar Jatobá TsJJ Graus - 15° 47' 35'' S 44° 24' 36''O Japonvar Pinhão TsJP Graus - 15° 55' 13'' S 44° 21' 51''O Limeiro do Oeste Alfredo S Maia II TsLOASM Graus - 19° 36' 15'' S 50° 34' 46''O Limeiro do Oeste Benício Curzedo I TsLOBC Graus - 19° 30' 27'' S 50° 41' 02''O Limeiro do Oeste José F. Queiroz TsLOJFQ Graus - 19° 14' 47'' S 50° 42' 13''O Lontra Gangorra TsLG UTM 23S 574517 8241679 Lontra São José TsLSJ Graus - 15° 52' 01'' S 44° 20' 52''O Lontra São José II TsLSJ2 Graus - 15° 54' 00'' S 44° 16' 12''O Luislância Abóboras TsLA Graus - 16° 06' 52'' S 44° 33' 17''O Luislândia Barreiro TsLB UTM 23S 544335 8217969 Luislândia Manhãs TsLM Graus - 16° 16' 35'' S 44° 36' 29''O Mamonas Melada TsMM UTM 23S 720104 8335389 Mamonas Riacho de Areia TsMRA Graus - 14° 56' 31'' S 42° 55' 05''O Mamonas Teiú TsMT Graus - 14° 55' 45'' S 42° 53' 00''O Manga Curralinho TsMC UTM 23S 614461 8368229 Manga Empoeira TsME Graus - 14° 48' 52'' S 44° 15' 27''O Manga Floresta TsMF Graus - 14° 27' 14'' S 44° 06' 12''O Montalvânia Batedeira TsMB UTM 23S 568014 8405363 Montalvânia Gergelim TsMG Graus - 14° 29' 07'' S 44° 27' 35''O Montalvânia Quilômetro TsMQ Graus - 14° 36' 27'' S 44° 27' 00''O Montalvânia Vereda TsMV Graus - 14° 33' 54'' S 44° 24' 18''O Monte Azul Barreirinho TsMAB UTM 23S 726374 8319107 Monte Azul Barreirinho I TsMAB1 UTM 23S 725638 8321187 Monte Azul Barreiro Grande TsMABG UTM 23S 728915 8319651 Monte Azul Bocaina TsMABO Graus - 15° 11' 24'' S 42° 58' 14''O Monte Azul Bom Sucesso TsMABS Graus - 15° 15' 46'' S 42° 57' 12''O Monte Azul Brejinho TsMABRE Graus - 15° 13' 42'' S 42° 59' 01''O Monte Azul Canabrava TsMAC Graus - 15° 15' 09'' S 42° 57' 31''O (58) Cont. da tabela 2. Codificação das diferentes populações de T. sordida procedentes do Estado de Minas Gerais,2012. Município Localidade Sigla Coordenada Fuso E N Monte Azul Landinho TsMAL Graus - 15° 16' 00'' S 42° 59' 43''O Monte Azul Perneta TsMAPE Graus - 15° 14' 41'' S 43° 03' 07''O Monte Azul Porteiras TsMAPO Graus - 15° 18' 04'' S 43° 02' 49''O Montes Claros Camará TsMCC UTM 23S 620224 8149443 Montes Claros Ponte do Ribeirão TsMCPR UTM 23S 629826 8152213 Montes Claros Ribeirão do Ouro TsMCRO Graus - 15° 06' 01'' S 43° 47' 12''O Porteirinha Cova da Mandioca TsPCM Graus - 15° 46' 51'' S 43° 02' 17''O Porteirinha Curral Velho TsPCV UTM 23S 719210 8253616 Porteirinha Furado da Onça TsPFO Graus - 15° 37' 21'' S 43° 00' 02''O S. J da Ponte Canabraval TsSJPC UTM 23S 606146 8238616 S. J. da Ponte Assa Peixe TsSJPAP Graus - 15° 06' 01'' S 43° 45' 22''O S. J. da Ponte Gentil Gomes TsSJPGG Graus - 15° 56' 16'' S 43° 54' 32''O S. J. Missões Cotendiba TsSJMC UTM 23S 598655 8354329 S. J. Missões Simão Correa TsSJMSC Graus - 14° 51' 57'' S 44° 06' 50''O S. J. Missões Traíras TsSJMT Graus - 14° 58' 13'' S 44° 04' 49''O Santo Hipólito Buracão TsSHB UTM 23S 582276 7975994 Santo Hipólito Caquende TsSHC UTM 23S 587207 7964163 Santo Hipólito Salobo TsSHS UTM 23S 588739 7964810 São Francisco Barreiro Grota TsSFBG UTM 23S 514680 8235628 São Francisco Croá TsSFC Graus - 16° 05' 28'' S 44° 59' 16''O São Francisco Espinheiro TsSFE Graus - 16° 00' 38'' S 44° 47' 59''O S. de Minas Brejo TsSMB UTM 23S 716210 8250131 S. de Minas Cachoeira TsSMC Graus - 15° 57' 08'' S 42° 53' 39''O S. de Minas Senharol TsSMS UTM 23S 728830 8256167 Várzea da Palma Buritizinho TsVPB UTM 23S 532778 8055671 Várzea da Palma Brejo TsVPBRE UTM 23S 532409 8054918 Várzea da Palma Garça TsVPG Graus - 17° 43' 16'' S 44° 37' 24''O Varzelância Lagoa do Jóia I TsVLJ1 UTM 23S 603738 8263537 Varzelândia Cruzeiro TsVC Graus - 15° 38' 16'' S 44° 03' 00''O Varzelândia Lagoa do Jóia TsVLJ Graus - 15° 40' 36'' S 43° 51' 45''O 59 4.3 Definição do perfil de suscetibilidade das populações de campo de T. sordida: bioensaios quantitativos Os bioensaios quantitativos tem por objetivo quantificar o status da suscetibilidade/resistência de triatomíneos a inseticidas por meio de ensaios dose resposta, possibilitando o cálculo da RR das populações alvo. Estes ensaios foram realizados segundo protocolo definido por PESSOA (2008). Diluições seriais de deltametrina foram preparadas e aplicadas no dorso do abdômen de ninfas I da geração F1 (cinco dias de idade, jejum - peso 1,2 ± 0,2 mg) com auxílio de uma microseringa Hamilton acoplada a dispensador automático de mesma marca (volume de 0,2 µL de solução por aplicação). O inseticida foi diluído em acetona na proporção de 1:10, totalizando quatro doses iniciais (0,001; 0,01 ; 0,1; 1,0 ng i.a/ninfa). O intervalo que apresentou mortalidade próxima a 50% foi fracionado em subdoses que cubriram a faixa de 0,05 a 2,5 ng i.a./ninfa. Nos insetos do grupo controle foi aplicada somente acetona. Três repetições, cada uma com 10 ninfas I foram realizadas para cada dose (figuras 4 e 5). Após a aplicação do inseticida, os triatomíneos foram transferidos para placas de petri forradas com papel filtro e acondicionadas em ambiente com temperatura e umidade controladas (25ºC ± 1ºC; 60% ±10% UR). O registro de mortalidade foi realizado 72 horas após o tratamento com o ativo químico, por um único observador. Adotou-se o seguinte critério de mortalidade: após serem transferidas para uma placa de petri com 7 cm de diâmetro, as ninfas foram colocadas sobre o centro da mesma e estimuladas com auxílio de uma pinça. Consideraram-se vivos (normais) os insetos que não apresentaram alteração na atividade locomotora e alcançaram a borda da placa no período máximo de 50 segundos; e mortos os insetos que apresentaram fortes sintomas de desequilíbrio ou total incapacidade de andar do centro à borda do disco no período de tempo supracitado (OBARA et al., 2002). Os dados de mortalidade obtidos nos ensaios dose resposta foram analisados com auxílio do programa Basic Probit Analysis (FINNEY, 1971), estimando as doses letais 50% (DL50 ) e 95% (DL95), expressas em nanogramas de ingrediente ativo por ninfa tratada, bem como o slope. O slope se refere ao coeficiente angular da reta formada entre as doses de inseticida aplicadas na população e sua consequente taxa de mortalidade, fornecendo informações sobre a variabilidade da população em relação à característica estudada (BRONGDON & MCALLISTER, 1998). O cálculo da inclinação da curva dose-resposta para construção de gráfico correspondente foi realizado com auxílio do GRAPH PAD Prism® versão 4.0 (Graph Pad Software INC, San Diego, CA). 60 As razões de resistência de interesse foram calculadas por meio do quociente da DL específica de cada população de campo, pela correspondente a da LRS. A caracterização das razões de resistência foi realizada utilizando critérios propostos por ZERBA & PICOLLO (2002) E OPAS (2005). ZERBA & PICOLLO (2002) propõe a estratégia abaixo como suporte para tomada de decisões na interpretação das razões de resistência encontradas em ensaios para avaliação da suscetibilidade/resistência de triatomíneos a inseticidas em laboratório frisando que se trata de uma estimativa sem confirmação experimental: • Para RR ≤ 2 se considera que a alteração de suscetibilidade encontrada é produzida por variações individuais e que não existe resistência a inseticida; • Para 2 ≤ RR < 20 se considera que existe resistência incipiente, sendo necessário avaliar as falhas de controle no campo; • Para RR ≥ 20 se considera que a resistência está estabelecida; Em contrapartida, a OPAS (2005) propõe o seguinte critério de classificação em resposta a tratamentos com inseticidas: • Para RR < 5 se considera que a alteração de suscetibilidade encontrada é produzida por variações individuais e que não justificam falhas no controle. Recomenda-se, então, continuar o controle com o mesmo inseticida utilizado e manter o monitoramento da resistência; • Para 5 ≤ RR < 20 se considera que existe resistência incipiente, sendo necessário avaliar as falhas de controle no campo. Caso confirmadas faz-se necessário trocar o inseticida para outro com modo de ação distinto. Caso não se confirmem as falha no campo deve-se permanecer com o mesmo inseticida e intensificar o monitoramento da resistência realizando avaliações entomológicas com um mês e doze meses após a borrifação; • Para RR ≥ 20 se considera que a resistência está estabelecida sendo recomendada a troca do inseticida por outro de modo de ação distinto. 61 4.4. Definição da taxa de mortalidade das populações de campo de T. sordida à dose diagnóstica: bioensaios qualitativos Entende-se por ensaios biológicos qualitativos aqueles primeiros a serem realizados em laboratório, com vistas a separar as populações resistentes das suscetíveis. Tem-se por Figura 5. Aplicação tópica do inseticida nos triatomíneos (A), acondicionamento dos insetos pós-tratamento para subsequente registro de mortalidade (B) A B Figura 4. Registro diário dos experimentos (A); seringa Hamilton acoplada a dispensador automático (B), separação dos triatomíneos com idade adequada para realização dos ensaios biológicos (C). A C B 62 princípio a utilização de uma dose única, conhecida por “Dose Diagnóstica” – DD, a ser aplicada na população alvo. Após definida a linha base de suscetibilidade da população referência de T. sordida, 30 ninfas I da geração F1 (cinco dias de idade, jejum - peso 1,2±0,2 mg) de todas as populações de campo foram submetidas a dose diagnóstica de 1xDL99 da LRS conforme metodologia apresentada no item “4.3. Definição do perfil de suscetibilidade das populações de campo de Triatoma sordida em ensaios quantitativos”. Foi definido o percentual de mortalidade dos insetos e a classificação do padrão da suscetibilidade /resistência foi realizada de acordo com WHO (1994). A sobrevivência, em resposta a essa DD, de no mínimo um inseto em dois dos três ensaios com 10 ninfas I deve ser interpretada como indicativo de resistência justificando a necessidade do estabelecimento das concentrações letais para o consequente cálculo das RRs. Ressalta-se que a escolha da dose diagnóstica utilizada foi realizada de acordo com preconização da WHO (1994) e OPS (2005) que recomendam o uso de uma dose diagnóstico (DD) referente à 1xDL99 da linhagem referência de suscetibilidade. A sobrevivência, em resposta a essa DD, de no mínimo um inseto em dois dos três ensaios com 10 ninfas I deve ser interpretado como indicativo de resistência justificando a necessidade do estabelecimento das concentrações letais para esta população, e conseqüente, razões de resistência. Em 2007 populações de T. sordida da localidade Barriguda (município de Coração de Jesus) apresentaram RR50 de 6,5. Utilizando mesma metodologia, em 2009 novas capturas foram realizadas na mesma área revelando a manutenção da RR anteriormente encontrada. Na tentativa de elucidar questões referentes a dinâmica da resistência na linha temporal, foi realizada caracterização ambiental, bioquímica e molecular das populações triatomínicas coletadas na região de entorno a área de interesse, sendo elas: Boa Vista I, Bom Jesus, Jataí I e Jataí II, com exceção de Pau Dólio (anexo 2). 4.5. Caracterização ambiental das localidades de estudo do município de Coração de Jesus Os parâmetros de umidade relativa do ar, temperatura (máxima e mínima), insolação e precipitação referentes ao período de 1970 a 2010, foram obtidos junto ao Banco de Dados Metereológicos para Ensino e Pesquisa (BDMEP) do Instituto Nacional de Metereologia (INMET) , sendo em seguida, associados às informações de ocorrência dos fenômenos “El nino” e “La nina” no país. 63 Ressalta-se que a intensidade dos fenômenos El Nino e La Nina foi classificada em fraca, moderada e forte utilizando com a média dos Índices Oceânico do Niño (ION) de acordo com preconização do Golden Gate Wheather Services (2008). As unidades domiciliares foram caracterizadas por meio de um questionário próprio (anexo 3), aplicado pelos agentes de saúde, em conformidade com o Comitê de Ética do CPqRR/FIOCRUZ/MS (CAAE: 0 005.0.245.000-11). Foram abordados os seguintes aspectos: 1) estrutura/aspectos físicos das UD`s, 2) criação de animais domésticos e uso de inseticidas com vistas ao controle de praga dos mesmos; 3) áreas de cultivo e uso de inseticia com vistas ao controle de pragas das mesmas; 4) uso de inseticidas domésticos para controle de pragas nas UD`s; 5) caracterização do peridomicílio e acesso as matas no entorno que possam intercomunicar os ambientes silvestres, domésticos e peridomésticos . Todas essas informações foram digitalizadas por dupla entrada no Excel, seguido da análise dos dados. A qualidade das atividadesde controle desenvolvidas pelo PCDCh nas localidades de interesse foram investigadas por meio de um segundo questionário (anexo 4) no qual foram abordados: tempo de experiência profissional dos agentes, realização de cursos de capacitação/atualização, procedimentos adotados nas atividades de borrifação, possíveis dificuldades para a execução das atividades (falta de funcionários, veículos, inseticida, etc), intoxicação com ativos químicos. Para avaliação do histórico de infestação triatomínica nas áreas de interesse e carga de inseticidas utilizadas durante as atividades do PCDCh no período de 1978 a 1994, foram analisadas as informações disponíveis no Cárdex, bem como dados fornecidos pela SES/MG. O Cárdex é um arquivo organizado pela FUNASA que registra todas as informações sobre os resultados obtidos nas atividades do PCDCh em municípios de Minas Gerais, onde constam informações de pesquisa, borrifação, infestação e outros parâmetros ao nível de cada localidade, desde a implantação do Programa de Chagas até 1997 (DIOTAIUTI, 2009), quando se deu o início da municipalização do controle de endemias. O consumo de inseticida nos anos de 2000 a 2006 foi obtido diretamente pela SES/MG. 4.6. Estruturação genética das populações de T. sordida utilizando marcadores microssatélites Os indivíduos parentais das populações de T. sordida foram armazenados em freezer -20ºC até o momento da extração do DNA de acordo com DE QUEIROZ BALBINO et al. (2006) com modificações. O músculo alar foi retirado de cada espécime com auxílio de pinça e tesoura, lavado com pbs, e macerado individualmente em 100 µl de “solução de extração” STE 64 1X (NaCl 0,01M; Tris-HCl 0,1M e EDTA 1M) com auxílio de um pistilo. Após incubação a 90oC por 10 minutos, as amostras foram centrifugadas a 13.000 rpm por 1 minuto e o sobrenadante retirado. A quantificação do DNA extraído foi realizada individualmente em espectofotômetro NanoDrop ND.1.000. O material processado foi mantido a -20oC até o momento do uso. Para as reações de PCR foram utilizados os iniciadores (anexo 5) descritos para T. brasiliensis (HARRY et al., 2009), T. dimidiata (ANDERSON et al., 2002), T. infestans (MARCET et al., 2005) e T. pseudomaculata (HARRY et al., 2008) e Taq DNA Polymerase Recombinant (InvitrogenTM), totalizando um volume final de 10µl contendo: 5ng de DNA, 1µL de Tampão 10x, 1µL de DNTp a 10mM , 1µL de cada iniciador a 1µM, MgCl2 a 50mM (algumas reações foram realizadas com 0,3µL e outras com 0,6µL de acordo com especificidade do iniciador) e água ultrapura. As reações de amplificação foram realizadas em termociclador Eppendorf Mastercycles® Gradient. Após desnaturação do DNA a 94ºC por 5 minutos foram realizados 35 ciclos (94ºC por 30 segundos, anelamento por um minuto com temperaturas específicas de cada iniciador, 72ºC por 45 segundos) seguidos de extensão final a 72ºC por 5 minutos. Os produtos de PCR foram visualizados em géis de poliacrilamida corados com nitrato de prata 0,2% e revelados em solução de NAOH 0,75M e formaldeído 0,1M. O tamanho dos produtos de PCR foram estimados relativamente pelo padrão de peso molecular (DNA do bacteriófago Ø-X174 digerido pela enzima de restrição Haelll). As reações que obtiveram amplificação do locus esperado foram ressubmetidas a outra PCR com iniciador marcado com sonda bioluminescente específica (InvitrogenTM). Em placas de 96 poços, a cada 2 µL desta reação foram adicionados 8 µl de um mix contendo 7,6 µl de solução Tween 0,1% e 0,4 µL de marcador ET-400 (GE Health Care). Após a desanaturação, as placas foram encaminhadas para a genotipagem na Plataforma do Centro de Pesquisa Rene Rachou- CPqRR. Os dados foram analisados utilizando o programa Fragment Profiler versão 1.2. Para a análise genética foi utilizado o programa Arlequin versão 3.0 (EXCOFFIER et. al., 2005). Para cada locus calculou-se o número de alelos, as frequências alélicas observadas, as frequências genotípicas observadas e os valores de heterozigose observada e esperada dentro do equilíbrio de Hardy-Weinberg. No programa Arlequin a estrutura genética das populações foi investigada pela análise de variância molecular (AMOVA) que é um método para estimar a proporção da variação devida a cada tipo de agrupamento das populações, e a partir daí permite-se testar hipóteses sobre estas diferenças. Trata-se de um teste de hipóteses que avalia a diferença encontrada dentro de um grupo e entre grupos. Caso não exista diferença, conclui-se pela não estruturação genética da 65 população, considerando-se a possibilidade de haver fluxo gênico entre elas. Em caso contrário, sugere-se que os grupos estão bem estruturados sendo portanto, populações distintas (EXCOFFIER et. al., 1992). Para os testes da AMOVA foram realizados os seguintes agrupamentos: Grupo 1 - todas as populações juntas (Barriguda, Boa Vista, Bom Jesus, Jataí I, Jataí II), Grupo 2 - as populações foram divididas em 2 grupos de acordo com o status de resistência proposto pela OPAS (2005) (Barriguda e Jataí I, Jataí II, Boa Vista, Bom Jesus) e Grupo 3 - as populações foram divididas em 2 grupos de acordo com o status de resistência proposto por ZERBA & PICOLLO (2002) (Resistentes: Barriguda, Bom Jesus e Boa Vista e Suscetíveis: Jataí I, Jataí II). As estatísticas calculadas representaram os índices de fixação (FSC e FIS) originalmente propostos por WRIGHT (1965). Foi gerada uma matriz de distâncias (FST) entre os pares de populações. 4.7. Quantificação da atividade de enzimas relacionadas com a detoxificação de inseticida nas populações de T. sordida Os ensaios bioquímicos foram realizados de acordo com VALLE et al., (2006), com modificações. Um total de 150 ninfas I (jejum, 5 dias de idade - peso 1,2±0,2 mg) de cada população de interesse foi acondicionado em tubos eppendorf e congelado, ainda vivo, à - 70ºC. As amostras foram retiradas imediatamente antes do uso, e colocadas no gelo para seu processamento inicial. A trituração dos insetos foi realizada fora do gelo em 30µl de água deionizada (Milli Q), durante aproximadamente 10 segundos com o auxílio de um pistilo para microtubos acoplado a um homogeneizador mecânico (Foredom). Após a trituração, elevou-se o volume do homogenato para 300µl e a partir daí foram retiradas alíquotas para todos os ensaios. O homogenato de cada inseto foi submetido à quantificação simultânea da atividade das enzimas: esterases, com os substratos acetato de alfa-naftil, de beta-naftil, e de p-nitrofenil; oxidase de função mista; Glutationa-S-Transferase; acetilcolinesterase. Dosagem de proteínas totais de cada indivíduo, utilizando reagente de Bradford, foi realizada para normalização das atividades enzimáticas. Quatro alíquotas por indivíduos, de 25µL cada, foram reservadas para dosagem de AChE. Duas outras alíquotas por indivíduo, de 20µL cada, foram utilizadas para dosagem de OFM. O restante do homogenato (~160 µL) foi centrifugado a -4ºC a 12.000g por um minuto. Em seguida, os tubos voltaram para o gelo de forma a reduzir a proteólise. O restante do homogenato foi distribuído em placas de 96 poços para a realização dos demais ensaios bioquímicos, conforme descrito no anexo 6 (figura 6). Após o processamento das amostras e leitura em espectofotômetro SpectraMax (Molecular Devices), obteve-se como resultado o valor de absorbância das réplicas de cada 66 ninfa. Para serem expressos em valores de atividade enzimática, estes dados foram processados e corrigidos quanto: ao volume de homogeneização da ninfa, a quantidade de proteínas totais e a unidade de atividade de cada enzima. Foram utilizadas planilhas, elaboradas em Excel, que permitiram: 1) a verificação e validação dos resultados obtidos com as duplicatas (foram rejeitadas as amostras cujo desvio padrão entre as réplicas foram superior a 30% de sua média); 2) transformação dos valores de absorbância em atividade enzimática; 3) a correção dos valores de atividade pela quantidade de proteínas totais em cada inseto e 4) a confecção automática de histogramas com o perfil das populações, para cada enzima avaliada. A classificação do perfil de atividade enzimática das populações de estudo foi realizada por meio da adoção de medidas não paramétricas, tendo sido adotado como ponto de corte o percentil 99 (p99) da LRS. A categorização dos resultados foi feita empregando o percentual das populações que apresentam atividade superior ao ponto de corte utilizado, sendo classificadas como: 1) normal: se até 15% dos indivíduos da população tiver atividade acima do p99 da cepa LRS; 2) alterada: quando de 15 a 50% da população apresentam atividade acima do p99 da cepa LRS, e 3) muito alterada: se mais de 50% da população tiver atividade acima do p99 da cepa LRS. Além deste critério de classificação foram produzidos gráficos de dispersão com os resultados obtidos para cada população analisada utilizando o programa GRAPH PAD Prism® versão 4.0 (Graph Pad Software INC, San Diego, CA). Neste gráficos, cada indivíduo tem sua atividade representada por um ponto. Adicionalmente, foram marcadas as medianas do perfil de cada população. 67 Considerando a inexistência de ensaios bioquímicos para quantificação da atividade enzimática com triatomíneos, avaliaram-se os seguintes detalhes técnicos: geração ideal, idade ideal e número amostral ideal para realização dos ensaios. 4.7.1. Determinação da geração ideal dos triatomíneos para quantificação da atividade de enzimas relacionadas com a detoxificação de inseticidas Os ensaios foram realizados de acordo com metodologia apresentada no item “ 4.7. Quantificação da atividade de enzimas relacionadas a detoxificação nas populações de T.sordida” variando-se a geração dos indivíduos processados. Foram utilizadas 45 ninfas I da LRS das gerações F1 e F2 (cinco dias de idade, jejum - peso 1,2±0,2 mg). A B C D E G H F I Figura 6. Acondicionamento dos espécimes no gelo para processamento incial (A), acondicionamento individual dos espécimes em eppendorf (B), maceração dos triatomíneos com auxílio de um pistilo acoplado a homogeneizador mecânico (C), distribuição das amostras pré-centrifugação nas placas dispostas em gelo para realização dos ensaios de ACHE e OFM (C), centrifugação a 4ºC (E), distribuição das amostras pós-centrifugação nas placas para demais ensaios (F), realização dos ensaios bioquímicos em temperatura ambiente (G), exemplo de ensaio colorimétrico (H), leitura dos ensaios em espectofotômetro (I). 68 4.7.2. Determinação da idade ideal dos triatomíneos para quantificação da atividade de enzimas relacionadas com a detoxificação de inseticidas Ensaios foram realizados de acordo com metodologia apresentada no item “4.7. Quantificação da atividade de enzimas relacionadas a detoxificação de inseticida nas populações de T.sordida” variando-se a idade dos indivíduos processados. Foram utilizadas 45 ninfas I da LRS da geração F2 com um, três e cinco dias de idade (jejum - peso 1,2±0,2 mg) . 4.7.3. Determinação do número amostral ideal para quantificação da atividade de enzimas relacionadas com a detoxificação de inseticidas Ensaios foram realizados de acordo com metodologia apresentada no item “4.7. Quantificação da atividade de enzimas relacionadas a detoxificação de insticida nas populações de T.sordida” variando-se o número amostral de indivíduos processados por análise. Foram utilizados 45, 90 e 135 ninfas I da LRS da geração F2 (cinco dias de idade, jejum - peso 1,2±0,2 mg). 69 Resultados 70 5.1. Perfil de suscetibilidade de populações de T. sordida ao piretróide deltametrina Os valores calculados para as DL50 e DL95 da linhagem referência de suscetibilidade, “TsREF”, foram de 0,06498 ng i.a./ninfa e 0,25558 ng i.a./ninfa, respectivamente (anexo 7). As análises dos ensaios dose-resposta utilizando o programa PROBIT (FINEY, 1971) identificaram RR50 que variaram de 0,44 a 6,5 (tabela 3). 71 Tabela 3. DL50, DL95, RR50, RR95 e Slope da linhagem referência de suscetibilidade (em vermelho) e das populações de campo de T. sordida tratadas com deltametrina, classificados em ordem crescentes de RR50 Sigla DL50 (IC 95%) DL95 (IC 95%) RR50 RR95 Slope ± Desvio padrão TsMABO 0,02316 (0,01854 - 0,02862) 0,12074 (0,08239 – 0,22552) 0,35 0,42 2,294127 ± 0,3117911 TsMABG 0,02316 (0,01854 - 0,02862) 0,12074 ( 0,08239 - 0,22552) 0,36 0,47 2,585084 ± 0,3462416 TsMB 0,02703 (0,02264 - 0,03179) 0,11540 (0,08650 - 0,17871) 0,42 0,45 2,609935 ± 0,3075596 TsMABS 0,02878 (0,02366 - 0,03500) 0,14447 (0,10001 - 0,26053) 0,44 0,57 2,348057 ± 0,3037205 TsMAPE 0,03429 (0,022821 - 0,04194) 0,16969 (0,11718 - 0,30493) 0,53 0,66 2,368817 ± 0,2992534 TsMAB1 0,04067 (0,03582 - 0,04609) 0,11103 (0,08790 - 0,16261) 0,63 0,43 3,77233 ± 0,5066604 TsIBG 0,04698 (0,03502 - 0,06145) 0,48518 (0,28753 - 1,15977) 0,72 1,90 1,622538 ± 0,2249861 TsCMCA 0,04687 (0,03668 - o,o5865) 0,31420 (0,21007 - 0,59230) 0,72 1,23 1,990988 ± 0,2529151 TsSHS 0,05714 (0,04449 - 0,07296) 0,45522 (0,28247 - 0,99810) 0,88 1,78 1,825349 ± 0,2464478 TsSMS 0,05695 (0,04260 - 0,07584) 0,67391 (0,36593 - 1,98778) 0,88 2,64 1,533097 ± 0,2312359 TsREF 0,06498 (0,05297 - 0,07711) 0,25558 (0,18773 - 0,43379) 1,00 1,00 2,766234 ± 0,4103722 TsCJBO 0,06644 (0,05198 - 0,8516) 0,50023 (0,31693 - 1,02544) 1,02 1,96 1,876515 ± 0,2345804 TsPFO 0,06791 (0,05344 - 0,08526) 0,51367 (0,34245 - 0,94239) 1,05 2,01 1,872208 ± 0,2134808 TsSMC 0,07325 (0,58630 - 0,09102) 0,50068 (0,33516 - 0,92368) 1,13 1,96 1,970957 ± 0,2319078 TsSFBG 0,07500 (0,05668 - 0,09855) 0,89802 (0,52814 - 2,06372) 1,15 3,51 1,525866 ± 0,1879548 TsCMS 0,07776 (0,06066 - 0,09756) 0,56767 (0,36144 - 1,21667) 1,20 2,22 1,905577 ± 0,2696053 TsBMCC 0,07949 (0,06385 - 0,09740) 0,45157 (0,30949 - 0,82780) 1,22 1,77 2,18076 ± 0,2846758 TsMQ 0,07932 (0,06216 - 0,10150) 0,71648 (0,43847 - 1,56782) 1,22 2,80 1,721247 ± 0,2177378 TsBM 0,08312 (0,06526 - 0,10569) 0,67358 (0,43621 - 1,29174) 1,28 2,64 1,810565 ± 0,2054649 TsMAPO 0,08466 (0,07052 - 0,10082) 0,36033 (0,26325 - 0,58847) 1,30 1,40 2,615409 ± 0,3261687 TsFGFC 0,08499 (0,06499 - 0,10480) 0,50497 (0,34896 - 0,94263) 1,31 1,98 2,12592 ± 0,3079842 TsIVB 0,08695 (0,6990 - 0,10724) 0,48874 (0,33712 - 0,86746) 1,34 1,91 2,194177 ± 0.2681836 TsMCPR 0,09550 (0,07598 - 0,11982) 0,81130 (0,52377 - 1,57173) 1,47 3,17 1,770575 ± 0,2018067 TsBE 0,10271 (0,07733 - 0,13320) 1,17226 (0,70175 - 2,67052) 1,58 4,58 1,555875 ± 0,2008325 TsSHC 0,10253 (0,08124 - 0,13072) 0,76961 (0,46577 - 1,83469) 1,58 3,01 1,879292 ± 0,272835 72 Cont.tabela 3. DL50, DL95, RR50, RR95 e Slope da linhagem referência de suscetibilidade (em vermelho) e das populações de campo de T. sordida tratadas com deltametrina, classificados em ordem crescentes de RR50 Sigla DL50 (IC 95%) DL95 (IC 95%) RR50 RR95 Slope ± Desvio padrão TsELP 0,10271 (0,07733 - 0,13320) 1,17226 (0,70175 - 2,67052) 1,58 4,58 1,555875 ± 0,2008325 TsMAL 0,10261 (0,08322 - 0,13134) 0,55160 (0,34366 - 1,29802) 1,63 2,16 2,25236 ± 0,3500948 TsMT 0,11008 (0,08930 - 0,13497) 0,69030 (0,46779 - 1,26293) 1,69 2,70 2,063389 ± 0,2501181 TsIMC 0,11480 (0,09478 - 0,13851) 0,59758 (0,42397 - 1,00476) 1,77 2,34 2,296312 ± 0,2662443 TsMG 0,11642 (0,09540 - 0,13968) 0,55610 (0,39701 - 0,95471) 1,79 2,18 2,422501 ± 0,3166517 TsSHB 0,11690 (0,09223 - 0,15103) 0,91627 (0,54775 - 2,19232) 1,80 3,59 1,839856 ± 0,258450 TsMRA 0,11722 (0,09524 - 0,14413) 0,74224 (0,49788 - 1,38501) 1,80 2,90 2,052581 ± 0,2509337 TsLSJ 0,11745 (0,9520 - 0,14230) 0,62231 (0,43057 - 1,14039) 1,81 2,43 2,271913 ± 0,3087804 TsJJ 0,11942 (0,09072 - 0,15617) 1,81227 (1,06075 - 4,05402) 1,84 7,09 1,392897 ± 0,1559985 TsBSC 0,11991 (0,09614 - 0,14787) 0,92016 (0,61340 - 1,70535) 1,85 3,60 1,858971 ± 0,2156289 TsVPB 0,12191 (0,09267 - 0,15765) 0,96449 (0,57940 - 2,38214) 1,88 3,77 1,831577 ± 0,280755 TsLG 0,12287 (0,09975 - 0,14922) 0,66315 (0,45388 - 1,24196) 1,89 2,59 2,246997 ± 0,3076005 TsCJCAB 0,12526 (0,09909 - 0,15901) 1,07407 (0,65789 - 2,38571) 1,93 4,20 1,762943 ± 0,2307603 TsSMB 0,12548 (0,09134 - 0,17139) 1,83702 (0,97361 - 5,38784) 1,93 7,18 1,411558 ± 0,1993814 TsICV 0,12792 (0,10157 - 10,16307) 0,89219 (0,56567 - 1,84615) 1,97 3,49 1,950446 ± 0,2486568 TsSJMT 0,12769 (0,10886 - 0,14866) 0,43428 (0,33630 - 0,63749) 1,97 1,70 3,094685 ± 0,3611941 TsIMB 0,12835 (0,10585 - 0,15612) 0,70259 (0,48567 - 1,24090) 1,98 2,75 2,228378 ± 0,2653458 TsLM 0,12893 (0,10429 - 0,15843) 0,77145 (0,53933 - 1,30455) 1,98 3,02 2,117515 ± 0,2319684 TsFM 0,12941 (0,10305 - 0,16427) 1,06651 (0,65051 - 2,40536) 1,99 4,17 1,796065 ± 0,2387321 TsBBV2 0,13147 (0,10885 - 0,15811) 0,91627 (0,54775 - 2,19232) 2,02 3,58 1,831577 ± 0,2501181 TsEM 0,13078 (0,10466 - 0,16648) 1,09804 (0,68060 - 2,30967) 2,01 4,28 1,780396 ± 0,2123702 TsFSA 0,13094 (0,10450 - 0,16262) 0,85504 (0,54959 - 1,81728) 2,02 3,35 2,018894 ± 0,288686 TsMV 0,13147 (0,10885 - 0,15811) 0,75352 (0,53535 - 1,24620) 2,02 2,95 2,169659 ± 0,2351051 73 Cont.tabela 3. DL50, DL95, RR50, RR95 e Slope da linhagem referência de suscetibilidade (em vermelho) e das populações de campo de T. sordida tratadas com deltametrina, classificados em ordem crescentes de RR50 Sigla DL50 (IC 95%) DL95 (IC 95%) RR50 RR95 Slope ± Desvio padrão TsJC 0,13179 (0,10442 - 0,16866) 1,15552 (0,68846 - 2,73717) 2,03 4,52 1,744842 ± 0,236445 TsPCV 0,13302 (0,10752 - 0,16348) 0,78972 (0,51879 - 1,61381) 2,05 3,09 2,126784 ± 0,3024842 TsLSJ2 0,13370 (0,11020 - 0,16129) 0,65940 (0,45943 - 1,18689) 2,06 2,58 2,373962 ± 0,3149217 TsFSA1 0,13558 (0,11142 - 0,16424) 0,69381 (0,47707 - 0,28336) 2,09 2,71 2,320285 ± 0,3123067 TsMCRO 0,13676 (0,11146 - 0,16957) 0,87463 (0,57295 - 1,71103) 2,10 3,42 2,041550 ± 0,255140 TsFSM 0,13662 (0,10788 - 0,17221) 1,31121 (0,81358 - 2,77704) 2,10 5,13 1,675118 ± 0,2053498 TsLA 0,13739 (0,10704-0,17640) 0,97599 (0,59275 - 2,36446) 2,11 3,82 1,93214 ± 0,2946357 TsEMI 0,13762 (0,11336 - 0,16653) 0,69303 (0,47805 - 1,27312) 2,12 2,71 2,343333 ± 0,3138000 TsFB1 0,13873 (0,11149 - 0,17533) 1,04662 (0,64966 - 2,27785) 2,13 4,09 1,874634 ± 0,2452204 TsJD 0,13822 (0,10094 - 0,18133) 1,05175 (0,61592 - 2,98984) 2,13 4,12 1,866702 ± 0,1109403 TsLOJFQ 0,13912 (0,11004 - 0,17588) 1,35352 (0,82681 - 2,96594) 2,14 5,29 1,665056 ± 0,2081881 TsGAM 0,13977 (0,11477 - 0,16994) 0,73233 (0,49784 - 1,38701) 2,15 2,87 2,287267 ±0 ,311153 TsVPG 0,14019 (0,11555 - 0,16988) 0,69683 (0,48349 - 1,25549) 2,16 2,73 2,362419 ± 0,3078096 TsJP 0,14102 (0,10983 - 0,18553) 1,61369 (0,92132 - 3,92317) 2,17 6,31 1,554218 ± 0,1917058 TsIA 0,14150 (0,11732 - 0,17050) 0,55770 (0,40814 - 0,90245) 2,18 2,18 2,762036 ± 0,3399455 TsIB 0,14268 (0,11446 - 0,17518) 0,81228 (0,56295 - 1,43675) 2,20 3,18 2,178084 ± 0,2699631 TsFJC 0,14405 (0,11805 - 0,17607) 0,78185 (0,52326 - 1,53041) 2,22 3,06 2,239602 ± 0,3093611 TsLB 0,14755 (0,12214 - 0,17877) 0,72884 (0,50126 - 1,34612) 2,27 2,85 2,371621 ± 0,3170539 TsGVC 0,14735 (0,12157 - 0,17668) 0,77192 (0,54883 - 1,30706) 2,27 3,02 2,287449 ± 0,2756872 TsVC 0,14824 (0,12418 - 0,17729) 0,64617 (0,46165 - 1,10468) 2,28 2,53 2,573088 ± 0,3291464 TsBMA 0,14824 (0,12418 - 0,17729) 0,64617 (0,46165 - 1,10468) 2,28 2,53 2,573088 ± 0,3291464 TsBB 0,14950 (0,11738 - 0,19611) 1,19232 (0,70751 - 2,82645) 2,30 4,66 1,824465 ± 0,2456384 TsVPBRE 0,15078 (0,12599 - 0,18111) 0,67948 (0,47957 - 1,19023) 2,32 2,66 2,516285 ± 0,3262575 TsJBL 0,15051 (0,12614 - 0,18014) 0,64617 (0,46165 - 1,10468) 2,32 2,53 2,762036 ± 0,3399455 TsSJPC 0,15203 (0,12738 - 0,18215) 0,66673 (0,47399 - 1,15117) 2,34 2,61 2,562517 ± 0,3294625 TsMF 0,15255 (0,12673 - 0,18185) 0,61998 (0,46666 - 0,93969) 2,35 2,43 2,701605 ± 0,3016131 74 Cont.tabela 3. DL50, DL95, RR50, RR95 e Slope da linhagem referência de suscetibilidade (em vermelho) e das populações de campo de T. sordida tratadas com deltametrina, classificados em ordem crescentes de RR50 Sigla DL50 (IC 95%) DL95 (IC 95%) RR50 RR95 Slope ± Desvio padrão TsJB4 0,15938 (0,13268 - 0,18961) 0,63384 (0,45317 - 1,13442) 2,45 2,48 2,744123 ± 0,4074209 TsSFC 0,16091 (0,12876 - 0,19817) 1,02991 (0,70583 - 1,83493) 2,48 4,02 2,040651 ± 0,2428582 TsFANC 0,16333 (0,13637 - 0,19480) 0,79077 (0,56853 - 1,31057) 2,51 3,09 2,401844 ± 0,2838995 TsMM 0,16391 (0,13498 - 0,20222) 0,88915 (0,58363 - 1,81203) 2,52 3,47 2,240305 ± 0,3134104 TsSJPGG 0,16452 (0,13779 - 0,19855) 0,73832 (0,51567 - 1,32165) 2,53 2,89 2,523264 ± 0,3306413 TsVLJ1 0,16781 (0,13907 - 0,20567) 0,84729 (0,56775 - 1,65214) 2,58 3,32 2,33951 ±0,3201323 TsMC 0,17171 (0,13857 - 0,21221) 1,01106 (0,68036 - 1,89540) 2,64 3,95 2,136691 ± 0,2714072 TsLOBC 0,17280 (0,13762 - 0,21792) 1,44048 (0,86617 - 3,45103) 2,66 5,63 1,786408 ± 0,2548225 TsCMCC 0,17315 (0,14373 - 0,20862) 0,91783 (0,63883 - 1,61808) 2,66 3,59 2,271287 ± 0,2780752 TsMCC 0,17689 (0,13729 - 0,23344) 1,86853 (1,06277 - 4,69824) 2,72 7,31 1,60696 ± 0,2105084 TsIMA 0,17652 (0,14786 - 0,21194) 0,89673 (0,63770 - 1,49129) 2,72 3,51 2,330747 ± 0,2587591 TsMAC 0,17689 (0,13729 - 0,23344) 1,86853 (1,06277 - 4,69824) 2,72 7,31 1,60696 ± 0,2105084 TsSJMC 0,17695 (0,14142 - 0,22452) 1,32283 (0,83993 - 2,68003) 2,72 5,17 1,883137 ± 0,2266903 TsSFE 0,18045 (0,14684 - 0,22172) 0,98753 (0,67542 - 1,79351) 2,78 3,86 2,228676 ± 0,2781051 TsLOASM 0,18217 (0,14617 -0,23089) 1,57904 (0,96774 - 3,43277) 2,80 6,17 1,754118 ± 0,2168159 TsVLJ 0,18337 (0,15084 - 0,22936) 1,00766 (0,64578 - 2,16366) 2,82 3,94 2,22333 ± 0,3175878 TsPCM 0,19576 (0,15846 - 0,24547) 1,25621 (0,82256 - 2,41429) 3,01 4,91 2,037808 ± 0,2421186 TsSJPAP 0,19529 (0,15339 - 0,25241) 1,60671 (0,94817 - 3,98341) 3,01 6,28 1,797522 ± 0,258684 TsME 0,19914 (0,16970 - 0,23274) 0,72906 (0,54726 - 1,14609) 3,06 2,85 2,919085 ±0,3682901 TsSJMSC 0,20571 (0,17510 - 0,24128) 0,77303 (0,57379 - 1,24240) 3,17 3,02 2,861521 ± 0,3659245 TsFSBF 0,20732 (0,17178 - 0,25142) 0,95338 (0,67496 - 1,62833) 3,19 3,73 2,48284 ±0,3024829 TsGC 0,215629 (0,17256 - 0,25986) 1,00766 (0,64578 - 2,16366) 3,21 3,94 2,228676 ± 0,2781051 TsGCM 0,21933 (0,18320 - 0,26447) 1,03250 (0,70707 - 1,96113) 3,38 4,03 2,445338 ± 0,3440588 TsMABRE 0,25646 (0,21031 - 0,31007) 1,27922 (0,88636 - 2,34184) 3,94 5,00 2,357295 ± 0,3204596 TsCJB 0,42289 (0,36786 - 0,48405) 1,43181 (1,08906 - 2,24144) 6,50 5,60 3,106183 ± 0,4136599 75 De acordo com critério de categorização do status da resistência proposto pela OPAS (2005), das 99 populações de T. sordida estudadas, apenas uma (1%) foi classificada como resistente incipiente a deltametrina (TsCJB; RR50: 6,50 – maior RR encontrada), sendo as demais (99%) suscetíveis (figura 7A). Contudo, de acordo com critério proposto por ZERBA & PICOLLO (2002), 55 populações (55,5%) foram consideradas resistentes (RR50 2,01 a 6,5), sendo as demais 44 (44,4%) suscetíveis ao ativo químico testado (figura 7B). Utilizando ambos os critérios, 10 populações (10,1%) foram mais suscetíveis ao inseticida avaliado que a própria LRS. Figura 7. Distribuição das localidades de acrodo com o status de suscetibilidade/resistência proposto pela OPAS (2005) – A e por Zerba &PICOLLO (2002) – B. Das 98 populações estudadas, duas (2,04 %) apresentaram slope igual ao da LRS e 4 ( 4,08 %) maior, refletindo perfis de heterogeneidade iguais ou semelhantes ao da linhagem referência, respectivamente. Contudo, outras 92 populações (93,88 %) apresentaram slope inferior a LRS refletindo maior variabilidade das mesmas com relação a esta característica merecendo atenção considerando a capacidade de modificação deste perfil de resposta frente a pressão de seleção com o ativo químico em campo na linha do tempo. A B 76 Os perfis de inclinação da reta dose resposta variaram bastante inclusive ao nível de município (figuras 8, 9, 10, 11e 12). 77 0.001 0.01 0.1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsSHBTsREF TsSHCTsSHS Dose (nag i.a./inseto) M o r t a l i d a d e ( P R O B I T ) 0.001 0.01 0.1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsBSCTsREF TsBE TsBBV2 Dose (nag i.a./inse to) M o r t a l i d a d e ( P R O B I T ) 0.001 0.01 0.1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsVPBUTsREF TsVPG TsVPBR Dose (nag i.a./inseto) M o r t a l i d a d e ( P R O B I T ) 0.001 0.01 0.1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsCJBTsREF TsLSCJBO TsCJCAB Dose (nag i.a./inseto) M o r t a l i d a d e ( P R O B I T ) 0.001 0.01 0.1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsIBGTsREF TsIVB Dose (nag i.a./inseto) M o r t a l i d a d e ( P R O B I T ) 0.001 0.01 0.1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsMCROTsREF TsMCPR TsMCC Dose (nag i.a./inseto) M o r t a l i d a d e ( P R O B I T ) Figura 8. Perfil de inclinação da reta dose resposta para populações de T. sordida, em escala logarítmica (aplicação tópica de 0,2µL de deltametrina, solubilizada em acetona, no dorso de abdômen de ninfas I da geração F1 - cinco dias de idade, jejum - peso 1,2±0,2 mg – registro de mortalidade com 72 horas.) Localidades amostradas: A: Santo Hipólito; B: Buenópolis, C: Várzea da Palma; D: Ibiaí; E: Coração de Jesus; F: Montes Claros. A B C D E F Dose (ng i.a./inseto) Dose (ng i.a./inseto) Dose (ng i.a./inseto) Dose (ng i.a./inseto) Dose (ng i.a./inseto) Dose (ng i.a./inseto) 78 D E F C B A 0.001 0.01 0.1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsELPTsREF TsEM TsEMI Dose (nag i.a./inseto) M o r t a l i d a d e ( P R O B I T ) A B 0.001 0.01 0.1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsFSBFTsREF TsFSA1 TsFSA Dose (nag i.a./inseto) M o r t a l i d a d e ( P R O B I T ) 0 .00 1 0 .0 1 0 .1 1 1 0 10 0 2 3 4 5 6 7 8 TsPCMTsREF TsPF O TsPCV Dos e (nag i.a./ins e to) M o r t a l i d a d e ( P R O B I T ) 0.001 0.01 0.1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsSMCTsREF TsSMSTsSMB Dose (nag i.a./inseto) M o r t a l i d a d e ( P R O B I T ) Figura 9. Perfil de inclinação da reta dose resposta para populações de T. sordida, em escala logarítmica (aplicação tópica de 0,2µL de deltametrina, solubilizada em acetona, no dorso de abdômen de ninfas I da geração F1 - cinco dias de idade, jejum - peso 1,2±0,2 mg – registro de mortalidade com 72 horas.) Localidades amostradas: A: Francisco Sá; B: Porteirinha, C: Serranópolis de Minas; D: Monte Azul; E: Mamonas ; F: Espinosa 0.001 0.01 0.1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsMTTsREF TsMRA TsMM Dose (nag i.a./inseto) M o r t a l i d a d e ( P R O B I T ) 0.001 0.01 0.1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsREF TsMABA TsMABS TsMABA1 TsMAC TsMABO TsMABRE TsMABG Dose (nag i.a./inseto) M o r t a l i d a d e ( P R O B I T ) Dose (ng i.a./inseto) Dose (ng i.a./inseto) Dose (ng i.a./inseto) Dose (ng i.a./inseto) Dose (ng i. ./inseto) Dose (ng i.a./inseto) 79 A 0.001 0.01 0.1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsBM CCTsREF Dos e (nag i.a./ins e to) M o r t a l i d a d e ( P R O B I T ) 0.001 0.01 0.1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsLMTsREF TsLA TsLB Dose (nag i.a./inseto) M o r t a l i d a d e ( P R O B I T ) 0.001 0.01 0.1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsIMATsREF TsIMB TsIMC Dose (nag i.a./inseto) M o r t a l i d a d e ( P R O B I T ) 0.001 0.01 0 .1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsSFCTsREF TsSFE TsSF BG Dos e (nag i.a./ins e to) M o r t a l i d a d e ( P R O B I T ) 0.001 0.01 0.1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsJPTsREF TsJD TsJJ Dose (nag i.a./inseto) M o r t a l i d a d e ( P R O B I T ) Figura 10. Perfil de inclinação da reta dose resposta para populações de T. sordida, em escala logarítmica (aplicação tópica de 0,2µL de deltametrina, solubilizada em acetona, no dorso de abdômen de ninfas I da geração F1 - cinco dias de idade, jejum - peso 1,2±0,2 mg – registro de mortalidade com 72 horas.) Localidades amostradas: A: São joão da Ponte; B: Brasília de Minas, C: Luislândia; D: Icaraí de Minas; E: São Franciso; F: Japonvar. E F D B C 0.001 0.01 0.1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsSJPCTsREF TsSJPAPTsSJPGG Dose (nag i.a./inseto) M o r t a l i d a d e ( P R O B I T ) Dose (ng i.a./ nseto) Dose (ng i.a./inseto) Dose (ng i.a./ nseto) Dose (ng i. ./inseto) ose (ng i.a./inseto) (ng i.a./inseto) 80 A C B D E F 0.001 0.01 0.1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsCM STsREF TsCM CCTsCM CA Dose (nag i.a./inse to) M o r t a l i d a d e ( P R O B I T ) 0.001 0.01 0.1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsLSJTsREF TsLSJ2 TsLG Dose (nag i.a./inseto) M o r t a l i d a d e ( P R O B I T ) 0.001 0.01 0.1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsICVTsREF TsIB TsIA Dose (nag i.a./inse to) M o r t a l i d a d e ( P R O B I T ) 0.001 0.01 0.1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsVCTsREF TsVLJ1TsVLJ Dose (nag i.a./inseto) M o r t a l i d a d e ( P R O B I T ) 0.001 0.01 0.1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsREF TsJC TsJBLTsJB4 Dose (nag i.a./inseto) M o r t a l i d a d e ( P R O B I T ) 0.001 0.01 0.1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsMBTsREF TsMV TsMQ TsMG Dose (nag i.a./inseto) M o r t a l i d a d e ( P R O B I T ) Figura 11. Perfil de inclinação da reta dose resposta para populações de T. sordida, em escala logarítmica (aplicação tópica de 0,2µL de deltametrina, solubilizada em acetona, no dorso de abdômen de ninfas I da geração F1 - cinco dias de idade, jejum - peso 1,2±0,2 mg – registro de mortalidade com 72 horas.) Localidades amostradas: A:Lontra; B: Ibiracatu; C: Vazerlândia; D:Januária; E: Cônego Marinho; F: Montalvânia. Dose (ng i.a./inseto) Dose (ng i. ./inseto) Dose (ng i.a./inseto) ose (ng i.a./inseto) Dose (ng i.a./inseto) ose (ng i.a./ nseto) 81 B F A B F Figura 12. Perfil de inclinação da reta dose resposta para populações de T. sordida, em escala logarítmica (aplicação tópica de 0,2µL de deltametrina, solubilizada em acetona, no dorso de abdômen de ninfas I da geração F1 - cinco dias de idade, jejum - peso 1,2±0,2 mg – registro de mortalidade com 72 horas.) Localidades amostradas: A:São João das Missões; B:Buritis; C: Gurinhatã; D: Limeiro do Oeste; E: Frutal; F:Manga. 0.001 0.01 0.1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsSJMTTsREF TsSJMC TsSJMSC Dose (nag i.a./inseto) M o r t a l i d a d e ( P R O B I T ) 0.001 0.01 0.1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsBBTsREF TsBMATsBM Dose (nag i.a./inseto) M o r t a l i d a d e ( P R O B I T ) 0.001 0.01 0.1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsGVC TsGC TsGCMTsREF TsGAM Legenda C Dose (ng i.a/inseto) M o r t a l i d a d e ( p r o b i t ) 0.001 0.01 0.1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsFANC TsFGFC TsFBTsREF TsFJC TsFSM TsFM Legenda B Dose (ng i.a/inseto) M o r t a l i d a d e ( p r o b i t ) E 0.001 0.01 0.1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsMCTsREF TsME TsMF Dose (nag i.a./inseto) M o r t a l i d a d e ( P R O B I T ) 0.001 0.01 0.1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsLOASM TsLOJFQ TsLOBCTsREF Legenda D Dose (ng i.a/inseto) M o r t a l i d a d e ( p r o b i t ) Dose (ng i.a./inseto) Dose (ng i.a./ nseto) Dose (ng i.a./inseto) 82 Para as localidades de entorno de Barriguda as RR50 variaram de 1,22 a 2,82 (tabela 4). De acordo com preconização da OPAS (2005), todas as populações são suscetíveis ao inseticida testado, enquanto que de acordo com ZERBA & PICOLLO (2002) duas são suscetíveis (TsCJJ II e TsCJJ I) e outras duas, resistentes (TsCJBJ e TsCJBV1). Tabela 4. DL50, DL95, RR50, RR95 e Slope da linhagem referência de suscetibilidade e das populações T. sordida coletadas nas localidades de entorno de Barriguda (município de Coração de Jesus), ranquiados por RR50 em ordem crescente. Sigla DL50 (IC 95%) DL95 (IC 95%) RR50 RR95 Slope TsCJJ I 0,07949 (0,06385 - 0,09740) 0,45157 (0,30949 - 0,82780) 1,22 1,77 2,18076 ± 0,2846758 TsCJJ II 0,11991 (0,09614 - 0,14787) 0,92016 (0,61340 - 1,70535) 1,85 3,60 1,858971 ± 0,2156289 TsCJBJ 0,14450 (0,11637 - 0,18009) 0,93499 (0,58884 - 2,09696) 2,22 3,66 2,028811 ± 0,2992796 TsCJBV1 0,18339 (0,15155 - 0,22313) 1,04427 (0,70594 - 1,94930) 2,82 4,08 2,177855 ± 0,2747436 Referindo-se ao slope, todas as populações apresentaram slope inferior a LRS, refletindo maior heterogeneidade destas quando comparada a LRS referindo-se a característica avaliada (figura 13) Figura 13. Perfil de inclinação da reta dose resposta para populações de T. sordida, em escala logarítmica (aplicação tópica de 0,2µL de deltametrina, solubilizada em acetona, no dorso de abdômen de ninfas I da geração F1 - cinco dias de idade, jejum - peso 1,2±0,2 mg - registrode mortalidade com 72 horas.) Localidades amostradas: A: Barrigura – em vermelho análise feita em 2007 e em azul, em 2009. B: localidades de entorno de Barriguda. B A 0.001 0.01 0.1 1 10 100 2 3 4 5 6 7 8 TsCJB (PESSOA, 2008)TsREF TsCJB Dose (nag i.a./inseto) M o rt a lid a de (P R O BI T) 0 .00 1 0 .01 0 .1 1 10 10 0 2 3 4 5 6 7 8 TsCJBTsREF TsCJBJ TsCJBV1 TsCJJ1 TsCJJ2 Dos e (nag i.a./ins e to) M or ta lid ad e (P R O B IT ) Dose (ng i.a./inseto) ose (ng i. ./inseto) 83 5.2. Taxa de mortalidade das populações de T.sordida em resposta à dose diagnóstica O percentual de mortalidade de ninfas I de T. sordida em resposta a dose diagnóstica de 1xDL99 da LRS variou de 43,3% a 100% (tabela 5). Utilizando-se a dose 2xDL99 de acordo com WHO (1981) em todas as populações se verificou 100% de mortalidade, indicando suscetibilidade ao ativo testado de acordo com metodologia adotada. 84 Tabela 5. Mortalidade das populações de T. sordida em resposta à dose diagnóstica (DD) 1xDL99 da linhagem referência de suscetibilidade. Total amostrado por população de 30 espécimes. População RR50 Número de ninfas I mortas em resposta a 1x DD99 LRS % mortalidade Classificação do status de suscetibilidade 0,45073 nag i.a/ninfa TsCJB 6,5 13 43,3 RESISTENTE TsMABO 1,81 21 70 RESISTENTE TsMABRE 3,94 21 70 RESISTENTE TsGCM 3,38 22 73,3 RESISTENTE TsLOASM 2,8 23 76,6 RESISTENTE TsLOBC 2,66 23 76,6 RESISTENTE TsPCM 3,01 23 76,6 RESISTENTE TsSJPAP 3,01 23 76,6 RESISTENTE TsLOJFQ 2,14 24 80 RESISTENTE TsFSM 2,1 25 83,3 RESISTENTE TsGVC 2,27 25 83,3 RESISTENTE TsVPB 1,88 25 83,3 RESISTENTE TsIBG 0,72 25 83,3 RESISTENTE TsMCC 2,72 25 83,3 RESISTENTE TsSMB 1,93 25 83,3 RESISTENTE TsMRA 1,8 25 83,3 RESISTENTE TsIMA 2,72 25 83,3 RESISTENTE TsSFC 2,48 25 83,3 RESISTENTE TsLG 1,89 25 83,3 RESISTENTE TsIB 2,2 25 83,3 RESISTENTE TsCMCC 2,66 25 83,3 RESISTENTE TsMB 0,42 25 83,3 RESISTENTE TsSJMC 2,72 25 83,3 RESISTENTE TsME 3,06 25 83,3 RESISTENTE TsFANC 2,51 26 86,6 RESISTENTE TsBSC 1,85 26 86,6 RESISTENTE TsBE 1,58 26 86,6 RESISTENTE TsVPG 2,16 26 86,6 RESISTENTE TsMCRO 2,1 26 86,6 RESISTENTE TsFSA1 2,09 26 86,6 RESISTENTE TsFSBF 3,19 26 86,6 RESISTENTE TsMM 2,52 26 86,6 RESISTENTE TsELP 1,58 26 86,6 RESISTENTE TsLA 2,27 26 86,6 RESISTENTE TsLM 1,98 26 86,6 RESISTENTE TsSFE 2,78 26 86,6 RESISTENTE TsJJ 1,84 26 86,6 RESISTENTE 85 Cont. tabela 5. Mortalidade das populações de T. sordida em resposta à dose diagnóstica (DD) 1xDL99 da linhagem referência de suscetibilidade. Total amostrado por população de 30 espécimes. População RR50 Número de ninfas I mortas em resposta a 1x DD99 LRS % mortalidade Classificação do status de suscetibilidade 0,45073 nag i.a/ninfa TsJP 2,17 26 86,6 RESISTENTE TsICV 1,97 26 86,6 RESISTENTE TsVLJ 2,82 26 86,6 RESISTENTE TsSJMSC 3,17 26 86,6 RESISTENTE TsMF 2,35 26 86,6 RESISTENTE TsFB1 2,13 27 90 RESISTENTE TsFM 1,99 27 90 RESISTENTE TsFSA 2,02 27 90 RESISTENTE TsLB 2,11 27 90 RESISTENTE TsJD 2,13 27 90 RESISTENTE TsFJC 2,22 28 93,3 RESISTENTE TsGC 3,30 28 93,3 RESISTENTE TsGAM 2,15 28 93,3 RESISTENTE TsBBV2 2,01 28 93,3 RESISTENTE TsVPBRE 2,32 28 93,3 RESISTENTE TsCJCAB 1,93 28 93,3 RESISTENTE TsMCPR 1,47 28 93,3 RESISTENTE TsPCV 2,05 28 93,3 RESISTENTE TsEM 2,01 28 93,3 RESISTENTE TsSFBG 1,15 28 93,3 RESISTENTE TsVLJ1 2,58 28 93,3 RESISTENTE TsJBL 2,32 28 93,3 RESISTENTE TsJB4 2,45 29 93,3 RESISTENTE TsBMA 2,3 28 93,3 RESISTENTE TsFGFC 1,31 29 96,6 SUSCETÍVEL TsSHB 1,8 29 96,6 SUSCETÍVEL TsIVB 1,34 29 96,6 SUSCETÍVEL TsCJBO 1,02 29 96,6 SUSCETÍVEL TsMT 1,69 29 96,6 SUSCETÍVEL TsEMI 2,12 29 96,6 SUSCETÍVEL TsSJPC 2,34 29 96,6 SUSCETÍVEL TsSJPGG 2,53 29 96,6 SUSCETÍVEL TsIMC 1,77 29 96,6 SUSCETÍVEL TsLSJ 1,81 29 96,6 SUSCETÍVEL TsLSJ2 2,06 29 96,6 SUSCETÍVEL TsIA 2,18 29 96,6 SUSCETÍVEL TsVC 2,28 29 96,6 SUSCETÍVEL TsJC 2,03 29 96,6 SUSCETÍVEL TsMQ 1,22 29 96,6 SUSCETÍVEL 86 Cont. tabela 5. Mortalidade das populações de T. sordida em resposta à dose diagnóstica (DD) 1xDL99 da linhagem referência de suscetibilidade. Total amostrado por população de 30 espécimes. População RR50 Número de ninfas I mortas em resposta a 1x DD99 LRS % mortalidade Classificação do status de suscetibilidade 0,45073 nag i.a/ninfa TsMV 2,02 29 96,6 SUSCETÍVEL TsMC 2,64 29 96,6 SUSCETÍVEL TsBB 1,28 29 96,6 SUSCETÍVEL TsBM 1,28 29 96,6 SUSCETÍVEL TsSHC 1,58 30 100 SUSCETÍVEL TsSHS 0,88 30 100 SUSCETÍVEL TsPFO 1,05 30 100 SUSCETÍVEL TsSMC 1,13 30 100 SUSCETÍVEL TsSMS 0,88 30 100 SUSCETÍVEL TsMAB 0,67 30 100 SUSCETÍVEL TsMAB1 0,63 30 100 SUSCETÍVEL TsMABG 0,36 30 100 SUSCETÍVEL TsMABS 0,44 30 100 SUSCETÍVEL TsMAPE 0,53 30 100 SUSCETÍVEL TsBMCC 1,22 30 100 SUSCETÍVEL TsIMB 1,98 30 100 SUSCETÍVEL TsCMCA 0,72 30 100 SUSCETÍVEL TsCMS 1,2 30 100 SUSCETÍVEL TsMG 1,79 30 100 SUSCETÍVEL TsSJMT 1,97 30 100 SUSCETÍVEL TsMAL 1,63 30 100 SUSCETÍVEL TsMAPO 1,3 30 100 SUSCETÍVEL TsMAC 2,72 28 100 SUSCETÍVEL De acordo com preconização da WHO (1994), os resultados dos ensaios qualitativos revelaram que 38 populações (38,8%) seriam suscetíveis a deltametrina, sendo todas as demais, resistentes (figura 14) 87 Figura 14. Distribuição das localidades de estudo de acordo com o status de suscetibilidade/resistência a deltametrina popostro por WHO (1981). Categorização da mortalidade das populações de T.sordida frente a dose diagnóstica 1xDL99 da LRS. Em vermelho as populações resistentes a deltametrina e em verde, as suscetívieis. Para as áreas limítrofes com Barriguda (município de Coração de Jesus) a taxa de moratalidade a DD variou de 80,0% a 100% (tabela 6). De acordo com preconização da WHO (1994) todas as populações seriam resistentes a deltametrina, exceto Jataí I. Tabela 6. Percentual de mortalidade das populações de T. sordida circunvizinhas de Barriguda (Coração de Jesus) em resposta às dose diagnósticas (DD) 1xDL99 da linhagem referência de suscetibilidade ranquiados em ordem crescente de % de mortalidade. População RR50 1xDL99 LRS 0,45073 nag i.a/ninfa % mortalidade Classificação do status de suscetibilidade TsCJBV1 2,82 24 80 RESISTENTE TsCJJ2 1,85 26 86,6 RESISTENTE TsCJBJ 2,22 28 93,3 RESISTENTE TsCJJ1 1,22 30 100 SUSCETÍVEL 5.3. Caracterização ambiental do município de Coração de Jesus - MG. 5.3.1. Caracterização das condições climáticas da região de interesse A temperatura máxima variou entre os anos de 1973 (28,6 ºC) a 2010 (30,8 ºC) em 2.2 ºC. Considerando-se a temperatura média normal do período amostrado (29,6 ºC), não se observou diferença significativa em relação ao ano de 1989 a partir do qual se verificou tendência de aumento da temperatura máxima (p< 0,05) (figura 15). 88 Figura 15. Média das temperaturas (máxima e mínima) e insolação do município de Coração de Jesus, do período de 1970 a 2009. Observou-se ainda uma tendência de manutenção da temperatura mínima e da umidade relativa do ar (figura 16). Em contrapartida, verificou-se um aumento da insolação (5,8 a 8,5) na região, medida pela incidência da luz solar em horas e décimos (figura 15). Não se verificou, variações no número meio de dias de chuva, sendo o volume anual regularmente controlados pelos fenômenos La Nina e El Nino. Figura 16. Média da precipitação e umidade relativa do ar do município de Coração de Jesus, do período de 1970 a 2009, incluindo-se intensidade do fenômeno El Nino e La Nina (fraca 100, moderada 200 e forte 300). 89 5.3.2. Caracterização das unidades domiciliares avaliadas Todas as unidades domiciliares das localidades de Barriguda (14 UDs), Boa Vista (17 UDs), Bom Jesus (22 UDs), Jataí II (8 UDs) e Jataí I (27 UDs) foram amostradas. A maior parte das residências apresentaram idade média de construção de 1-10 anos (43,2%) ou >21 anos (45,4%). As paredes em sua predominância são constituídas de adobe sem reboco (40,9%) e tijolo com reboco (38,6%). Os telhados são em 98,9% de telhas de barro e o piso, em sua maioria, revestido de ladrilho (45%) e cerâmica (36,4%) (tabela 7). Ressalta-se que em todas as avaliações as casas se encontravam em bom estado de conservação, isentas de buracos e/ou rachaduras, exceto nas casas de pau-a-pique em Jataí I. Tabela 7. Caracterização das UD`s em relação a idade média, constituição das paredes, teto e piso das mesmas. Localidades Barriguda RR50 6,5 Boa Vista RR50 2,82 Bom Jesus RR50 2,22 Jatai II RR50 1,85 Jatai I RR50 1,22 Idade média das UD`s (%) 1-10 anos 42,8 64,7 27,3 62,5 44,4 11-20 anos 14,3 5,9 9,1 12,5 14,8 >21 anos 42,9 29,4 72,7 25,0 40,7 Constituição das Paredes (%) Pau a Pique - - - - 3,7 Adobe sem reboco 28,6 47,1 40,9 62,5 37,0 Tijolo sem reboco 54,2 5,9 45,5 25,0 48,2 Tijolo com reboco 14,3 47,1 13,6 12,5 11,1 Constituição das Telhados (%) Telha de amianto - - - 12,5 - Telha de barro 100 100 100 87,5 100 Constituição dos Pisos (%) Terra 28,6 35,3 4,6 75,0 29,6 Cimento 41,9 11,8 81,8 25,0 63,0 Ladrilho/cerâmica 29,6 52,9 13,6 - 7,4 A criação de animais domésticos é uma atividade comum que variou de 90,9% em Bom Jesus a 100% nas UD`s em Barriguda e Jataí II, sendo predominantes as galinhas e porcos (tabela 8). Em todas as casas os animais dormem no peridomicílio. Somente nas localidades de Barriguda (21,4%), Jataí I (7,4%) e Bom Jesus (4,5%) os moradores fazem uso de inseticidas para tratamento de pragas em seus animais domésticos sendo eles os cabamatos Lepecide (40%) e Bolfo (40%), bem como Baygon (40%) – combinação de PI e CB. Foi relatado pelos moradores não existir frequência para o uso destes ativos químicos. 90 Tabela 8. Caracterização das UD`s em relação a criação de animais domésticos e uso de inseticidas com vistas ao controle de pragas em suas criações. Localidades Barriguda RR50 6,5 Boa Vista RR50 2,82 Bom Jesus RR50 2,22 Jatai I RR50 1,85 Jatai II RR50 1,22 Total Criação de animais domésticos (%) 100 94,1 90,2 92,6 100 Número Total de Animais Domésticos Cão 27 37 42 25 8 139 Gato 11 28 22 54 28 143 Galinha 357 418 668 33 5 1.481 Porco 60 32 65 750 19 926 Total 455 512 797 862 60 2686 % de moradores que tratam pragas dos animais domésticos com inseticida 21,4 0 4,5 7,4 0 Somente nas UD`s de Barriguda (35,7%), Bom Jesus (18,2%) e Jataí I (14,8%) foi relatado uso de inseticida com fins domésticos (tabela 9), sendo especificado local de uso. Os produtos utilizados são: o organoclorado BHC (8,3%), o organofosforado Malagran (8,3%), os piretróides Rayd (8,3%), Bolfo (8,3%), K-othrine (24,9%), e a combinação de PI com CB - Colosso (8,3%), Barrage (16,6%), Baygon (16,6%). Quanto a frequência de utilização destes ativos químicos 100% dos moradores declararam fazer uso somente quando se faz necessário combater alguma praga doméstica. Tabela 9. UD`s nas quais o morador relatou uso de inseticidas com vistas ao controle de pragas domésticas, especificando local de uso. Barriguda RR50 6,5 Boa Vista RR50 2,82 Bom Jesus RR50 2,22 Jatai II RR50 1,85 Jatai I RR50 1,22 US`s nas quais morador faz uso de inseticidas domésticos (%) 37,7 0 18,2 0 14,8 Local de uso de inseticidas com fins domésticos Peridomicílio 60 - 0 - 50 Intradomicílio 20 - 0 - 25 Intra e Peridomicílio 20 - 100 - 25 O cultivo de grãos, legumes, frutas e hortaliças foi observado em as UD`s de todas as localidades estudadas, variando de 52,9 % em Boa Vista a 95,5 % em Bom Jesus (tabela 10). As áreas de plantio apresentam dimensão reduzida (0,5 a 2 hectares). Nenhum agricultor tem acompanhamento junto a EMATER e nem faz utilização de inseticidas com fins agrícolas. 91 Tabela 10. UD`s nas quais se verifica cultivo de grãos, legumes, frutas ou hortaliças. Localidades Barriguda RR50 6,5 Boa Vista RR50 2,82 Bom Jesus RR50 2,22 Jatai II RR50 1,85 Jatai I RR50 1,22 % de agricultores 92,9 52,9 95,5 75 63 Formando os anexos peridomiciliares das UD`s de Barriguda (7,1%), Bom Jesus (54,5%) e Jataí 1 (3,7%) foram observados montes de lenhas. Apesar da idade de tais anexos ser semelhante em ambas as localidades (0-2 anos), a distância destes em relação ao intradomicilio variou de 8 metros em Barriguda a 15 metros em Jataí 1 (tabela 11). Apenas em uma UD de Barriguda foi relatado uso da mata no entorno (7,7%) com fins de extração de gravetos de lenha. Em todas as localidades foram observadas no peridomicílio amontoados de tijolos e telhas, em maior quantidade nas UD`s das localidades nas quais foram coletadas os triatomíneos suscetíveis de acordo com preconização da OPAS (2005), especialmente em Bom Jesus (59,1%) e Jataí I (48,1%). Em contrapartida, observou-se que este tipo de anexo se localiza mais distante dos intradomicílios de Barriguda (13,3 metros) quando comparado as demais localidades. A idade média destes anexos é de aproximadamente 1,5 anos (tabela 11). Todas as UD`s apresentam em seu peridomicílio cercas constituídas exclusivamente de madeira. A distância média das cercas ao intradomicílio variou de 8,2 metros em Jataí I a 13,8 metros em Bom Jesus. Em Barriguda e Boa Vista as cercas se apresentam mais antigas que as das demais localidades (tabela 11). Os depósitos de máquinas estão presentes apenas no peridomicílio de Bom Jesus e Jataí I com distância média até o intradomicílio variando de 5 a 8 mestros e idade de 7,5 a 10 anos (tabela 11). 92 Tabela 11. UD`s nas quais os montes de lenha, amontoados de tijolos e telhas, cercas e depósitos de máquinas estão presentes no peridomicílio. Distância média entre tais anexos e o intradomicílio em metros e, idade média dos mesmos em anos. Localidades Montes de Lenha Barriguda RR50 6,5 Boa Vista RR50 2,82 Bom Jesus RR50 2,22 Jatai II RR50 1,85 Jatai I RR50 1,22 Presença de montes de lenha no peridomicílio (%) 7,1 - 54,5 - 3,7 Distância média dos montes de lenha ao intradomicílio (metros) 8 - 10,8 - 15 Idade média dos montes de (anos) 2 - 2 - 2 Amontoados de telhas e tijolos Presença de amontoados de telhas e tijolos no peridomicílio (%) 21,4 29,4 59,1 25 48,1 Distância média dos amontoados de telhas e tijolos ao intradomicílio (metros) 13,3 9 8,5 6,5 8,8 Idade média dos amontoados de telhas e tijolos (anos) 1,5 1,6 1,8 0,8 16,2 Cercas Presença de cercas no peridomicílio (%) 14,3 17,6 18,2 25 22,2 Distância média das cercas ao intradomicílio (metros) 10 11 13,8 9 8,2 Idade média das cercas (anos) 25 20 5,4 7,5 11,2 Depósitos de máquinas e utensílios Presença de depósitos de máquinas e utensílios no peridomicílio (%) - - 4,5 - 9,1 Distância média dos depósitos de máquinas e utensílios ao intradomicílio (metros) - - 5 - 8 Idade média dos depósitos de máquinas e utensílios (anos) - - 10 - 7,5 Os galinheiros são anexos peridomiciliares muito comuns em todas as localidades sendo constituídos em sua maioria por madeira. Ressalta-se que em Barriguda são mais distantes do intradomicílio do que os das outras localidades. A idade média destes anexos variou de 2,5 a 4,7 anos (tabela 12). Nos peridomicílios de todas as localidades foram observados chiqueiros, sendo constituídos em sua maioria por madeira. Esses peridomicílios, particularmente na localidade de 93 Barriguda, são mais próximos do intradomicílio do que os das demais localidades. A idade média destes anexos variou de 2,2 a 3,6 anos (tabela 12). Em todas as localidades verificam-se UD`s com currais, construídos de madeira ou arame. A distância média dos currais até os intradomicílios variou de 9,6 metros em Barriguda a 16,7 metros em Boa Vista. A idade média dos mesmos variou de 4 a 8,2 anos (tabela 12). Tabela 12. UD`s nas quais os galinheiros, chiqueiros e currais estão presentes no peridomicílio. Distância média entre tais anexos e o intradomicílio em metros e, idade média dos mesmos em anos e material de construção utilizado. Localidades Galinheiros Barriguda RR50 6,5 Boa Vista RR50 2,82 Bom Jesus RR50 2,22 Jatai II RR50 1,85 Jatai I RR50 1,22 Presença de galinheiros no peridomicílio (%) 85,7 76,5 81,9 75 70,4 Distância média dos galinheiros ao intradomicílio (metros) 13,6 10,8 11,4 9,5 10,2 Idade média dos galinheiros (anos) 2,9 4,15 4,7 2,5 3,3 Constituição dos galinheiros (%) Madeira 91,6 84,6 100 100 89,4 Barro - - - - 5,30 Terra 8,4 15,4 - - 5,30 Chiqueiros Presença de chiqueiros no peridomicílio (%) 71,4 64,7 72,7 37,5 55,6 Distância média dos chiqueiros ao intradomicílio (metros) 10,7 13,6 11,7 13,3 11,8 Idade média dos paióis (anos) 2,2 3,2 3,6 2,7 2,4 Constituição dos chiqueiros (%) Madeira 100 100 94 100 100 Tijolo - - 6 - - Currais Presença de currais no peridomicílio (%) 50 35,3 68,2 12,5 40,7 Distância média dos currais ao intradomicílio (metros) 9,6 16,7 14,3 10 10,4 Idade média dos currais (anos) 5,3 5,5 8,2 4 6,5 Constituição dos Currais (%) Madeira 100 84,0 86,4 100 81,8 Arame - 16,0 13,6 - 18,2 Todas as localidades apresentaram UD`s contendo paióis no peridomicílio (tabela 13), construídos em sua maioria de madeira. Em todas elas a distância entre eles e os intradomicílios é semelhante, contudo os paióis de Barriguda são mais velhos que os das demais localidades. 94 Tabela 13. UD`s nas quais os paióis estão presentes no peridomicílio. Distância média entre tais anexos e o intradomicílio em metros e, idade média dos mesmos em anos e material de construção utilizado. Localidades Paióis Barriguda RR50 6,5 Boa Vista RR50 2,82 Bom Jesus RR50 2,22 Jatai II RR50 1,85 Jatai I RR50 1,22 Presença de paióis no peridomicílio (%) 92,9 64,7 81,8 75 59,3 Distância média dos paióis ao intradomicílio (metros) 8,4 9,1 7,8 9 8,9 Idade média dos paióis ao intradomicílio (anos) 15,7 4,5 3,3 1,7 4,7 Constituição dos paióis (%) Madeira 70,0 54,5 94,4 83,4 68,75 Barro 15,0 7,7 6,6 7,6 12,5 Tela - - - - 6,25 Tijolo - - - - 6,25 Adobe 15,0 37,8 - - 6,25 Os fornos de barro estão presentes nos peridomicílios de UD`S de todas as localidades (tabela 14). A distância média destes anexos até o intradomicílio variou de 3 a 6,7 metros enquanto a idade, de 5 meses a 4 anos. Tabela 14. UD`s nas quais os fornos de barro estão presentes no peridomicílio. Distância média entre tais anexos e o intradomicílio em metros e, idade média dos mesmos em anos. Localidades Fornos de barro Barriguda RR50 6,5 Boa Vista RR50 2,82 Bom Jesus RR50 2,22 Jatai II RR50 1,85 Jatai I RR50 1,22 Presença de fornos de barro no peridomicílio (%) 21,4 17,6 31,8 12,5 29,6 Distância média dos fornos de barro ao intradomicílio (metros) 3 6,7 4,3 5 5,8 Idade média dos fornos de barro (anos) 2,3 4 3,4 0,5 4,1 5.3.3. Histórico de infestação triatomínica e uso de inseticidas na região de interesse O histórico de infestação das UD`s das localidades estudadas está apresentado na tabela 15. O percentual de unidades domiciliares infestadas com triatomíneos foi semelhante em todas as localidades, apresentando-se mais elevado em Barriguda a partir de 1985. O percentual de UD`s trabalhadas permaneceu próximo a 100% em toda região amostrada. Os índices de captura de triatomíneos foram mais elevados em Barriguda, Jataí I e Jataí II. Quanto ao número de cargas de inseticidas borrifadas verificou-se uma maior utilização Barriguda, Jataí II 95 e Jataí I, respectivamente. Até 1982, o inseticida de uso era o organoclorado BHC, sendo substituído por K-Othrine até 1993 quando foi iniciado o uso da alfacipermetrina. As espécies de triatomíneos capturadas foram: T. sordida (94,5%), P. megistus (1,5%), R. nasutus (1,2%), T. infestans (1,1%) e T. pseudomaculata (0,7%), esta última equivocadamente identificada com T. maculata. 96 Tabela 15: Percentual de UD`s positivas e de UD`s trabalhadas, número bruto de triatomíneos capturados por UD e de carga de inseticida aplicado por UD em todas as localidades de interesse. UD´s Positivas / UD´s Trabalhadas / Triatomíneos capturados por UD / Carga de inseticida aplicada por UD Anos Barriguda (RR50 6,5) Boa Vista (RR50 2,82) Bom Jesus (RR50 2,22) Jatai II (RR50 1,85) Jatai I (RR50 1,22) 1980 23,6 / 89,5 / 1 / 2,56 7,14 / 100,0 / - / 1,23 13,0 / 88,5 / - / 3,8 44,4 / 75,0 / - / 0,84 28,7 / 83,1 / - / 0,84 1981 55,2 / 86,8 / 1 / 5,04 21,0 / 93,3 / 1 / 1,00 3,9 / 94,6 / - / 0,43 50,0 / 68,5 / - / 0,72 64,4 / 77,23 / 1 / 3,49 1982 48,0 / 92,5 / 3 / 1,30 7,1 / 85,7 / - / 0,30 3,7 / 96,6 / 5 / 0,14 70,5 / 95,8 / 2 / 1,57 36,1 / 86,7 / 2 / 2,13 1983 76,2 / 100,0 / 4 / 1,78 24,4 / 89,3 / 3 / 0,86 24,4 / 97,0 / 8 / 0,28 32,1 / 100,0 / 5 / 5,5 57,9 / 100,0 / 4 / 1,14 1984 29,5 / 95,3 / 2 / 0,75 7,7 / 89,3 / 1 / 0,33 - / 88,6 / - / 0,76 40,2 / 96,2 / 4 / 0,77 18,9 / 96,2 / 3 / 0,6 1985 99,4 / 88,3 / 4 / 6,04 7,7 / 92,9 / 1 / 0,25 3,6 / 93,3 / 4 / - 36,4 / 95,8 / 6 / 1,03 54,3 / 95,8 / 6 / 1,42 1986 61,9 / 95,5 / 5 / 1,7 27,3 / 84,6 / 4 / 3,3 24,3 / 84,1 / 4 / 0,83 1987 100,0 / 96,7 / 5 / 3,85 71,0 / 92,3 / 5 / 0,54 44,7 / 90,7 / 10 / 2,57 1989 69,6 / 90,2 / 4 / 1,98 50,4 / 95,9 / 3 / 3,1 72,8 / 86,7 / 2 / 0,98 1990 19,1 / 100,0 / 5 / 0,57 5,26 / 100,0 / 3 / 0,88 32,4 / 97,3 / 3 / 0,87 1991 20,0 / 100,0 / 6 / 0,9 16,7 / 92,3 / 5 / 0,67 18,9 / 90,2 / 4 / 0,9 1994 70,6 / 89,5 / 4 / 2,32 36,4 / 91,7 / 3 / 1,09 43,4 / 82,1 / 4 / 1,08 Nota: Nos itens “Triatomíneos capturados por UD” e “Carga de inseticida aplicada por UD” onde existe a simbologia “-“ entende-se que não houve encontro/captura de triatomíneos e não houve aplicação de inseticida, respectivamente. 97 O uso de inseticidas pelo PCDCh nas localidades de interesse no período de 2004 a 2010 está apresentado na tabela 16. Os maiores consumos de inseticida foram observados em Barriguda seguido de Jataí II. Ressalta-se que o único ativo químico utilizado foi a alfacipermetrina (carga igual a 50 mL para cada dez litros de água). Tabela 16. Cargas de inseticidas utilizadas pelo PCDCh nas localidades de interesse no período de 2004 a 2010. Carga do Inseticida Período (anos) Localidade 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 TOTAL Carga/UD Barriguda RR50 6,5 0 0 21 12 0 0 6 39 28,9 Boa Vista RR50 2,82 0 0 11 0 0 0 25 36 9,8 Bom Jesus RR50 2,22 0 0 0 0 0 0 74 74 5,0 Jatai II RR50 1,85 3 0 39 24 0 0 38 82 20,1 Jatai I RR50 1,22 0 0 0 5 0 0 12 17 17,03 5.3.4. Caracterização das atividades prestadas pelos agentes de campo O município de Coração de Jesus conta atualmente com três agentes de saúde, com tempo de experiência profissional variando de quatro meses a um ano. Apesar de nenhum dos funcionários ter sido treinado para executar atividades de controle dos triatomíneos utilizando inseticidas, os dois com mais tempo de serviço (seis meses e um ano) o fazem. Ambos acreditam que a manutenção da pressão do equipamento seja um fator importante na borrifação. Afirmaram sempre terem utilizado o bico TJET 8002® em suas atividades nunca tendo utilizado o bico chapinha. O uso de prego para alterar a saída do bico quando o mesmo entope não foi relatado. A carga do inseticida é medida utilizando as referências da embalagem, sendo a diluição realizada diretamente no pulverizador sem utilização de balde graduado. Em nenhuma campanha de controle eles aplicaram doses do inseticida menores do que as recomendadas ou fizeram uso de ativos químicos vencidos. Em nenhum programa de borrifação foi vivenciada situação que por falta de inseticida, funcionários ou veículos houvesse a necessidade de se excluir algumas UD`s das atividades. Os agentes relataram nunca terem trabalhado em alguma localidade que mesmo executando as atividades de borrifação de forma adequada os triatomíneos não morriam ou em que as colônias cresciam mais rápido do que o esperado. Nenhum relatou ter se intoxicado com inseticida. 98 5.4. Ensaios moleculares de genética de população Dentre os 21 pares de iniciadores testados apenas 10 apresentaram amplificação satisfatória para amostras de T. sordida, sendo eles: Tb 830, Tb 8112, Tb 8124, Tdms 3, Tdms 4, Tp 20, Tp 59, Tp 544, T.infest_ms23, T.infest_ms42 (figura 17). Nas análises dos 44 exemplares de T. sordida foram identificados 75 haplótipos com uma diversidade genética média por loci (pin) de 0,408 (tabela 17). Tabela 17: Variabilidade genética dos 10 loci de microssatélites em populações de T. sordida Localidade n pin S H Jatai I 10 0.507 ± 0.287 8 15 Bom Jesus 10 0.497 ± 0.282 7 18 Barriguda 7 0.467 ± 0.273 9 14 Jatai II 8 0.430 ± 0.252 8 13 Boa Vista 9 0.530 ± 0.300 9 15 TOTAL 44 0,480 ± 0,278 - 75 n = número amostral; pin = diversidade genética média por locus; S = número de loci polimórfico; H = número de haplótipos. A análise individual das populações demonstrou que o número de haplótipos variou de 13 (Jataí II) a 18 (Bom Jesus). As populações de Barriguda e Boa Vista apresentaram o maior número de loci polimórficos (9). A diversidade genética média por loci (pin) variou de 0,430 (Jataí II) a 0,530 (Boa Vista). A variação genética apresentada pelos 10 loci de microssatélites nas populações de T. sordida estão apresentados na tabela 18. O número médio de alelos por locus variou de 0,8 a 5,6. Os menores valores de heterozigosidade média observada e esperada foram observados em Figura 17. Loci Tb 8124 (A) e T.infest_ms42 (B) visualização em gel de acrilamida corado com nitrato de prata. Nota: controles negativos - CN 234 pb 194 pb 99 Jataí II (Ho=0,125 e HE=0,43083), enquanto que os maiores foram observados em Bom Jesus (Ho=0,185 e He=0,71127). O locus Tdms4 se apresentou monomórfico em todas as populações. Desvios significativos do equilíbrio de Hardy-Weinberg foram observados em pelo menos quatro dos 10 loci analisados em todas as populações, revelando déficit de heterozigosidade. Tabela 18. Variação genética apresentada pelos 10 loci de microssatélites nas populações de T. sordida. Loci Localidade Ti 23 Ti 42 Tdms 3 Tdms 4** Tb 830 Tb 8112 Tb 8124 Tp 20 Tp 59 Tp 544 Jatai I NA 7 5 2 x 3 x 8 5 4 4 HO 0.10000 0.00000 0.00000 x 0.30000 x 0.10000 0.30000 0.0000 0.0000 HE 0.84737* 0.77895* 0.33684* x 0.27895 x 0.85789* 0.63158* 0.73684* 0.61053* Bom Jesus NA 6 5 2 x 4 x 5 6 6 x HO 0.20000 0.00000 0.00000 x 0.50000 x 0.10000 0.30000 0.20000 x HE 0.80000* 0.82105* 0.50526* x 0.43684 x 0.78421* 0.84737* 0.78421* x Barriguda NA 4 6 2 x 3 2 3 3 3 4 HO 0.00000 0.28571 0.00000 x 0.57143 0.00000 0.57143 0.28571 0.14286 0.14286 HE 0.74725* 0.79121* 0.26374 x 0.47253 0.26374 0.53846 0.47253 0.47253* 0.64835* Jatai II NA 6 5 2 x 2 x 3 3 7 2 HO 0.37500 0.12500 0.00000 x 0.12500 x 0.00000 0.25000 0.12500 0.0000 HE 0.68333* 0.67500* 0.23333 x 0.12500 x 0.63333* 0.56667* 0.89167* 0.50000* Boa Vista NA 5 5 2 x 2 2 9 3 5 4 HO 0.00000 0.22222 0.00000 x 0.22222 0.00000 0.33333 0.00000 0.11111 0.11111 HE 0.75817* 0.66667* 0.47059* x 0.36601 0.36601* 0.80392* 0.62745* 0.71242* 0.52941* Média 5,6 5,2 2,0 0 2,8 0,8 5,6 4,0 5,0 2,8 NA = número de alelos; HO = heterozigosidade observada; HE = heterozigosidade esperada. * Equilíbrio de Hardy-Weiberg apresentou déficit significativos de heterozigozidade (p<0,05) ** Locus monomórfico Foram identificados 24 alelos exclusivos, sendo: 5 em Jataí I, 4 em Bom Jesus, 2 em Barriguda, 4 em Jataí II e 9 em Boa Vista. Os alelos exclusivos da população resistente segundo OPAS (2005), foram: Tb8112 (alelo 79) e TP544 (alelo 150) (tabela 19). 100 Tabela 19: Relação dos alelos observados nos 10 loci de microssatélites nas populações de T. sordida estudadas. Destacados em vermelho os loci exclusivos. Locus Alelo Ja I BJ Ba Ja II BV Locus Alelo Ja I BJ Ba Ja II BV Ti 23 156 x x x x x Tb 8124 209 x 157 x 210 x x x 158 x x x 212 x x x x 164 x x x x 213 x x 165 x x x 217 x 168 x x x x x 218 x x x x 169 x 220 x x x x 170 x x 221 x 172 x x x 222 x x 173 x 226 x 237 x 248 x x Ti 42 205 x Tp 20 125 x 208 x x 126 x x x x 210 x x x x x 135 x 212 x x x x x 136 x x x 213 x x 140 x x 214 x x x x 143 x x x x 222 x x 144 x x x x x 223 x x x x Tp 59 121 x 224 x 123 x x x Tdms 3 137 x 124 x x x x 142 x x x x 127 x x x x x 143 x x x x x 128 x x x x 129 x Tdms 4 160 x x x x x 130 x x x 131 x Tb 830 119 x x x x x 140 x 120 x x x 149 x 121 x x x x Tp 544 142 x 122 x x 148 x 150 x Tb 8112 78 x x x x x 154 x x x 79 x 156 x x 80 x 157 x 213 x x x x 101 Considerando todas as amostras como pertencentes a um único grupo, a AMOVA revelou uma variação interpopulacional e intrapopulacional de 9,4% e 70%, respectivamente (tabela 20). Tais resultados, de acordo com preconização de WRIGHT (1978), indicaram pequena e grande diferenciação, respectivamente. O mesmo resultado foi observado considerando as populações como pertencentes a dois grupos distintos de acordo com critério de categorização de suscetibilidade/resistência proposto por OPAS (2005). Verificou-se uma variação entre os grupos de 6,44%, entre populações dentro dos grupos de 6,83% e entre indivíduos dentro das populações de 66,78%. Utilizando critério proposto por (ZERBA & PICOLLO, 2002), verificou-se uma redução na variação entre grupos (6,44%) mantendo-se os demais índices semelhantes a análise proposta pela OPAS (2005). Tabela 20: AMOVA para as amostras de T. sordida estudadas através dos 10 loci de microssatélites Região Geográfica Hierarquia Categoria % Variação Índice de Fixação Coração de Jesus (MG) Um Grupo Entre populações 9,40 Fst = 0.09391 Fis = 0.76991 Dentro das Populações 70 Entre indivíduos 21 Dois Grupos Entre grupos 6,44 Fsc = 0.07296 Fis = 0.76991 Coração de Jesus(MG) (Resistentes x Suscetíveis) OPAS (2005) Entre populações dentro dos grupos 6,83 Entre indivíduos dentro dos grupos 66,78 Coração de Jesus (MG) Dois Grupos Entre grupos 2,70 Fsc = 0.07863 Fis = 0.76991 (Resistentes x Suscetíveis ) Zerba & Picollo (2002) Entre populações dentro dos grupos 7,65 Entre indivíduos dentro dos grupos 69,02 Análise de cálculo dos FST pareados entre as populações estudadas revelaram 70% de significância, demonstrando diferenciação genética entre as populações de T. sordida estudadas (tabela 21). 102 Tabela 21: FST pareado entre as amostras de T. sordida estudadas, calculados por meio dos 10 loci de microssatélite Jatai I Bom Jesus Barriguda Jatai II Jatai I - Bom Jesus 0.12273* - Barriguda 0.17204* 0.14751* - Jatai II 0.01905 0.19700* 0.22659* - Boa Vista 0.05705 0.16500* 0.17907* 0.08675 * Valores estatisticamente significantes. p<0,05; 110 permutações Os resultados obtidos permitiram observar três grupos distintos. O primeiro grupo é composto por triatomíneos procedentes das localidades de Jataí I, Jataí II e Boa Vista. O segundo grupo é formado por exemplares de T. sordida capturados na localidade de Barriguda. O terceiro é composto por triatomíneos oriundos da localidade de Bom Jesus. 5.5. Quantificação da atividade de enzimas relacionadas a detoxificação de inseticidas nas populações de T. sordida 5.5.1. Determinação da geração ideal dos triatomíneos para quantificação da atividade de enzimas relacionadas com a detoxificação de inseticidas Os ensaios bioquímicos revelaram a inexistência de um padrão único de resposta relacionado a geração de insetos. Foram observados índices mais elevados de alfa-EST, beta- EST e GST em indivíduos da geração F2, enquanto que de pnpa-EST, ACHE, ACHI e OFM em espécimes da F1 (figura 18). 5.5.2. Determinação da idade ideal dos triatomíneos para quantificação da atividade de enzimas relacionadas com a detoxificação de inseticidas Os ensaios bioquímicos revelaram diferenças significativas entre insetos com idades distintas (figura 19). Para alfa-EST, beta-EST foi observada maior atividade enzimática em espécimes com cinco dias de idade. Para pnpa-EST não foi observada diferença significativa na resposta com insetos diferentes. Para as demais enzimas (ACHE, ACHI, GST e OFM) observou-se uma menor atividade em insetos com três dias de idade e resposta semelhante para os indivíduos de um e cinco dias de vida. 103 5.5.3. Determinação do número amostral ideal dos triatomíneos para quantificação da atividade de enzimas relacionadas com a detoxificação de inseticidas Os ensaios bioquímicos com “n amostral” de 45, 90 e 135 indivíduos revelaram um perfil de resposta mantido para os três grupos (figura 20), exceto OFM, único ensaio cuja mensuração da atividade é feita de forma indireta. 101 Figura 18: Quantificação da atividade das enzimas alfa-EST, beta-EST, pnpa-EST, ACHE , ACHI, GST e OFM em ninfas I de T. sordida das gerações F1 e F2 (1 dia de idade - jejum - peso 1,2±0,2 mg - população LRS). ALFA ESTERASE F1 F2 0 100 200 300 400 500 600 Gerações A t i v i d a d e / m g p t n / m i n BETA ESTERASE F1 F2 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 Gerações A t i v i d a d e / m g p t n / m i n PNPA ESTERASE F1 F2 0 10 20 Gerações A t i v i d a d e / m g p t n / m i n ACHE F1 F2 0 5 10 15 Gerações A t i v i d a d e / m g p t n / m i n GST F1 F2 0 250 500 Gerações A t i v i d a d e / m g p t n / m i n ACHI F1 F2 0 5 10 15 Gerações A t i v i d a d e / m g p t n / m i n % ATIV. RES. 105 Cont. figura 18. Quantificação da atividade das enzimas alfa-EST, beta-EST, pnpa-EST, ACHE , ACHI, GST e OFM em ninfas I de T. sordida das gerações F1 e F2 (1 dia de idade - jejum - peso 1,2±0,2 mg - população LRS). OFM F1 F2 0 10 20 30 40 Gerações A t i v i d a d e / m g p t n / m i n 106 ACHI 1DIA 3DIAS 5DIAS 0 10 20 30 Idade dos indivíduos A t i v i d a d e / m g p t n / m i n ALFA ESTERASE 1DIA 3DIAS 5DIAS 0 25 50 75 100 125 Idade dos indivíduos A t i v i d a d e / m g p t n / m i n ACHE 1DIA 3DIAS 5DIAS 0 5 10 15 20 25 30 35 Idade dos indivíduos A t i v i d a d e / m g p t n / m i n BETA ESTERASE 1DIA 3DIAS 5DIAS 0 250 500 750 Idade dos indivíduos A t i v i d a d e / m g p t n / m i n PNPA ESTERASE 1DIA 3DIAS 5DIAS 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Idade dos indivíduos A t i v i d a d e / m g p t n / m i n GST 1DIA 3DIAS 5DIAS 0 1 2 Idade dos indivíduos A t i v i d a d e / m g p t n / m i n Figura 19. Quantificação da atividade das enzimas alfa-EST, beta-EST, pnpa-EST, ACHE , ACHI, GST e OFM em ninfas I da geração F1 de T. sordida com 1, 3 e 5 dias de idade ( jejum - peso 1,2±0,2 mg - população LRS). ACHI % ATIV. RES. 107 OFM 1DIA 3DIAS 5DIAS 0 10 20 A t i v i d a d e / m g p t n / m i n Cont. figura 19. Quantificação da atividade das enzimas alfa-EST, beta-EST, pnpa-EST, ACHE , ACHI, GST e OFM em ninfas I da geração F1 de T. sordida com 1, 3 e 5 dias de idade ( jejum - peso 1,2±0,2 mg - população LRS). 108 PNPA ESTERASE 45 90 135 0 5 10 15 20 25 n amostral A t i v i d a d e / m g p t n / m i n ALFA ESTERASE 45 90 135 0 50 100 n amostral A t i v i d a d e / m g p t n / m i n BETA ESTERASE 45 90 135 300 400 500 600 700 n amostral A t i v i d a d e / m g p t n / m i n ACHE 45 90 135 0 5 10 15 n amostral A t i v i d a d e / m g p t n / m i n GST 45 90 135 0 1 2 3 n amostral A t i v i d a d e / m g p t n / m i n Figura 20: Quantificação da atividade das enzimas alfa-EST, beta-EST, pnpa-EST, ACHE, ACHI, GST e OFM em ninfas I da geração F1 de T. sordida com amostragem de 45, 90 e 135 espécimes (1 dia de idade - jejum - peso 1,2±0,2 mg - população LRS) ACHI 45 90 135 0 10 20 n amostral A t i v i d a d e / m g p t n / m i n % ATIV. RES. 109 OFM 45 90 135 0 10 20 n amostral A t i v i d a d e / m g p t n / m i n Cont. figura 20: Quantificação da atividade das enzimas alfa-EST, beta-EST, pnpa-EST, ACHE, ACHI, GST e OFM em ninfas I da geração F1 de T. sordida com amostragem de 45, 90 e 135 espécimes (1 dia de idade - jejum - peso 1,2±0,2 mg - população LRS) 101 5.5.4 Perfil da quantificação da atividade de enzimas relacionadas com a detoxificação de inseticidas nas populações de T. sordida estudadas. A quantificação da atividade enzimática relacionada com resistência a inseticida, para as populações da localidade de Barriguda e regiões limítrofes está apresentado na figura 21. Analisando os resultados de MFO, observa-se que a LRS obteve o perfil mais homogêneo do gráfico, o que está condizente como esperado. A maioria das populações apresentou grande heterogeneidade em suas distribuições, no entanto apenas as populações de Barriguda e Jataí I foram significativamente diferentes (p< 0,0001). Foram observadas algumas diferenças significativas em relação ao perfil enzimático da LRS para as enzimas alfa, beta e pnpa-EST, além de Ace, principalmente nas populações de Jataí II, Boa Vista e Bom Jesus. O ensaio que mede a inibição da atividade de ACE (AChi) foi pensado de modo a evidenciar alterações da enzima que dificultassem seu acoplamento com o inseticida inibidor, com isso um pequeno percentual de atividade remanescente significa uma grande inibição de atividade. Por isso as diferenças significativas observadas para Barriguda e Jataí I em relação a LRS, não denotam significância biológica. Além disso, aplicando-se o critério de classificação da OMS, que aponta os indivíduos como mais de 30% de atividade remanescente como tendo Ace alterada, observa-se que nenhuma das populações usadas apresenta alteração de Ace. No gráfico de GST observa-se que a LRS apresentou perfil de atividade maior mais heterogêneo que as populações de campo avaliadas. Justifica-se a falta de homogeneidade da enzima GST devido a problemas operacionais durante a realização dos ensaios e que não foi encontrado. Uma vez que o perfil de LRS é o resultado da análise de 152 espécimes individuais, cujos resultados foram validados, acredita-se que o perfil visualizado seja representativo da população, o que levanta questionamento sobre a validade da LRS utilizada. Por outro lado, quando se compara os perfis das populações ensaiadas com a distribuição de Jataí I, perfil menor e mais homogêneo do gráfico, contata-se que com exceção de Jataí II, todas as demais populações apresentaram diferenças significativas (p< 0,0001). 111 Alfa-Esterase LR S Ba rr igu da Ja taí 1 Ja taí 2 Bo a Vis ta Bo m Je su s 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 n m o l / m g p t n / m i n Beta-Esterase LR S Ba rr igu da Ja taí 1 Ja taí 2 Bo a Vis ta Bo m Je su s 0 25 50 75 100 125 n m o l / m g p t n / m i n Pnpa-Esterase LR S Ba rr igu da Ja taí 1 Ja taí 2 Bo a Vis ta Bo m Je su s 0 10 20 30 D A b s / m g p t n / m i n AChE LR S Ba rri gu da Ja taí 1 Ja taí 2 Bo a Vis ta Bo m Je su s 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 A B S / m g P T N / h o r a AChI LR S Ba rr igu da Ja taí 1 Ja taí 2 Bo a Vis ta Bo m Je su s 0 5 10 15 20 25 % a t i v i d a d e r e m a n e s c e n t e GST LR S Ba rri gu da Ja taí 1 Ja taí 2 Bo a Vis ta Bo m Je su s 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 m m o l / m i n / m g p t n Figura 21. Quantificação da atividade das enzimas alfa-EST, beta-EST, pnpa-EST, ACHE , ACHI, GST e OFM em ninfas I da geração F1 de T. sordida com 5 dias de idade ( jejum - peso 1,2±0,2 mg). Nota: Teste Kruskal wallis e Post test Dunn`s - Legenda: * = p<0,01; ** = p<0,001; *** = p<0,0001 ** *** *** *** *** * *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** ** *** *** ** *** 112 MFO LR S Ba rri gu da Ja taí 1 Ja taí 2 Bo a Vis ta Bo m Je su s 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 n m o l e s c i t / m g p t n Cont. figura 21. Quantificação da atividade das enzimas alfa-EST, beta-EST, pnpa-EST, ACHE , ACHI, GST e OFM em ninfas I da geração F1 de T. sordida com 5 dias de idade ( jejum - peso 1,2±0,2 mg). Nota: Teste Kruskal wallis e Post test Dunn`s - Legenda: * = p<0,01; ** = p<0,001; *** = p<0,0001 *** *** 113 Utilizando o método da análise do percentil 99 não foi observada alteração em nenhuma das enzimas avaliadas para a população de Barriguda. Todas as demais populações apresentaram alteração moderada para a enzima ACHE. O mesmo padrão foi observado para OFM, diferindo-se apenas em Jataí I que apresentou grande alteração. Análises das atividades de α-EST revelaram alteração pequena em Boa Vista, moderada em Jataí I e II e grande em Bom Jesus. Apenas a população de Bom Jesus apresentou alteração moderada para β-EST. Não foram observadas alterações para pnpa-EST e GST (figura 22). ano População AChE AChI MFO αNA-Est βNA-Est ρnpa-Est GST 2011 Barriguda 5 0 1 4 1 0 0 Jataí 1 24 0 66 35 11 1 0 Jataí 2 32 3 27 43 1 1 0 Boa Vista 25 5 17 8 8 7 1 Bom Jesus 31 2 25 56 26 2 0 Figura 22. Análise da frequência de indivíduos das populações com atividade enzimática além do percentil 99 da linhagem de referência. As cores representam o percentual de indivíduos da população com atividade enzimática acima do percentil 99 da LRS: verde – até 15%, amarelo – entre 15 e 50% e, vermelho – acima de 50%. Estes valores correspondem a alteração enzimática na população classificada, respectivamente, como ausente, baixa e alta. Como os gráficos indicavam uma alteração visível em beta-EST e pnpa-EST em várias populações, esta não detectada pelo percentil 99, foram realizados teste de Kruskal Wallis, seguido de Duns`s post test para comparar a distribuição total entre as populações. Foi verificado que as populações de Boa Vista e Bom Jesus e Jataí II apresentaram alteração para pnpa-EST enquanto, que todas para beta-EST, inclusive Barriguda. Análises de correlação (Sperman) entre as razões de resistência obtidas nos bioensaios e o perfil enzimático de cada população não revelaram correlação significativa . 114 Discussão 115 Os relatos cada vez mais frequentes de populações triatomínicas com razões de resistência elevadas tem causado grande impacto, desafiando cientistas e sanitaristas na busca de novas alternativas para o controle vetorial. Neste contexto, a resistência a inseticidas tem assumido prioridade no cenário da doença de Chagas demandando uma melhor caracterização e delimitação. Os bioensaios quantitativos realizados com as 99 populações de T. sordida avaliadas neste projeto revelaram que as RR50 variaram de 0,44 a 6,5. De acordo com critério de categorização do status da suscetibilidade/resistência proposto pela OPAS (2005), apenas 1% das populações foi classificada como resistente a deltametrina (TsCJB; RR 6,50), enquanto que de acordo com critério de ZERBA & PICOLLO (2002), este valor aumentou para 55,5%. Utilizando ambos os critérios, 10 populações (10,1%) foram mais suscetíveis que a própria LRS ao inseticida avaliado revelando que esta linhagem utilizada se mostra inadequada a sua função: ser referência de suscetibilidade. Isto pode ser comprovado recalculando-se as razões de resistência 50% para as mesmas amostras estudadas, considerando-se como LRS a população TsMABO por ser esta a mais sensível e apresentar slope semelhante a TsREF. Neste caso as RR50 variaram de 2,86 a 18,3. A mesma observação pode ser verificada em estudo desenvolvido por OBARA (2010) quando as RR50 das populações estudadas de T.sordida que eram de 1,05 a 2,71 se alteraram para 26,3 a 68,7 em função da troca da linhagem referência de suscetibilidade. Uma das grandes dificuldades em se desenvolver estudos de resistência de triatomíneos a inseticidas tem sido determinar uma linhagem suscetível que possa ser utilizada como referência. De acordo com preconização da OPAS (2005) entende-se por linhagem referência de suscetibilidade aquela há mais de cinco gerações em laboratório, sem contato com inseticida e sem aporte de material externo ou aquela coletada em local onde nunca houve tratamento com inseticida. Neste estudo foi escolhida uma linhagem proveniente de Uberaba, atendendo aos requisitos solicitados. Contudo nos ensaios quantitativos de laboratório 10 populações de campo se mostraram mais suscetíveis a deltametrina que a própria LRS, motivo pelo qual se mostrou inadequada para este fim. Para a estruturação da Rede de Monitoramento da Resistência de Aedes aegypti – MoReNAa foi vivenciada a mesma dificuldade. Inicialmente, utilizando critérios similares aos estabelecidos pela OPAS (2005) foi escolhida uma LRS que se mostrou ao longo do tempo menos suscetível que as populações de campo estudadas. Deste modo, posteriormente esta linhagem foi trocada pela cepa Rockfeller, colônia esta que vem sendo utilizada há vários anos(comunicação pessoal – Dra. Denise Valle). Outra problemática diz respeito à manutenção desta LRS em laboratório ad infinitum para que a mesma possa ser utilizada como referência em todos os estudos desenvolvidos com a 116 espécie de interesse, considerando as dificuldades em se manter colônias viáveis por longos períodos de tempo em insetário sem aporte de material externo. Novamente, referindo-se a rede MoReNAa, a dificuldade supracitada não foi vivenciada, considerando as características biológicas do modelo estudado, sendo a mesma utilizada como referência de controle interno em todos os laboratórios que integram a rede ao nível nacional (comunicação pessoal – Dra. Denise Valle). Referindo-se aos ensaios qualitativos com triatomíneos, a WHO (1994) e OPAS (2005) preconizam o uso de uma dose diagnóstico (DD) referente a 1xDL99 da linhagem referência de suscetibilidade. A sobrevivência, em resposta a essa DD, de no mínimo um inseto em dois dos três ensaios com 10 ninfas I deve ser interpretado como indicativo de resistência justificando a necessidade do estabelecimento das concentrações letais para esta população, e conseqüente, razões de resistência. No caso dos ensaios com mosquitos, a dose diagnóstica utilizada é de 2xDL99 da linhagem referência de suscetibilidade. Mortalidade superior a 98% e inferior a 80% indicam suscetibilidade e resistência estabelecida, respectivamente. Mortalidade entre 80 e 98% sugere resistência incipiente, apontando para a necessidade de vigilância entomológica e monitoramento da resistência desta população (WHO, 1981). HEMINGWAY et al. (2004) acreditam que a eleição de uma dose diagnóstica de 2xDL99 da população referência de suscetibilidade elimina mais de 50% dos indivíduos resistentes, comprometendo, deste modo a eficiência dos bioensaios. Nestes casos o melhor método de monitoramento para detectar resistência é o uso de uma dose que mate 99% dos suscetíveis, que é um compromisso entre a baixa sobrevivência dos suscetíveis e a baixa mortalidade dos resistentes. O aumento da dose discriminante para duas ou três vezes a DL99 representa risco de alta mortalidade dos resistentes, como verificado em estudos feitos por DENNEHY et al. (1983). Com relação aos ensaios biológicos qualitativos realizados neste trabalho, o percentual de mortalidade de ninfas I de T. sordida em resposta dose diagnóstica 1xDL99 variou de 43,3% a 100%. De acordo com categorização proposta por WHO (1994), 61,2% das populações foram classificadas como resistentes a deltametrina, sendo as demais, suscetíveis. Utilizando-se contudo, 2xDL99 da LR, não se verificou sobrevivência alguma, sendo todas as populações estudadas classificadas como suscetíveis ao inseticida testado. A dose diagnóstica permite discriminar o vigor da linhagem referência de suscetibilidade (laboratorial) e o da população de campo. A dificuldade está em se definir qual o limiar de risco acima do qual há comprometimento do controle em campo. Observando as razões de resistência obtidas neste trabalho e considerando que, segundo OPAS (2005), somente RR>5 indica 117 resistência, uma possibilidade operacional seria usar 1xDL99 como DD e considerar percentuais de sobrevivência diferentes dos preconizados pela WHO(1994) como indicativo de resistência, contudo essa informação só poderá ser obtida a partir da realização de ensaios de campo. Uma possível causa das RRs verificadas neste trabalho pode ser atribuída ao uso contínuo de piretróides no Brasil desde a década de 80, como descrito por VASSENA et al. (2000) em estudos realizados com populações de T. infestans procedentes do Rio Grande do Sul. Na ocasião, foram observadas RR 7,0 a deltametrina, 3,6 a β-ciflutrina e a 3,3 a cipermetrina. A possibilidade de resistência cruzada com outros inseticidas com mesmo sítio de ação não deve ser descartada, como verificado em estudos com Blatella germanica que apresentou resistência cruzada entre piretróides e DDT por meio do mecanismo de resistência do tipo Knockdown resistance - kdr (SIEGFRIED & SCOTT, 1992). Neste contexto, pode-se considerar ainda os inseticidas utilizados com fins agrícolas e domésticos. Possíveis falhas operacionais também devem ser avaliadas. Com relação a heterogeneidade das populações verifica-se que das 99 estudadas, 46 (46,5%) apresentaram slope inferior a LRS refletindo maior diversidade genética referente a característica avaliada quando comparado a mesma. Interessante destacar grande variação inclusive ao nível de município. A escolha das localidades amostradas neste trabalho permitiu uma comparação dos resultados obtidos neste estudo com os de PESSOA (2008) referentes à localidade de Barriguda (município de Coração de Jesus). Em coleta realizada em 2007, PESSOA (2008) encontrou, utilizando as mesmas condições experimentais, RR50 de 6,5 para Barriguda (Coração de Jesus). Em outra amostragem realizadas em 2009, foi observada manutenção deste valor. Com intuito de compreender tal fenômeno, coletas das populações triatomínicas das áreas de entorno foram realizadas em 2010 para definição do perfil de suscetibilidade a deltametrina, sendo elas: Boa Vista 1 (TsCJBV1), Bom Jesus (TsCJBJ), Jataí 2 (TsCJJ2) e Jataí 1 (TsCJJ1). As RR50 encontradas foram de 2,82; 2,22; 1,85; 1,22, respectivamente. De acordo com preconização da OPAS (2005), todas as populações são suscetíveis ao inseticida testado, enquanto que de acordo com ZERBA & PICOLLO (2002) duas são suscetíveis (TsCJJ2 e TsCJJ1) e outras duas resistentes (TsCJBJ e TsCJBV1). Para as áreas limítrofes com Barriguda a taxa de mortalidade a DD variou de 43,3 a 100%. Referindo-se ao slope, todas as populações apresentaram coeficiente inferior ao da LRS, refletindo maior variabilidade genética que a última, e consequentemente necessidade de monitoramento do perfil de suscetibilidade na linha do tempo. A comparação dos resultados dos ensaios biológicos qualitativos e quantitativos obtidos neste trabalho permitiu verificar falta de correspondência entre eles no que diz respeito a 118 discernir diferentes perfis de suscetibilidade. Os critérios utilizados para categorização das populações triatomínicas em resistentes ou suscetíveis é bastante arbitrário e empírico sem fundamentação teórico-prática, revelando a necessidade da realização de ensaios de laboratório e de campo de forma simultânea e complementar, de modo a permitir estabelecer uma correlação entre ambos para fornecer um melhor entendimento da real relação existente entre eles e consequentemente de se compreender o que é resistente e o que é suscetível. A partir daí, será possível estabelecer pontos de corte funcionais e operacionais referentes ao percentual de mortalidade frente a dose diagnóstica e a categorização das RR junto ao status de suscetibilidade. Consequentemente, em uma instância operacional, estes estudos permitirão a adoção de medidas de intervenção em momento oportuno de forma a não comprometer o sucesso do controle vetorial obtido no país até o momento. Trata-se de uma realidade já verificada por nosso grupo de pesquisa em outros estudos. Outro ponto importante a ser ressaltado se refere a escolha das razões de resistência a serem utilizadas como critério para classificação de suscetibilidade/resistência a inseticidas. Em nenhuma das duas preconizações faz-se menção quanto a utilização da RR50 ou da RR95. Ressalta-se que na grande maioria dos artigos não é informado qual o critério utilizado o que de certa forma dificulta, ou até mesmo, inviabiliza a interpretação dos resultados e comparação dos mesmos. No caso da RR95 ser o critério adotado para categorização do status de suscetibilidade/resistência, o número de populações resistentes segundo a preconização de ZERBA& PICOLLO (2002) e OPAS (2005) sobe de 55% e 1% para 83,5% e 11,7%, respectivamente, fato este muito preocupante. Contudo, o que se verifica na prática é que apenas uma das RR não é elemento suficiente para definir critérios e avaliar condutas a serem tomadas. Deste modo recomenda-se a adoção da interpretação de ambas as razões atrelada as informações fornecidas pelo slope. Referindo-se as inferências sobre a grande variabilidade em relação à característica estudada da maior parte das populações, com base no slope, estes resultados corroboram com estudos moleculares que demonstram que em áreas com tratamento químico a diversidade genética é menor que em áreas não tratadas (ROJAS DE ARIAS et al., 2003; 2004; PEREZ DE ROSAS et al., 2007; 2008; CERCERE et al., 2007; MARCET et al., 2009). Na tentativa de se compreender o real significado dos resultados obtidos em laboratório para a localidade de Barriguda e seu entorno foi realizado um levantamento das características ambientais da região de interesse, do histórico de infestação triatomínico da região bem como o número de cargas de inseticidas aplicadas no local, da qualidade da borrifação desenvolvida pelos agentes de saúde, de possíveis usos de inseticida com fins agrícolas e domésticos, da estrutura física das UD`s e do perfil bioquímico e molecular das populações de interesse. 119 Informações referentes a precipitação, temperatura, umidade e insolação da área de interesse foram avaliadas entre os períodos de 1970 a 2010, com vistas a realização de possíveis inferências sobre um padrão de degradação do inseticida uma vez que todas estas condições influenciam neste fenômeno. Justifica-se tão longo período de observação pelo fato da região de interesse – o Norte de Minas - ter sofrido intensas modificações ambientais ao longo das últimas décadas com potencial de alteração das condições macro e microambientais. Observou-se variação significativa nos parâmetros de temperatura, pluviosidade e insolação (p< 0,05). Todas essas variações climatológicas, podem ser responsáveis pela degradação do inseticida de forma irregular na linha do tempo, em períodos diferentes dos preconizados pelos fabricantes destes ativos químicos e dos gestores de saúde envolvidos no delineamento e programação das atividades de borrifação, expondo triatomíneos a subdoses e selecionando, por conseguinte, insetos menos suscetíveis. A toxicidade do DDT e piretróides é significativamente afetada pela temperatura (VINSON & KEARNS, 1952). ALZOGARAY & ZERBA (1993) demonstraram que os piretróides são menos ativos em altas temperaturas. Outra observação relevante a ser considerada é que estes inseticidas utilizados nas campanhas para o controle dos triatomíneos apresentam em geral, pouco efeito residual, uma vez que as doses recomendadas produzem alto impacto inicial nas populações, mas as doses letais não se mantem nas superfícies tratadas mais do que alguns meses exatamente por conta dessas condições climáticas (OLIVEIRA FILHO, 1983; PINCHIN et al., 1984; OLIVEIRA FILHO & MELO, 1987). Este fato é esperado, pois as formulações convencionais mais usadas são os pós molháveis e as suspensões concentradas, que representam somente um veículo para os princípios ativos e não fornecem proteção contra o ar, radiação ultravioleta e umidade, bem como fatores físicos, tais como chuva, vento e outro agentes, inclusive seres humanos e animais domésticos, os quais promovem a erosão das superfícies tratadas removendo o inseticida aí depositado. No caso dos piretróides, a perda química pode ser esperada em superfícies altamente alcalinas ou expostas a radiação ultravioleta. Como conseqüência aplicações repetidas dos inseticidas fazem-se necessárias, em especial quando os triatomíneos presentes podem viver também nas áreas silvestres ao redor das habitações humanas, de onde invadem constantemente o peridomicílio, e daí as casas. Todas estas variáveis ambientais são importantes e influenciam diretamente na velocidade de degradação do inseticida e na consequente necessidade de reaplicações de modo a manter as UD`s livres de infestações triatomínicas. Contudo, verifica-se nas atividades de rotina a impossibilidade de se avaliar tais variáveis ponto a ponto, redefinindo frequências específicas de tratamento para cada macroregião do Estado. Deste modo, o aporte de indivíduos externos, bem como um resíduo triatomínico sobrevivente das aplicações e da eclosão dos ovos, 120 recolonizam as casas sendo responsáveis pela considerável diversidade genética observada. Esta imigração implica também em uma possível diluição das razões de resistência observadas, que neste caso podem estar sendo subestimada. Com o objetivo de avaliar o padrão de infestação das localidades de interesse e da quantidade de cargas de inseticida utilizada, de modo a correlacionar com a pressão de ativo químico aplicada na região, foram extraídos dados do Cárdex referentes ao período de 1978 a 1994. O percentual de unidades domiciliares infestadas com triatomíneos foi semelhante em todas as localidades, apresentando-se mais elevado em Barriguda a partir de 1985. O percentual de UD`s trabalhadas permaneceu próximo a 100% em toda região amostrada . Os índices de captura de triatomíneos foram mais elevados em Barriguda, Jataí II e Jataí I, locais estes nos quais a quantidade de inseticida borrifada também foi maior (p < 0,05), sendo T. sordida (94,5%) a espécie predominantemente capturada. Os inseticidas foram BHC, K-Otrhrine e alfacipermetrina. Para o período de 2004 a 2010 verificou-se uma maior uso de inseticida também em Barriguda, com utilização exclusiva de alfacipermetrina. Ressalta-se que o Cárdex apresentou duas falhas: 1) referente a informação do número bruto de triatomíneos coletados, sendo informado na ficha apenas a espécie encontrada, o que impossibilitou maiores afirmações e 2) apenas o nome do ativo químico foi informado não detalhando a quantidade utilizada. Excluídas as possíveis falhas supracitadas, pode-se pensar na possibilidade de uma maior captura nas localidades mais borrifadas, talvez devido ao efeito desalojante do ativo químico, e/ou da maior experiência do agente de campo que executou a busca ativa. De forma geral, a localidade de Barriguda sofreu maior pressão com inseticida para o controle de triatomíneos que as localidades vizinhas. Referindo-se as taxas de infestação, a região do Norte de Minas é uma área caracterizada como de alto risco de transmissão da DC pela SVS/MS (2005) considerando a grande abundância de triatomíneos presentes, destacando-se a espécie T. sordida nas áreas de cerrado e caatinga (GURGEL-GONÇALVES, 2011). Observando-se a linha temporal na qual é apresentado o número de insetos, pode-se inferir que a fase de ataque em 1980 surtiu efeitos limitados referente a T. sordida o que pode ser verificado na pequena redução do número destes insetos após a introdução do controle químico. Por se tratar de uma espécie autóctone, os resultados apresentados, ainda que fragmentados revelam a necessidade de se implementar uma vigilância entomológica ativa atrelada as atividades de borrifação quando necessárias. PRATA (1981) e VILLELA (2007) atribuíram a irregularidade com que as campanhas tem sido conduzidas, por motivos de ordem administrativa, e orçamentária principalmente, a 121 persistência das endemias. Esta falta de rigor metodológico – seja na falta da borrifação ou, atividade feita de forma errônea - expõe insetos a subdoses selecionando os menos suscetíveis. Com o objetivo de se identificar possíveis falhas operacionais no trabalho dos agentes de saúde que possam interferir na qualidade da borrifação, e consequentemente na pressão do ativo químico sobre as populações triatomínicas, um questionário de confecção própria foi aplicado aos agentes de saúde para sondar a qualidade das atividades desenvolvidas. O município de Coração de Jesus conta atualmente com três agentes de saúde, com tempo de experiência profissional variando de quatro meses a um ano. Apesar de nenhum dos funcionários ter sido treinado para executar atividades de controle dos triatomíneos utilizando inseticidas, os dois com mais tempo de serviço (seis meses e um ano) o fazem de acordo com preconização do PCDCh. Referindo-se a borrifação, foi relatado que em nenhuma campanha de controle eles aplicaram doses do inseticida menores do que as recomendadas ou fizeram uso de ativos químicos vencidos. Em nenhum programa de borrifação foi vivenciada situação que por falta de inseticida, funcionários ou veículos houvesse a necessidade de se excluir algumas UD`s das atividades. Os agentes relataram nunca terem trabalhado em alguma localidade que mesmo executando as atividades de borrifação de forma adequada os triatomíneos não morriam ou em que as colônias cresciam mais rápido do que o esperado. Até o momento nenhum deles se intoxicou com inseticida. Pelo exposto, concluiu-se que a qualidade dos trabalhos prestados pelos agentes de saúde pode estar comprometida considerando a complexidade das atividades de borrifação, a consequente necessidade de treinamento e a ausência do mesmo. No contexto operacional, pode-se atribuir a este fato a possibilidade de ocorrência de falhas de controle. As falhas de controle segundo OPAS (2005), podem ser ocasionadas pela ausência de eficácia do inseticida, por falhas operacionais e/ou por condicionantes ambientais. A ausência de eficácia do inseticida está relacionada a má qualidade do ingrediente ativo e/ou formulação inadequada. As falhas operacionais abrangem erros de diluição do inseticida, falhas nas aplicações bem como, problemas com as máquinas de borrifação. Esta falta de capacitação dos agentes e a grande rotatividade dos profissionais devido a falta de incentivos, inexistência de planos de carreira, baixos salários associados as dificuldades diárias para a execução das atividades desestimulam os agentes a permanecerem no cargo, o que pode de fato comprometer todas as atividades desenvolvidas. O processo de descentralização do PCDCh tem sido responsável por uma perda gradativa de reconhecimento da importância da doença e manutenção dos índices entomológicos obtidos após 50 anos de trabalho, priorizando outras endemias (VILLELA et al., 2005). Fato esse revelado pela existência de agentes executando atividades de borrifação sem treinamento prévio, como observado neste trabalho. 122 De acordo com Portaria de nº. 1.399, do Ministério da Saúde de 15 de dezembro de 1999 e posteriormente, da Portaria de nº. 1.172 do Ministério da Saúde de 15 de Julho de 2004, cabe a GRS não só a preparação dos agentes de saúde contratados pelo município a partir da realização de cursos de capacitação, como também da supervisão e avaliação das ações de controle da endemia. Uma das dificuldades deste sistema é que embora a descentralização se justifique em pressupostos teóricos, não existe tradição deste controle em níveis municipais, o que dificulta a transferência de encargos e o cumprimento continuado do programa. Tendo em vista as informações obtidas nos questionários esta parece não ser a realidade vivenciada pelo município de Coração de Jesus, o que pode estar comprometendo a continuidade das ações em tal região resultando na fragmentação e pouca produtividade de trabalho. Os resultados das campanhas de borrifação para o controle da doença Chagas em regiões de ocorrência de T. sordida no Brasil apontam para indiscutível persistência deste triatomíneo no ambiente peridomiciliar apesar das borrifações sucessivas de inseticidas na linha do tempo. Esta “resistência” deve ser relacionada a aspectos comportamentais deste triatomíneo, como sua prevalência em montes de lenha, galinheiros, paióis, etc., cujas superfícies, permitindo a permanência de exemplares livres do contato com os mesmos e capazes de se multiplicar nestes ecótopos, ou mesmo, permitindo a sua reinfestação por exemplares de procedência silvestre (DIOTAIUTI & PINTO, 1991). Deste modo, associado ao controle químico reforça-se a necessidade do controle físico, voltado a organização deste peridomicílio. Com o objetivo de se caracterizar as UD`s das localidades de interesse na tentativa de identificar possíveis fatores isolados ou combinados que pudessem estar associados aos diferentes perfis de suscetibilidade a deltametrina observados, questionários foram aplicados em 100% das residências. A caracterização dos materiais utilizados na construção das UD`s, entendendo-se neste caso intra e peridomicílio – esteve voltada a investigação de possíveis diferenças que pudessem influenciar na penetração do inseticida nestas superfícies bem como na velocidade de degradação do mesmo, tais como porosidade, alcalinidade, etc. A caracterização dos anexos peridomiciliares teve como objetivo avaliar a complexidade do peridomicílio e estado de conservação e distância deste ao intradomicílio e as matas de entorno, com vistas a inferir sobre a abundância de possíveis esconderijos para os triatomíneos e fluxo entre os ambientes peridomésticos e silvestre. A maior parte das residências apresentaram idade média de construção de 1-10 anos (43,2%) ou >21 anos (45,4%), com paredes em sua predominância constituídas de adobe sem tijolo (40,9%) e tijolo com reboco (38,6%). Os telhados são em 98,9% de telhas de barro e o piso, em sua maioria, revestido de ladrilho (45%) e cerâmica (36,4%). Em todas as localidades verificou-se a criação de animais domésticos, contudo apenas naquelas com maior RR50 (Barriguda , Bom Jesus e Jataí I) foram detectados moradores que relataram uso de inseticidas 123 piretróides e carbamatos com fins ao controle de pragas em seus animais e até mesmo em suas residências. Em ambos os casos foi relatado não existir peridiciocidade para tal utilização. A agricultura de subsistência é comum em todas as localidades não tendo sido relatados o uso inseticidas com fins agrícolas. De forma geral, o peridomicílio se mostrou bastante complexo com grande diversidade de ecótopos, constituídos por diferentes materiais sendo em sua maioria madeira. Na prática estes ambientes representam uma infinidade de refúgios para os triatomíneos frente a presença do ativo químico. De acordo com a natureza das estruturas (porosidade e alcalinidade), percebe-se diferentes mecanismos de penetração e absorção do inseticida. Deste modo, em superfícies porosas o ativo químico se deposita e parece perder a atividade mais rapidamente que em outras superfícies tais como placas de madeira e cerâmicas. Atrelado a isso, ressalta-se que a pressão de inseticida pode ser diferente entre as localidades variando inclusive entre os ambientes domésticos e peridomésticos (ROJAS DE ARIAS et al., 2003; 2004; GURTLER et al, 2004). Referindo-se a Barriguda, foi observado o maior número de UD`s com amontoados de lenhas, com a maior proporção de galinheiros e paióis sendo estes mais distantes do intradomicílio que as demais localidades e consequentemente mais próximas das matas no entorno, permitindo um fluxo de insetos entre esses dois ambientes. Este fato pode ser agravado pelo uso das matas limítrofes por alguns moradores de Barriguda com vistas a retirada de lenha e madeira, permitindo o fluxo de insetos entre esses ecótopos. As cercas de madeira são as mais antigas. Neste contexto, ressalta-se que peridomicílios mais antigos puderam refletir um pior estado de conservação e consequentemente maiores e melhores esconderijos para os triatomíneos de modo a possibililitar o contato com em suas sub-doses. Nossas observações são concordantes com resultados observados por DIOTAIUTI et al (1998), DIOTAIUTI & DIAS (1988) e DIOTAIUTI & PINTO (1991). A sobrevivência de triatomíneos a borrifação confirma a limitação desta técnica na eliminação completa dos insetos peridomiciliares. As características do peridomicilio estudadas nesta tese desmonstram a grande variedade de ecótopos existentes, correspondendo a um número infinito de esconderijos, nas quais foram observadas a criação de inúmero animais, tais como: galinhas, porcos, cães, gatos, etc. A borrifação desse peridomicílio é um trabalho exaustivo para o qual o desempilhamento de todo o material aí acumulado é operacionalmente impossível de ser realizado pelo agente de campo responsável. Em conseqüência, um resíduo de barbeiros permanece após a aplicação do inseticida no fundo de montes de lenha que as vezes atingem muitos metros cúbicos, nos telhados de paióis e em vários outros esconderijos quase inacessíveis livres de contato com o ativo químico e/ou em contato com subdoses favorecendo a sua multiplicação nestes ecótopos. Neste contexto, a falta de cobertura ou descontinuidade de 124 ciclos de borrifação também deve ser considerado. Além disso, o aporte de material externo vindo do ambiente silvestre pode participar desta reconstrução populacional sendo que tal fluxo pode ocorrer em ambas as direções: do ambiente silveste para o peridomicilio e vice-versa. A grande disponibilidade de alimento existente, representada principalmente por galinhas, transforma o peridomicílio num lugar de excelência para a manifestação de toda a valência ecológica do T. sordida, no que resulta ser essa a espécie de triatomíneo mais capturada no Brasil. As experiências de campo, tem revelado que a recolonização das casas tratadas, pode perfeitamente fazer-se às custas das novas gerações, advindas de ovos de geração anterior, não afetadas pelo inseticida (DIOTAIUTI et. al, 1998). Referindo-se a utilização de inseticidas para os diversos fins, verificou-se o uso de PI e CB para o controle de pragas em animais domésticos e para a proteção do intradomicílio contra insetos diversos. Ressalta-se neste contexto que a utilização de diversos tipos de inseticidas com finalidades distintas, ocasionando uma pressão de seleção sobre a população triatomínica fora a programada pelo PCDCh, pode contribuir para a seleção de indivíduos menos suscetíveis. De acordo com a SES/MG, não existe sobreposição de programas de controle de endemias na área de interesse. PORCASI et. al., (2006) atribuíram a persistência de T. infestans na região do Gran Chaco (Argentina) a interrupções nos programas de controle locais, mas frisando também a boa adaptação destes triatomíneos as características ambientais da região. GURTLER et. al., (2004) atribuíram a dificuldade de eliminação de T. infestans em áreas do semi-árido do Chaco tratadas, às altas densidades de infestação, numerosas estruturas peridomésticas constituídas de material que pode ser refúgio para os triatomíneos, altas temperaturas, exposição ao sol e chuva, dosagens inapropriadas de inseticidas, frequência e tempo de aplicação. Contexto ambiental este muito semelhante ao observado neste trabalho. Todo este cenário de sobrevivência de triatomíneos menos suscetíveis, atrelado a dinamicidade do fluxo de insetos nos ambientes silvestres, peridomésticos e domésticos reforçado pela alta capacidade de dispersão de T. sordida podem subestimar os resultados obtidos neste estudo. Uma limitação deste trabalho foi que a avaliação da suscetibilidade/resistência foi realizada ao nível de localidade e não de UD, considerando o grande número de ninfas I necessário a ser utilizado nos ensaios biológicos partindo de uma geração parental bastante reduzida. Deste modo, não foi possível investigar as características das casas, ponto a ponto, discernindo diferenças físicas e estruturais nos quais insetos suscetíveis e resistentes foram amostrados. A utilização de imagens de satélite junto a esta análise pode ser uma ferramenta útil no conhecimento das modificações ambientais das décadas anteriores até o momento atual – 125 período este de grandes alterações ambientais em virtude do cultivo de algodão. Neste contexto, podem ser investigados aspectos refrentes ao uso e ocupação do solo, índice de cobertura vegetal, proximidade e intercomunicação do ambiente silvestre com o doméstico, bem como isolamento geográfico de algumas populações. Com o objetivo de verificar alterações bioquímicas que possam estar correlacionadas aos diferentes perfis de suscetibilidade a deltametrina observados, foram desenvolvidos ensaios bioquímicos voltados a quantificação de enzimas detoxificativas. Para a realização destes ensaios por se tratar de uma metodologia ainda não padronizada para barbeiros, considerou-se pertinente redefinir alguns detalhes técnicos. Foi observado não existir um padrão de resposta para insetos de geração e idades diferenciadas contudo, para o “n amostral” os resultados revelaram a manutenção de um perfil de resposta, exceto da quantificação de OFM na qual se observou uma grande diversidade. O ensaio para esta enzima específica, aos moldes do realizado neste trabalho, é bastante criticado considerando a mensuração indireta da atividade enzimática. Considerando-se esta ressalva apenas para OFM, a partir demais ensaios recomenda-se a execução deste estudos com “n” de 45 indivíduos. Dentre as problemáticas que precisam ser repensadas, destacam-se: 1) o processo de maceração dos triatomíneos aos moldes do realizado neste trabalho, considerando a dificuldade de trituração completa do inseto e o aquecimento da amostra em virtude do tempo de manipulação junto ao pistilo e consequente, degradação enzimática; 2) a avaliação dos tempos de incubação das enzimas e consequente performance das leituras e 3) o uso de insetos da LRS como controle interno junto aos ensaios considerando a dificuldade de manutenção das colônias ad infinitum. Outro ponto relevante a ser ressaltado é sobre a necessidade de também se verificar se há resistência a outras classes de inseticidas, principalmente aquelas que se sabe que foram utilizadas, como os CB. Os mecanismos de resistência são revelados de maneira geral, cabendo aos responsáveis pelos ensaios interpretá-los e associá-los com as classes de inseticidas, sendo mais fácil caso não se encontre resistência múltipla. A análise do percentil 99 referente a quantificação da atividade enzimática relacionada com detoxificação de inseticida das populações de T. sordida revelou que todas elas apresentaram alteração moderada na expressão da enzima ACHE, exceto Barriguda. As mesmas quatro revelaram alteração moderada para OFM, sendo que em Jataí I foi observada grande alteração. Nas análises das atividades de α-EST observou-se pequena alteração em Boa Vista, moderada em Jataí I e II e grande em Bom Jesus. Apenas a população de Bom Jesus apresentou alteração moderada para β-EST. Não foram observadas alterações para pnpa-EST e GST em nenhuma das populações. Deste modo, foi feito um teste de Kruskal Wallis, seguido de Dun`s 126 post test para verificar alterações. Foi verificado que as populações de Boa Vista e Bom Jesus e Jataí II apresentaram alteração para pnpa-EST enquanto, que todas para beta-EST, inclusive Barriguda. Todas estas alterações enzimáticas observadas nos ensaios podem estar correlacionadas ao uso de inseticidas pertencentes a todas as classes como relatado nos questionários para o controle de pragas nas criações domésticas e demais insetos, bem como OP e PI junto as atividades do PCDCh. Referindo-se a metodologia de análise por meio do p99 verificou-se limitação desta técnica por mascarar alteração enzimática em algumas populações, recomendando-se que ela esteja atrelada outras análises estatísticas de modo a assegurar a validade dos resultados. Contudo, de antemão deve-se considerar primeiro a limitação da LRS escolhida. A análise dos resultados obtidos neste projeto demonstrou falta de correlação entre os resultados dos ensaios biológicos e dos bioquímicos, problemática esta também enfrentada pela rede MoReNAa nos estudos com Aedes aegypti. Apesar disto, os dados indicam que alteração na atividade de ALFA-EST e BETA-EST parecem contribuir para uma menor suscetibilidade de triatomíneos a PI e de ACE a CB. No entanto, não se tem aqui elementos suficientes para apontar o grau de contribuição de cada uma dessas alterações para o fenótipo de resistência. As diferenças encontradas nos ensaios biológicos e bioquímicos podem estar relacionadas a estrutura genética das populações de T. sordida como observado para T. infestans (MONTEIRO et al, 1999; MARCET et al, 2008; PEREZ DE ROSAS et al, 2007; 2008, PICCINALI et al., 2009). Pelas baixas razões de resistência observadas as alterações de suscetibilidade podem ser devido a múltiplos mecanismos, isolados ou combinados, dentre os quais se destacam o espessamento cuticular, alterações bioquímicas e comportamentais. Ainda neste contexto, outro ponto a ser considerado se refere a utilização de um limitado número de substratos em tais ensaios enzimáticos, frente a grande infinidade existente nos insetos, atrelado ao fato das enzimas avaliadas serem multifuncionais. Deste modo, não necessariamente as alterações observadas se referem a eventos relacionados com a resistência a inseticidas, revelando falta de especificidade. O mesmo foi observado por SAAVEDRA- RODRIGUES et al. (2012) através da técnica do microarray utilizando um maior número de substratos enzimáticos em estudos com Aedes aegypti. Deste modo, acredita-se que os estudos mais promissores voltados para esta linha de pesquisa estejam em investigações no sítio-alvo dos ativos químicos e nas ferramentas de bioinformática. Apesar da distribuição focal dos triatomíneos, com colônias geralmente compostas por poucos indivíduos e longo ciclo evolutivo, fatores estes determinantes na variabilidade genética, foi observado na análise dos microssatélites uma grande diversidade intrapopulacional. A diversidade entre as populações foi moderada revelando inclusive possível fluxo gênico, 127 independente dos tipos de agrupamentos. Em todas as populações foram identificados haplótipos e alelos exclusivos. Pelos resultados obtidos é possível inferir um possível fluxo de insetos entre as localidades de Jataí I, Jataí II e Boa Vista. A populações de Barriguda e de Bom Jesus se mostraram bastante diferenciadas das demais indicando um possível isolamento independente de ambas. Estudos com um maior número amostral e com imagens de satélite seriam ferramentas úteis no esclarecimento desta questão. GIORDANO et al., (2005) sugerem o uso dos microssatélites como uma ferramenta úitl no estudo de populações submetidas a diferentes pressões com inseticida, contudo, o que observamos foi que tal ferramenta não dicerniu populações com diferentes perfis de suscetibilidade. Observou-se grande diversidade genética suportando a hipótese de que o rápido crescimento da população pode estar associado a recolonização por insetos sobreviventes ao tratamento com inseticida, sugerindo possíveis falhas no controle operacinal (MARCET et al., 2006; PEREZ DE ROSAS et al., 2007; RICHER et al., 2007; PIZARRO et al., 2008). Os marcadores moleculares utilizados foram desenhados antes da disponibilidade das informações do genoma Rhodnius prolixus, por predição aleatória. A análise de similaridade destes marcadores com os dados disponíveis neste genoma podem revelar relação destes com genes envolvidos com a resistência a inseticida, contudo esta análise não ainda foi realizada. Recomenda-se nos próximos estudos o desenho destes iniciadores com base nas informações deste banco de dados com fragmentos de DNA ligados a genes envolvidos com a resistência a inseticida. Os resultados aqui obtidos precisam, em definitivo, ser reavaliados em condições de campo para se compreender o real significado das razões de resistência observadas, não podendo ser transpostos para outras espécies de triatomíneos e nem outras populações (OLIVEIRA FILHO 1999). 128 Conclusões 129 • As análises dos bioensaios quantitativos revelaram RR50 que variaram de 0,44 a 6,5. De acordo com critério de categorização do status da suscetibilidade/resistência proposto pela OPAS (2005), apenas 1% das populações foi classificada como resistente a deltametrina (TsCJB; RR50: 6,50), enquanto que de acordo com critério de ZERBA & PICOLLO (2002), este valor representa 55,5%. As definições de resistência propostas por ZERBA & PICOLLO (2002) e OPAS (2005) não se mostraram concordantes, revelando percentuais de resistência distintos. • Apesar da inexistência de informações mais consistentes sobre o que realmente as razões de resistência significam em campo, até que os ensaios de campo voltados a esta finalidade sejam realizados, o indicativo de resistência a inseticida utilizando critério preconizado pela OPAS (2005), recomenda-se para o município de Barriguda, que a SES/MG realize uma avaliação das ações de controle de campo. • Os bioensaios qualitativos revelaram um percentual de mortalidade a DD 1xDL99 que variou de 43,3% a 100%, sendo 61,2% das populações classificadas como resistentes à deltametrina. Os resultados obtidos nos bioensaios qualitativos e quantitativos não se mostraram correspondentes. • A padronização dos ensaios bioquímicos revelou que estes ensaios devem ser realizados com insetos de mesma geração e idade considerando-se a inexistência de um padrão único de resposta que seja passível de comparação. Referindo-se ao número amostral, recomenda-se a utilização de no mínimo de 45 insetos, considerando uma possível diversidade genética das populações. A análise dos ensaios bioquímicos utilizando somente o percentil 99 se mostrou deficiente, justificando a necessidade de um teste estatístico em paralelo, a ser escolhido de acordo com a distribuição dos dados. • De forma geral, independente do status de suscetibilidade/resistência, foi observada alteração na maioria das populações para todas as enzimas, exceto de GST. Não foi observada correlação entre as RR encontradas e os resultados do testes bioquímicos. • Não foi observada diferença no padrão das localidades com triatomíneos classificados como resistentes ou suscetíveis em relação a: constituição do intradomicílio, tipo de ecótopos peridomiciliares, a disponibilidade de esconderijos, e uso de inseticidas pelo próprio morador. • Verificou-se acompanhando no período amostrado, diferenças nos parâmetros climatológicos (insolação, temperatura e pluviosidade) em todo o município (p< 0,05). Este fato pode contribuir para a degradação do inseticida de forma inconstante ao longo do tempo, em um período diferente do planejado pelo gestor responsável pela borrifação, expondo o domicílio a possíveis reinfestações. 130 • Dentre as localidades avalidas foi observado maior infestação e uso de inseticidas na localidade de Barriguda, sendo T. sordida (94,5%) a espécie predominantemente coletada. • Não existe sobreposição de programas de controle na região. O município de Coração de Jesus conta atualmente com três agentes de saúde, com pouco tempo de experiência profissional, não treinados para as atividades de borrifação que afirmaram ter trabalhado em concordância com as preconizações do MS. • Os estudos com microssatélites revelaram uma diversidade genética média por loci (pin) de 0,408. Foram identificados 75 haplótipos e 24 alelos exclusivos. Desvios significativos do equilíbrio de Hardy-Weinberg foram observados revelando déficit de heterozigosidade. Independente da constituição dos grupos, a AMOVA revelou uma pequena variação interpopulacional e uma grande intrapopulacional. A análise do FST possibilitou inferir sobre um fluxo de insetos entre as localidades de Jataí I, Jataí II, Boa Vista. As populações de Bom Jesus e Barriguda se mostraram diferenciadas das demais indicando um possível isolamento independente. • Os microssatélites se mostraram úteis na caracterização da estrutura genética das populações, contudo não se trata de uma ferramenta que possibilite dissernir populações com status de suscetibilidade diferenciado. • De forma geral, o uso de inseticidas para diversos fins, possíveis falhas operacionais principalmente devidas à falta de capacitação dos agentes de saúde, somados a uma degradação irregular do inseticida determinada pelas condições ambientais, pode estar contribuindo para a persistência da infestação na região. A diversidade de RR observada dentro da mesma localidade, o fluxo genético observado nos ensaios moleculares, a abundância e diversidade de esconderijos e os diferentes perfis bioquímicos encontrados justificam a necessidade de estudos mais detalhados. 131 Considerações finais 132 Os resultados encontrados nos bioensaios para triatomíneos brasileiros até o momento não apontam a resistência a inseticida como um problema grave. Contudo, a detecção de “alteração de suscetibilidade”, ainda que em pequenos níveis, evidencia a necessidade de implementação de estratégias de manejo de modo a preservar a vida útil dos produtos utilizados na área domissanitária e garantir todo o sucesso de controle vetorial adquirido desde o início do PCDCh. Neste contexto, torna-se mais do que necessário o aperfeiçoamento da vigilância entomológica dentro da estrutura do SUS contemplando as nuances sociais, ambientais e eco- epidemiológicas da saúde. Somado a isto ressalta-se também a necessidade da avaliação das atividades técnicas, operacionais e de gestão desenvolvidas em relação às normas técnicas já definidas por parte dos municípios que fazem o controle dos triatomíneos. Várias perguntas e questionamentos existem no que se refere ao estabelecimento de uma rotina de monitoramento de suscetibilidade/resistência em laboratório, revelando real demanda do desenvolvimento de técnicas e políticas a serem assumidas pelas gestões e políticos deste país. Para tal faz-se necessária e prioritária a realização de ensaios de laboratório e de campo de forma simultânea e complementar, de modo a permitir uma correlação entre ambos e o consequente entendimento da relação existente entre eles e da compreensão do que é resistente e do que é suscetível. Identificar as particularidades toxicológicas, bioquímicas e genéticas de cada população “resistente” tem relação direta com o ótimo manejo da resistência e o monitoramento do controle que permitirá: 1) conhecer os fatores operacionais e biológicos que possibilitam o desenvolvimento da resistência em cada população, 2) elaborar estratégias de manejo da resistência específica de cada foco detectado e 3) proceder em momento oportuno para a manutenção dos índices entomológicos existentes atualmente adquirido as custas de anos de esforços dos funcionários e gestores do PCDCh. Com a realização deste projeto, a FIOCRUZ amplia o seu papel no âmbito do Sistema Nacional de Vigilância em Saúde e contribui para uma melhor efetividade das ações de controle de uma importante doença no contexto epidemiológico no país. 133 Referências bibliográficas 134 Acevedo GR, Mougabure Cueto GA, Germano M, Orihuela PS, Cortez MR, Noireau F, Picollo MI & Vassena C 2011. Susceptibility of sylvatic Triatoma infestans from Andeans Valleys of Bolivia a deltamethrin and fipronil. Journal of Medical Entomology 48: 830-835. Akhavan D 1998. Análise de custo efetividade do Programa de Controle da Doença de Chagas no Brasil: relatório final. Dariush Akhavan, Brasília, Programa de desenvolvimento de recursos humanos/OPAS, 271 pp. Alout H, Djogbénou L, Berticat C, Chandre F, Weill M 2008. Comparasin of Anopheles gambiae and Culex pipiens acetylcholinesterase 1 biochemical properties. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol Part B 150: 271-7. Anand A, Crone EJ, Zera AJ 2008. Tissue and stage-specific juvenile hormone esterase (JHE) and epoxide hydrolase (JHEH) enzyme activities and the transcript abundance in lines of the cricket Gryllus assimilis artifically selected for plasma JHE activity: implications for JHE microevolution. J Insect Physiol 54: 1323-31. Anaspayghg DD & Roe RM 2005. Regulation of JH epoxide hydrolase versus JH esterase activity in the cabbage looper, Trichoplusia ni, bye juvenile hormone and xenobiocts. J Insect Physiol 51: 523-35. Anderson JM, LAI JE, Dotson EM, Cordon-Rosales C, Ponce C, Norris De, Beard CD 2002. Identification and characterization of microsatellites markers in the Chagas disease vector Triatoma dimidiata. Infection, Genetics and Evolution 1: 243-248. Anspaugh DD, Rose RL, Koehler PG, Hodgson E, Roe RM 1994. Multiple mechanisms of pyrethroid resistance in the german cockroach, Blattella germanica (L.). Pestic biochem Physiuol 50: 138-148. Apperson CS, Georghiou GP 1979. Mechanisms of resistance to organophosphorus insecticides in Culex tarsalis. J Econ Biochem 68: 63-781. Assis GFM 2006. Avaliação do programa de controle da doença de Chagas no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, Brasil, oito anos após implantação da vigilância entomológica, Dissertação, Programa de pós-graduação em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto. Audino PG, Vassena C, Barrios S, Zerba E, Picollo M 2004. Role of enhanced detoxification in a deltamethrin-resistant population of Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) from Argentina. Mem Inst Oswaldo Cruz 99: 335-339. Barbosa da Silva JR, Siqueira JB JR, Coelho GE, Vilarinhos PT, Pimenta FG JR 2002. Dengue in Brazil: current situation and control activities. Epidemiol Bull 23: 3-6. Barreto MP, Albuquerque RDR, Funayama GK 1969. Estudos sobre os reservatórios e vetores silvestres do Trypanosoma cruzi In: XXXVI Investigações sobre triatomíneos de palmeiras no município de Uberaba, MG, Brasil. Rev Brasil Biol 29: 577-588. Barretto MP. 1979. Epidemiologia. In: Brener, Z, Andrade, Z. (Eds.), Trypanosoma cruzi e Doença de Chagas, Guanabara Koogan, Brasil, 90-151 pp. Bass C, Schroeder I, Turberg A, Field M, Williamson MS. 2004. Identification of mutations associated with pyrethroid resistance in the para-type sodium channel of the cat flea, Cnenocephalides felius. Insect Biochem. Mol. Biol. 34: 1305-1313. 135 Bérenger JM, Blanchet D 2007. A new species of the genus Panstrongylus from French Guiana (Heteroptera; Reduviidae; Triatominae). Mem Inst Oswaldo Cruz 102: 733-736. Bergé HBM Feyreisen R, AmichoT M 1998. Cytochrome P450 monooxygenases and insecticide resistance in insects. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 353: 1701-5. Bisset JÁ, Rodrigueq MM, Hemingway J, Diaz C, SmalL GJ, Ortiz 1991. Malathion and pyretrhoid resistance in Culex quinquefasciatus from Cuba efficacy of pirimiphos-methyl in the presence of at least three resistance mechanisms. Med Vet Entomol 5:223-228. Bloomquist JR 1996. Ion channels as targets of insecticides. Ann Rev Entomol 41: 163-190. Bloomquist JR. 2009. Insecticides: Chemistries and Characteristics. In (University of Minnesota`s electronic textbook of Integrated Pest Management”. Disponível em: http://ipmworld.umn.edu/chapters/bloomq.htm. Acesso em 19 Jul 2012. Bracco JE, Barata JMS, Marinotti O 1999. Evalutation of insecticide resistance and biochemical mechanisms in a population of Culex quinquefasciatus (Diptera:Culicidae) from São Paulo, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 94: 115-120. Braga IA, Lima JBP, Soares SS, Valle D 2004. Aedes aegypti resistance to temephos during 2001 in several municipalities in the state of Rio de Janeiro, Sergipe and Alagoas, Brazil. Mem Inst Osw Cruz 99: 199-203. Braga IA, Valle D 2007b. Aedes aegypti: vigilância, monitoramento da resistência e alternativas de controle no Brasil. Epidemiol Serv Saúde 16: 295 – 302. Braga IA, Valle D. Aedes aegypti: inseticidas, mecanismso de ação e resistência. Epidemiol Serv Saúde 2007a; 16: 279 – 293. Brasil. Ministério da saúde/gabinete do ministro. Portaria nº 1172, de 17 de junho de 2004. Disponível em http://dtr2001.saude.gov.br/sas/PORTARIAS/Port2004/GM/GM-1172.htm. Acesso em 19 Jul 2012. Brasil. Ministério da saúde/gabinete do ministro. Portaria nº 119, de 15 de dezembro de 1999. Disponível em http://www.saude.ms.gov.br. Acesso em 19 Jul 2012 Brasil. Ministério da saúde/gabinete do ministro. Portaria nº 3252, de 22 de dezembro de 2009. Disponível em http://www.brasilsus.com.br/legislacoes/gm/102068-3252. Acesso em 19 Jul 2012. Brengues C, Hawkes NJ, Chandre F, McCarroll L, Duchon S, Guillet P, Manguin S, Morgan JC, Hemingway J 2003. Pyrethroid and DDT cross-resistance in Aedes aegypti is correlated with novel mutations in the voltage-gated sodium channel gene. Med Vet Entomol 17:87-94. Brogdon WG, Mcallister JC 1998. Inseticide resistente and vector control. Emerg Infec Diseases 4: 605-613. Brooke BD, Hunt RH, Matambo TS, Koekemoer LL, Wyk PV, Coetzee M 2006. Dieldrin resistance in the malaria vector Anopheles gambiae in Ghana. Med Vet Entomol 20: 294-299. Brow AQ, Paul R 1971. Insecticide resistance in arthopods. World Health Organization, WHO Monogr Geneva Ser 38. Bustamante FM, Carvalho AG 1957. Observações sobre a ação dos inseticidas Dieldrin e BHC contra Triatoma infestans no interior das habitações. Rev Bras Malariol 9: 305-3111. 136 Busvine J, Barnes M 1947. Observations on mortality among insects exposed to dry insecticidal films. Bull Ent Res 38:81-90. Carcavallo RU 1985. Sinopsis epidemiológica de la enfermedad de Chagas. In: Carcavallo, RU, Rabinovich JE, Tonn, RJ. Factores biológicos y ecológicos en la enfermedad de Chagas: Tomo I – Epidemiología – Vectores. Chagas 2: 19-20. Carrilo SJ 1954. El empleo del Dieldrin en Venezuela. Bol Of San Panam 37:76-81. Casabe N, Zerba E 1981. Esterases of Triatoma infestans and its relationship with the metabolism of organophosphorous insecticides. Comp Biochem Physiol 68: 255-258. Cecchine G, Golomb BA, Hilborne LH, Spektor DM & Anthony CR. 2000. Pesticides. A review of the scientific literature as it pertains to Fulf War ilinesses, Rand Corp Santa Monica CA 8. Disponível em: http://www.fulflink.osd.mil/library/randrep/pesticides_paper/index.html. Acesso em 19 Jul 2012. Cercere MC, Vazquez-Prokopec GM, Gürtler RE, Kitron U 2006b. Reinfestation sources for Chagas disease vector, Triatoma infestans, Argentina. Emerging Infectious Diseases 12: 1096- 1102. Cercere MC, Vazquez-Prokopec GM, Gürtler RE, Kitron U 2004. Spatio-temporal analysis of reinfestation by Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) following insecticide spraying in a rural community in a Northweastern Argentina. Am Trop Med Hyg 71: 803-810. Champ BR, Dyte K. 1976. FAO global survey of pesticide susceptibility of Stored Grain Pests. FAO/UN, Rome. Chang C, Shen WK, Wang TT, Lin YH, Hsu EL, Dai SM 2009. A novel amino acid substitution in a voltage-gated sodium channel in associated with knockdown resistance to permethrin in Aedes aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology In Press, Accepeted Manuscript. Clarke KC; Osleeb JR; Sherry JM.; Meert JP; Larsson RW 1991. The use of remote sensing and geographic information systems in UNICEF dracunculiasis (Guinea worm) eradication effort. Prev Vet Med 11: 229-235. Cockburn JM 1972. Laboratory investigations bearing on possible insecticide resistance in triatomines bugs. WHO/72.359. Consenso Brasileiro em Doença de Chagas 2005. Secretaria de Vigilância em Saúde do Ministério da Saúde. Rev Bras Med Trop 38: 1-29. Costa J & Felix M, 2007. Triatoma juazeirensis sp. from the state of Bahia, Northeastern Brazil (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae). Mem Inst Oswaldo Cruz 102: 87-90. Costa J, Argolo A, Felix M, 2006. Redescription of Triatoma melanica Neiva & Lent, 1941, new status (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae). Zootaxa 1385: 47-58. Coura JR, Barret TV, Arboleda-Naranjo M 1994. Ataque de populações humanas por triatomíneos silvestres no Amazonas: uma nova forma de transmissão da infecção chagásica? Rev Soc Bras Med Trop 27: 251 - 253. Coura JR, Dias JCP 2009. Epidemiology, control and surveillance of Chagas disease – 100 years after itsdixcovery. Mem Inst Oswaldo Cruz 104: 31-40. 137 Coura JR, Viñas PA 2010. Chagas disease: a new worldwide challenge. Nature (Chagas Disease Outlook): S6-S7. D`Amato C, Torres JPM, Malm O. 2002. DDT (Dicloro Difenil Tricloroetano), toxicidade e contaminação ambiental – uma revisão. Química Nova 25: 995-1002. Davies TG, Field LM, Usherwood PN, Williamson MS 2007. A comparative study of voltage- gated sodium channels in the Insecta: implications for pyrethroid resistance in Anopheline and other Neopteran species. Insect Mol Biol 16:361-375. Dennehy TJ, Granett J, Leigh TF 1983. Relevance of slide-dip and residual bioassay comparisons to detection of resistance in spider mites. J Entomol 76: 1225-1230. Deprés L, David JP, Gallet C 2007. The evolutionary ecology of insect resistance to plant chemicals. Trends Ecol Evol 22: 298-305. DevelouX M, Lescure FX, Jaureguiberry S, JeanneL D, ElghouzzI MH, Gay F, Paris L, Le Loup G, Danis M, PialouX G 2010. Emergence of Chagas disease in Europe: description of the first cases observed in Latin American immigrants in mainland France. Med Trop 70: 38-42. Devonshire AL, Moores GD 1984. Characterization of the insecticide insensitive acetilcholinesterase: microcomputer-based analysis of enzyme inhibition in homogenates of individual houses-fly (Musca domestica) heads. Pestic Biochem Physiol 21:341-348. Dias E 1957. Profilaxia da doença de Chagas. O hospital. 51: 53-67. Dias E, Pellegrino J 1948. Alguns ensaios com o “Gamexanne” no combate aos transmissores da doença de Chagas. Brasil Medico 62: 185-190. Dias E, Pinto OS. Pelegrino J, Castro JA 1952. Ensaio experimental de luta contra triatomíneos por meio de inseticidas de ação residual. Rev Bras Malar Doen Trop 4: 22-46. Dias FBS, Silva de Paula A, Belisário CJ, Lorenzo CM, Harry M, Diotaiuti L 2011. Influence of the palm tree species on the variability of Rhodnius nasutus Stal, 1829 (Hemiptera, Reduviidae, Triatominae). Infection, Genetics and Evolution 11: 869-877. Dias JCP 2001. Doença de Chagas: ambiente, participação e Estado. Cad Saúde Pública. 17: 165-169. Dias JCP 2002. O controle da doença de Chagas no Brasil. In: Silveira AC. O controle da Doença de Chagas nos países do Cone Sul da América: uma iniciativa internacional. Organização Pan-Americana da Saúde / Faculdade de Medicina do Triângulo Mineiro, 316pp. Dias JCP 2006. Doença de Chagas: sucessos e desafios. Cad Saúde Pública 22: 2020-2021. Dias JCP 2009. Primórdios entomológicos. Assessoria de Comunicação Social/Centro de Pesquisas René Rachou - Fiocruz Minas. Ago. 2009. Disponível em http://www.cpqrr.fiocruz.br. Acesso em 21 Dez 2009. Dias JCP, 2000. Epidemiologia. In: Brener Z, Andrade ZA, Barral-Neto M. Trypanosoma cruzi e a Doença de Chagas, 2. ed. Rio Janeiro, Guanabara Koogan, 48-74 pp. Dias JCP, Garcia ALR. 1976. Vigilância epidemiológica com participação comunitária. Rev Inst Educ Saud. 19: 29-44. 138 Dias JCP, Machado EMM, Borges EC, Moreira EF, Gontijo C, Azeredo BVM 2002. Doença de Chagas em Lassance, MG. Reavaliação Clínico - epidemiológica 90 anos após a descoberta de Carlos Chagas. Rev Soc Bras Med Trop, 35: 167-176. Dias JCP, Shofield CJ 1999. The evolution of Chagas disease (American Trypanosomiasis) control after 90 years since Carlos Chagas Discovery. Mem Inst Oswaldo Cruz 94: 103-121. Dias JCP, Bastos C, Araujo E, Mascarenhas AV, Netto EM, Grassi F, Silva M, Tatto E, Mendonça J, Araujo RF, Shikanai –Yasuda MA, Aras R 2008. Acute Chagas disease associated with oral transmission. Rev Soc Bras Med Trop. 41: 296-300. Ding Y, Ortelli F, Rossiter LC, Hemingway J, Ranson H 2003. The Anopheles gambiae glutahione trasferase supergene family: annotation, phylogeny and expression profiles. BMC Genomics 4: 35. Diotaiuti L 1997. Alterações ambientais e a colonização peridomiciliar pelo Triatoma sordida no Estado de Minas Gerais, Brasil. Acta Toxicol Argent 5: 15-62. Diotaiuti L, Azeredo BVM, Busek SCU, Fernandes AJ 1998. Controle do Triatoma sordida no Peridomicílio Rural do Município de Porteirinha, Minas Gerais, Brasil. Rev Pan Salud Pública, 3: 21-25. Diotaiuti L, Bezerra CM, Ferraz ML, Gomes A 2009. Transmissão do Trypanosoma cruzi por espécies secundárias. In: 25ª REUNIÃO ANUAL DE PESQUISA APLICADA EM DOENÇA DE CHAGAS/13ª REUNIÃO ANUAL DE PESQUISA APLICADA EM LEISHMANIOSES. Rev Soc Bras Med Trop 42:81-82 Diotaiuti L, Carneiro M, Loiola CCP, Silveira Neto HV, Coutinho RM, Dias JCP 1988. Alternativa de controle do Triatoma sordida no triângulo mineiro. I. Borrifação parcial (intradomicílio) no município de Douradoquara, MG, Brasil. Rev Soc Bras Med Trop 21: 199- 203. Diotaiuti L, Dias JCP 1988. O peridomicílio no controle vetorial da doença de Chagas, com especial referência ao Triatoma sordida em Minas Gerais. In: Resumos da V Reunião de Pesquisa Aplicada em doença de Chagas, Araxá p.79. Diotaiuti L, Paula OR, Falcão PL, Dias JCP 1994. Evaluation of the Chagas disease vector control program in Minas Gerais, Brasil, with special reference to Triatoma sordida. Bull Pan Americ Health Organization; 28: 211-219. Diotaiuti L, Pereira AS, Loiola CF, Fernandes AJ, Schofield JC, Dujardin JP, Dias JCP, Chiari E 1995. Inter-relation of sylvatic and domestic transmission of Trypanosoma cruzi in areas with and without domestic vectorial transmission in Minas Gerais, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz, 90: 443-448. Diotaiuti L, Pinto CT 1991. Suscetibilidade biológica do Triatoma sordida e Triatoma infestans a deltametrina e lambdacyalotrina em condições de campo. Rev Soc Bras Med Trop, 24: 151- 155. Diotaiuti L, Ribeiro de Paula AO, Falcão PL, Dias JCP 1997. Avaliação do programa de Controle da Doença de Chagas em MG, Brasil com referência especial ao Triatoma sordida. Bol Oficina Saint Panam 118: 211-219. Diotauti L, Loiola CF, Falcão PL, Dias JCP 1993. The ecology of Triatoma sordida in natural enviroments in two different regions of the state of Minas Gerais, Brazil. Rev Inst Med Trop 35: 237-245. 139 Dong K, Scott JG 1994. Linkage of KDr-type resistance and para-homologous sodium channel genes in German cockroaches (Blatella germanica). Insect Biochem Mol Biol 24: 647-654. Enayati AA, Ranson H, Hemingway J 2005. Insect glutathione trasferases and insecticide resistance. Insect Mol Biol 14: 3-8. Excoffier L, Lawlor S, Schneider S 2005. Arlequin ver.3,0: An integrated software package for population genetics data analysis. Excoffier L, Smouse PE, Quattro JM 1992. Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes: application to human mitochondrial DNA restriction data. Genetics 131:479-491. Fabro J, Sterkel M, Capriotti N, Mougabure-Cueto G, Germano M, Rivera-Pomar R, Ons S 2012. Identification of a point of mutation associated with pyrethroid resistance in the para-type sodium channel of Triatoma infestans, a vector of Chagas disease. Infection, Genetics and Evolution 12:487-491 Farham AW, Murray AWA, Sawicki RM, Denholm I, White JC 1987. Characterization of the structure activity relationship of kdr and two variants of super Kdr to pyrethroids in the housefly (Musca domestica). Pestic Sci 19:209-220. Ferreira ILM, Silva TPT 2006. Eliminação da transmisão da doneça de Chagas pelo Triatoma infestans no Brasil: um fato histórico. Rev Soc Bras Med Trop 39: 507-509. Feyereinsen R 1999. Insect P450 enzymes. Annu Rev Entomol 44:507-533. Fitzpatrick S, Feliciangeli MD, Sanchez-Matin MJ, Moteiro FA, Miles MA, 2008. Molecular genetics reveal that silvatic Rhodnius prolixus do colonise rural houses. Plos Negl Trop Dis. 2: 1-16. Fitzpatrick S, Watt PC, Feliciangeli MG, Miles Ma, Kemp SJ 2009. A panel of ten microsatellite loci for Chagas disease vector Rhodnius prolixus (Hemiptera: Reduviidade). Infection, Genetics and Evolution 9:206-209. Focioli D, Frey B, Frey JE 2002. High nucleotide diversity in the para-like voltage-sensitive sodium channel gene sequence in the western flower thrips (Thyusanoptera: Thripidae). J Econ Entomol 95: 838-848. Foratinni, OP 1980. Biogeografia, origem e distribuição da domiciliação de triatomíneos no Brasil. Rev Saúde Pública 14: 265–299. Forattini OP, Ferreira OA, Rocha E Silva EO, Rabello EX 1975. Aspectos ecológicos da tripanossomíase americana. VII-Permanência e mobilidade do Triatoma sordida em relação aos ecótopos artificiais. Rev Saúde Publica 9: 467- 476. Forattini OP, Rocha E Silva EO, Ferreira OA, Rabello EX, Pattoli D 1971. Aspectos ecológicos da Tripanossomíase Americana: III – Dispersão local de triatomíneos, com especial referência a Triatoma sordida. Rev Saúde Pública 5: 193 – 205. Forattinni OP; Ferreira OA; Silva EOR, Rabello EX 1974. Aspectos ecológicos da tripanossomose americana. IV. Persistência do Triatoma sordida após alteração ambiental e suas possíveis relações com a dispersão da espécie. Rev Saude Publ 8: 265-282. 140 Forattinni OP; Ferreira OA; Silva EOR; Rabello EX & Santos JF 1971. Aspectos ecológicos da tripanossomose americana. II. Distribuição e dispersão local de triatomíneos em ecótopos naturais e artificiais. Rev Saude Publ 5: 163-191. Fox I, Bayona IG, Orozco HI 1966. The toxicity of DDT, Dieldrin, Malathion, and Fenthion to Rhodnius prolixus in the laboratory. Bull Wld Hlt Org 35: 974-976. Frova C 2006. Glutathione transferases in the genomics era: new insights and perspectives. Biomol Eng 23(4): 149-69. Fukuto TR 1990. Mechanism, of action of organophosphorus and carbamate insecticides. Environ Health Perspect 87: 245-254. Fundação Nacional de Saúde. 1995 Coordenação de Minas Gerais. Relatório Técnico. Galvão C, Carcavallo R, Silva Rocha D, Jurberg J 2003. A checklist of the current valid species of the subfamily Triatominae Jeannel, 1919 (Hemiptera: Reduviidae) and their geographical distribuition, with nomenclatural and taxonomic notes. Zootaxa 202, 1-36. Garcia BA, Zheng LO, Perez de Rosas AR, Segura EL 2004. Isolation and characterization of polymorphic microsatellite locus in the Chagas disease vector Triatoma infestans (Hemipetera: Reduviidae). Mol Ecol Notes 4: 568-571. Garcia GP, Flores AE, Fernandez-Salas I, Saavedra-Rodrigues K, Reyes-Solis G, Lozano- Fuentes S, Guillermo Bond J, Casas-Martinez M, Ramsey JM, Garcia-Rejon J, Dominguez- Galera M, Ranson H, Hemingway J, Einsen L, Black 4th WC 2009. Recent rapid rise of a permethrin knock down resistance allele in Aedes aegypti in Mexico. Plos Nel Trop Dis 3:531. Georghiou GP 1994. Principles of insecticide resistance management. Phytoprotection 75: 51- 59. Georghiou GP, Wirth M, Tran H, Saume F, Knudsen AB 1987. Potential for organophosphate resistance in Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in the Caribbean area and neighboring countries. J Med Entomol 24: 290-294. Germano MD, Acevedo GR, Mougabure Cueto GA, Toloza AC, Vassena CV, Picollo MI. 2010. New findings of insecticide resistance in Triatoma infestans (Heteroptera: Reduviidae) from the Gran Chaco. Journal of Medical Entomology 47: 1077-1081. Germano MD, Vassena CV, Picollo MI 2010. Autosomal inheritance of deltamethrin resistance in field populations of Triatoma infestans (Heteroptera: Reduviidae) from Argentina. Pest Manag Sci 66: 705-708. Gerold P 1969. Mode of entry of contact insecticides. J Insect Physiol 563-580. Giordano R, Cortez JCP, Paulk S, Stevens L 2005. Genetic diversity of Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) in Chuquisaca, Bolívia base don the mitochondrial cytochrome b gene. Mem Inst Oswaldo Cruz 100: 753-760. Glynn P 1999. Neuropathy target esterase. Biochem J 344: 625-631. Golden Gate Weather Services 2008. Disponível em: http://ggweather.com/enso/oni.htm. Acessado em 09 de junho de 2012. Goodland RJA, Ferri MG 1979. Ecologia do cerrado. Belo Horizonte: Itatiaia, 193p. 141 Goetz SJ, Prince SD & Small J 2000. Advances in satellite remote sensing of environmental variables for epidemiological applications. Adv Parasitol 47: 289-304. González-Audino P, Barrios S, Vassena C, Cueto GM, Zerba E, Picollo MI 2005. Increase monooxygenase activity associated with resistance to permethrin in Pediculus humanus capitis (Anoplura: Pediculidae) from Argentina. J Med Entomol 42: 342 – 345. González-Audino P, Vassena C, Barrios S, Zerba EN, Picollo MI 2004. Role of Enhanced Detoxication in a Deltamethrin-resistant Population of Triatoma infestans (Hemiptera, Reduviidae) from Argentina. Mem Inst Oswaldo Cruz 99: 335-339. González-Valdivieso FE, Diaz BS, Nocerino F 1971. Susceptibility of Rhodnius prolixus to chlorinated hydrocarbon insecticides in Venezuela. WHO/VBC/71.264. Goodman - Gilman S. Brunton LL, Lazo JS, Parker KL 2006. The Pharmalocigal Basis of Therapeutics. 11. ed. New York: E. McGraw-Hill. Gorla D, Schorfield C 1989. Population dynamics of Triatoma infestans under natural climatic conditions in the Argentine chaco. Med Vet Entomol 3: 179-14. Gorla D 1991. Recovery of Triatoma infestans populations after insecticide application: an experimental field study. Med Vet Entomol 53: 311-324 Gorla D 1994. Perspectivas biológicas y ecológicas para el desarrollo de resistencia en triatominos. Acta Toxicol Argent 2: 48-51. Gorla DE, Catalá SS, Grilli MP 1997. Efecto de la temperatura sobre la distribución de Triatoma infestans y es riesgo de transmisión vectorial de la enfermedad de Chagas na Argentina. Acta Toxicol Argent 5: 15-62. Gorla DE, Dujardin JP, Schofield CJ 1997. Biosystematics of old world Triatominae. Acta Trop 63: 127–140. Grant IH, Gold JW, Winter M 1987. Transfusion associated acute Chagas disease acquired in the United States. Ann Inter Med 111: 849-851. Grisson R, Konno TRR, Motoyama N, Dauterman WC 1989. Comparasion between in vivo and in vitro cutaneous penetration of fenvalerate in tabacco budworm (Lepdoptera: Noctuidae). J Ecnom Entomol 82: 41-44. Guglielmone AA, Castelli ME, Volpogni MM, Ansiani OS, Mangold AJ 2002. Dynamics of cypermethrin resistance in the field in the horn fly Haematobia irritans. Med Vet Entomol 16: 310-315. Gustafson EJ & Gardner RH 1996. The effect of landscape heterogeneity on the probability of patch colonization. Ecology 77, 94-107. Hargreaves K, Koekemoer LL, Brooke BD, Hunt RH, Mthembu J, Coetzee M 2000. Anopheles funestus resistant to pyrethroid insecticides in South Africa. Med Vet Entomol 14: 181-189. Harry M, DuponT L, QuartieR M, Diotaiuti L, Walter A, Romana C 2009. New perspective for population genetics of Chagas disease vectors in the Northeastern Brazil: isolation of polymorphic microsatellite markers in Triatoma brasiliensis. Infection, genetics and evolution 9: 633-637 142 Harry M, Dupont L, Romana C, Demanche C, Mercier A, Livet A, Diotaitui L, Noireau F, Emperaire L 2008. Microsatellite markers in Triatoma pseudomaculata (Hemiptera, Reduvidae, Triatominae), Chagas`disease vector in Brasil. Infection, Genetic and Evolution. 8: 672-5. Harry M, Poyet G, Romana CA, Solignac M 1998. Isolation and characterization of microsatellite markers in the Chagas disease vector Rhodnius pallescens. Mol Ecol 7: 1784- 1786. Harry M, Roose CL, Vautrin D, Noireau F, Romana CA, Solignac M 2008. Microsatellite markers from the Chagas disease vector, Rhodnius prolixus (Hemiptera, Reduviidae) and their applicability to Rhodnius species. Infect Genet Evol 8: 381-385. Hayes JK, Flanagan JU E Jowsey IR 2005. Glutathione Transferases. Annu Rev Pharmacol Toxicol 45:51-88. He H, Chen AC, Davey RB, Ivie GW, George JE 1999. Identification of a point mutation in the para-typoe sodium channel gene from a pyrethroid-resistant cattle tich. Biochem Biphys Res. Commmum 261: 558-561. Head DJ, McCaffery AR, Cllaghan A 1998. Novel mutations in the para-homologous sodium channel gene associated with phenotypic expression of nerve insensitivity resistance to pyretrhoids in Heliothine Lepidoptera. Insect Mol Biol 7: 191-196. Hemingway J, Hawkes LM, Ranson H 2004. The molecular basis of insecticide resistance in mosquitoes. Insect Biochemistry and Molecular Biology 34: 653-665. Hemingway J, Ranson H 2000. Insecticide resistance in insect vectors of human disease. Annu Rev Entomol 45:371-91. Hemingway J, Small GJ, Monro A, Sawyer BV 1992. Insecticide resistance gene frequencies in Anopheles sacharovi populations of the Çukurova plain, Andana Province, Turquia. Med Vet Entomol 6: 342-348. Hollingworth RM 1969. Dealkylation of Organophosphorus Esters by Mouse Liver Enzymes in Vitro and in Vivo. J Agric Food Chem 17: 987-966. Hotelier T, Renault L, Cousin X, Negre V, Marchot P, Chatonnet A 2004. Esther, the database of the α/β-hydrolase fold superfamily of proteins. Nucleic Acids Res 32: 145-147. Huchard E, Martinez M, Alout H, Douzery EJ, Lutfalla G, Berthomieu A, Berticat C, Raymond M, Weill M 2006. Acetylcholinesterase resistance genes which Diptera: takeover and loss in true flies. Proc Biol Sci 273: 2595-604. Hugh-Jones, M 1989. Applications of Remote Sensing to the identification of the habitats of parasites and disease vectors. Parasitol Today 5: 244-251. Hunaiti AA, Elbetieha AM, Obeidat MA, Owais WM 1995. Developmental studies on Drosophila melanogaster glutathione S-transferase and its induction by oxadiazolone. Insect Biochem Mol Biol 25:1115-9. IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística 1992. Disponível em: http://www.ibge.gov.br/. Acesso em 15 Abr 2009. Ingles PJ, Adams PM, Knipll DC, Soderlund DM 1996. Characterizatin of voltage sodium channel gene coding sequences from insecticide-susceptible and knockdown-resistant house fly strains. Insect Biochem Mol Biol 26: 319-326. 143 Kakani EG, Bon S, Massoulié J, Mathiopoulos KD. 2011. Altered CPI modification of insect AchE improves tolerance to organophosphate insecticides. Insect Biochem Mol Biol 41: 150-8. Karunaratne SHPP, Hemingway J 2000. Insecticide resistance spectra and resistance mechamisms in populations of Japanese encephalitis vector mosquitoes, Culex tritaeniorhyunchus and Cx gelidus, in Sri Lanka. Med Vet Entomol 14:430-436. Kasai S, Komaga O, Okamura Y & Tomita T 2009. Alternative splicing and developmental regulation of glutathione trasferases in Culex quinquefasciatus Say Pest Biochem Physiol 94: 21-9. Kirchhoff LV, Gam AA, Gillam F 1987. American trypanosomiasis (Chagas disease) in Central American immigrants. Amer J Trop Med Hyg 82: 915-920. Kumar S, Thomas A, Sahgal A, Verma A, Samuel T, Pillai MKK 2002. Effect of the synergist, piperonyl botoxide, on the development of deltamethrin resistance in yellow fever mosquito, Aedes aegypti L. (Diptera: Cullicidae). Archives of Insect Biochemistry and Physiology 50: 1-8 Labbè P, Berticat C, Berthomieu A, Unal S, Bernard C, Weill M, Lenormand T 2007. Forty years of erratic insecticide resistance evolution in the mosquito Culex pipiens. Plos Genet 3: 2190-2199. Lainson R, Shaw JJ, Frahia H, Miles MA, Draper CC 1979. Chaga´s disease in Amazon Basin I. Trypanosoma cruzi infections in silvatic mammals, triatomine bugs and man in the State of Pará, north Brazil. Trans Royal Soc Med Trop Hyg 73: 193-204. Lardeux F, Depickère S, Cuchon S, Chaves T 2010. Insecticide resistance of Triatoma infestans (Hemiptera, Reduviidae) vector of Chagas disease in Bolivia. Tropical Medicine and International Health 15: 1037-1048. Lee SH, Dunn JB, Clark JM, Soderlund DM 1999. Molecular analysis of Kdr-like resistance in a permethrin-resistant strain of Colorado potato beetle. Pestic Biochem Physiol 63: 63-75. Lee SH, Gao JR, Yoon KS, Mumcuoglu KY, Taplin D, Edman JD, Takano-Lee M, Clark M 2003. Sodium channel mutations associated with Knockdown resistance in the human head louse, Pediculus capitis (De Geer). Pestic Biochem Physiol 75: 79-91. Lee SH, Yoon KS, Williamson MS, Goodson SJ, Takano Lee M, Edman JD, Devonshire AL, Clark JM 2000. Molecular analysus of Kdr-like resistance in permethrin-resistant strains of head lice. Pediculus capitis. Pestic Biochem Physiol 66: 130-143. Lenormand T, Bouguet D, Guillemaud T, Raymond M 1999. Tracking the evolution of insecticide resistance in the mosquito Culex pipiens. Nature 400: 861-4. Lenormand T, Raymond M 2000. Analysis of clines eigth variable selection and variable midration. AM Nat 155: 70-82. Lent H & Wygodzinsky P 1979. Revision of the Triatominae (Hemiptera, Reduviidae), and their significance as vectors of Chagas' disease. Bull Amer Mus Nat Hist. 163. New York. Lent H, Oliveira SJ 1944. Nota preliminar sobre a ação do DDT (dicloro-difeniltricloetana) em insetos transmissores da doença de Chagas. Rev Bras Biol 4: 329-331. Lesueur D, Binka F, Lengeler C, DE Savigny D, Snow B, Teuscher & Touré Y 1997. An atlas of malaria in Africa. Afri Health 19: 23-24. 144 Li V, Schuler MA, Berenbaum MR 2007. Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics. Ann Rev Entomol 52:231-53. Review. Li YC, Korol AB, Fahima T, Beiles A, Nevo E 2002. Microsatellites: genomic distribuition, putative functions and mutational mechanisms a review. Molecular Ecology 11: 2453-2465. Li YC, Korol AB, Fahima T, Nevo E 2004. Microsatellites within genes: Structure, function and evolution. Molecular Biology and Evolution 21: 991-1007. Lima JB, Da-Cunha MP. Da Silva RC, Galardo AK, Soares SS, Braga IA, Ramos RP, Valle D 2003. Resistance of Aedes aegypti to organophosphates in several municipalities in the State of Rio de Janeiro and Espírito Santo, Brazil. Am J Trop Med Hyg 68: 329-333 Lima JTF 1983. Incremento do programa de controle da doença de Chagas no Brasil. Rev Soc Bras Med Trop 16: 128 - 129. Lines JD, Myamba J, Curtis CF 1987. Experimental hut trials of Permethrin-impregnated mosquito nets and curtains against Malaria vectors in Tanzania. Med Vet Entomol 1: 37-51. Liu Z, Valles SM, Dong K 2000. Novel point mutations in the German cockroack para sodium channel gene are associated with knockdown resistance (Kdr) pyrethroid insecticides. Insect Biochem Mol Biol 30: 991-997 Lockwood JA, Sparks TC, Soty RN 1984. Evolution of insect resistance to insecticides: a reevaluation of the roles of physiology and behavior. Bull Entomol Soc Ame 30: 41-51. Lofgren CS, Keller JC, BurdeN GS 1958. Resistance tests with the bed bugs and evaluation of insecticides for its control. J Econ Entomol 51: 241-244. Lumjuan N, Stevenson BJ, Prapanthadara LA, Somboon P, Brophy PM, Loftus BJ, Severson DW E Ranson H 2007. The Aedes aegypti gltathione transferase family. Insect Biochem Mol Biol 37:1026-1035. MacElwe JJ, Schuster E, Blanc E, Piper Md, Thomas JH, Patel DS, Selman C, Withers DJ, Thornton JM, Partridge L, Gems D 2007. Evolutionary conservation of regulated longevity assurance mechanisms. Genome Biol 8:R132. Magnin M, Marboutin E, Pasteur N 1988. Insecticide resistance in Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) in West Africa. J Med Entomol 25: 99-104. Maibèche-Coisne M, Merlin C, François MC, Porcheron P, Jacquin-Joly E 2005. P450 and P450 reductase cDNAs from the moth Mamestra brassicae: cloning and expression patterns in male antennae. Gene 346: 195-203. Marcet PL, Lehmann T, Groner G, Gurtler RE, Kitron U, Dotston EM 2006. Identification and characterization of microsatellite markers in the Chagas disease Triatoma infestans (Heteroptera: Reduviidae). Infection, Genetics and Evolution 6: 32-37. Mariconi FA. Inseticidas e seu emprego no combate às pragas. Agron Ceres Ltda. 2ed, São Paulo, 1963. Martínez E, Chávez T, Sossa D, Aranda R, Vargas B, Vidaurre P 2007. Triatoma boliviana sp. n. de los valles subandinos de La Paz, Bolivia (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae), similar a Triatoma nigromaculata Stål, 1859. Bol Inst Invest Salud y Desarrollo 3: 1-11. 145 Martinez-Torres D, Chandre F, Williamson MS, Darriet F, Bergé JB, Devonshire AL, Guillet P, Pasteur N, Pauron D. 1998. Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance (Kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 7: 179-184. Martinez-Torres D, Chevillon C, Brun-Barale A, Bergé JB, Pasteur N, Pauron D 1999a. Voltage-dependent Na+ channels in pyrethroid-resistant Culex pipiens L. mosquitoes. Pestic Sci 55: 1012-1020. Martinez-Torres D, Devonshire AL, Williamson MS 1997. Molecular studies of knockdown resistance to pyrethroids: Cloning of Domain II Sodium Channel Gene Sequences from Insects. Pestic Sci 51: 265-270. Martinez-Torres D, Foster SP, Field LM, Devonshire AL, Williamson MS 1999b. A sodium channel point mutation is associated with resistance to DDT and pyrethroid insecticides in the peache-potato aphid, Mysus persicae (Sulzer) (Hemiptera: Aphididae). Insect Molec Biol 8: 339-346. Martins AJ, Lima LB, Peixoto AA, Valle D 2009. Frequency of Val10106lle mutation in the voltage-gated sodium channel gene of Aedes aegypti Brazilian populations. Trop Med Int Health 14: 1351-1355. Martins AJ, Lins RMMA, Linss JCB, Peixoto AA, Valle D 2009. Voltage-gated sodium channel polymorphism and metabolic resistance in pyrethroid-resistant Aedes aegypti from Brazil. Am J Trop Med Hug 81: 108-115. Martins Junior A, Lima JB, Peixoto AA, Valle D 2009. Frequency of Val 1016 Ile mutation in the voltage-gated sodium channel gene of Aedes aegypti Brazilian populations. Tropical Medicine and Ineternational Health. 14: 1351-1355. Matambo TS, Abdalla H, Brooke BD, Koekemoer LL, Msnzava A, Hunt RH, Cotzee M 2007. Insecticide resistance in the malarial mosquito Anopheles arabiensis and association with the kdr mutation. Med Vet Entomol 21: 97-102. Mathenge EM, Gimning JE, Dolczak M, Ombok M, Irungu LW, Hawley WA 2001. Effect of permethrin-impregnated nets on exiting behaviour, blood feeding success, and time of feeding of malaria mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Western Kenya. J Med Entomol 38: 531-536. Matins AJ, Belinato TA, Lima JB, Valle D 2008. Chitin synthesis inhibitor effect on Aedes aegypti populations susceptible and resistant to organophosphate temephos. Pest Manag Sci 6: 676-680 Matsumura F 1963. The permeability of the cuticle of Periplaneta Americana (L.) to malathion. J Insect Physiol 9:207-221. Mbogo CNM, Baya NM, Ofulla AVO, Githure JI, Snow RW 1996. The impact of permethrin- impragnated bednets on Malaria vectors of the Kenyan coast. Med Vet Entomol 10: 251-259. Ministério da Saúde. Manual de Normas Técnicas da Campanha de Controle da doença de Chagas. Brasília: Superintendência de campanhas de saúde pública; 1980. Ministério da Saúde. Superintendência de campanhas de saúde pública. O controle das endemias no Brasil de 1979 a 1984. Brasília, DF; 1985. 146 Miyazaki M, Ohyama K, Dumlap DY, Matsumura F 1996. Cloning and sequencing of the para- type sodium channel gene from susceptible and kdr-resistant German cockroaches (Blatella germanica) and house fly (Musca domestica). Mol Gen Genet. 252: 61-68. Moncayo A, Silveira AC 2009. Current epidemiological trends for Chagas disease in Latin America and future challenges in epidemiology, surveillance and health policy. Mem Inst Oswaldo Cruz 104: 17 - 30. Monteiro FA, Pérez R, Panzera F, Dujardin JP, Galvão C, Rocha D, Noireau F, Schofield C, Beard CB 1999. Mitochondrial DNA variation of Triatoma infestans populations and its implication on the specific status of T. melanosoma. Mem Inst Oswaldo Cruz 94:229-238. Montella IR 2008. Estudos dos mecanismos bioquímicos da resistência a inseticidas em diferentes populações de Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) do Brasil, PhD Thesis, Instituto Oswaldo Cruz/ FIOCRUZ, 92 pp. Montella IR, Chama R, Valle D 2012. The classification of esterases: an important gene family involved in insecticide resistance – A review. Mem Inst Oswaldo Cruz 107 (4) : 437-449. Montella IR, Martins AJ, Viana-Medeiros PF, Lima JB, Braga IA, Valle D 2007. Insecticide resistance mechanisms of Brazilian Aedes aegypti populations from 2001 to 2004. Am J Trop Med Hyg 77: 467-77. Moreno AR, Carcavallo RU 1998. Enfoque ecológico para epidemiologia da doença de Chagas. In: Atlas of Chagas Disease Vectors on the Americas. Fiocruz, Rio de Janeiro. Morin S, Williamson MS, Goodson SJ, Brown JK, Tabashinik BE, Dennehy TJ 2002. Mutations in the Bemisia tabaci for sodium channel gene associated with resistance to a pyrethroid plus organophosphate mixture. Insect Biochem Mol Biol. 32: 1781-1791. Mouganbure Cueto G, Zerba E, Picollo MI 2005. Biological effect of 1-dodecanol in teneral and post-teneral Rhodnius prolixus and Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae). Mem Inst Oswaldo Cruz 100: 59-61. Myamba J, Maxwell CA, Asidi A, Curtis CF 2002. Pyrethroid resistance in tropical bedbugs, Cimex hemipterus, associated with use of treated bednets. Med Vet Entomol 16:448-451. Nabeshima T, Mori A, Kozaki T, Iwatta Y, Hidoh O, Harada S, Kasai S, Severson DW, Kono Y, Tomita T 2004. An amino acid substituion attributable to insecticide-insensitivity of acetylcholinesterase in a Japonse encephalitis vector mosquito, Culex tritaeniorhynchus. Biochem Biophus Res Commun 313: 794-801. Nardini M, Dijkstra BW 1999. α/β Hydrolase Ford enzimes: the family keeps growing. Curr Opin Struct Biol 9:732-737. Nelson MJ, Colmenares P 1979. Topical application of insecticides to R. prolixus (Reduviidae: Triatominae) a Chagas disease vector. Document WHO/BVC/79.737. Geneva, WHO. Nóbrega AA, Garcia MH, Tatto E, Obara MT, Costa E, Sobel J, Araujo WN 2009. Oral transmission of Chagas Disease by consumption of açaí Palm Fruit, Brasil. Emerging Inf Diseases 15: 653 - 655. Nocerino F, Hernández A 1986. Establishment of baseline data on the insecticide susceptibilities of the Chagas’disease vector Rhodnius prolixus in Venezuela. PAHO Bull 20: 366 – 369. 147 Nogueira RMR, Miagostovich MP, Schatzmayr HG, Santos, FB, Araujo ESM, Filippis AMB, Souza RV, Zagne SMO, Nicolai C, Baran M, Teixeira-Filho G 1999. Dengue in the State of Rio de Janeiro, Brazil 1986 – 1998. Mem Inst Oswaldo Cuz 94: 297 – 304. Oakeshott JC, Johnson RM, Berenbaum MR, Ranson H, Cristino AS, Claudianos C 2012. Metabolic enzymes associated with xenobiotic and chemosensory responses in Nasonia vitripennis. Insect Mol Biol 19: 147-63. Oakeshott JC, Papenrecht EA, Boyce TM, Healvy MJ, Russel RJ 1993. Evolutionary genetics of Drosophila esterases. Genetica 36: 9-10. Oakeshott JG, Johnson RM, Berenbaum MR, Ranson H, Cristino AS, CLaudianos C 2010. Metabolic enzymes associated with xenobiotic and chemosensory responses in Nasonia vitripennis.Insect Mol Biol 19: 147-63. Obara MT, Barata JMS, Silva NNDA, Ceretti JR. W, Urbinatti PR, Rosa JA, Jurberg J, Galvão C 2007. Estudo de ovos de quatro espécies do gênero Meccus (Hemiptera, Reduviidae, Triatominae), vetores da doença de Chagas. Mem Inst Oswaldo Cruz 102: 13-19. Obara MT. 2010. Caracterização de resistência a inseticidas em populações da subfamília Triatominae (Hemiptera: Reduviidade), vetores de Trypanosoma cruzi, Chagas, 1909. Tese de doutorado. São Paulo: Faculdade de Saúde Pública da USP. 246p. Oliveira EJ, Padua JG, Zucchi MI, Vencovsy R, Vieira MLC 2006. Origin, evolution and genome distribution of microsatellites. Genetics and Molecular Biology. 29: 294-307. Omumbo JA, Hay SI, Goetz RWS, Rogers DJ 2002. Updating historical maps of malaria transmission intensity in East Africa using remote sensing. Photogramm Eng Remote Sensing, 68: 161-166. OPAS – Organização Pan Americana de Saúde 2006. 2º Reunião da Inicitativa Intergovernamental de Vigilância e Prevenção da doença de Chagas na Amazônia. Caiena/Guiana Francesa. Rev Soc Bras Med Trop 39: 311- 317. Pacheco IA, Sartori MR, Bolonhezi I 1990. Resistance to Malathion, Pirimiphos-methyl and Fenitrothion in coleoptera from stored grains. Proceedings of the 5th International Working Conference on Stored Product Protection (Ed. By Working Conference on Stored Product). p.1029-1037. Park Y, taylor MFJ, Feyereisen R 1999. Voltage-gated sodium channel genes hscp and hDSC1 of Heliothis virescens F.genomic organization. Insect Mol Biol 8: 161-170. Pedreira De Freitas JL 1963. Importância do expurgo seletivo dos domicílios e anexos para profilaxia da moléstia de chagas pelo combate aos triatomíneos. Arq Hig Saúde Públ 28: 217- 272. Pedrini N, Mijailovsky SJ, Girotti JR, Stariolo R, Cardozo RM, Gentile A, Juarez MP 2009. Control of Pyrethroid-Resistant Chagas disease vectors with entomopathogenic fungi. PLOS Negl Trop Disease 3: 1 – 11 Penteado PR, KavalcoKF, Pazza R 2011. Amplificação cruzada de seis loci microssatélites isolados de Astyanax mexicanus para espécies do gênero com distribuição sul americana. Evolução e Conservação da Biodiversidade 2: 2-15. 148 Pereira da Cunha M, Lima JBP, Brogdon WG, Moya GE, Valle D 2005. Monitoring of resistance to the pyrethroid cypermethrin in Brazilian Aedes aegypti (Díptera: Culicidae) popuylations collected between 2001 and 2003. Mem Inst Osw Cruz 100: 441-444. Pereira KS, Schmidt FL, Guaraldo AM, Franco RM, Dias VL, Passos LA 2009. Chagas disease as a foodborne illness. J Food Prot 72: 441-446. Perez AR, Segura EL, Fichera L, Garcia BA 2008. Macrogeographic and microgeographic genetic structure of the Chagas disease vector Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidade) from Catamarca, Argentina. Genetica 133: 247-260. Perez de Rosas AR, Segura EL, García BA 2007. Microssatellites analysis of genetic structure in natural Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) populations from Argentina: its implication in assessing the effectieness of Chagas disease vector control programmes. Mol Ecol 16: 1401-1412. Perlowagora-Szumlewicz A 1956. A eficácia do expurgo domiciliário com dieldrin no controle do vetor da doença de Chagas. Rev Bras Malar Doen Trop 8: 289- 304. Pessoa GCA 2008. Monitoramento da suscetibilidade ao piretróide deltametrina em populações de Triatoma sordida Stål, 1859 (Hemiptera: Reduviidae), Dissertação de Mestrado, Centro de Pesquisas René Rachou da Fundação Oswaldo Cruz, Belo Horizonte. 95pp. Picollo MI, Cueto GM, Vassena C, Santo Orihuela P, Toloza A, Germano M 2011. Estado actual de la Resistencia a insecticidas en Triatoma infestans del cono sur. Centro de Investiganiones dem Plagas e Insecticidas (CONICET_CITEFA). Juan B. de La Salle 4397 (1603). Província de Buenos Aires, Argentina. Picollo MI, Vassena C, Orihuela PS, Barrios S, Zaidemberg M, Zerba E 2005. High resistence to pyrrethroid insecticides associated with ineffective field treatments in Triatoma infestans (Hemipetra: Reduviidade from Northern Argentina. J Med Entomol 42: 637-642. Pinchin R, Fanara DM, Oliveira Filho AM 1984. A village scale trail of Pirimiphos-methyl (OMS 1424), wettable power and slow-release formulations, in comparison with HCH for the controle of Triatoma infestans in Brazil. World Health Org., VBC/82.840, 8ps. Pinchin R, Oliveira Filho AM, Pereira ACB 1980. The flushing-out activity of pyrethrum and synthetic pyrethroids on Panstongylus megistus. Trans Roy Soc Trop Med Hyg 74:801-803. Pinto J, Lynd A, Elissa N, Donnelly MJ, Costa C, Gentille G, Caccone A, Do R, V 2006. Co- occurrence of East and West African kdr mutations suggests high levels of resistance to pyrethroid insecticides in Anopheles gambiae from Libreville, Gabnon. Med Vet Entomol 20: 27-32 Pinto OS, Bicalho JC 1952. Profilaxia da doença de Chagas no Estado de Minas Gerais por meio de inseticidas. Rev Bras Malar Doen Trop 4: 145-156. Pittendrigh B, Reenan R, Ffrench-Constant RH, Ganezky B 1997. Point mutations in the Drosophila sodium channel gene for associated with resistance to DDT and pyrethroid insecticides. Mol Gen Genet 256: 602-610. Pizarro JC, Gilligan LM, Stevens L 2008. Microsatellites reveal a high population structure in Triatoma infestans from Chuquisaca, Bolivia. Plos Neglected Tropical Diseases 2:1-8. Pongjaroenkit S, Jirajaroenrat K, Boonchauy C, Chanama U, Leetachewa S, Prapanthadara L, Ketterman AJ 2001. Genomic organization and putative promoters of highly conserved 149 glutahione S-transferases originating by alternative splicing in Anopheles dirus. Insect Biochem Mol Biol 31:75-85. Porcasi X, Catala SS, Hellac H, Scavuzzo MC, Gorla DE 2006 Infestation of rural houses by Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) in Southern Área of Gran Chaco in Argentina. Journal of Medical Entomology 43:1060-1067. Rajatileka S, Black WC, Assacedra-Rodriguez K, Trongtokit Y, Apiwathnasorn C, McCall PJ, Ranson H 2008. Development and application of a simple colorimetric assay reveals widespread distribution of sodium channel mutations in thai populations of Aedes aegypti. Acta Trop. 108: 54-57. Ranson H, Clauydianos C, Ortelli F, Abgrall C, Hemingway J, Sharakhova MV, Unger MF, Collins FH, Feyereinsen R 2002. Evolution of supergene families associated with insecticide resistance. Science 298:179-181. Ranson H, Jensen B. Vulule JM, Wang X, Hemingway J, Collins FH 2000. Identification of a point mutation in the voltage-gated sodium channel gene of Kenyn Anopheles gambiae associated with resistance to DDT and pyrethroids. Insect Mol Biol 9: 491-497. Rassi-JR A, Rassi A, Marin-Neto JA 2010. Chagas disease. Lancet 375: 1388-1402. Rawlins A, Wan JH 1995. Resistance in some Caribbean populations of Aedes aegypti to several insecticides. J Amer Mosq Control Assoc 11: 59-65. Reyes M, Angulo VM, Sandoval CM 2007. Efecto tóxico de beta-cipermetrina, deltametrina y fenitrotión en cepas de Triatoma dimidiata (Latreille, 1811) y Triatoma maculata (Erichson, 1848) (Hemiptera, Reduviidae). Biomédica 27 Richer W, Kengne P, Cortez MR, Perrineau MM, Cohuet A, Fontenille D & Noireau F 2007. Active dispersal by wild Triatoma infestans in the Bolivian Andes. Tropical Medicine and International Health 12:759-764. Riviero A, Véxilier J, Weill M, Read Af, Gandon S 2010. Insecticide control of vector-borne diseases: ehen is insecticide resistance a problem? Plos Pathog 6(8): e10010000. Roberts DR, Alecrim WD 1991. Response of Anopheles darlingi to spreying with DDT in Amazonas, Brazil. Bull of PAHO 25: 210-217. Rocha & Silva EO 1979. Profilaxia. In: Brener Z, Andrade Z. Trypanosoma cruzi e doença de Chagas, Guanabara Koogan. 463pp. Rodriguez MM, Bisset JA, Mila LH, Calvo E, Diaz C, Soca LA 1999. Levels of insecticide resistance and its mechanisms in a strain of Aedes aegypti of Santiago de Cuba. Rev Cubana Med Trop 51:83-88. Rogers DJS; Hay SI & Packer MJ 1996. Predicting the distribution of tse flies in West África using temporal Fourier processed meteorological satellite data. Ann Trop Med Parasitol 90: 225-241. Rojas de Arias A, Lehane MJ, Schofield CJ, Fournet A 2003. Comparative Evaluation of Pyrethroid Insecticide Formulations against Triatoma infestans (Klug): Residual Efficacy on Four Sunstrates. Mem Inst Oswaldo Cruz 98: 975-980. 150 Saavedra-Rodriguez K, Suarez AF, Salas IF, Strode C, Ranson H, Hemingway J, Black IV WC 2011. Transcription of detoxification genes after permethrin selection in the mosquito Aedes aegypti. Insect Mol Biol online: doi: 10.1111/j.1365-2583.2011.01113.x. Salgado AP, Pinto OS 1952. Levantamento dos triatomíneos domiciliários como trabalho preliminar a um programa profilático contra a doença de Chagas. Rev Bras Malariol Doencas Trop 4:88-96. Sandoval CM, Joya MI, Gutierrez R, Angulo VM, 2000. Cleptohaematophagy of the triatomine bug Belminus herreri. Med Vet Entomology 14: 100-101. Santo Orihuela PL, Vassena CV, Zerba EN, Picollo MI 2008. Relative Contribution of Monooxygenase and Esterase to Pyrethroid Resistance in Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) from Argentina and Bolivia. J Med Entomol 45:298-306. Santo Orihuela PL & Picollo MI 2011. Contribuition of general esterases to pyrethroid resistant Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) from Argentina and Bolivia. Acta Toxicol. Argent. 19 (1): 32-40. Satoh T, Hososkawa M 2006. Structure, function and regulation of carboxylesterases. Chem Bio Interact 162: 195-211. Schatzmayr HG 2000. Dengue situation by year 2000. Mem Inst Oswaldo Cruz 95: 179 – 181. Schofield C 1989. The evolution of insecticide resistance: have the insects won? Trends Ecol Evol 4: 336-340. Schofield CJ, 1994. Triatominae: Biología y Control. Eurocommunica Publications: United Kingdom, 80pp. Schofield CJ, Jannin J, Salvatella R 2006. The future of Chagas disease control. Trends Parasitol 22: 583-588. Schofield CJ; Diotaiuti L; Dujardin JP 1999. The process of domestication in Triatominae. Mem Inst Oswaldo Cruz 94: 375-378. Scholotterer C 2000. Evolutionary dynamics of microsatellite DNA. Chromossoma 109: 365- 371. Schuler TH, Martinez-Torres D, Thompson AJ, Denholm I, Devonshire AL, Duce IR, Willianson MS, 1998. Toxicological electrophysiological and molecular characterization of knockdown resistance to pyretrhoid insecticides in the diamond back moth Plutella xylostella (L.). Pestic Biochem Physiol 59: 169-192. Scott JG 1999. Cytochromes P450 and insecticide resistance. Insect Biochem Mol Biol 29: 757- 77. Sfara V, Zerba EM, Algozagay RA 2006. Toxicity of pyrethroids and repellency of diethyltoluamide in two deltamethrin-resistant colonies of Triatoma infestans Klug, 1834 (Hemiptera: Reduviidae). Mem. Inst. Oswaldo Cruz 101: 89 – 94. Shaw J, Lainson R, Friha H 1696. Considerações sobre a epidemiologia dos primeiros casos autóctones de doença de Chagas registrados em Belém, Pará, Brasil. Rev Saúde Públ 3: 153- 157. 151 Sheenan D, Meade G, Floley VM, Dowd CA 2001. Structure, function and evoltution of glutathione transferases: implications for classification of non-mammalian members of an ancient enzyme superfamiliy. Biochem J 360: 1-16. Shenone H, Zomosa E, Villarroel F, Rojas A, Alfaro E, Queiroz M 1972. Acción de 7 formulaciones de insecticidas sobre Triatoma infestans criados em laboratório. Biol Chileno Parasit 27:14-22. Sherlock I, Muniz TM 1975. Combate ao Panstrongylus megistus com o malathion concentrado. Rev Soc Bras Med Trop 9: 289-296. Sherlock I, Muniz TM, Guitton N 1976. A ação do malathion sobre os ovos de triatomíneos vetores de doença de Chagas. Rev Soc Bras Med Trop 10: 77-84. Silveira AC 2000. Profilaxia Doença de Chagas. In Brener Z, Andrade Z, Barral-Neto M, Trypanozoma cruzi e Doença de Chagas, Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2 ed, p.75-87. Silveira AC, Souza PC, Silveira Neto HV 1993. Importância de espécies secundárias de triatomíneos na transmissão domiciliar da doença de Chagas no Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba. In: XXIV Congresso da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, Fortaleza, p.200. Silveira AC, Vinhaes MC 1998. Doença de Chagas: aspectos epidemiológicos e de controle. Rev Soc Bras Med Trop 31: 50-60. Silvori JL, Casabé NB, Woode EJ 1997. Glutathione S-transferases in nom-vertebrates and mammals. Its role in detoxifying insecticides. Acta Bioqu Clin Latinoamericana, im press. Singh M, Silva E, Schulze S, Sinclair DA, Fitzpatrick HA, Honda BM 2000. Cloning and chracterization of a new theta-class glutathi8one-S-transferase (GST) gene, gst-3, from Drosophila melanogaster. Gene 247(1-2)167-73. Sonoda IV, Dias LS, Bezerra CM, Dias JPC, Romanha AJ, Diotaituti L 2010. Susceptibility of Triatoma brasiliensis from state of Ceará, Northeastern Brazil, to the pyrethroid deltamethrin. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 105: 348-352. Soreq H & Seidman S 2001. Acetylcholinesterase-new roles for an old actor. Nat Rev Neurosci 2:294-302. Souza AP, Jelicks LA, Tanowitz HB, Olivieri BP, Medeiros MM, Oliveira GM, Pires ARC, Santos AM, Araújo-Jorge TC 2010. The benefits of using selenium in the treatment of Chagas disease: prevention of right ventricle chamber dilatation and reversion of Trypanosoma cruzi- induced acute and chronic cardiomyopathy in mice. Mem Inst Oswaldo Cruz 105: 746-751. Stark JD, & Banks JE 2003. Population level effects of pesticides and other toxicants on arthropods. Annu Rev Entomol 48: 505-519. Strode C, Wondji CS, David JP, Hawkes NJ, Lumjuan N, Nelson DR, Drane DR, Karunaratne S, Hemingway J, Black WC E, Ranson H 2008. Genomic analysis of detoxification genes in the mosquito Aedes aegypti. Insect Biochem Mol Biol 38: 113-123. Sugiura M, Horibe Y, Kawada H, Tabaki M 2008. Insect spiracle as the main penetration route of pyrethroids. Pestic Biochem Physiol 91: 135-140. Tabashink BE, Roush RT 1990. Introduction. In: Roush RT, Tabashnik BE, editors. Pesticide resistance in arthropods. New York: Chapman and Hall, p.1-3. 152 Takahashi M, Yasutomi K 1987. Insecticidal resitance of Culex tritaeniorhynchus (Díptera: Culicidae) in Japan: genetics and mechanisms of resistance to organophosphorus insecticides. J Med Entomol 24: 595-603. Tautz D, Scholotterer C 1994. Simple sequences. Curr Op Gen Dev. 4: 832-837. Teixeira A 2007. Doença de Chagas e evolução. 1ed. Brasília, DF: Editora UNB- Finatec, p. 304. Toloza AC, Germano M, Cueto GM, Vassena C, Zerba E, Picollo MI 2008. Differencial patterns of insecticide resistance in eggs and first instar of Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) from Argentina and Bolivia. J Med Entomol 45: 421-426. Urbina JA & Docampo 2003. Specific chemotherapy of Chagas disease: controversies and advances. Trends in Parasitology 19: 495-501. Valle D, Montella IR, Ribeiro RA, Viana-Medeiros PF, Martins AJ, Lima JBP 2006. Metodologia para quantificação de atividade de enzimas relacionadas com a resistência a inseticida em Aedes aegypti/ Quantification methodology for enzyme activity related to insecticide resistance in Aedes aegypti. Publicação em parceria entre Fundação Oswaldo Cruz e Secretaria de Vigilancia em Saúde, Ministério da Saúde, Rio de Janeiro e Distrito Federal, Brasil, 128p. Vanessa CV, PicolIo MI. Monitoreo de resistencia a insecticidas en poblaciones de campo de Triatoma infestans y Rhodnius prolixus, insectos vectores de la efermedad de Chagas. 2003. [on line 12 maio de 2007]. Disponível em: http://www.sertox.com.ar/retel/default.htm Vassena CV, Cueto GM, Gonzalez-Audino P, Alzogaray RA, Zerba EN, PicolIo MI 2003. Prevalence and levels of permethrin resistance in Pediculus humanus capitis (De Geer) (Anoplura: Pediculidae) from Buenos Aires, Argentina. J Med Entomol 40: 447 – 450. Vassena CV, Picollo MI, Zerba EN 2000. Insecticida resistance in Brasilian Triatoma infestans and Venezuelan Rhodnius prolixus. Med Vet Entomol 14: 51-55. Vazquez-Prokopec GM, Cercere MC, Canale DM, Gurtler RE & Kitron U 2005. Spatiotemporal patterns of reinfestation by Triatoma guasayana (Hemiptera: Reduviidae) in a rural community of Northweastern Argentina. J Med Entomol 42: 1-10. Villate F, Bachmann TT 2002. How many genes encode cholinesterase in artropods? Pestic Biochem Physiol 73: 122 – 129. Villela MM, Souza JB, Mello VP, Azeredo BVM, Dias JCP 2005. Vigillância entomológica da doença de Chagas na região centro-oeste de Minas Gerais, Brasil, entre os anos de 2000 e 2003. Cad Saúde Pública 21: 878-886 Wanderley DMC, Carvalho ME, Silva RA, Rodrigues VLCC, Barbosa GL, Curado I. Programa de Controle da doença de Chagas. Boletim Epidemiol Paulista: [ftp://ftp.cve.saude.sp.gov.br/doc_tec/outros/suple1_sucen.pdf] 2006 [Citado em 19 Jul 2012] ISSN 1806-4272. 58p. Disponível em: Ware GW & Whitacre DM 2004. An introduction to insecticides (online): Minnesota. Disponível em: http://ipmworld.umn.edu/chapters/ware.htm. Acesso em 19 Jul 2012 Weill M, Berthomieu A, Berticat C, Lutfalla G, Negre V, Pasteur N, Phillips A, LeonettiI JP, Fort P, Raymond M 2004. Insecticide resistance: a silent base prediction. Curr Biol 14: 552-3. 153 Weill M, Duron O, Labbe, Berthomieu A 2003. La résistance Du moustique Culex pipiens aux insecticides 19: 1190-1192. Weill M, Fort P, Berthomieu A, Dubois MP, Pasteur N, Raymond M 2002. A novel acetylcholinesterase gene in mosquitoes codes for the insecticide target and is homologous to the ace gene in Drosophila. Proc Biol Sci 269:2007-16. Wheelock CE, Shan G, Ottea J 2005. Overview of carbowyesterases and their role in the metabolism of insecticides. J Pestic Sci 30: 75-83. Wood EJ, Picollo DE, Villar MI, Melgar F, Zerba EN 1982. Mode of action of organophosphorus insecticidas in Triatoma infestans. An Assoc Quim Argent 70: 801. World Health Organization 1981. Criteria and meaning of testes for determining the susceptibility or resistance of insects to insecticides. VBC/81.6. World Health Organization 1994. Taller sobre la evaluación de efecto insecticida sobre triatominos. In: Workshop on the insecticide effect evaluation in triatominos. Buenos Aires, Argentina. Acta Toxicol Argentina; 2 (1):29-33. World Health Organization 1991. Control of Chagas disease. WHO Technical Report Series 811, World Health Organization, Geneva. World Health Organization 2002. Control of Chagas disease. Second Report of the WHO Expert Committee. WHO Technical Report Series 905:109. World Health Organization 2006. Control of Chagas disease. Second Report of the WHO Expert Committee. WHO Technical Report Series Buenos Aires, p. 7. Wright S 1965. The interpretation of population structure by F-statistics with special regard to systems of mating. Evolution. 19:395-420. Xu Q, Liu H, Zhang L, Liu N 2005. Resistance in the mosquito, Culex quinquefasciatus, and possible mechanisms for resistance. Pesticiede and Management Science 61: 1096-1102. Zerba EN 2002. Evolución del control químico y resistencia a insecticidas en triatominos vectores de la enfermedad de Chagas In: XI Reunión de INCOSUR/ Chagas, Asunción, Paraguay. Zerba EN, Picollo MI 2002. Resistencia a insecticidas piretroides en Triatoma infestans. Centro de Investigaciones de Plagas e Insecticidas (CIPEIN) CITEFA-CONICET. Buenos Aires, Argentina. Zhai J, Robinson WH 1992. Measuring cypermethrin resistance in the german cochroach (Orthoptera:Blattellidae). J Econ Entomol; 85(2):348-351. Zhu Y, Strassmann JE, Queller DC 2000. Insertiona, substitutions, and the origin of microsatellites. Genetics Research 76:227-236. Zlotkin E 1999. The insect voltage – gated sodium channel as targets for insecticides. Annu Rev Entomol 44: 429-55. 154 Anexos 155 ANEXO 1. Relatos na literatura de resistência de triatomíneos a inseticida. Espécie País Município/Localidade Inseticida DL50 RR RR50 RR90 Referência LRS/CIPEIN deltametrina 0,1 (0,12 - 0,15) - - - Germano et al., 2010 T. infestans Argentina Salta/Salvador Mazza deltametrina 31,1 (12,9 - 84,7) 133,1 - - Germano et al., 2010 Salta/Banda Sur deltametrina 5,1 (3,07 - 8,70) 39 - - Germano et al., 2010 Salta/Corralito deltametrina 0,02 (0,01 - 0,03) 0,1 - - Germano et al., 2010 Salta/San Carlos deltametrina 1,1 (0,51 - 2,54) 8,4 - - Germano et al., 2010 Catamarca/Palo Blanco deltametrina 0,6 (0,07 - 0,69) 4,5 - - Germano et al., 2010 Santiago del Estero/Capital deltametrina 0,5 (0,27 - 0,80) 3,8 - - Germano et al., 2010 Santiago del Estero/La Noria deltametrina 0,04 (0,02 - 0,05) 0,3 - - Germano et al., 2010 Chaco/Taco Pozo deltametrina 0,5 (0,22 - 0,80) 3,7 - - Germano et al., 2010 Santa Fé/El Nocherco deltametrina 0,1 (0,11 - 0,14) 0,9 - - Germano et al., 2010 Bolivia Tarija/T.Nuevas deltametrina 70,1 (26,63 - 1.240,21) 541,6 - - Germano et al., 2010 Tarija/V.El Carmen deltametrina 56,7 (24,47 - 313,15) 438 - - Germano et al., 2010 Tarija/El Palmar deltametrina 33,2 (23,40 - 53,80) 299,8 - - Germano et al., 2010 Tarija/Villamonte deltametrina 32,0 (16,45 - 128,06) 274,4 - - Germano et al., 2010 Paraguai Boqueron/Jerico deltametrina 0,5 (0,01 - 1,59) 3,7 - - Germano et al., 2010 T.infestans LRS/CIPEIN fipronil 2,1 (1,28 - 3,46) - - - Germano et al., 2010 Argentina Salta/Salvador Mazza fipronil 4,9 (3,25 - 5,61) 1,9 - - Germano et al., 2010 Salta/Banda Sur fipronil 6,2 (4,36 - 8,98) 3 - - Germano et al., 2010 Salta/San Carlos fipronil 4,9 (2,34 - 12,99) 2,2 - - Germano et al., 2010 Salta/Corralito fipronil 2,3 (0,36 - 7,52) 1,09 - - Germano et al., 2010 Santiago del Estero/Capital fipronil 4,5 (2,31 - 9,90) 2 - - Germano et al., 2010 Bolívia Tarija/ T. Nuevas fipronil 0,4 (0,20 – 0,60) 0,19 - - Germano et al., 2010 Tarija / V. El Carmen fipronil 205,9 (148,0 – 267,1) 92,7 - - Germano et al., 2010 Tarija/El Palmar fipronil 123,1 (50,7 - 215,3) 55,5 - - Germano et al., 2010 156 Cont. ANEXO 1. Relatos na literatura de resistência de triatomíneos a inseticida. Espécie País Município/Localidade Inseticida DL50 RR RR50 RR90 Referência LRS/CIPEIN deltametrina 0,13 (0,12 - 0,15) - - - Toloza et al., 2008 T. infestans Argentina Salvador Mazza deltametrina 31,1 (12,9 - 84,7) 133,1 - - Toloza et al., 2008 Bolivia Mataral deltametrina 2,25 (0,28 - 4,80) 17,38 - - Toloza et al., 2008 Sucre deltametrina 4,05 (2,24 - 6,15) 31,27 - - Toloza et al., 2008 Yacuiba deltametrina 28,42 (18,30 - 53,77) 154,4 - - Toloza et al., 2008 LRS/CIPEIN lambda-cialotrina 0,11 (0,09 - 0,56) - - - Toloza et al., 2008 T. infestans Argentina Salvador Mazza lambda-cialotrina 19,6 (6,6 - 58,8) 106,2 - - Toloza et al., 2008 Bolivia Mataral lambda-cialotrina 0,53 (0,43 - 0,64) 2,9 - - Toloza et al., 2008 Sucre lambda-cialotrina 0,51 (0,38 - 0,65) 2,8 - - Toloza et al., 2008 LRS/CIPEIN fipronil 2,12 (1,28 - 3,46) - - - Toloza et al., 2008 T. infestans Argentina Salvador Mazza fipronil 4,96 (3,25 - 5,61) 1,9 - - Toloza et al., 2008 Bolivia Mataral fipronil 859,8 (675,8 - 1099,6) 368,8 - - Toloza et al., 2008 Sucre fipronil 1301,2 (968,5 - 1959,3) 585,5 - - Toloza et al., 2008 LRS/CIPEIN fenitrotion 21,6 (5,3 - 67,9) - - - Toloza et al., 2008 T. infestans Argentina Salvador Mazza fenitrotion 23,4 (19,8 - 27,8) 1,39 - - Toloza et al., 2008 Bolivia Mataral fenitrotion 15,32 (9,6 - 22,0) 0,72 - - Toloza et al., 2008 Sucre fenitrotion 21,89 (19,5 - 24,4) 1,03 - - Toloza et al., 2008 LRS/CIPEIN deltametrina 0,999 (0,072 - 0,137) - - - Gonzales Audino et al., 2004 T. infestans Argentina Catamarca deltametrina 0,266 (0,181 - 0,385) 2,679 - - Gonzales Audino et al., 2004 Mendonza deltametrina 0,375 (0,180 - 0,773) 3,771 - - Gonzales Audino et al., 2004 San Luis deltametrina 0,199 (0,141 - 0,269) 2,000 - - Gonzales Audino et al., 2004 Salta deltametrina 0,784 (0,553 - 1,077) 7,891 - - Gonzales Audino et al., 2004 LRS/CIPEIN deltametrina 0,13 ( 0,12 - 0,15) - - - Pícollo et al., 2005 T. infestans Argentina Salta/El Choro deltametrina 12,8 (11,0 - 14,9) 99,0 - - Pícollo et al., 2005 157 Cont. ANEXO 1. Relatos na literatura de resistência de triatomíneos a inseticida. Espécie País Município/Localidade Inseticida DL50 RR RR50 RR90 Referência T. infestans Argentina Salta/La Toma deltametrina 11,3 (6,1 - 23,3) 86,9 - - Pícollo et al., 2005 Salta/El Sauzal deltametrina 6,5 (2,3 - 19,4) 50,5 - - Pícollo et al., 2005 Salta/Salvador Mazza deltametrina 31,1 (12,9 - 84,7) 133,1 - - Pícollo et al., 2005 T. infestans Argentina LRS/CIPEIN betacipermetrina 0,24 (0,11 - 0,55) - - - Pícollo et al., 2005 Salta/El Choro betacipermetrina 106,5 (73,6 - 164,9) 451,2 - - Pícollo et al., 2005 Salta/La Toma betacipermetrina 63,7 (46,9 - 88,5) 270,1 - - Pícollo et al., 2005 Salta/El Sauzal betacipermetrina 62,2 (35,2 - 118,2) 263,5 - - Pícollo et al., 2005 Salta/Salvador Mazza betacipermetrina 72,8 (62,2 - 87,1) 308,4 - - Pícollo et al., 2005 LRS/CIPEIN beta ciflutrina 0,46 (0,09 - 1,26) - - - Pícollo et al., 2005 T. infestans Argentina Salta/El Choro beta ciflutrina 27,1 (7,6 - 70,7) 171,7 - - Pícollo et al., 2005 Salta/La Toma beta ciflutrina 23,4 (11,9 - 43,5) 148,4 - - Pícollo et al., 2005 Salta/El Sauzal beta ciflutrina 9,5 (5,4 - 16,4) 60,3 - - Pícollo et al., 2005 Salta/Salvador Mazza beta ciflutrina 105,1 (43,0 - 352,2) 667,6 - - Pícollo et al., 2005 LRS/CIPEIN lambda-cialotrina 0,11 (0,09 - 0,56) - - - Pícollo et al., 2005 T. infestans Argentina Salta/El Choro lambda-cialotrina 53,3 (25,7 - 123,9) 288,7 - - Pícollo et al., 2005 Salta/La Toma lambda-cialotrina 26,2 (9,3 - 75,7) 141,7 - - Pícollo et al., 2005 Salta/El Sauzal lambda-cialotrina 11,9 (2,9 - 55,6) 64,5 - - Pícollo et al., 2005 Salta/Salvador Mazza lambda-cialotrina 19,6 (6,6 - 58,8) 106,2 - - Pícollo et al., 2005 LRS/CIPEIN fenitrotion 21,6 (5,3 - 67,9) - - - Pícollo et al., 2005 T. infestans Argentina Salta/El Choro fenitrotion 27,0 (1,8 - 69,3) 1,29 - - Pícollo et al., 2005 Salta/La Toma fenitrotion 25,7 (21,9 - 30,2) 1,54 - - Pícollo et al., 2005 Salta/El Sauzal fenitrotion 36,1 (31,8 - 41,1) 1,78 - - Pícollo et al., 2005 Salta/Salvador Mazza fenitrotion 23,4 (19,8 - 27,8) 1,39 - - Pícollo et al., 2005 158 Cont. ANEXO 1. Relatos na literatura de resistência de triatomíneos a inseticida. Espécie País Município/Localidade Inseticida DL50 RR RR50 RR90 Referência LRS/CIPEIN deltametrina 0,10 (0,06 - 0,16) - - - Vassena & Picollo, 2003 T. infestans Argentina San Juan deltametrina 0,18 (0,14 - 0,24) 1,8 - - Vassena & Picollo, 2003 Mendonza deltametrina 0,38 (0,20 - 0,66) 3,8 - - Vassena & Picollo, 2003 Catamarca deltametrina 0,26 (0,14 - 0,52) 2,6 - - Vassena & Picollo, 2003 Salta deltametrina 0,85 (0,13 - 5,54) 5,6 - - Vassena & Picollo, 2003 San Luis deltametrina 0,30 (0,24 - 0,34) 3 - - Vassena & Picollo, 2003 LRS/CIPEIN deltametrina 0,010 (0,007 - 0,016) - - - Vassena & Picollo, 2003 R. prolixus Venezuela Carabobo deltametrina 0,114 (0,070 - 0,170) 11,4 - - Vassena & Picollo, 2003 R. prolixus Venezuela Trujillo deltametrina 0,034 (0,025 - 0,048) 3,4 - - Vassena & Picollo, 2003 T. dimidiata Colombia Santander/San Joaquin - NI deltametrina 0,44 (0,38 - 0,51) - - - Reyes et al., 2007 Santander/San Joaquin - NI betacipermetrina 0,46 (0,39 - 0,52) - - - Reyes et al., 2007 Santander/San Joaquin - NI fenitrotion 16,45 (15,22 - 17,64) - - - Reyes et al., 2007 Santander/San Joaquin - NV deltametrina 510,72 (279,49 - 406,23) - - - Reyes et al., 2007 Santander/San Joaquin - NV betacipermetrina 1623,59 (1322,36 - 1894,34) - - - Reyes et al., 2007 Santander/San Joaquin - NV fenitrotion 838,91 (791,36 - 887,51) - - - Reyes et al., 2007 T. maculata Colombia Santander/San José de Miranda - NI deltametrina 0,07 (0,05 - 0,09) - - - Reyes et al., 2007 Santander/San José de Miranda - NI betacipermetrina 0,05 (0,05 - 0,07) - - - Reyes et al., 2007 Santander/San José de Miranda - NI fenitrotion 4,12 (3,56 - 4,78) - - - Reyes et al., 2007 T. infestans Bolivia LRS/CIPEIN CIPEIN 0,24 (0,22 - 0,26) - - - Lardeux et al., 2010 Chuquisaca/Barrio Itaty deltametrina 67,33 (49,02 -96,83) - 277 735 Lardeux et al., 2010 Chuquisaca/Icla deltametrina 1,69 (1,35 - 2,00) - 6,9 - Lardeux et al., 2010 Chuquisaca / Jatum Cka Cka deltametrina 1,29 (0,98 - 1,55) - 5,2 - Lardeux et al., 2010 Chuquisaca/ Corso deltametrina 1,44 (1,30 - 1,57) - 5,9 - Lardeux et al., 2010 Chuquisaca/ El Chaco deltametrina 2,04 (1,73 - 2,42) - 8,5 - Lardeux et al., 2010 159 Cont. ANEXO 1. Relatos na literatura de resistência de triatomíneos a inseticida. Espécie País Município/Localidade Inseticida DL50 RR RR50 RR90 Referência T. infestans Bolivia Chuquisaca/ Machareti deltametrina 8,07 (4,27 - 11,17) - 33 - Lardeux et al., 2010 Chuquisaca/ Rodeo Porvenir deltametrina 2,65 (2,31 - 3,03) - 11 - Lardeux et al., 2010 Chuquisaca/ Pajcha deltametrina 5,08 (4,25 - 6,37) - 21 - Lardeux et al., 2010 Chuquisaca/ Sotomayor deltametrina 3,32 (2,09 - 4,05) - 14 - Lardeux et al., 2010 Chuquisaca/ Tambo Ackachilla deltametrina 1,26 (1,02 - 1,47) - 5 - Lardeux et al., 2010 Chuquisaca/ Tambo Atajo deltametrina 1,30 (1,01 - 1,54) - 5 - Lardeux et al., 2010 Chuquisaca/ Tentami deltametrina 78,44 (61,76 - 103,83) - 323 936 Lardeux et al., 2010 Chuquisaca/Tiguipa Estación (intra) deltametrina 55,98 (34,78 - 90,43) - 230 - Lardeux et al., 2010 Chuquisaca/Tiguipa Estación (peri) deltametrina 34,47 (27,13 - 43,43) - 142 307 Lardeux et al., 2010 Chuquisaca/ Tihuacana deltametrina 3,27 (2,14 - 4,07) - 13 - Lardeux et al., 2010 Cochabamba/ Mataral deltametrina 3,35 (2,88 - 3,78) - 14 - Lardeux et al., 2010 La Paz/ Colopampa deltametrina 2,31 (1,84 - 2,73) - 9,5 - Lardeux et al., 2010 La Paz/ Parani deltametrina 0,91 (0,80 - 1,04) - 3,7 - Lardeux et al., 2010 Tarija/ Estacion Caiza deltametrina 49,46 (39,50 - 60,06) - 204 924 Lardeux et al., 2010 Tarija/Quinchao deltametrina 31,70 (21,19 - 54,45) - 131 530 Lardeux et al., 2010 Tarija/ Saladito deltametrina 23,34 (16,72 - 35,51) - 96 274 Lardeux et al., 2010 Tarija/ San Antonio deltametrina 76,37 (62,45 - 96,95) - 315 1157 Lardeux et al., 2010 Tarija/San Francisco del Inti deltametrina 7,41 (4,61 - 10,69) - 30 189 Lardeux et al., 2010 Tarija/Sausal deltametrina 119,12 (87,00 - 189,04) - 491 1170 Lardeux et al., 2010 Tarija/ Terra Nuevas deltametrina 35,82 (30,34 - 42,09) - 148 - Lardeux et al., 2010 Tarija/Villa El Carmen deltametrina 52,00 (41,35 - 64,00) - 214 - Lardeux et al., 2010 Tarija/Yuchan deltametrina 8,10 (6,73 - 9,57) - 33 405 Lardeux et al., 2010 LRS/CIPEIN CIPEIN 11,15 (10,41 - 11,93) - - - Lardeux et al., 2010 La Paz/Los Sotos bendiocarb 17,67 (15,86 – 19,70) - 1,6 - Lardeux et al., 2010 160 Cont. ANEXO 1. Relatos na literatura de resistência de triatomíneos a inseticida. Espécie País Município/Localidade Inseticida DL50 RR RR50 RR90 Referência T. infestans Bolivia Tarija/Barrial bendiocarb 19,56 (18,56 - 20,66) - 1,8 - Lardeux et al., 2010 Tarija/ Barrety Chaco bendiocarb 15,18 (12,56 - 17,00) - 1,4 - Lardeux et al., 2010 Tarija/ Estacion Caiza bendiocarb 17,73 (16,54 - 18,83) - 1,6 - Lardeux et al., 2010 Tarija/San Francisco del Inti bendiocarb 18,80 (8,54 - 41,32) - 1,7 3,1 Lardeux et al., 2010 Tarija/T.Nuevas bendiocarb 20,82 (18,48 - 23,46) - 1,7 2,5 Lardeux et al., 2010 Tarija/Villa Primavera bendiocarb 20,70 (19,28 - 22,08) - 1,8 - Lardeux et al., 2010 Tarija/Yuchan bendiocarb 16,52 (14,30 - 19,09) - 1,5 2,1 Lardeux et al., 2010 Tarija/ La Grampa malation 38,81 (33,62 - 45,85) - 2,2 3,4 Lardeux et al., 2010 Tarija/ Laime malation 31,14 (28,47 - 35,13) - 1,8 - Lardeux et al., 2010 Tarija/Yuchan malation 26,67 (26,09 - 27,29) - 1,5 - Lardeux et al., 2010 T. brasiliensis Brasil LRS/CIPEIN CIPEIN 0,19 (O,16 - 0,23) - - - Sonoda et al., 2010 Tauá/ Cachoeira do Julio (Intra) deltametrina 0,33 (0,29 - 0,38) 1,74 - - Sonoda et al., 2010 Tauá/ C. das Pedrosas (Intra) deltametrina 0,22 (0,18 - 0,26) 1,16 - - Sonoda et al., 2010 Tauá/ Dormideira (Intra) deltametrina 0,34 (0,27 - 0,39) 1,79 - - Sonoda et al., 2010 Tauá/Mutuca (Intra) deltametrina 0,30 (0,26 - 0,39) 1,58 - - Sonoda et al., 2010 Tauá/ C. das Pedrosas (Peri) deltametrina 0,24 (0,20 - 0,30) 1,26 - - Sonoda et al., 2010 Tauá/M. Nova do Tomás (Peri) deltametrina 0,33 (0,27 - 0,44) 1,74 - - Sonoda et al., 2010 Tauá/C. das Pedrosas (Silvestre) deltametrina 0,19 (0,17 - 0,22) 1,00 - - Sonoda et al., 2010 T. infestans Argentina LRS/CIPEIN deltametrina 0,13 (O,12 - 0,15) - - - Santo Orihuela et al., 2008 Salta/El Choro deltametrina 12,80 (11,00 - 14,86) 99 - - Santo Orihuela et al., 2008 Salta/La Toma deltametrina 11,27 (6,06 - 23,30) 86,9 - - Santo Orihuela et al., 2008 Salta/El Sauzal deltametrina 6,54 (2,26 - 19,39) 50,5 - - Santo Orihuela et al., 2008 La Rioja/ C. Esquinas deltametrina 1,83 (1,01 - 3,3) 14,09 - - Santo Orihuela et al., 2008 La Rioja/ San Antonio deltametrina 2,79 (1,53 - 5,16) 21,09 - - Santo Orihuela et al., 2008 161 Cont. ANEXO 1. Relatos na literatura de resistência de triatomíneos a inseticida. Espécie País Município/Localidade Inseticida DL50 RR RR50 RR90 Referência T. infestans Bolivia Yacuiba deltametrina 28,42 (18,30 - 53,77) 154,4 - - Santo Orihuela et al., 2008 LRS/CIPEIN fenitrotion 21,60 (5,3 - 67,93) - - - Santo Orihuela et al., 2008 Salta/El Choro fenitrotion 26,97 (1,81 - 69,33) 1,29 - - Santo Orihuela et al., 2008 Argentina Salta/La Toma fenitrotion 25,72 (21,88 - 30,24) 1,54 - - Santo Orihuela et al., 2008 Salta/El Sauzal fenitrotion 36,11 (31,76 - 41,06) 1,78 - - Santo Orihuela et al., 2008 La Rioja/ C. Esquinas fenitrotion 4,02 (1,08 - 11,14) 0,19 - - Santo Orihuela et al., 2008 La Rioja/ San Antonio fenitrotion 3,69 (2,30 - 55,98) 0,17 - - Santo Orihuela et al., 2008 Bolivia Yacuiba fenitrotion 17,03 (12,82 - 22,05) 0,79 - - Santo Orihuela et al., 2008 LRS/CIPEIN fipronil 2,12 (1,28 - 3.46) - - - Santo Orihuela et al., 2008 Salta/El Choro fipronil 4,02 (2,84 - 5,68) 1,88 - - Santo Orihuela et al., 2008 Salta/La Toma fipronil 3,44 (2,46 - 4,80) 1,40 - - Santo Orihuela et al., 2008 Argentina Salta/El Sauzal fipronil 4,27 (3,25 - 5,61) 1,80 - - Santo Orihuela et al., 2008 La Rioja/ C. Esquinas fipronil 2,57 (1,84 - 2,89) 1,16 - - Santo Orihuela et al., 2008 La Rioja/ San Antonio fipronil 0,54 (0,42 - 061) 0,22 - - Santo Orihuela et al., 2008 Bolivia Yacuiba fipronil 3,31 (1,33 - 8,22) 1,46 - - Santo Orihuela et al., 2008 LRS/CIPEIN bendiocarb 1,45 (1,16 - 1,77) - - - Santo Orihuela et al., 2008 Salta/El Choro bendiocarb 1,16 (0,44 - 3,01) 0,67 - - Santo Orihuela et al., 2008 Salta/La Toma bendiocarb 1,71 (1,45 - 2,03) 1,03 - - Santo Orihuela et al., 2008 Argentina Salta/El Sauzal bendiocarb 1,16 (0,99 - 1,59) 0,50 - - Santo Orihuela et al., 2008 T. infestans Argentina La Rioja/ C. Esquinas bendiocarb 0,59 (0,46 - 0,75) 0,45 - - Santo Orihuela et al., 2008 La Rioja/ San Antonio bendiocarb 1,66 (1,42 - 1,96) 1,02 - - Santo Orihuela et al., 2008 Bolivia Yacuiba bendiocarb 1,60 (1,35 - 1,89) 1,02 - - Santo Orihuela et al., 2008 T. infestans Argentina Santiago del Estero - NI betacipermetrina 0,4 (0,3 - 0,7) - - - Zerba et al., 1997 Santiago del Estero - NV betacipermetrina 290 (130 - 650) - - - Zerba et al., 1997 162 Cont. ANEXO 1. Relatos na literatura de resistência de triatomíneos a inseticida. Espécie País Município/Localidade Inseticida DL50 RR RR50 RR90 Referência T. infestans Argentina Santiago del Estero - Adulto betacipermetrina 47 (33 - 76) - - - Zerba et al., 1997 Santiago del Estero - NI deltametrina 1,3 (0,9 - 1,8) - - - Zerba et al., 1997 Santiago del Estero - NV deltametrina 550 (310 - 990) - - - Zerba et al., 1997 Santiago del Estero - Adulto deltametrina 30 (25 - 35) - - - Zerba et al., 1997 T. infestans Brasil LRS/CIPEIN deltametrina 0,10 (0,06 - 0,16) - - - Vassena et al., 2000 Rio Grande do Sul deltametrina 0,70 (0,52 - 1,04) 7 - - Vassena et al., 2000 LRS/CIPEIN betacipermetrina 0,26 (0,20 - 0,34) - - - Vassena et al., 2000 Rio Grande do Sul betacipermetrina 0,24 (0,18 - 0,32) 0,92 - - Vassena et al., 2000 LRS/CIPEIN beta ciflutrina 0,10 (0,04 0 0,22) - - - Vassena et al., 2000 Rio Grande do Sul beta ciflutrina 0,36 (0,24 - 0,54) 3,6 - - Vassena et al., 2000 LRS/CIPEIN lambdacialotrina 0,16 (0,06 - 0,26) - - - Vassena et al., 2000 Rio Grande do Sul lambdacialotrina 0,28 (0,14 - 0,52) 1,75 - - Vassena et al., 2000 LRS/CIPEIN cipermetrina 0,40 (0,08 - 0,68) - - - Vassena et al., 2000 Rio Grande do Sul cipermetrina 1,34 (0,98 - 1,82) 3,35 - - Vassena et al., 2000 R. prolixus Venezuela LRS/CIPEIN deltametrina 0.010 (0,007 - 0,016) - - - Vassena et al., 2000 Carabobo deltametrina 0,114 (0,070 - 0,170) 11,4 - - Vassena et al., 2000 LRS/CIPEIN betacipermetrina 0,036 (0,025 0 0,054) - - - Vassena et al., 2000 Carabobo betacipermetrina 0,286 (0,0153 - 0,686) 7,9 - - Vassena et al., 2000 LRS/CIPEIN beta ciflutrina 0,021 (0,004 - 0,081) - - - Vassena et al., 2000 Carabobo beta ciflutrina 0,142 (0,093 - 0,215) 6,8 - - Vassena et al., 2000 LRS/CIPEIN lambdacialotrina 0,020 (0,011 - 0,029) - - - Vassena et al., 2000 Carabobo lambdacialotrina 0,091 (0,052 - 0,274) 4,5 - - Vassena et al., 2000 R. prolixus Venezuela LRS/CIPEIN cipermetrina 0,080 (0,050 - 0,130) - - - Vassena et al., 2000 Carabobo cipermetrina 0,990 (0,570 - 1,710) 12,4 - - Vassena et al., 2000 163 Cont. ANEXO 1. Relatos na literatura de resistência de triatomíneos a inseticida. Espécie País Município/Localidade Inseticida DL50 RR RR50 RR90 Referência R. prolixus Venezuela LRS/CIPEIN dieldrin 8,47 (5,77 - 12,07) - - - Vassena et al., 2000 Carabobo dieldrin 23,34 (20,09 - 29,37) 3 - - Vassena et al., 2000 T. infestans Bolivia LRS/CIPEIN deltametrina 0,13 (0,11 - 0,15) - - - Roca Azevedo et al., 2011 Cochabamba/ Alquile/ Mataral - D deltametrina 2,25 (0,28 - 4,80) 17,38 - Roca Azevedo et al., 2011 Cochabamba/Alquile/Mataral - S deltametrina 1,53 (0,53 - 3,34) 11,90 - - Roca Azevedo et al., 2011 Potosi/ Toro Toro/ Kirus Mayu - S deltametrina 0,95 (0,49 - 1,66) 7,35 - - Roca Azevedo et al., 2011 Cochabamba/ 20 de Outubro - S deltametrina 0,88 (0,08 - 1,84) 6,80 - - Roca Azevedo et al., 2011 Cochabamba/ Omereque/ Ilicuni - S deltametrina 0,25 (0,14 - 0,39) 1,92 - - Roca Azevedo et al., 2011 LRS/CIPEIN fipronil 2,0 (1,6 - 3.2) - - - Roca Azevedo et al., 2011 Cochabamba/ Alquile/ Mataral D fipronil 296,0 (160,2 - 414,8) 139,2 - - Roca Azevedo et al., 2011 Cochabamba/Alquile/Mataral S fipronil 49,8 (10,2 - 256,0) 23,4 - - Roca Azevedo et al., 2011 Potosi/ Toro Toro/ Kirus Mayu - S fipronil 96,86 (32,0 - 332,0) 45,6 - - Roca Azevedo et al., 2011 Cochabamba/ 20 de Outubro - S fipronil 1,0 ( 0,5 - 2,1) 0,5 - - Roca Azevedo et al., 2011 Cochabamba/ Omereque/ Ilicuni - S fipronil 11,8 (8,6 - 17,0) 5,5 - - Roca Azevedo et al., 2011 T. infestans Argentina LRS/CIPEIN deltametrina 0,1 (0,1 - 0,3) - - Sfara et al., 2006 El Choro deltametrina >1,400 99,0 - - Sfara et al., 2006 La Toma deltametrina >1,400 86,9 - - Sfara et al., 2006 LRS/CIPEIN lambdacialotrina 0,3 (0,2 - 0,3) - - Sfara et al., 2006 El Choro lambdacialotrina 23,2 (17,0 - 32,9) 288,7 - - Sfara et al., 2006 La Toma lambdacialotrina 14,4 141,7 - - Sfara et al., 2006 LRS/CIPEIN tetametrina 270 (133,6 - 404,9) - - Sfara et al., 2006 El Choro tetametrina > 1,400 >5,2 - - Sfara et al., 2006 La Toma tetametrina > 1,400 > 5,2 - - Sfara et al., 2006 164 Cont. ANEXO 1. Relatos na literatura de resistência de triatomíneos a inseticida. Espécie País Município/Localidade Inseticida DL50 RR RR50 RR95 Referência T. sordida Brasil LRS - Uberaba/ MG deltametrina 0,0654 (0,0528 - 0,0813) - - - Pessoa, 2008 Monjolos / Fazenda Cipó deltametrina 0,1731 (0,1379 – 0,2254) - 2,6 3,8 Pessoa, 2008 Monjolos / P. Tamboril deltametrina 0,2991 (0,2518 – 0,3689) - 4,6 4,7 Pessoa, 2008 Presidente Juscelino/ S. Mandioca deltametrina 0,3609 (0,2984 – 0,4385) 5,5 5,4 Pessoa, 2008 Buenópolis/ P. Cerrado deltametrina 0,3609 (0,2984 – 0,4385) - 3,6 4,0 Pessoa, 2008 Monte Azul / F. Brejinho deltametrina 0,2188 (0,1447 – 0,2784) - 3,3 3,7 Pessoa, 2008 Monte Azul / F. Tábuas deltametrina 0,2279 (0,2043 – 0,2546) - 3,5 1,8 Pessoa, 2008 Coração de Jesus/ F. Jatobá deltametrina 0,2644 (0,2206 – 0,3367) - 4,0 4,1 Pessoa, 2008 Coração de Jesus/ F. Jat. Cima deltametrina 0,2369 (0,1827 – 0,2926) - 3,6 4,4 Pessoa, 2008 Coração de Jesus/ F. Jataí deltametrina 0,1905 (0,1495 – 0,2491) - 2,9 4,2 Pessoa, 2008 Coração de Jesus/ F. Domingada deltametrina 0,3551 (0,2972 – 0,4563) - 5,4 5,2 Pessoa, 2008 Coração de Jesus/ F. Barriguda deltametrina 0,4442 (0,3814 – 0,5252) - 6,5 5,0 Pessoa, 2008 Bocaiuva/ F. Félix deltametrina 0,2908 (0,2385 – 0,3426) - 4,4 3,9 Pessoa, 2008 Bocaiuva/ F. Félix I deltametrina 0,4034 (0,3228 – 0,4975) - 6,2 6,2 Pessoa, 2008 Bocaiuva/ F. Chaves deltametrina 0,3814 (0,3318 – 0,4543) - 5,8 3,9 Pessoa, 2008 Panstongylus megistus Brasil LRS - Sento Sé/ Pov. Quixadá deltametrina 1,02 (0,95 – 1,11) - 1,00 1,00 Obara, 2010 Serranópolis do Iguaçu deltametrina 2,01 (1,90 – 2,13) - 1,97 1,19 Obara, 2010 T. brasiliensis Brasil LRS – Umari/CE deltametrina 0,68 (0,64 – 0,73) - 1,00 1,00 Obara, 2010 Itaporanga/ F. Vaca Morta/ deltametrina 0,68 (0,64 – 0,78) - 1,00 1,27 Obara, 2010 Mãe d´Água/ F. Cacimba de Pedra deltametrina 0,83 (0,75 – 0,90) - 1,21 1,65 Obara, 2010 Monteiro/ F. Olho d´Água das Dores deltametrina 0,82 (0,76 – 0,88) - 1,20 1,18 Obara, 2010 Piancó/ S. Junco de Cima deltametrina 0,81 (0,69 – 0,93) - 1,19 1,85 Obara, 2010 Santa Cruz / S. Goiabeira deltametrina 0,97 (0,89 – 1,04) - 1,41 1,80 Obara, 2010 São Francisco/ S. São Luiz deltametrina 0,74 (0,69 – 0,79) - 1,09 1,03 Obara, 2010 São José das Espinharas/ F. Laranjeiras deltametrina 0,73 (0,67 – 0,78) - 1,06 1,02 Obara, 2010 165 Cont. ANEXO 1. Relatos na literatura de resistência de triatomíneos a inseticida Espécie País Município/Localidade Inseticida DL50 RR RR50 RR95 Referência T. brasiliensis Brasil Lagoa Grande/ F. Morada Nova deltametrina 1,10 (0,99 – 1,22) - 1,61 2,15 Obara, 2010 Petrolina/ F. Lagoas e Pov. Capim deltametrina 0,79 (0,71 – 0,86) - 1,16 1,63 Obara, 2010 Salgueiro/ S. Santana e Quixabeiras deltametrina 0,77 (0,69 – 0,84) - 1,13 1,57 Obara, 2010 Serra Talhada/ F. Jardim e Nova deltametrina 0,85 ( 0,77 – 0,95) - 1,25 1,65 Obara, 2010 Oeiras/ S. Pau de Chapada deltametrina 1,12 (1,01 – 1,23) - 1,66 2,85 Obara, 2010 Oeiras/ S. Tabocas deltametrina 1,20 (1,08 – 1,32 - 1,75 2,88 Obara, 2010 Oeiras/ S. Formosa II deltametrina 1,33 (1,20 – 1,46) - 1,94 3,43 Obara, 2010 Oeiras/ S. Sapé deltametrina 1,48 (1,38 – 1,61) - 2,17 2,61 Obara, 2010 Caicó/ S. Pedra do Sino e F. Laginha deltametrina 0,85 (0,76 – 0,93) - 1,24 1,77 Obara, 2010 T. sordida Brasil LRS/ Cordeiros deltametrina 0,58 (0,54 – 0,63) - 1,00 1,00 Obara, 2010 Cafarnaum/ Pov. Boa Vista do Canal deltametrina 0,77 (0,72 – 0,83) - 1,32 1,33 Obara, 2010 Carinhanha/ F. Micaela deltametrina 0,81 (0,74 – 0,87) - 1,38 1,71 Obara, 2010 Malhada/ F. Serra do João Alves deltametrina 1,46 (1,33 – 1,58) - 2,49 3,41 Obara, 2010 Mucugê/ F. Bonfim e Lage deltametrina 1,59 (1,44 – 1,74) - 2,71 3,40 Obara, 2010 Nova Redenção/ F. Alto Verde deltametrina 0,86 (0,80 – 0,93) - 1,48 1,71 Obara, 2010 Palmeiras/ F. Rio Preto e P. Pecuária deltametrina 1,02 (0,90 – 1,15) - 1,75 2,21 Obara, 2010 Rio das Contas/ F. Boa Vista deltametrina 1,16 (1,10 – 1,23) - 1,99 1,66 Obara, 2010 Xique Xique/ A. Roçado I e Gado Bravo deltametrina 0,61 (0,56 – 0,66) - 1,05 1,04 Obara, 2010 Firminópolis/ Pov. Córrego Seco e Diamantina deltametrina 0,70 (0,63 – 0,78) - 1,20 1,75 Obara, 2010 Guarani do Goiás/ F. Samambaia e Barreirão deltametrina 0,75 (0,70 – 0,80) - 1,29 1,13 Obara, 2010 Posse/ F. Emburana deltametrina 0,86 (0,76 – 0,96) - 1,48 2,36 Obara, 2010 São Luis Montes Belos/ F. Empedrado I deltametrina 0,71 (0,65 – 0,76) - 1,21 1,29 Obara, 2010 Poxoréo/ F. Modelo e S. Santa Fé deltametrina 0,64 (0,57 – 0,71) - 1,10 1,52 Obara, 2010 São José do Povo/ S. Serrinha e Cascata deltametrina 0,70 (0,66 – 0,75) - 1,20 1,01 Obara, 2010 Campo Grande/ Pov. Aguão deltametrina 0,61 (0,56 – 0,67) - 1,05 1,19 Obara, 2010 166 Cont. ANEXO 1. Relatos na literatura de resistência de triatomíneos a inseticida Espécie País Município/Localidade Inseticida DL50 RR RR50 RR95 Referência T. sordida Brasil Aparecida do Taboado/ F. José Rodrigues deltametrina 0,78 (0,70 – 0,86) - 1,33 1,91 Obara, 2010 Douradina/ S. Maria Curadeira deltametrina 0,85 (0,78 – 0,92) - 1,45 1,60 Obara, 2010 Rochedo/ F. Estência Ermelinda deltametrina 0,70 (0,63 – 0,77) - 1,21 1,28 Obara, 2010 Terenos/ Pov. Colônia Velha deltametrina 0,69 (0,61 – 0,77) - 1,19 1,24 Obara, 2010 Lontra/ Pov. Rodeador deltametrina 0,84 (0,77 – 0,92) - 1,45 1,86 Obara, 2010 Aurora do Tocantins/ F. Mucambo e Veneranda deltametrina 1,04 (0,87 – 1,18) - 1,79 2,56 Obara, 2010 T. infestans Brasil LRS – Montes Claros deltametrina 0,36 (0,241 – 0,410) - 1,00 - Sonoda et al., 2009 Goiás deltametrina 0,42 (0,321 – 0,515) - 1,17 - Sonoda et al., 2009 Mato Queimado deltametrina 0,53 (0,354 – 0,710) - 1,47 - Sonoda et al., 2009 Guarani das Missões deltametrina 0,35 (0,240 – 0,548) - 0,97 - Sonoda et al., 2009 Três de Maio deltametrina 0,67 (0,520 – 0,925) - 1,86 - Sonoda et al., 2009 Doutor Maurício Cardoso deltametrina 0,26 (0,199 – 0,356) - 0,72 - Sonoda et al., 2009 T. infestans Bolívia Yacuiba deltametrina 10,84 (7,706 – 14,635) - 30,11 - Sonoda et al., 2009 167 ANEXO 2. Mapa de conjunto das localidades de estudo de Coração de Jesus 168 ANEXO 3. Questionário aplicado aos moradores das localidades de interesse visando descrever a unidade domiciliar bem como o possível uso de inseticida com fins domésticos e agrícolas. PROGRAMA DE CONTROLE DA DOENÇA DE CHAGAS CPqRR - FIOCRUZ/UFMG/GRS – MONTES CLAROS-MG I –Dados gerais da casa: 1. Localidade:_________________________________________ 2. Número da localidade:________________________________ 3. Número da casa:___________________________________ 4. Recusa? ( ) 1-sim ( ) 2-não 5. Casa habitada? ( ) 1-sim ( ) 2-não 6. Nome do dono (a) da casa: ________________________________________ 7. Número de residentes: __________ 8. Há quanto tempo mora no domicílio? Há __________ ( ) anos ( ) meses ( ) semanas ( ) dias 9. Veja atrás da porta de entrada da sua residência a ficha domiciliar. Permite transferir os dados da ficha para este questionário? Número da visita Data da visita Trabalho executado Produto aplicado 10. Tem animais domésticos na casa ou quintal ? ( ) 1-sim ( ) 2-não ( ) 9-NR ( ) 0-NS 169 11. Se sim, quantos animais domésticos vocês tem? (Marcar o animal e a quantidade ao lado) ( ) Cão quantos?_________ ( ) Gato quantos?_________ ( ) Galinha quantos?_________ ( ) Porco quantos?_________ ( ) Vaca quantos?_________ ( ) Cabra quantos?_________ ( ) outro : ___________________ quantos?_________ ( ) NR ( ) NS 12. Se você tem animais domésticos em caso, você os trata com venenos para combater pragas como carrapatos, pulgas, piolhos, sarnas,etc? ( ) 1-sim ( ) 2-não ( ) 9-NR ( ) 0-NS 13. Se sim, qual (is) produto (s) você costuma usar? ___________________________ 14. Algum animal dorme dentro de casa? ( ) 1-sim ( ) 2-não ( ) 9-NR ( ) 0-NS 15. Se sim, quais e quantos? ( ) Cão quantos?_________ ( ) Gato quantos?_________ ( ) Galinha quantos?_________ ( ) Porco quantos?_________ ( ) outro : ___________________ ( ) NR ( ) NS 16- Aonde estes animais dormem dentro da casa? ( ) sala ( ) quarto ( ) cozinha ( ) banheiro ( ) varanda (soleira) ( ) Outro: ____________ ( ) NR ( ) NS 17. Aonde que cada animal dorme no quintal (peridomicílio)? ( ) Cão local?_______________ ( ) Gato local? __________________ ( ) Galinha local? ______________ ( ) Porco local?__________________ ( ) Vaca local?_______________ ( ) Cabra local?__________________ ( ) outro : _______________ local?______________ ( ) NR ( ) NS 18. Vocês usam veneno (remédio) contra insetos (baratas, formigas, cupins, etc) ? ( ) 1-sim ( ) 2-não ( ) 9-NR ( ) 0-NS 19- Dentro de casa? ( ) 1-sim ( ) 2-não ( ) 9-NR ( ) 0-NS Se sim, marcar o local: ( ) sala ( ) quarto ( ) cozinha ( ) banheiro ( ) varanda (soleira) ( ) Outro: _____________ ( ) NR ( ) NS 20. Fora da casa (quintal)? ( ) 1-sim ( ) 2-não ( ) 9-NR ( ) 0-NS Se sim, marcar o local: ( ) telhado ( ) cerca ( ) chiqueiro ( ) galinheiro ( ) paiol ( ) Outro: ____________ ( ) NR ( ) NS 170 21. Posso ver? Qual veneno (remédio) você usa? Escrever nome do produto: ____________________________________________ 22. Qual a última vez que você passou veneno na sua casa (fora ou dentro)? ( ) Na última semana ( ) No último mês ( ) Há 3 meses atrás ( ) Há 6 meses atrás ( ) Há 1 ano ( ) outro período: _____________ ( ) NR ( ) NS 23. De quanto em quanto tempo você passa veneno em sua casa? ( ) uma vez a cada mês ( ) uma vez a cada dois meses ( ) uma vez a cada seis meses ( ) uma vez ao ano ( ) não tenho frequência, passo quantas vezes forem necessárias 24. Você tem alguma plantação em sua propriedade? ( ) 1-sim ( ) 2-não ( ) 9-NR ( ) 0-NS Se sim, responda: De que? ..................................................... Qual a área plantada (ha)? ..................................................... Tem acompanhamento da EMATER? ( ) 1-sim ( ) 2-não ( ) 9-NR ( ) 0-NS 25.Você usa veneno para controlar alguma praga agrícola? ( ) 1-sim ( ) 2-não ( ) 9-NR ( ) 0-NS Se sim, responda: De quanto em quanto tempo você aplica veneno em suas plantações? ( ) uma vez a cada mês ( ) uma vez a cada dois meses ( ) uma vez a cada seis meses ( ) uma vez ao ano ( ) não tenho frequência, passo quantas vezes forem necessárias 26. Tem algum veneno guardado hoje em sua propriedade? ( ) 1-sim ( ) 2-não ( ) 9-NR ( ) 0-NS Se sim, responda: Qual (is)? ..................................................................................... Para que é (são) utilizado(s)? ..................................................... Você tem prática ou costume de utilizá-lo (s)? ................................................ Onde foi (foram) comprado(s)?...................................................................... 27. Vocês freqüentam as matas aqui perto ou mais longe? ( ) 1-sim ( ) 2-não ( ) 9-NR ( ) 0-NS 28. Como que vocês utilizam essas matas? ( ) Coletando lenha ( ) Coletando frutos/sementes ( ) Pesca ( ) PescaColeta de fibras (alguma atividade artesanal) ( ) Caça ( ) Outro jeito: ________________ ( ) NR ( ) NS 29. Área da casa:___________________ 30. Idade da casa:________________ 31 Tipo de parede: Tijolo sem reboco ( ) Tijolo com reboco ( ) Pau-a-pique, barro ( ) 171 Adobe sem reboco ( ) Madeira ( ) NS ( ) NR ( ) Se mista, completar: ___________ Com: Fendas, gretas, rachaduras e buracos ( ) 32. Tipo de teto Telha de barro ( ) Telha de amianto ( ) Lage ( ) Zinco ( ) Madeira ( ) Capim ( ) Palha (palmeira) ( ) Papelão, plástico,lona ( ) NS ( ) NR ( ) Outro: ____________ Com: Fendas, gretas, rachaduras e buracos ( ) 33. Tipo de forro Lage ( ) Madeira ( ) Pano ( ) Esteira ( ) Não tem ( ) NS ( ) NR ( ) Outro: ____________________ 34. Tipo de piso Ladrilho ou cerâmica ( ) Cimento ( ) Madeira ( ) Terra ( ) NS ( ) NR ( ) Se misto completar _______________ Outro _____________________ Com: Fendas, gretas, rachaduras e buracos ( ) 35. Anexos peridomésticos,distância e tempo da estrutura: Estrutura Presente Distância da casa (m)? Tempo que a estrutura existe? Material de Construção Galinheiro Chiqueiro Curral Paiol Forno de barro Depósito de máquinas e utensílios Cerca Monte de madeira Monte de Lenha Monte de telha Monte de tijolos Entulhos NA NS NR Outros 172 ANEXO 4. Questionário aplicado aos agentes de saúde que trabalham nas localidades de interesse visando detectar possíveis falhas operacionais no campo. PROGRAMA DE CONTROLE DA DOENÇA DE CHAGAS CPqRR - FIOCRUZ/UFMG/GRS – MONTES CLAROS-MG Caro agente de saúde, Com o nosso reconhecimento pelo trabalho que você presta a sua comunidade, solicitamos que preencha o questionário abaixo de modo a nos auxiliar na avaliação das atividades prestadas referentes ao controle dos barbeiros, vetores da doença de Chagas. Contamos com sua colaboração. Dra. Liléia Diotaiuti e Grasielle Caldas I –Dados gerais do agente: 1. Município:_________________________________________ 2. Número do município:________________________________ 3. Nome do agente de saúde:_______________________________________________ 4. CPF do agente de saúde: _________________________________________ 5. Há quanto tempo trabalha como agente de saúde no município? Há __________ ( ) anos ( ) meses ( ) semanas ( ) dias 6. Você foi treinado para exercer suas atividades de controle dos triatomíneos utilizando inseticidas? ( ) 1-sim ( ) 2-não ( ) 9-NR ( ) 0-NS Se sim, informe quando __________________________________________ 7. Você já fez cursos de reciclagem e atualização junto .às secretarias municipal e estadual de saúde ? ( ) 1-sim ( ) 2-não ( ) 9-NR ( ) 0-NS Se sim, informe quando __________________________________________ 173 8. Se você não contar com o bico TJET 8002, você usa outros tipos de bico que não ele? ( ) 1-sim ( ) 2-não ( ) 9-NR ( ) 0-NS Se sim, informe quais __________________________________________ 9. Você pulverizou com o bico tipo chapinha (cônico)? É aquele que vem com o pulverizador novo. ( ) 1-sim ( ) 2-não ( ) 9-NR ( ) 0-NS Se sim, informe quando __________________________________________ 10.Você usa balde graduado para medir o volume de água a ser usado na preparação do inseticida? ( ) 1-sim ( ) 2-não ( ) 9-NR ( ) 0-NS 11. Você costuma usar arame ou prego para alterar a saído do inseticida, quando o bico entope? ( ) 1-sim ( ) 2-não ( ) 9-NR ( ) 0-NS 12. Para você, a manutenção da pressão do equipamento tem importância na borrifação? ( ) 1-sim ( ) 2-não ( ) 9-NR ( ) 0-NS 13. Como você prepara a carga de inseticida que coloca no pulverizador? 14. Como você mede ou dosa a carga do inseticida? _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ ________________________________________________________ 15. Você sempre faz assim? _____________________________________________________________________________ _______________________________________________________________ 16. Em alguma campanha você já aplicou doses do inseticidas menores do que a recomendada? ( ) 1-sim ( ) 2-não ( ) 9-NR ( ) 0-NS Se sim, informe quando __________________________________________ Quantas vezes? _________________________________________________ Qual (is) o(s) motivo(s)? ___________________________________________ 17. Por alguma razão você já teve que usar inseticida vencido? ( ) 1-sim ( ) 2-não ( ) 9-NR ( ) 0-NS Se sim, informe quando __________________________________________ Quantas vezes? _________________________________________________ Qual (is) o(s) motivo(s)? ___________________________________________ 174 18. Já aconteceu de em alguma campanha ter inseticida em quantidade insuficiente e você ter que optar por borrifar umas casas e outras não? ( ) 1-sim ( ) 2-não ( ) 9-NR ( ) 0-NS Se sim, informe quando __________________________________________ 19. Você já se intoxicou com algum inseticida no campo? ( ) 1-sim ( ) 2-não ( ) 9-NR ( ) 0-NS Se sim, informe quando __________________________________________ Quais sintomas você apresentou? ______________________________________ Como tratou? _____________________________________________________ Você teve que tirar licença médica por este motivo? ( ) 1-não ( ) 2-sim 20. Você já deixou de borrifar algumas casas desta região por falta de inseticida? ( ) 1-sim ( ) 2-não ( ) 9-NR ( ) 0-NS Se sim, informe quando __________________________________________ Qual(is) localidade(s)? _____________________________________________ 21. Você já deixou de borrifar algumas casas desta região por falta de veículo que desce acesso a mesma? ( ) 1-sim ( ) 2-não ( ) 9-NR ( ) 0-NS Se sim, informe quando __________________________________________ Qual(is) localidade(s)? _____________________________________________ 22. Sua equipe já deixou de borrifar algumas casas desta região por falta de funcionários? ( ) 1-sim ( ) 2-não ( ) 9-NR ( ) 0-NS Se sim, informe quando __________________________________________ Qual(is) localidade(s)? _____________________________________________ 23. Você já trabalhou em alguma localidade que mesmo aplicando inseticida os triatomíneos não morriam ou as colônias cresciam mais rápido do que o esperado? ( ) 1-sim ( ) 2-não ( ) 9-NR ( ) 0-NS Se sim, informe quando __________________________________________ Qual(is) localidade(s)? _____________________________________________ 24. Se sim, informe o que você fez para resolver o problema ( ) aplicou inseticida com maior frequência ( ) aplicou uma dose maior do que a recomendada ( ) não aplicou mais nenhum inseticida ( ) recomendou os moradores a organizarem o peridomicílio para acabar com os esconderijos para os barbeiros ( ) informou aos colegas e ao responsável pela coordenação das campanhas de controle de triatomíneos da região. 175 ANEXO 5: Loci de microssatélites descritos para T.brasiliensis (Tb), T.dimidiata (TD), T.infestans (Tinfest_ms) e T.pseudomaculata (Tp). Nome do loci Sequência dos iniciadores (5´- 3´) Arranjo de repetição Temperatura de anelamento (ºC) Tamanho do Fragmento (pb) Tb 728 F: NED-CTACAGCGATTTGTCTCG R: TATTGCATCATGTTTATTGG (GT)2 AT(GT)12 47 300 – 322 Tb 830 F: FAM-GTCAGATGCATGGTGATAC R: CATGGAAGATACCTAAACGG (AC)15 53 265 – 292 Tb 860 F: PET-CGTTTTAGTAAGGAATGG R: ATTGTGCCAAAATCAGGT (CT)5 (CA)10(CTCA)3 47 390 – 420 Tb 7180 F: VIC-TGACCTACCGCCACATTAC R: CAAATTTTCGATACCGCGATAG (CATA)3(CA)8A(CA)18(GA)3 54 214 – 260 Tb 8112 F: NED-GAATACGCCTATTCACAG R: GGATATGTATTTTAAGGGA (AC)11C(CT)6 49 078 – 096 Tb 8124 F: NED-GCCACTGTGTTCTCATTCC R: TGGTGTGATGCTCAGAAGG (CA)18 54 209 – 253 TDMS1 F: GGAAATACAGGTTTTCACA R: AATTGCACTTTCGGATGA (GT)5 57 133 – 221 TDMS3 F: TCAGATGACGAGGTGGATTG R: ACGACCTCAACATCCCTTTC (GA)4(TAG)3(TGT)3 57 129 – 146 TDMS4 F: CAGTTGTTCATCAGGAAGTGAATC R: GCTCAGAAAATATGTTCCCAGT (CT)C(CT)25G(CT)2 55 150 – 186 TDMS9 F: CATTGCAATCGTGTCGAAAT R: TGCCCAAAATTTTCGTGTCT (GT)13 57 194 – 230 TDMS11 F: GGTGCACCATGTTTAAAG R: AGCGAATGGTCTGTGAATTG (CT)5(CA)5(CTCA)2(CT)4 (CACTTT)(CT)20 55 132 – 230 Tinfest_ms3/AY742670 F: GCGGACTGAGAAAGGAACAC R: TTCACCGCTCGTCTACACAC (GT)10 G (GT)2 GC (GT)2 GG (GT)2 58 160 - 204 Tinfest_ms5/AY742671 F: ATGCTGATAGTCGCAACACG R: TCGATCTTTTTCCCAAATCG (CA)25 58 364 - 396 176 Cont. ANEXO 5 . Loci de microssatélites descritos para T.brasiliensis (Tb), T.dimidiata (TD), T.infestans (Tinfest_ms) e T.pseudomaculata (Tp). Nome do loci Sequência dos iniciadores (5´- 3´) Arranjo de repetição Temperatura de anelamento (ºC) Tamanho do Fragmento (pb) Tinfest_ms21/AY742672 F: h: CGCTTTCAACACAACAGGAG R: TTTGTTTAATTACAAAATCCA TACC (TG)2 TT (TG)14 GGG (GT)3 59.5 318 - 320 Tinfest_ms22/AY742673 F: f: CGAGTCAAATTTTCCATGAGG R: CCCATGGTGTTACCCAAAAC (TG)9 58 162 - 196 Tinfest_ms23/AY742674 F: h: CTCTTGCTGGTTGTGCACTG R: GTAAACGCCATCCTCACACC (CA)5 CC (CA)5 AA (CA)2 58 148 - 177 Tinfest_ms27/AY742675 F: h: ATGAAGCCGAAACCACAAAG R: GGG GAAGAGAATGCATTGAG (CT)13 58 290 - 314 Tinfest_ms42/AY742683 F: h: GACGCTCCAGCTATCGATTC R: GGCCAATTGGTTTGGTAG TG (CA)16 58 206 - 246 Tp57 F: NED-GTTACATTAAGGTTGGATT R: AATTATGCTGTCCTTTCC (GT)9 45 205 – 211 Tp59 F: FAM-ACTTAGGTGGGTATGGA R: CAGAGTAGTAGCGTATTGA (GT)8 45 120 – 128 Tp148 F: VIC-ACCAACTTTGATGCCACT R: GCTTCCTATGACTGCTTT (AT)3(GT)10 45 94 – 102 Tp20 F: VIC-ACTGACTCCGAGAAAGTG R: TTCCTAAATCCAAACCCT (GT)17(ATGT)7 52 170 – 206 Tp544 F: PET-TGTTAGAATGAATGCCACTA R: GCAATACAATAGAGGACTGA (GT)4GA(GT)5 45 148 – 172 177 ANEXO 6: Protocolo para quantificação de atividade de enzimas relacionadas com a resistência a inseticidas testadas para T. sordida Ensaio enzimático Reagentes/poço Tempo de incubação Leitura Acetilcolinesterase (AChE) * 25 µL do homogenato (antes da centrifugação) e 25 µL de água nos controles negativos * 145 µL de Triton/Na fosfato * 10 µL de DTNB / Na fosfato * 25 µL de AchE (na placa de AchE) e 25 µL de AchI (na placa de AchI) 90 minutos em temperatura ambiente end point a 405 nm Oxidase de Função Mista (OFM) * 20 µL do homogenato (antes da centrifugação), 20 µL de tampão k fosfato nos controles negativos, 20 µL de solução de citocromo C nos controles positivos * 60 µL de tampão K fosfato * 200 µL de TMBZ/ Na acetato * 25 µL de H2O2 a 3% 90 minutos em temperatura ambiente protegido da luz end point a 650nm Esterase alfa (α – EST) * 10 µL do homogenato (depois da centrifugação), 10 µL de água nos controles negativos, 10 µL de alfa-naftol a 0,5 µg/µl (~3,5 nmoles/µL) nos controles positivos * 200 µL de alfa-naftil acetato/Na fosfato * APÒS 15 minutos, 50µL de Fast Blue Salt 5 minutos em temperatura ambiente end point a 570 nm 178 Cont. ANEXO 6: Protocolo para quantificação de atividade de enzimas relacionadas com a resistência a inseticidas testadas para T. sordida Ensaio enzimático Reagentes/poço Tempo de incubação Leitura Esterase beta (β – EST) * 10 µL do homogenato (depois da centrifugação), 10 µL de água nos controles negativos, 10 µL de beta-naftol a 0,5 µg/µl (~3,5 nmoles/µL) nos controles positivos * 200 µL de beta-naftil acetato/Na fosfato * APÒS 15 minutos, 50µL de Fast Blue Salt 5 minutos em temperatura ambiente end point a 570 nm Esterase PNPA (ρ – EST) * 10 µL do homogenato (depois da centrifugação), 10 µL de água nos controles negativos, * 200 µL de PNPA /Na fosfato imediada Leitura cinética por dois minutos, intervalada por 15 segundos, a 405 nm Glutationa-S-Transferas (GST) * 15 µL do homogenato (depois da centrifugação), 15 µL de água nos controles negativos * 195 µL de GSH/CDNB * APÒS 15 minutos, 50µL de Fast Blue Salt imediata Cinética imediada, por 20 minutos, intervalada por 1 minuto, a 340 nm 179 ANEXO 7. Análise Probit da Linhagem Referência de Suscetibilidade de T.sordida.