UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS AVALIAÇÃO DOS FATORES PREDITORES DE INVASÃO VASCULAR MICROSCÓPICA NO CARCINOMA HEPATOCELULAR FERNANDA MARIA FARAGE OSÓRIO BELO HORIZONTE - MG 2013 I FERNANDA MARIA FARAGE OSÓRIO AVALIAÇÃO DOS FATORES PREDITORES DE INVASÃO VASCULAR MICROSCÓPICA NO CARCINOMA HEPATOCELULAR Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Aplicadas à Saúde do Adulto, da Universidade Federal de Minas Gerais, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Saúde do Adulto. Orientadora: Profª. Claudia Alves Couto Coorientadoras: Profª. Teresa Cristina de Abreu Ferrari Profª. Paula Vieira Teixeira Vidigal BELO HORIZONTE 2013 II UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS Reitor: Prof. Clélio Campolina Diniz Vice-Reitora: Profª. Rocksane de Carvalho Norton Pró-Reitor de Pós-Graduação: Prof. Ricardo Santiago Gómez Pró-Reitor de Pesquisa: Prof. Renato de Lima Santos FACULDADE DE MEDICINA DA UFMG Diretor da Faculdade de Medicina: Prof. Francisco José Penna Vice-Diretor da Faculdade de Medicina: Prof. Tarcizo Afonso Nunes Coordenador do Centro de Pós-Graduação: Prof. Manoel Otávio da Costa Rocha PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS À SAÚDE DO ADULTO Chefe do Departamento de Clínica Médica: Prof. Ricardo Macedo Menezes Coordenadora do Programa: Profa. Teresa Cristina Abreu Ferrari Subcoordenadora do Programa: Profa. Valéria Maria de Azeredo Passos Colegiado do Programa de Pós-Graduação em Saúde do Adulto: Profª. Teresa Cristina A. Ferrari Profª. Valéria Maria A. Passos Prof. Luiz Gonzaga Vaz Coelho Prof. Francisco Eduardo Costa Cardoso Prof. Marcus Vinícius M. de Andrade Andréa de Lima Bastos (representante discente) III DEDICATÓRIA Aos meus pais e Marcell. IV AGRADECIMENTOS Agradeço às minhas orientadoras que se tornaram, cada uma à sua maneira, um exemplo além da universidade. Obrigada por cada lição. Ao acadêmico Gabriel que foi muito importante na execução deste trabalho. Aos funcionários do SAME, pela colaboração e simpatia, especialmente à Maria Helena. À Fernanda da anatomia patológica por seu trabalho possibilitar o meu. Ao Fernando, estatístico da pós-graduação, por ter sido assertivo e tão compreensivo. Ao ambulatório de fígado e seus integrantes, por ser minha escola. À todo o grupo de transplantes hepático, ao Hospital das Clínicas e aos pacientes. Aos meus pais, que são a inspiração e que me ensinaram que o trabalho e o estudo é que enobrecem o indivíduo. Aos meus irmãos por alegrarem a minha vida, até mesmo em momentos difíceis. Ao amor da minha vida, Marcell, por ser o que me faltava. À minha prima Alice pela dedicação que me encantou. À todos que contribuíram na execução da tese, perto ou longe, ou simplesmente me toleraram neste período. V EPÍGRAFE “Viva como se fosse morrer amanhã. Aprenda como se fosse viver para sempre.” Mahatma Gandhi VI RESUMO O carcinoma hepatocelular é uma neoplasia de alta mortalidade e sua incidência vem crescendo globalmente apesar de haver métodos de prevenção e rastreamento eficientes. O tratamento de escolha em pacientes em estadio inicial, com cirrose avançada é o transplante hepático, no entanto, a recorrência tumoral ainda é um problema. A invasão vascular microscópica é um fator determinante na recorrência do tumor e na sobrevida dos pacientes após o transplante. O presente estudo avaliou variáveis clínicas e histopatológicas como preditores de invasão vascular. Para tal, foram incluídos 107 (76 homens, 71%) pacientes submetidos ao transplante hepático entre julho de 2001 e dezembro de 2010 e avaliados retrospectivamente seus prontuários médicos para obtenção das informações clinicas (etiologia da cirrose, história de tabagismo e diabetes mellitus, escore de Child–Pugh e escore MELD) e laboratoriais (alfafetoproteína, creatinina, bilirrubina total, albumina e RNI). Foi realizada revisão histológica das lâminas coradas em hematoxilina-eosina por um único patologista especialista em histologia hepática para determinação de invasão vascular e demais variáveis histológicas (presença de fibrose, esteatose, necrose e inflamação no parênquima tumoral e classificação do grau de diferenciação histológica, índice mitótico e tipo histológico). A média de idade foi 56,8 (±8,7) e a recorrência tumoral 12,9%. A sobrevida em um, três e cinco anos foi 75,0%, 71,4% e 67,5%, respectivamente. Na análise multivariada as variáveis independentes associadas à invasão vascular microscópica foram grau histológico (p < 0,001; OR 3,16; IC 1,525 a 4,156) e índice mitótico (p = 0,046; OR 2,56; IC 1,061 a 6,451). Este resultado ressalta a importância de se discutir a realização de biópsia hepática antes do tratamento, uma vez que grau de diferenciação histológica e índice mitótico, fatores preditores de invasão vascular microscópica, podem ser identificados pela mesma. VII ABSTRACT Background: Microvascular invasion (MVI) is a well-known risk factor for hepatocellular carcinoma (HCC) recurrence and mortality after liver transplantation (LT). The aim of this study was to determine clinicopathological predictive factors associated with MVI. Methods: Records of all patients who underwent LT with HCC at Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Minas Gerais, between July 2001 and December 2010, were reviewed. Laboratory tests, clinical and demographic data were obtained. Histopathological review of the hematoxylin and eosin specimens was performed by a single liver pathologist. Results: A total of 107 patients were included, 76 male (71%) and the mean age was 56.8 (±8.7). Tumor recurrence rate was 12.9%. One, three and five years overall survival was 75.0, 71.4 and 67.5% respectively. Only tumor recurrence was associated with mortality (p=0.038; OR= 2.54; CI 1.052 to 6.106). Mitotic index, histological grade, tumor architecture, alpha-fetoprotein and tumor fibrosis were included in the multivariate model. Significant independent predictors of MVI on logistic regression analysis were histological grade and mitotic index (p < 0.001; OR 3.16; CI 1.525 to 4.156 and p = 0.046; OR 2.56; CI 1.061 to 6.451 respectively). Discussion: Mitotic index and histological grade are good predictors of MVI. No other risk factor was identified in the logistic regression. These results highlight the importance of discussing pre transplantation liver biopsy to access prognosis and define treatment modalities in the setting of LT. VIII LISTA DE FIGURAS Figura 1: Carcinoma hepatocelular padrão trabecular. ............................................. 26 Figura 2: Carcinoma hepatocelular padrão pseudoglandular. ................................... 26 Figura 3: Carcinoma hepatocelular padrão sólido ..................................................... 27 Figura 4: Carcinoma hepatocelular bem diferenciado. .............................................. 28 Figura 5: Carcinoma hepatocelular pouco diferenciado. ........................................... 28 IX LISTA DE SIGLAS AASLD – American Association for the Study of Liver Diseases AFP – alfafetoproteína BCLC – Barcelona Clinic Liver Cancer CHC – carcinoma hepatocelular cm – centímetros EASL – European Association for the Study of Liver HC – Hospital das Clínicas HE – Hematoxilina-Eosina MELD – Model of End-Stage Disease RNM – ressonância nuclear magnética TC – tomografia computadorizada TH – transplante hepático UFMG – Universidade Federal de Minas Gerais UNOS - United Network for Organ Sharing US - ultrassonografia VHB – vírus da hepatite B VHC – vírus da hepatite C X SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 12 2 ANTECEDENTES CIENTÍFICOS ........................................................................... 13 2.1 Carcinoma hepatocelular ................................................................................. 13 2.1.1 Incidência e prevalência ............................................................................ 13 2.1.2 Fatores de risco ......................................................................................... 13 2.1.3 Rastreamento e vigilância .......................................................................... 14 2.1.4 Diagnóstico ................................................................................................ 15 2.1.5 Estadiamento ............................................................................................. 15 2.1.6 Indicação e priorização ao transplante hepático em indivíduos com carcinoma hepatocelular ..................................................................................... 16 2.1.7 Características histológicas e prognóstico ................................................. 17 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 19 3 OBJETIVOS ........................................................................................................... 23 3.1 Objetivo geral ................................................................................................... 23 3.2 Objetivos específicos ....................................................................................... 23 4 MÉTODOS ............................................................................................................. 24 4.1 Delineamento do estudo .................................................................................. 24 4.2 Seleção dos casos e coleta dos dados clínicos ............................................... 24 4.3 Avaliação histológica ........................................................................................ 25 Figura 1: Carcinoma hepatocelular padrão trabecular. ............................................. 26 Figura 2: Carcinoma hepatocelular padrão pseudoglandular. ................................... 26 Figura 3: Carcinoma hepatocelular padrão sólido ..................................................... 27 Figura 4: Carcinoma hepatocelular bem diferenciado. .............................................. 28 Figura 5: Carcinoma hepatocelular pouco diferenciado. ........................................... 28 4.4 Análise estatística ............................................................................................ 29 6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................... 45 ANEXOS ................................................................................................................... 46 ANEXO A – Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa - UFMG ....................... 46 ANEXO B – Ata da defesa da dissertação ............................................................. 47 ANEXO C – Folha de provação ............................................................................. 48 XI APÊNDICES .............................................................................................................. 48 APÊNDICE A - Termo de consentimento livre e esclarecido ................................. 49 APÊNDICE B - Protocolo de biópsia ...................................................................... 50 APÊNDICE C – Artigo publicado em periódico ...................................................... 52 12 1 INTRODUÇÃO Dentre as causas de neoplasia em geral, as neoplasias primárias do fígado são a sétima mais frequente em homens e a quinta nas mulheres (1). O carcinoma hepatocelular (CHC) representa 70 a 85% das neoplasias primárias do fígado e sua incidência está aumentando globalmente. Apesar de haver métodos de prevenção e rastreamento eficientes, ainda é responsável por altos índices de mortalidade. O tratamento varia conforme o estádio da doença, e o transplante hepático (TH) é a escolha em casos selecionados, em fase inicial. Entretanto, a recidiva tumoral e a mortalidade ainda são fatores preocupantes no tratamento do CHC. Apesar de critérios restritos para a realização do TH, a recorrência do CHC chega a 18% (2). A invasão vascular microscópica é um dos determinantes dos resultados após o TH ou ressecção cirúrgica do CHC (3). Diante da importância da invasão vascular microscópica, identificada em vários estudos como principal fator prognóstico após a ressecção cirúrgica do CHC e após o TH, e da impossibilidade de detectá-la pré-tratamento, torna-se desejável o estudo de marcadores da mesma. Neste contexto, insere-se o presente estudo, no qual é feita análise histológica e clínica de fatores preditivos da invasão vascular em pacientes submetidos ao TH no Hospital das Clínicas (HC) da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). 13 2 ANTECEDENTES CIENTÍFICOS 2.1 Carcinoma hepatocelular 2.1.1 Incidência e prevalência As neoplasias primárias do fígado são o sexto câncer mais frequente mundialmente e representam a terceira causa de mortalidade relacionada a câncer (4). O CHC constitui cerca de 70 a 90% das neoplasias primárias do fígado (5, 6). A incidência do CHC eleva-se progressivamente com o aumento da idade; raramente ocorre antes de 40 anos, sendo observado um pico de incidência aos 70 anos aproximadamente. As taxas de câncer de fígado em homems são duas a quatro vezes maiores do que nas mulheres (7). Nos indivíduos com cirrose hepática, o CHC é a principal causa de morte (8). 2.1.2 Fatores de risco Os fatores de risco para o CHC, em 90% dos casos, estão associados ao desenvolvimento ou progressão da cirrose hepática e incluem: infecção pelos vírus da hepatite B (VHB) ou C (VHC), hepatopatia alcoólica e esteatohepatite não- alcoólica. Causas menos comuns compreendem hemocromatose hereditária, deficiência de alfa-1-antitripsina, hepatite autoimune, algumas porfirias e doença de Wilson (7). A exposição dietética à aflatoxina B1, derivada dos fungos Aspergillus flavus e A. parasiticus é importante cofator na oncogênese do CHC em algumas partes da África e Ásia. Estudos epidemiológicos mostraram forte associação entre exposição à aflatoxina B1 e mutações no gen supressor tumoral p53 e a ocorrência de CHC, especialmente em pacientes infectados pelo VHB (6). 14 Diabetes melitus é fator de risco independente para o desenvolvimento de HCC (9) e o tabagismo, um importante cofator (10). Marcadores indiretos de disfunção hepática e hipertensão portal, tais como contagem de plaquetas abaixo de 75.000/mm3, atividade de protrombina menor que 75%, associados à idade mais avançada, ao sexo masculino e ao anti-HCV positivo são preditores do desenvolvimento do CHC em pacientes cirróticos (11). 2.1.3 Rastreamento e vigilância A vigilância do CHC é realizada com o intuito de redução da mortalidade relacionada ao câncer e trata-se de rastreamento periódico realizado em pacientes de risco. É amplamente utilizada apesar de pouca evidência de benefício (12). O único estudo randomizado no qual se comparou o resultado da realização de vigilância por ultrassonografia (US) e dosagem sérica de alfafetoproteína (AFP), a cada seis meses, com a não realização de vigilância foi feito na China, em pacientes com marcadores de infecção pelo VHB, obtendo-se redução de 37% na mortalidade no grupo submetido à vigilância (13). O método de imagem de escolha para o rastreamento é a US, por ser não- invasivo e amplamente disponível. A sua sensibilidade para detecção precoce do CHC em cirróticos é aproximadamente 70% (14). O uso combinado da US e dosagem de AFP se mostrou pouco eficiente, aumentando o número de casos falso- positivos e os custos da vigilância (15). Desta maneira, a American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD) e a European Association for the Study of Liver (EASL) não recomendam a dosagem deste marcador no rastreamento do CHC (12, 16). A recomendação atual da EASL é de que o rastreamento seja empregado em cirróticos Child-Pugh A e B, em cirróticos Child-Pugh C quando estiverem alocados em fila de TH, em portadores do VHB não-cirróticos com hepatite em atividade ou que tenham história familiar positiva para CHC e em pacientes com VHC e fibrose hepática avançada (16). 15 2.1.4 Diagnóstico O diagnóstico do CHC é realizado, cada vez mais, por meio de métodos não- invasivos, tomografia computadorizada com contraste (TC) ou à ressonância nuclear magnética (RNM), seguindo-se critérios radiológicos bem definidos. Por se tratar de tumor hipervascular, suprido pela artéria hepática, o CHC contrasta-se mais em relação ao restante do parênquima hepático na fase arterial da administração de contraste. Na fase venosa tardia, o CHC contrasta-se menos por não ter suprimento portal, fenômeno denominado “washout” (17, 18). A presença de captação de contraste na fase arterial seguida de “washout” na fase portal tardia é altamente específica para o CHC. Nódulos maiores do que um centímetro (cm), descobertos durante o rastreamento em pacientes cirróticos, e que apresentam características típicas dos critérios não-invasivos à TC ou à RNM podem ser diagnosticados como CHC (19). Desta maneira, a biópsia hepática para o diagnóstico de CHC limita-se aos indivíduos que apresentam nódulos hepáticos de tamanho igual ou superior a um cm e exames de imagem inconclusivos em relação aos critérios não-invasivos. Em nódulos menores de um cm, a US deverá ser repetida a cada três meses até que o tumor apresente crescimento superior a esta dimensão, quando então uma TC ou RNM deverão ser realizadas para conclusão diagnóstica. Caso o nódulo mantenha-se estável por período de 18 meses, o paciente deverá retornar ao rastreamento periódico semestral (20). 2.1.5 Estadiamento Atualmente, o sistema de classificação do CHC mais utilizado é o da Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC) segundo o qual os pacientes são subdivididos em cinco estádios (0, A, B, C e D), de acordo com variáveis prognósticas pré- estabelecidas e alocados em grupos de tratamento (16). 16 1-Estadio 0: presença de nódulo único menor ou iguais a dois cm de diâmetro sem evidências de invasão vascular, em paciente em boa condição de saúde e função hepática preservada (Child Pugh A). Estes pacientes podem ser submetidos à ressecção hepática do segmento acometido. 2- Estadio A: pacientes que apresentam tumores únicos maiores de dois cm e que não ultrapassem cinco ou até três nódulos de até três cm de diâmetro, em boa condição de saúde, Child Pugh A ou B. Estes indivíduos são candidatos ao TH. 3- Estadio B (intermediário): pacientes com doença multifocal, assintomáticos, sem evidências de metástases extra-hepáticas. São candidatos a quimioembolização transarterial. 4- Estadio C (avançado): pacientes com doença multifocal, com sintomas relacionados ao câncer, com evidência de invasão da veia porta ou metástases extra-hepáticas. Podem receber quimioterapia sistêmica com sorafenibe (NexavarR) para tratamento paliativo, desde que sejam classificados como Child-Pugh A. 5- Estadio D (terminal): pacientes que se apresentam muito debilitados pelo tumor. 2.1.6 Indicação e priorização ao transplante hepático em indivíduos com carcinoma hepatocelular Mazzafero e col. (1996) demonstraram que pacientes com tumores solitários de tamanho menor ou igual a cinco cm ou com até três lesões menores ou iguais a três cm apresentam maior sobrevida após o transplante, sobrevida que se equipara à de pacientes transplantados por outras indicações. A partir deste estudo ficaram estabelecidos, então, critérios de seleção de candidatos com CHC para o TH, chamados “critérios de Milão”(21). Estes critérios têm sido amplamente utilizados por diversos grupos de transplante. A United Network for Organ Sharing (UNOS) desenvolveu e adotou um sistema de prioridades para alocação dos candidatos ao TH baseado no escore Model of End-Stage Liver Disease (MELD) que, originalmente, foi criado para predizer a sobrevida de pacientes submetidos a derivação intra-hepática 17 portossistêmica transjugular (TIPS) (22, 23). De acordo com o MELD, pacientes com CHC de até dois cm de diâmetro recebem 22 pontos e aqueles com até três nódulos de até três cm recebem 29 pontos, obtendo, assim, prioridade para o transplante. Um modelo prognóstico chamado METROTICKET foi desenvolvido por Mazzaferro e col. (2009) na tentativa de estratificar melhor quanto à sobrevida os critérios de seleção para o TH e torna-los menos excludentes (24). O modelo leva em consideração o tamanho e o número de nódulos tumorais e estratifica os grupos de indivíduos considerando a sobrevida em três e cinco anos. Os pesquisadores identificaram um subgrupo de pacientes que excediam os critérios de Milão, mas apresentavam sobrevida em cinco anos de pelo menos 70%, semelhante àquela dos pacientes dentro deste critério. 2.1.7 Características histológicas e prognóstico A sobrevida após a ressecção cirúrgica ou TH para o tratamento do CHC está intimamente relacionada à recorrência do tumor (25). Desta maneira, as características clínicas e histopatológicas do CHC são amplamente estudadas na tentativa de se obter melhores resultados de sobrevida. A invasão vascular microscópica é a característica histológica com maior influência no prognóstico após a ressecção cirúrgica do CHC ou após o TH (26-28). É caracterizada pela presença de êmbolo tumoral em ramos da veia central, da veia porta ou dos vasos da pseudo-cápsula fibrosa tumoral (29). A presença de invasão vascular microscópica está associada ao tamanho do tumor, tendo sido descrita em 30% dos tumores medindo dois cm e em até 50 % de tumores com cinco cm (3). Parfitti e col. (2005) desenvolveram escore patológico de predição de recorrência do CHC após o TH baseado na análise de variáveis clínicas e histológicas do tumor. A invasão vascular microscópica foi o melhor preditor de recorrência tumoral, no entanto, o tamanho do tumor, o grau histológico, e a presença de microssateliose e células gigantes também foram preditores independentes de recorrência (30). Um estudo brasileiro que incluiu 45 pacientes transplantados por CHC demonstrou que a 18 invasão vascular foi melhor preditor de recorrência que tamanho e número de nódulos (31). O grau de diferenciação histológica do tumor, classificado de I a IV, varia de bem diferenciado a indiferenciado, de acordo com a classificação sugerida por Edmondson e Steiner (32). Sabe-se que tumores de alto grau (indiferenciados) influenciam a sobrevida após a ressecção do CHC e após o TH (33, 34). Jonas e col. (2001), por exemplo, descreveram sobrevida de cinco anos, em 84% dos pacientes com CHC bem diferenciados submetidos ao TH, comparada a 41%, em pacientes com tumor pouco diferenciado (35). A despeito do número e do tamanho de nódulos tumorais, o grupo de transplante da Universidade de Toronto indica transplante para pacientes fora dos critérios de Milão quando a biópsia hepática assegura que a lesão dominante não é pouco diferenciada e obtiveram bons resultados, sem redução de sobrevida (36). Outros grupos também utilizam biópsia hepática pré-transplante tornando pacientes com tumores irressecáveis, bem a moderadamente diferenciados, candidatos ao TH (33). Diversas características histológicas já foram estudadas na busca de indicadores prognósticos. O alto índice mitótico, por exemplo, já foi associado a pior índice de sobrevida após a ressecção cirúrgica do CHC (37). Lauwers e col. (2002) investigaram as variáveis índice mitótico, necrose tumoral, invasão vascular microscópica, grau de diferenciação histológica, arquitetura tumoral e pleomorfismo nuclear na predição de sobrevida (38). À análise univariada, a presença de invasão vascular, alto índice mitótico e tumores de alto grau relacionaram-se com pior sobrevida. Por outro lado, à análise multivariada, apenas a invasão vascular e o grau de diferenciação histológica mantiveram-se como preditores de pior prognóstico. 19 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Jemal A, Bray F, et al. Global cancer statistics. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 2012;61(2):69-90. 2. Roayaie S, Schwartz JD, Sung MW, Emre SH, Miller CM, Gondolesi GE, et al. Recurrence of hepatocellular carcinoma after liver transplant: patterns and prognosis. Liver Transpl. 2004;10(4):534-40. 3. Esnaola NF, Lauwers GY, Mirza NQ, Nagorney DM, Doherty D, Ikai I, et al. Predictors of microvascular invasion in patients with hepatocellular carcinoma who are candidates for orthotopic liver transplantation. J Gastrointest Surg. 2002;6(2):224-32; discussion 32. 4. Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C, Parkin DM. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer. 2010;127(12):2893-917. 5. El-Serag HB. Epidemiology of hepatocellular carcinoma. Clin Liver Dis. 2001;5(1):87-107, vi. 6. El-Serag HB, Rudolph KL. Hepatocellular carcinoma: epidemiology and molecular carcinogenesis. Gastroenterology. 2007;132(7):2557-76. 7. El-Serag HB. Hepatocellular carcinoma. N Engl J Med. 2011;365(12):1118-27. 8. Sherman M. Hepatocellular carcinoma: epidemiology, surveillance, and diagnosis. Semin Liver Dis. 2010;30(1):3-16. 9. Davila JA, Morgan RO, Shaib Y, McGlynn KA, El-Serag HB. Diabetes increases the risk of hepatocellular carcinoma in the United States: a population based case control study. Gut. 2005;54(4):533-9. 10. Marrero JA, Fontana RJ, Fu S, Conjeevaram HS, Su GL, Lok AS. Alcohol, tobacco and obesity are synergistic risk factors for hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 2005;42(2):218-24. 11. Velázquez RF, Rodríguez M, Navascués CA, Linares A, Pérez R, Sotorríos NG, et al. Prospective analysis of risk factors for hepatocellular carcinoma in patients with liver cirrhosis. Hepatology. 2003;37(3):520-7. 12. Bruix J, Sherman M. Management of hepatocellular carcinoma: an update. Hepatology. 2011;53(3):1020-2. 20 13. Zhang BH, Yang BH, Tang ZY. Randomized controlled trial of screening for hepatocellular carcinoma. J Cancer Res Clin Oncol. 2004;130(7):417-22. 14. Singal A, Volk ML, Waljee A, Salgia R, Higgins P, Rogers MA, et al. Meta- analysis: surveillance with ultrasound for early-stage hepatocellular carcinoma in patients with cirrhosis. Aliment Pharmacol Ther. 2009;30(1):37-47. 15. Zhang B, Yang B. Combined alpha fetoprotein testing and ultrasonography as a screening test for primary liver cancer. J Med Screen. 1999;6(2):108-10. 16. Liver EAFTSOT, Cancer EOFRATO. EASL-EORTC clinical practice guidelines: management of hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 2012;56(4):908-43. 17. Yu JS, Kim KW, Kim EK, Lee JT, Yoo HS. Contrast enhancement of small hepatocellular carcinoma: usefulness of three successive early image acquisitions during multiphase dynamic MR imaging. AJR Am J Roentgenol. 1999;173(3):597- 604. 18. Forner A, Vilana R, Ayuso C, Bianchi L, Solé M, Ayuso JR, et al. Diagnosis of hepatic nodules 20 mm or smaller in cirrhosis: Prospective validation of the noninvasive diagnostic criteria for hepatocellular carcinoma. Hepatology. 2008;47(1):97-104. 19. Sangiovanni A, Manini MA, Iavarone M, Romeo R, Forzenigo LV, Fraquelli M, et al. The diagnostic and economic impact of contrast imaging techniques in the diagnosis of small hepatocellular carcinoma in cirrhosis. Gut. 2010;59(5):638-44. 20. Forner A, Llovet JM, Bruix J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 2012;379(9822):1245-55. 21. Mazzaferro V, Regalia E, Doci R, Andreola S, Pulvirenti A, Bozzetti F, et al. Liver transplantation for the treatment of small hepatocellular carcinomas in patients with cirrhosis. N Engl J Med. 1996;334(11):693-9. 22. Freeman RB, Wiesner RH, Harper A, McDiarmid SV, Lake J, Edwards E, et al. The new liver allocation system: moving toward evidence-based transplantation policy. Liver Transpl. 2002;8(9):851-8. 23. Kamath PS, Wiesner RH, Malinchoc M, Kremers W, Therneau TM, Kosberg CL, et al. A model to predict survival in patients with end-stage liver disease. Hepatology. 2001;33(2):464-70. 24. Mazzaferro V, Llovet JM, Miceli R, Bhoori S, Schiavo M, Mariani L, et al. Predicting survival after liver transplantation in patients with hepatocellular carcinoma 21 beyond the Milan criteria: a retrospective, exploratory analysis. Lancet Oncol. 2009;10(1):35-43. 25. Marshall A, Alexander G. Vascular invasion leaves its mark in hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 2011;55(6):1174-5. 26. Vauthey JN, Klimstra D, Franceschi D, Tao Y, Fortner J, Blumgart L, et al. Factors affecting long-term outcome after hepatic resection for hepatocellular carcinoma. Am J Surg. 1995;169(1):28-34; discussion -5. 27. Dudek K, Kornasiewicz O, Remiszewski P, Kobryń K, Ziarkiewicz-Wróblewska B, Górnicka B, et al. Impact of tumor characteristic on the outcome of liver transplantation in patients with hepatocellular carcinoma. Transplant Proc. 2009;41(8):3135-7. 28. Briceño J, Ruiz J, Ciria R, Naranjo A, Sánchez-Hidalgo J, Luque A, et al. Factors affecting survival and tumor recurrence in patients transplanted for hepatocellular carcinoma and coexistent hepatitis C virus. Transplant Proc. 2008;40(9):2990-3. 29. Vauthey JN, Lauwers GY, Esnaola NF, Do KA, Belghiti J, Mirza N, et al. Simplified staging for hepatocellular carcinoma. J Clin Oncol. 2002;20(6):1527-36. 30. Parfitt JR, Marotta P, Alghamdi M, Wall W, Khakhar A, Suskin NG, et al. Recurrent hepatocellular carcinoma after transplantation: use of a pathological score on explanted livers to predict recurrence. Liver Transpl. 2007;13(4):543-51. 31. Coelho GR, Vasconcelos KF, Vasconcelos JB, Barros MA, Costa PE, Borges GC, et al. Orthotopic liver transplantation for hepatocellular carcinoma: one center's experience in the Northeast of Brazil. Transplant Proc. 2009;41(5):1740-2. 32. Edmondson HA, Steiner PE. Primary carcinoma of the liver: a study of 100 cases among 48,900 necropsies. Cancer. 1954;7(3):462-503. 33. Cillo U, Vitale A, Bassanello M, Boccagni P, Brolese A, Zanus G, et al. Liver transplantation for the treatment of moderately or well-differentiated hepatocellular carcinoma. Ann Surg. 2004;239(2):150-9. 34. Pawlik TM, Delman KA, Vauthey JN, Nagorney DM, Ng IO, Ikai I, et al. Tumor size predicts vascular invasion and histologic grade: Implications for selection of surgical treatment for hepatocellular carcinoma. Liver Transpl. 2005;11(9):1086-92. 35. Jonas S, Bechstein WO, Steinmüller T, Herrmann M, Radke C, Berg T, et al. Vascular invasion and histopathologic grading determine outcome after liver 22 transplantation for hepatocellular carcinoma in cirrhosis. Hepatology. 2001;33(5):1080-6. 36. DuBay D, Sandroussi C, Sandhu L, Cleary S, Guba M, Cattral MS, et al. Liver transplantation for advanced hepatocellular carcinoma using poor tumor differentiation on biopsy as an exclusion criterion. Ann Surg. 2011;253(1):166-72. 37. Ouchi K, Sugawara T, Ono H, Fujiya T, Kamiyama Y, Kakugawa Y, et al. Mitotic index is the best predictive factor for survival of patients with resected hepatocellular carcinoma. Dig Surg. 2000;17(1):42-8. 38. Lauwers GY, Terris B, Balis UJ, Batts KP, Regimbeau JM, Chang Y, et al. Prognostic histologic indicators of curatively resected hepatocellular carcinomas: a multi-institutional analysis of 425 patients with definition of a histologic prognostic index. Am J Surg Pathol. 2002;26(1):25-34. 23 3 OBJETIVOS 3.1 Objetivo geral Investigar associação entre dados clínicos e características patológicas do CHC e a ocorrência de invasão vascular microscópica e sobrevida, em pacientes submetidos ao TH no HC da UFMG. 3.2 Objetivos específicos Investigar a associação entre dados clínico-demográficos, laboratoriais e histopatológicos do CHC e presença de invasão vascular microscópica e recorrência e sobrevida após o TH. 24 4 MÉTODOS 4.1 Delineamento do estudo Trata-se de estudo de série de casos no qual foram avaliados parâmetros clínicos e histológicos de pacientes com CHC submetidos ao TH no HC da UFMG no período de julho de 2001 a dezembro de 2010. 4.2 Seleção dos casos e coleta dos dados clínicos Foram incluídos 107 casos de CHC identificados através do prontuário eletrônico do ambulatório de TH do HC da UFMG. Neste serviço os pacientes são selecionados por meio dos critérios de Milão e são alocados em fila de acordo com o escore de MELD. Foram revistos os prontuários médicos dos pacientes incluídos para obtenção das informações clínicas. O diagnóstico das hepatopatias não foi revisto, portanto, a etiologia aceita foi aquela descrita pelo médico que atendeu o paciente previamente, seguindo-se o protocolo de abordagem diagnóstica utilizado pelo Grupo de Transplante de Órgãos do HC da UFMG, o qual inclui sorologias para hepatites virais, cinética do ferro e autoanticorpos. Foi revista a história pregressa e classificados como tabagistas, aqueles que fumavam à época do transplante ou que haviam interrompido o hábito há menos de um ano. Pacientes com diagnóstico prévio de diabetes mellitus ou que estavam em uso de insulina ou hipoglicemiantes orais foram considerados diabéticos. Foram obtidos do prontuário médico a classificação de Child-Pugh e escore MELD, assim como os seguintes exames laboratoriais: creatinina, AFP, albumina, bilirrubina total e RNI. 25 4.3 Avaliação histológica A avaliação histológica foi realizada por um único patologista que reviu as lâminas coradas em hematoxilina-eosina (HE) e descrita de acordo com o protocolo desenvolvido como parte deste estudo (Apêndice B). As variáveis fibrose e necrose foram classificadas em presente ou ausente no parênquima tumoral. A esteatose foi considerada positiva quando presente em mais de 5% das células do parênquima tumoral. Inflamação tumoral foi considerada positiva quando havia mais de cinco células inflamatórias por campo de grande aumento, em 10 campos de grande aumento consecutivos. Atividade mitótica foi avaliada através da exploração de 10 campos de grande aumento consecutivos e graduada em baixa, quando havia até duas figuras de mitose, ou, em alta, quando havia três ou mais figuras de mitose por campo de grande aumento. A arquitetura tumoral foi classificada de acordo com o tipo predominante do tumor como trabecular, pseudoglandular e sólido1. O padrão trabecular caracteriza- se por crescimento em cordões ou placas com espessura de duas ou mais células (Figura 1). O pseudoacinar (pseudoglandular) apresenta formação de espaços glanduliformes de células com aspecto de hepatócitos (Figura 2). O padrão sólido apresenta-se com crescimento compacto das células tumorais com poucos espaços vasculares reconhecíveis (Figura 3). 1 Bacchi C, Almeida P, Franco M. Manual de padronização de laudos histopatológicos. Rio de Janeiro1999. 26 Figura 1: Carcinoma hepatocelular padrão trabecular. Figura 2: Carcinoma hepatocelular padrão pseudoglandular. 27 Figura 3: Carcinoma hepatocelular padrão sólido. O grau de diferenciação histológica predominante segundo Edmondson e Steiner foi classificado de I a IV e agrupado em I e II, bem diferenciados (células tumorais semelhantes ao hepatócito, citoplasma acidófilo e núcleos de tamanho normais a levemente aumentados, semelhante ao padrão trabecular), e III e IV, pouco diferenciados, (núcleos hipercromáticos de tamanhos variados, citoplasma menos acidófilo)2 (Figuras 4 e 5, respectivamente). 2 Edmondson HA, Steiner PE. Primary carcinoma of the liver: a study of 100 cases among 48,900 necropsies. Cancer. 1954;7(3):462-503. 28 Figura 4: Carcinoma hepatocelular bem diferenciado. Figura 5: Carcinoma hepatocelular pouco diferenciado. 29 A invasão vascular microscópica foi definida pela presença de êmbolo tumoral na veia central, na veia porta ou nos vasos da pseudocápsula fibrosa tumoral e foi avaliada em cortes rotineiros corados em HE3. 4.4 Análise estatística Os dados coletados foram digitados em banco de dados criados em Excel 14.0 (Microsoft Office 2010) e as análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o software SPSS versão 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Os resultados foram descritos por meio de frequências e porcentagens para as varáveis categóricas e de medidas de tendência central (médias e medianas) e de dispersão (desvio padrão e intervalo interquartílico) para as variáveis quantitativas. Para a análise univariada, empregou-se o teste qui-quadrado (χ2) ou teste exato de Fisher na comparação entre varáveis dicotômicas (gênero, etiologia da cirrose, tabagismo, presença de diabetes mellitus, Child-Pugh escore, índice mitótico, grau de diferenciação histológica, arquitetura tumoral, presença de fibrose, inflamação, esteatose e necrose no parênquima tumoral). O teste de Mann-Whitney foi empregado na comparação de variáveis contínuas (idade, creatinina, albumina sérica, AFP, bilirrubina total, RNI, escore de MELD). A análise de sobrevida foi realizada utilizando-se o teste Kaplan-Meier. As variáveis com p<0,20 na análise univariada foram incluídas em modelo multivariado. A adequação do modelo de regressão logística foi realizada pelo teste de Hosmer Lemeshow. 3 Vauthey JN, Lauwers GY, Esnaola NF, Do KA, Belghiti J, Mirza N, et al. Simplified staging for hepatocellular carcinoma. J Clin Oncol. 2002;20(6):1527-36. 30 5 ARTIGO Title: Histological grade and Mitotic index as predictors of microvascular invasion in Hepatocellular Carcinoma Fernanda Maria Farage OSÓRIO1, Paula Vieira Teixeira VIDIGAL4, Teresa Cristina Abreu FERRARI1, 2, Agnaldo Soares LIMA2, 3, Gabriel Martin LAUAR1 and Claudia Alves COUTO1, 2 1 Department of Internal Medicine, Faculty of Medicine, Federal University of Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, Brazil; 2 Alfa Gastroenterology Institute, University Hospital, Federal University of Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, Brazil; 3 Department of Surgery, Faculty of Medicine, Federal University of Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, Brazil; 4 Department of Pathology and Legal Medicine, Faculty of Medicine, Federal University of Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, Brazil. Keywords: hepatocellular carcinoma, microvascular invasion, liver transplantation, prognostic factors, histological grade 31 ABSTRACT Background: Microvascular invasion (MVI) is a well-known risk factor for hepatocellular carcinoma (HCC) recurrence and mortality after liver transplantation (LT). The aim of this study was to determine clinicopathological predictive factors associated with MVI. Methods: Records of all patients who underwent LT due to HCC between July 2001 and December 2010 at Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Minas Gerais were reviewed. Laboratory tests, clinical and demographic data were obtained. Histopathological review of the hematoxylin and eosin specimens was performed by a single liver pathologist. Results: A total of 107 patients were included, 76 male (71%) and the mean age was 56.8 (±8.7). Tumor recurrence rate was 12.9%. One, three and five years overall survival was 75.0, 71.4 and 67.5% respectively. Only tumor recurrence was associated with mortality (p=0.038; OR= 2.54; CI 1.052 to 6.106). Mitotic index, histological grade, tumor architecture, alpha-fetoprotein and tumor fibrosis were includes in the multivariate model. Significant independent predictors of MVI on logistic regression analysis were histological grade and mitotic index (p < 0.001; OR 3.16; CI 1.525 to 4.156 and p = 0.046; OR 2.56; CI 1.061 to 6.451 respectively). Discussion: Mitotic index and histological grade are good predictors of MVI. No other risk factor was identified in the logistic regression. These results highlight the importance of discussing pre transplantation liver biopsy to access prognosis and define treatment modalities in the setting of LT. 32 INTRODUCTION Primary liver cancer is the sixth most common cancer worldwide and the third cause of cancer related mortality; and, hepatocellular carcinoma (HCC) accounts for 85% to 90% of primary liver cancer (1, 2). Currently, orthotopic liver transplantation (LT) is the treatment of choice in selected patients with HCC and end-stage liver disease although cancer recurrence is still a major concern for its high incidence (3, 4). The selection criteria most widely used for indicating LT is the Milan criteria, which takes into account number and size of tumor nodules (5). Pathological data are usually not evaluated prior to HCC resection or LT although studies have shown its importance in providing information on recurrence and mortality. Microvascular invasion (MVI) is a well-recognized predictor of worse outcome and post-LT tumor recurrence (6, 7). HCC is a highly vascular tumor with a high propensity for vascular invasion, which is usually identified either macroscopically, when the invasion of the vessel is visible on gross examination, or microscopically, when the invasion is visible only on microscopy (8). Given the fact that MVI can only be confirmed as definitely present or absent when the whole tumor is available for careful histological examination after its resection or LT (9) preoperative methods of assessing the probability of MVI are needed. Our aim was to identify clinicopathological risk factors affecting MVI invasion in a group of patients who underwent LT due to HCC in a single center. PATIENTS AND METHODS Clinical records of all patients who underwent LT at the Hospital das Clínicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Brazil, between January 2001 and December 2010 were reviewed after the study approval by the local Ethics Committee. Data obtained included demographic, clinical (etiology of the underlying chronic liver disease, history of tobacco use, diabetes mellitus, Child Pugh score, Model of End Stage Liver Disease [MELD] score) and laboratory values (serum 33 alpha-fetoprotein [AFP], creatinine, albumin, total bilirubin and international normalized ratio [INR]). Patients with previous diagnosis or those under use of insulin or oral hypoglycemic agents were assumed to have diabetes mellitus and those who were under use of tobacco or those who quit a year before were considered smokers. In our institution LT is performed only in patients fulfilling the Milan criteria (preoperative imaging identifying either a single lesion of ≤5 cm or up to 3 lesions ≤3 cm) (5). Follow-up time was defined as the time from transplant to the last visit after LT. Per protocol, visits are conducted on an outpatient basis and all patients receive the same intra and post-operative care. Main immunosuppressant regimen is based on the administration of tacrolimus and a tapering dose of prednisone within 3 months, associated or not with mycophenolate mofetil. HISTOPATHOLOGICAL VARIABLES The histopathological assessment was based on the review, by a single liver pathologist, of all hematoxylin and eosin-stained sections. The histological features evaluated included: presence of fibrosis, steatosis, inflammation (more than 5 inflammatory cell/high power field [HPF] in 10 HPF) and necrosis inside the tumor parenchyma. They were reported as being either absent or present. Tumor architecture was assessed for trabecular, pseudoglandular and solid growth patterns. Predominant Edmonson and Steiner´s grade was classified and grouped, I and II as well differentiated, and III and IV as poor differentiated (10). Mitotic activity was counted by reviewing 10 HPF and classified as low (up to 2 mitotic figures in a HPF) or high (3 or more mitotic figures in a HPF) index in 10 HPF. MVI was defined as the presence of tumor emboli within the central vein, the portal vein, or large capsular vessels (Figure 1). 34 Figure 1: vascular invasion of a vessel in high power field STATISTICAL ANALYSES χ2 test or exact Fisher test were used for univariate comparisons between dichotomous variables (gender, cirrhosis etiology, tobacco use, diabetes mellitus, CHILD score, histological grade, tumor architecture, mitotic index and presence of steatosis, fibrosis, inflammation and necrosis within the tumor parenchyma), whereas unpaired t test or Mann-Whitney test were used to compare continues variables (age, creatinine, albumin levels. MELD score, INR, AFP and total bilirubin) as appropriate. The variables which p values were < 0.20 in the univariate analysis were included in the multivariate model to assess microscopic vascular invasion. The adequacy of the logistic regression model was accessed by the Hosmer Lemeshow test. Survival analysis was performed using Kaplan-Meier test. 35 All statistical analyses were performed using the computer software SPSS version 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) RESULTS During the study period, 107 patients were submitted to LT due to HCC and selected for this investigation: 76 were male (71%) and 31 female (29%), and the mean age was 56.8 (±8.7) years. It was not possible to retrieve histological samples from 5 patients; therefore, the final number was 102 individuals. The median follow- up time was 49.2 months (range 0-134 months) and the recurrence rate was 12.9% with a mean time of recurrence of 62.7 months (range 11.5-127.5 months). The results of the univariate analysis related to recurrence are shown in Table 1. Only vascular invasion was associated to HCC recurrence (p=0.05). One, three and five years overall survival was 75%, 71.4% and 67.5%, respectively; and a comparative analysis between the clinical and histological characteristics and survival were performed as shown in Table 2. The recurrence and survival analyses were performed excluding 14 patients due to early post-operative death, within the first month after LT. 36 Table 1: Comparative analysis between the clinical and histological characteristics and tumor recurrence (univariate analysis) Characteristics Recurrence (N/N) No recurrence (N/N) P value Male sex 2 10/12 (83.3%) 55/81 (67.9%) 0.336 HBV 2 HCV 1 Ethanol abuse 2 Cryptogenic 2 Other etiology 2 Smokers 2 Child-Pugh * A B C 1/12 (8.3%) 8/12 (66.7%) 3/12 (25.0%) 0/12 1/12 (8.3%) 4/11 (36.5) 2/10 (20%) 8/10 (80%) 0/10 4/81 (4.9%) 43/81 (53.1%) 28/81 (34.6%) 10/81 (12.3%) 6/81(7.4%) 18/78 (23.1) 21/74 (28.4%) 35/74 (47.3%) 18/74 (24.3%) 0.507 0.378 0.745 0.350 1.000 0.455 0.499 Diabetes mellitus 2 4/11 (36.4%) 15/81(18.5%) 0.229 High mitotic index 2 Histological grade 2 Low High Presence of MVI 2 Tumor architecture 2 Trabecular Pseudoglandular Solid Tumor Fibrosis 2 Yes No Tumor Inflamation 2 Yes No Tumor Necrosis 1 Yes No Tumor Steatosis 2 Yes No 4/12 (33.3%) 8/12 (66.7%) 4/12 (33.3%) 8/12 (66.7%) 5/12 (41.7%) 6/12 (50.0%) 1/12 (8.3%) 1/12 (8.3%) 11/12 (91.7%) 3/12 (25.0%) 9/12 (75.0%) 5/12 (41.7%) 7/12 (58.3%) 2/12 (16.7%) 10/12 (83.3%) Mean ± SD 17/76 (22.4%) 57/76 (75.0%) 19/76 (25.0%) 25/76 (32.9%) 44/76 (57.9%) 23/76 (30.3%) 9/76 (11.8%) 18/76 (23.7%) 58/76 (76.3%) 28/75(37.3%) 47/75 (62.7%) 38/76 (50.0%) 38/76 (50.0%) 25/76 (32.9%) 51/76 (67.1%) Mean ± SD 0.470 0.504 0.050 0.447 0.449 0.526 0.591 0.330 P value Albumin 3 AFP 3 MELD score 3 INR 3 Total bilirrubin 3 Age 3 3.4 ± 0.4 90.89 ± 224.4 13.18 ± 3.7 1.47 ± 0.4 2.54 ± 1.4 56.21 ± 5.2 3.1 ± 0.7 317.76 ± 895.6 15.4 ± 5.6 1.57 ± 0.5 2.36 ± 2.2 56.63 ± 9.5 0.203 0.658 0.409 0.578 0.261 0.521 N/N: number of patients with the characteristics/number for whom the information was available; 1 Qui- square; 2 Fisher Test ; 3 Mann-Whitney; * Linear-by-Linear association; HBV: hepatitis B virus ; HCV: hepatitis C virus; AFP: alpha-fetoprotein; INR: international normalized ratio 37 Table 2: Comparative analysis between the clinical and histological characteristics and survival (univariate analysis) Variables N/N % P value Sex 0.442 Male 65/93 69.9 Female 28/93 30.1 Ethanol Abuse 31/93 33.3 0.851 HCV 51/93 54.8 0.931 HBV 5/93 5.4 0.631 Other etiology 7/93 7.5 0.109 Smokers 22/89 24.7 0.067 Diabetes mellitus 19/92 20.7 0.142 Child-Pugh A B C 23/84 43/84 18/84 27.4 51.2 21.4 0.905 Tumor recurrence 12/88 13.6 0.033 Tumor architecture 0.832 Trabecular Pseudoglandular Solid 49/88 29/88 10/88 55.7 33.0 11.4 Low mitotic index 67/88 76.0 0.427 Tumor Fibrosis 19/88 21.6 0.791 Tumor Inflammation 31/87 35.5 0.823 Tumor necrosis 43/88 48.9 0.253 Tumor Steatosis Vascular Invasion 27/88 33/88 30.7 37.5 0.954 0.343 High grade 23/88 26.1 0.603 Median Mean± SD P value Age (years) 57.7 56.8 ± 9.0 0.568 AFP (ng/mL) 15.5 287 ± 839.4 0.422 MELD score 15 14.79 ±5.4 0.631 INR Total Bilirrubin (mg/dl) Creatinine (mg/dl) Albumin 1.4 2.0 0.9 3.0 1.60 ± 0.6 2.39 ± 2.1 0.96 ± 0.4 3.16 ± 0.7 0.201 0.411 0.144 0.766 N/N: number of patients with the characteristics/number for whom the information was available; HCV: hepatitis C virus; HBV: hepatitis B virus AFP: alpha-fetoprotein; INR: international normalized ratio The etiology of the underlying chronic liver disease was viral hepatitis C in 56.1% of the individuals, alcohol abuse in 32.7%, viral hepatitis B in 5.6%, cryptogenic cirrhosis in 12.1%, and other etiologies in 6.2% (two cases of 38 autoimmune hepatitis, and one case of hemochromatosis, primary biliary cirrhosis, the Budd Chiari syndrome, Caroli´s disease and non-alcoholic steatohepatitis). At the time of LT, the mean values of the following variables were: MELD score 14.7 (range 6-32), AFP level 255.7 ng/ml (range, 1.2-5592 ng/ml), INR 1.59 (range, 0.99-5.6), creatinine 0.99 mg/dl (range, 0.14- 3 mg/dl), albumin 3.1 g/dl (range 1.1-4.8 g/dl), total bilirubin 2.4 mg/dl (range 0.2-12.5 mg/dl). Diabetes mellitus was present in 19.8%, and 24.3% of the patients were smokers by the time of LT. The frequencies of Child Pugh A, B and C were 25.8%, 51.5% and 22.7%, respectively. The majority of tumors had a low mitotic index (n= 79/102; 77.5%) and low histological grade (n=75/102; 77.3%). The evaluation of tumor parenchyma showed the presence of fibrosis, inflammation, necrosis and steatosis in 23.5%, 35.6%, 44.1% and 28.4% respectively. MVI was identified in 38.2% of reviewed samples. Analysis of clinical and histological factors associated with MVI is shown in Table 3. Mitotic index, histological grade, AFP, tumor architecture and tumor fibrosis were selected to be included in the multivariate analysis model. Histological grade (p < 0.001; OR 3.16; CI 1.525 to 4.156) and high mitotic index (p = 0.046; OR 2.56; CI 1.061 to 6.451) were independently associated with MVI on logistic regression analysis. 39 Table 3: Comparative analysis between the clinical and histological characteristics and microvascular invasion (univariate analysis) Variables MVI (N=39) No MVI (N=63) P value Sex 1 Male Female Tumor architecture 1 Trabecular Pseudoglandular Solid Tumor Fibrosis 1 Yes No Tumor Inflamation 1 Yes No Tumor Necrosis 1 Yes No Tumor Steatosis 1 Yes No Tumor Mitotic index 1 High Low Tumor Histological grade 1 High Low HCV 1 HBV 1 Ethanol abuse 1 Cryptogenic 2 Other etiology 2 Smokers 1 Child Pugh * A B C Diabetes mellitus 1 29 (74.4%) 10 (25.6%) 19 (48.7%) 16 (41.0%) 04 (10.3%) 12 (30.8%) 27 (69.2%) 16 (41.0%) 23 (59.0%) 16 (41.0%) 23 (59.0%) 10 (25.6%) 29 (74.4%) 16 (41.0%) 23 (59.0%) 17 (43.6%) 22 (56.4%) 23 (59.0%) 01 (2.6%) 14 (35.9%) 05 (12.8%) 01 (2.6%) 08 (21.1%) 04 (11.4%) 27 (77.1%) 04 (11.4%) 09 (23.7%) Mean ± SD 44 (69.8%) 19 (30.2%) 40 (63.5%) 15 (23.8%) 08 (12.7%) 12 (19.0%) 51 (81.0%) 20 (32.3%) 42 (67.7%) 29 (46.0%) 34 (54.0%) 19 (30.2%) 44 (69.8%) 07 (11.1%) 56 (88.9%) 10 (15.9%) 53 (84.1%) 34 (54.0%) 05 (07.9%) 19 (30.2%) 08 (12.7%) 06 (9.5%) 15 (25.0%) 18 (31.6%) 22 (38.6%) 17 (29.8%) 11 (17.5%) Mean ± SD 0.623 0.184 0.175 0.370 0.621 0.623 0.001 0.002 0.621 0.403 0.547 1.000 0.246 0.653 0.905 0.447 P value Age (years) 3 57.3 ± 8.8 56.8 ± 8.5 0.485 AFP (ng/mL) 3 267.6 ± 615.9 227.2 ± 897.3 0.066 MELD score 3 14.5 ± 4.7 15.2 ± 6.0 0.780 INR 3 Total Bilirrubin(mg/dl) 3 Creatinine (mg/dl) 3 Albumin 3 1.5 ± 0.3 2.4 ± 1.6 1.0 ± 0.5 3.0 ± 0.5 1.7 ± 0.7 2.6 ± 2.4 1.0 ± 0.4 3.1 ± 0.8 0.267 0.465 0.526 0.976 1 Chi-square; 2 Fisher Test; 3 Mann-Whitney; * Linear-by-Linear association; MVI: microvascular invasion; HCV: hepatitis C virus; HBV: hepatitis B virus; AFP: alpha fetoprotein; INR: international normalized ratio 40 DISCUSSION The selection of patients for LT using the Milan criteria is based on tumor size and number, and macroscopic vascular invasion. However, imaging methods can either understage or overstage HCC (11). The most important feature not taken into account in the current selection criteria is MVI, which has been proved to be the main prognostic factor independently associated with survival after tumor resection and LT (12-15). Since tumor MVI cannot be determined preoperatively, surrogate markers of MVI are of utmost importance and have been largely investigated. In our study, 38.2% of tumors presented MVI, similarly to what have been previously reported by others (16, 17). However, our overall survival rate was smaller which might have been influenced by the higher rates of post-operative deaths. Two important markers of MVI were identified in multivariate analysis: tumor grade and mitotic index, and both could be recognized in a biopsy specimen prior to LT. Other pathologic variables were evaluated by the pathologist, including tumor architecture, steatosis, inflammation, fibrosis and necrosis within the tumor parenchyma, but none showed a positive association with MVI. Parfitt et al. (2007) have already studied tumor architecture, necrosis and inflammation and steatosis within the tumor and found no association with HCC recurrence (18). It has been previously shown that tumor grade is a surrogate marker of MVI (19-22). Furthermore, several studies have demonstrated a direct association of tumor differentiation grade with outcome after treatment (23-25). Colechia et al. (2011) showed that pre-operative liver biopsy was a safe and accurate diagnostic tool for tumor grading assessment. Additionally, those authors confirmed a close relationship between tumor grade and MVI: i.e., the high grade HCCs were more than twice more likely to have MVI in relation to the low grade HCCs (26). Mitotic index has also been associated with early tumor recurrence and worse prognosis (27-29), but it was not previously recognized as an MVI predictor, to our knowledge. Schmilovitz-Weiss et al. (2011) showed that mitotic activity evaluated by Ki-67 immunostaining was independently associated with mortality (30). Ouchi et al. (2000) found that mitotic index was the main characteristic associated with mortality 41 after HCC resection in the multivariate analyses; therefore, they considered this index a good predictor of poor survival (31). The retrospective nature of the present study might be a limitation, as some clinical information was missed. In conclusion we found tumor histological grade and mitotic index were independently associated with MVI. No other clinical features (etiology, gender, age, laboratory tests, MELD score and Child Pugh) prior to the histological assessment predicted MVI. These results are in accordance with previous studies and highlight the importance of discussing pre transplantation liver biopsy to access prognosis and define treatment modalities in the setting of LT for HCC. As HCC is a cancer with high recurrence rate and mortality, the use of predictors of MVI may lead to changes in management and follow-up after LT or tumor resection. REFERENCES 1. Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C, Parkin DM. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer. 2010;127(12):2893-917. 2. El-Serag HB, Rudolph KL. Hepatocellular carcinoma: epidemiology and molecular carcinogenesis. Gastroenterology. 2007;132(7):2557-76. 3. Llovet JM, Schwartz M, Mazzaferro V. Resection and liver transplantation for hepatocellular carcinoma. Semin Liver Dis. 2005;25(2):181-200. 4. Marsh JW, Dvorchik I, Subotin M, Balan V, Rakela J, Popechitelev EP, et al. The prediction of risk of recurrence and time to recurrence of hepatocellular carcinoma after orthotopic liver transplantation: a pilot study. Hepatology. 1997;26(2):444-50. 5. Mazzaferro V, Regalia E, Doci R, Andreola S, Pulvirenti A, Bozzetti F, et al. Liver transplantation for the treatment of small hepatocellular carcinomas in patients with cirrhosis. N Engl J Med. 1996;334(11):693-9. 42 6. Shetty K, Timmins K, Brensinger C, Furth EE, Rattan S, Sun W, et al. Liver transplantation for hepatocellular carcinoma validation of present selection criteria in predicting outcome. Liver Transpl. 2004;10(7):911-8. 7. Jonas S, Bechstein WO, Steinmüller T, Herrmann M, Radke C, Berg T, et al. Vascular invasion and histopathologic grading determine outcome after liver transplantation for hepatocellular carcinoma in cirrhosis. Hepatology. 2001;33(5):1080-6. 8. Roayaie S, Blume IN, Thung SN, Guido M, Fiel MI, Hiotis S, et al. A system of classifying microvascular invasion to predict outcome after resection in patients with hepatocellular carcinoma. Gastroenterology. 2009;137(3):850-5. 9. Marshall A, Alexander G. Vascular invasion leaves its mark in hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 2011;55(6):1174-5. 10. Edmondson HA, Steiner PE. Primary carcinoma of the liver: a study of 100 cases among 48,900 necropsies. Cancer. 1954;7(3):462-503. 11. Wiesner RH, Freeman RB, Mulligan DC. Liver transplantation for hepatocellular cancer: the impact of the MELD allocation policy. Gastroenterology. 2004;127(5 Suppl 1):S261-7. 12. Vauthey JN, Klimstra D, Franceschi D, Tao Y, Fortner J, Blumgart L, et al. Factors affecting long-term outcome after hepatic resection for hepatocellular carcinoma. Am J Surg. 1995;169(1):28-34; discussion -5. 13. Thuluvath PJ. Vascular invasion is the most important predictor of survival in HCC, but how do we find it? J Clin Gastroenterol. 2009;43(2):101-2. 14. Yao FY. Expanded criteria for liver transplantation in patients with hepatocellular carcinoma. Hepatol Res. 2007;37 Suppl 2:S267-74. 15. Vauthey JN, Ajani JA. Liver transplantation and hepatocellular carcinoma biology: beginning of the end of the era of educated guesses. J Clin Oncol. 2003;21(23):4265-7. 16. Moon JI, Kwon CH, Joh JW, Choi GS, Jung GO, Kim JM, et al. Primary versus salvage living donor liver transplantation for patients with hepatocellular carcinoma: impact of microvascular invasion on survival. Transplant Proc. 2012;44(2):487-93. 17. McHugh PP, Gilbert J, Vera S, Koch A, Ranjan D, Gedaly R. Alpha-fetoprotein and tumour size are associated with microvascular invasion in explanted livers of 43 patients undergoing transplantation with hepatocellular carcinoma. HPB (Oxford). 2010;12(1):56-61. 18. Parfitt JR, Marotta P, Alghamdi M, Wall W, Khakhar A, Suskin NG, et al. Recurrent hepatocellular carcinoma after transplantation: use of a pathological score on explanted livers to predict recurrence. Liver Transpl. 2007;13(4):543-51. 19. Pawlik TM, Delman KA, Vauthey JN, Nagorney DM, Ng IO, Ikai I, et al. Tumor size predicts vascular invasion and histologic grade: Implications for selection of surgical treatment for hepatocellular carcinoma. Liver Transpl. 2005;11(9):1086-92. 20. D'Amico F, Schwartz M, Vitale A, Tabrizian P, Roayaie S, Thung S, et al. Predicting recurrence after liver transplantation in patients with hepatocellular carcinoma exceeding the up-to-seven criteria. Liver Transpl. 2009;15(10):1278-87. 21. Mazzaferro V, Llovet JM, Miceli R, Bhoori S, Schiavo M, Mariani L, et al. Predicting survival after liver transplantation in patients with hepatocellular carcinoma beyond the Milan criteria: a retrospective, exploratory analysis. Lancet Oncol. 2009;10(1):35-43. 22. Klintmalm GB. Liver transplantation for hepatocellular carcinoma: a registry report of the impact of tumor characteristics on outcome. Ann Surg. 1998;228(4):479- 90. 23. Kishi K, Shikata T, Hirohashi S, Hasegawa H, Yamazaki S, Makuuchi M. Hepatocellular carcinoma. A clinical and pathologic analysis of 57 hepatectomy cases. Cancer. 1983;51(3):542-8. 24. Kemeny F, Vadrot J, Wu A, Smadja C, Meakins JL, Franco D. Morphological and histological features of resected hepatocellular carcinoma in cirrhotic patients in the West. Hepatology. 1989;9(2):253-7. 25. Sasaki Y, Imaoka S, Ishiguro S, Nakano H, Kasugai H, Fujita M, et al. Clinical features of small hepatocellular carcinomas as assessed by histologic grades. Surgery. 1996;119(3):252-60. 26. Colecchia A, Scaioli E, Montrone L, Vestito A, Di Biase AR, Pieri M, et al. Pre- operative liver biopsy in cirrhotic patients with early hepatocellular carcinoma represents a safe and accurate diagnostic tool for tumour grading assessment. J Hepatol. 2011;54(2):300-5. 27. Guzman G, Alagiozian-Angelova V, Layden-Almer JE, Layden TJ, Testa G, Benedetti E, et al. p53, Ki-67, and serum alpha feto-protein as predictors of 44 hepatocellular carcinoma recurrence in liver transplant patients. Mod Pathol. 2005;18(11):1498-503. 28. Nakanishi K, Sakamoto M, Yamasaki S, Todo S, Hirohashi S. Akt phosphorylation is a risk factor for early disease recurrence and poor prognosis in hepatocellular carcinoma. Cancer. 2005;103(2):307-12. 29. Morinaga S, Ishiwa N, Noguchi Y, Yamamoto Y, Rino Y, Imada T, et al. Growth index, assessed with Ki-67 and ssDNA labeling; a significant prognosticator for patients undergoing curative resection for hepatocellular carcinoma. J Surg Oncol. 2005;92(4):331-6. 30. Schmilovitz-Weiss H, Tobar A, Halpern M, Levy I, Shabtai E, Ben-Ari Z. Tissue expression of squamous cellular carcinoma antigen and Ki67 in hepatocellular carcinoma-correlation with prognosis: a historical prospective study. Diagn Pathol. 2011;6:121. 31. Ouchi K, Sugawara T, Ono H, Fujiya T, Kamiyama Y, Kakugawa Y, et al. Mitotic index is the best predictive factor for survival of patients with resected hepatocellular carcinoma. Dig Surg. 2000;17(1):42-8. 45 6 CONSIDERAÇÕES FINAIS O resultados do presente estudo destaca o grau de diferenciação histológica e índice mitótico, como fatores preditores da invasão vascular microscópica. Este resultado ressalta a importância de se discutir a realização de biópsia hepática antes do tratamento, uma vez que pode levar à mudança de protocolos de tratamentos em pacientes que aguardam o transplante ou a ressecção cirúrgica do tumor. Como parte da dissertação de mestrado foi desenvolvido protocolo histopatológico para avaliação do explante hepático dos transplantes realizados no HC da UFMG. O protocolo encontra-se nos apêndices (Apêndice B) . Outra contribuição importante da dissertação foi o levantamento dos casos de CHC que possuíam laudo histopatológico proveniente de biópsia, ressecção cirúrgica ou TH no HC, UFMG de 1998 a 2010. Destes casos, obtiveram-se informações epidemiológicas e demográficas e os resultados foram publicados no periódico Arquivos de Gastroenterologia (Arq. Gastroenterol. vol.50 no.2 São Paulo abr./jun. 2013) em estudo intitulado “Epidemiological aspects of hepatocellular carcinoma in a reference center of Minas Gerais, Brazil” (Apêndice C). 46 ANEXOS ANEXO A – Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa - UFMG 47 ANEXO B – Ata da defesa da dissertação 48 ANEXO C – Folha de provação 49 APÊNDICES APÊNDICE A - Termo de consentimento livre e esclarecido TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO O (A) Sr.(a) _________________________________está sendo convidado(a) a participar, como voluntário(a), do projeto de pesquisa “CORRELAÇÃO ENTRE ASPECTOS HISTOLÓGICOS DO CARCINOMA HEPATOCELULAR E A SOBREVIDA APÓS O TRATAMENTO”. Este estudo consiste na análise da histologia do carcinoma hepatocelular em biópsias arquivadas no Serviço de Biópsia do Departamento de Anatomia Patológica e Medicina Legal da Faculdade de Medicina da UFMG e correlação dos achados com a evolução após o tratamento, seja ele transplante ou cirurgia. O objetivo é de investigar a existência de marcadores que possam fornecer informações sobre a evolução da doença. A sua participação neste estudo consiste em consentir o uso das informações contidas em seu prontuário médico e a análise do material coletado durante o seu tratamento contra o carcinoma hepatocelular, que se encontra armazenado Serviço de Biópsia do Departamento de Anatomia Patológica. Não será necessária a realização de outros exames médicos ou coleta de outro material. As informações obtidas são de sigilo médico, mas podem ser utilizadas para fins de publicação científica preservando a sua identidade. Você não terá que arcar com custos de nenhum dos exames realizados para fins de pesquisa e também não receberá nenhuma forma de gratificação pela sua participação neste estudo. Não há benefícios em termos individuais imediatos. No entanto, esperamos contribuir para o conhecimento dessa entidade, o que futuramente poderá trazer benefícios para outros pacientes. A qualquer momento, você poderá desistir de participar do estudo, sem que isso traga prejuízo à continuidade de seu acompanhamento e tratamento clínico. Em caso de dúvidas posso esclarecê-las em consulta médica ou contactar um dos pesquisadores. Posso telefonar para Dra. Fernanda Farage Osório, no número (31)93142456 ou para a Profa. Cláudia Alves Couto, no número (31)3409-9746. Caso ainda permaneça alguma dúvida posso entrar em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Minas Gerais (COEP/UFMG) no número (31)3409- 4592, situado à Av. Antônio Carlos, 6627, Campus da Pampulha, Unidade Administrativa II - segundo andar, sala 2005. CEP: 31270-901, Belo Horizonte-MG; e-mail: coep@prpq.ufmg.br. DECLARAÇÃO DE CONSENTIMENTO: Eu li este formulário de consentimento (ou alguém o explicou para mim), todas as minhas perguntas foram respondidas e concordo em participar deste estudo. Estou ciente de que eu posso sair a qualquer momento, sem perder o direito de receber cuidados médicos. Nome do paciente: ___________________________________________________________________ Assinatura do paciente: ___________________________________________________________________ Nome do investigador que prestou as informações: ___________________________________________________________________ Assinatura e CRM do investigador que prestou as informações: ___________________________________________________________________ 50 APÊNDICE B - Protocolo de biópsia Serviço de Biópsia Hospital das Clínicas – UFMG Prontuário: ____________________ Número do exame: ____________________ FÍGADO Procedimento cirúrgico: Nodulectomia Segmentectomia (Segmento _______ ) Hepatectomia E Hepatectomia D Hepatectomia total (transplante) Biópsia por agulha Biópsia em cunha Outros:_________________________ Exame macroscópico: Peso do espécime: _______ g Dimensões do espécime: _____ x _____ x _____ cm Superfície externa: Lisa e brilhante Irregular com nódulos variados Outros: espessada, acastanhada, lobulada, com área cruenta Superfície de corte: Lisa de aspecto habitual Evidenciação de espaço porta Múltiplos nódulos de tamanhos variados Comprometimento maciço por formação tumoral  Único nódulo: Dimensões: _________ x ________ x _________ cm Consistência: ________________________________ Coloração: __________________________________ Distância da margem cirúrgica: __________________ Número de nódulos suspeitos encontrados: ________  Dimensões dos nódulos:  1 - _____ x _____ x_____ cm localização: ______________________  2 - _____ x _____ x _____ cm localização: ______________________  3 - _____ x _____ x _____ cm localização: ______________________  4 - _____ x _____ x _____ cm localização: ______________________  5 - _____ x _____ x _____ cm localização: ______________________ Hilo hepático Veia hepática: _____________________ Veia porta: _____________________ Artéria Hepática: _____________________ Vesícula biliar (se presente): Medida: ______ x ______ cm Espessura da parede: ________ cm Mucosa: _____________________ Relação com o tumor:_______________ ______________________________________________________________ Presença de linfonodo: Sim Não Aspecto: ________________ Parênquima hepático não tumoral: Macroscopicamente normal Evidências de hepatopatia crônica 51 Descrição: __________________________________________________________ Cirrótico Macronodular Micronodular Outros: ____________________________________________________________ Exame microscópico: Tipo histológico Número de nódulos neoplásicos: __________ Maior medida: _____________ Distribuição dos nódulos neoplásicos: Uunilobar ________ Bilobar ________ Padrão histológico: Padrão trabecular Pseudo-acinar Sólido Fibrolamelar Fibrose: Sim Não Inflamação tumoral (> 5 células inflamatórias/HPF ou agregados céluas inflamatórias): Sim Não Necrose: Sim Não Padrão citológico: Hepatocítico Células claras Oncocítico Células fusiformes Células gigantes Pleomórfico Mitoses: HE _______________ KI67 __________________________ Características intracelulares: Esteatose: Leve Moderada Acentuada Pigmento biliar Corpúsculo de Mallory Degeneração baloniforme Glóbulos hialinos células gigantes Outra:_______________________ Grau de diferenciação (Edmondson-Steiner modificado): Baixo grau Grau I/II) Alto grau (Grau III/IV) Extensão da neoplasia: Cápsula: Livre Invadida focalmente Invadida difusamente Pseudocápsula Presença de embolização venosa ou linfática em HE: Não Sim Presença de embolização venosa ou linfática em IMUNO: CD34 Não Sim DII40 Não Sim Presença de invasão de elementos hílares: Não Sim Presença de metástase em linfonodos: Não Sim Nº de linfonodos:________ Margens de ressecção: Livres Comprometidas Incerta Parênquima hepático não tumoral: Histologicamente dentro dos limites da normalidade Alterações secundárias a processo expansivo intraparenquimatoso Presença de hepatopatias crônicas não cirróticas Cirrose:  Grau de atividade inflamatória: _______________  Marcadores etiológicos: ____________________  Nódulos displásicos: _______________________ 52 APÊNDICE C – Artigo publicado em periódico 53 54 55 56