UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS FACULDADE DE MEDICINA PÓS-GRADUAÇÃO EM CIENCIAS DA SAÚDE: INFECTOLOGIA E MEDICINA TROPICAL ALINE DE OLIVEIRA MAGALHÃES MOURÃO FATORES GENÉTICOS E NÃO GENÉTICOS RELACIONADOS ÀS DOSES DE VARFARINA E À QUALIDADE DO CONTROLE DA ANTICOAGULAÇÃO EM PACIENTES CARDIOPATAS Belo Horizonte 2017 Aline De Oliveira Magalhães Mourão FATORES GENÉTICOS E NÃO GENÉTICOS RELACIONADOS ÀS DOSES DE VARFARINA E À QUALIDADE DA ANTICOAGULAÇÃO EM PACIENTES CARDIOPATAS Belo Horizonte 2017 Tese apresentada ao programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde: Infectologia e Medicina Tropical da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito parcial para a obtenção do grau de doutorado junto ao referido programa. Orientadora: Profa. Dra. Maria Auxiliadora Parreiras Martins Coorientador: Prof. Dr. Manoel Otávio da Costa Rocha. Mourão, Aline de Oliveira Magalhães. M929f Fatores genéticos e não genéticos relacionados às doses de varfarina e à qualidade da anticoagulação em pacientes cardiopatas [manuscrito]. / Aline de Oliveira Magalhães Mourão. - - Belo Horizonte: 2017. 102f. Orientador: Maria Auxiliadora Parreiras Martins. Coorientador: Manoel Otávio da Costa Rocha. Área de concentração: Infectologia e Medicina Tropical. Tese (doutorado): Universidade Federal de Minas Gerais, Faculdade de Medicina. 1. Anticoagulantes/administração & dosagem . 2. Varfarina/administração & dosagem. 3. Polimorfismo Genético. 4. Testes Farmacogenômicos. 5. Estudos de Coortes. 6. Dissertações Acadêmicas. I. Martins, Maria Auxiliadora Parreiras. II. Rocha, Manoel Otávio da Costa. III. Universidade Federal de Minas Gerais, Faculdade de Medicina. IV. Título. NLM: QV 193 Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca J. Baeta Vianna – Campus Saúde UFMG UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS FACULDADE DE MEDICINA PÓS-GRADUAÇÃO EM CIENCIAS DA SAÚDE: INFECTOLOGIA E MEDICINA TROPICAL Reitor:Prof. Jaime Arturo Ramírez Vice-Reitora: Profa. Sandra Regina Goulart Almeida Pró-Reitora de Pós-Graduação: Profa. Denise Maria Trombert de Oliveira Pró-Reitor de Pesquisa: Prof. Ado Jório de Vasconcelos Diretor da Faculdade de Medicina: Prof. Tarcizo Afonso Nunes Vice-Diretor da Faculdade de Medicina: Prof. Humberto José Alves Coordenador do Centro de Pós-Graduação: Prof. Luiz Armando Cunha de Marco Sub-coordenador do Centro de Pós-Graduação: Prof. Selmo Geber Chefe do Departamento de Clínica Médica: Profa. Valéria Maria Augusto Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde: Infectologia e Medicina Tropical: Prof. Eduardo Antônio Ferraz Coelho Sub-coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde: Infectologia e Medicina Tropical: Prof. Antônio Luiz Pinho Ribeiro Colegiado do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde: Infectologia e Medicina Tropical: Prof. Antônio Luiz Pinho Ribeiro Prof. Daniel Vitor de Vasconcelos Santos Profa. Denise Utsch Gonçalves Prof. Eduardo Antônio Ferraz Coelho Prof. Unaí Tupinambás Prof. Vandack Alencar Nobre Jr Beatriz Cristina Silveira Salles – Representante Discente AGRADECIMENTOS Aos Mestres Prof. Manoel Otávio da Costa Rocha, Profa. Maria Auxiliadora Parreiras Martins e Profa. Karina Braga Gomes Borges pelo tempo que vocês dedicaram ao meu crescimento. Vocês têm tantos alunos, vários afazeres profissionais e pessoais e, ainda assim, me orientaram nessa longa caminhada. Obrigada por transmitirem conhecimentos valiosos e pela oportunidade de realizar o doutorado. Ao Programa de Pós-Graduação Ciências da Saúde: Infectologia e Medicina Tropical e especialmente à Jussara Magalhães, secretária do Programa que sempre me atendeu com imensa solicitude. Ao Prof. Renan Pedra de Souza por contribuir com a análise estatística dos dados e por tornar esse momento leve e descontraído. Vejo a Estatística com outros olhos após nosso convívio. Aos farmacêuticos, médicos, funcionários do Ambulatório Borges da Costa do Hospital das Clínicas da UFMG que semanalmente cuidam dos pacientes com tanta dedicação. Obrigada também a todos os estudantes de Farmácia pelo auxílio na coleta de dados, principalmente à Isabela Pacheco, Paula Leite e ao Emílio Campos. E um agradecimento especial para minhas mães Cândida e Jovita e meu pai Wilson, além de todos os meus familiares, que me acolhem e enchem minha vida de amor e carinho. "Education is not the filling of a pail,but the lighting of a fire" William ButlerYeats RESUMO A varfarina é amplamente utilizada na prevenção de eventos tromboembólicos. A Razão Normalizada Internacional (RNI) constitui o parâmetro de escolha para monitorar a resposta à varfarina e o tempo em que o RNI permanece na faixa terapêutica (TTR) é utilizado na avaliação da qualidade da anticoagulação. O objetivo desse estudo foi (1) avaliar a associação dos polimorfismos CYP2C9*2 (rs1799853), CYP2C9*3 (rs1075910) e VKORC1-G1639A (rs9923231) e fatores não genéticos com doses de varfarina e TTR e (2) criar algoritmosde predição de doses de varfarina e TTR. Estudo de coorte retrospectivo que incluiu 312 pacientes em uso crônico de varfarina recrutados em clínica de anticoagulação (CA) de hospital universitário brasileiro. A indicação da anticoagulação oral incluiu fibrilação atrial (FA), prótese mecânica de válvula cardíaca ou histórico de acidente vascular encefálico isquêmico. Os genótipos foram determinados utilizando Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)em tempo real e o TTR foi calculado pelo método de Rosendaal. Foi investigada a associação de dados sociodemográficos, clínicos, comportamentais, farmacoterapêuticos e genéticos com doses de varfarina e RNI registrados entre 2009-2015. Para análise dos dados, foi feita regressão multivariada e construção da Curva Característica de Operação do Receptor (ROC). A idade média dos pacientes foi 60,4 (±13,5) anos, sendo 59,9% do sexo feminino. Poucos pacientes (12,8%) utilizaram doses semanais <17,5mg de varfarina. No modelo de regressão multivariada, as variáveis associadas com doses de varfarina <17,5 mg/semana foram RNI alvo 2,00-3,00 [razão de chance (RC) 3,66, intervalo de confiança (IC)1,40-11,24; p=0,013], genótipo VKORC1 AA (RC 32,34, IC 11,39-102,91; p<0,001) e genótipo CYP2C9 2/2, 2/3 ou 3/3 (RC 15,34, IC 2,99-82,78; p<0,001). A curva ROC apresentou área de 82,8% (75,4-90,3%) e ponto de corte de 0,18 com sensibilidade e especificidade de 67,5% e 87,5%, respectivamente. O TTR médio foi igual a 63,4%, sendo que 122 (60,9%) pacientes apresentaram boa qualidade da terapia anticoagulante (TTR >60%) e 64 (20,5%) ótima qualidade da terapia anticoagulante (TTR ≥75%). Em análise multivariada, o aumento do número de relatos de não administração à varfarina (RC 1,60, IC 1,11–2,35; p=0,013), o aumento do número de absenteísmo nas consultas de controle do RNI (RC 1,66, IC 1,22– 2,30; p=0,002) e o aumento do número de ajustes de dose da varfarina (RC 2,32, IC 1,87– 2,96; p<0,001) elevaram a chance do paciente apresentar TTR≤60%. Enquanto, o aumento na duração do acompanhamento (RC 1,001, IC 1,001–1,002; p<0,001) e RNI alvo entre 2,00- 3,00 (RC 6,097, IC 2,358–17,844; p<0,001) elevaram a chance do paciente apresentar TTR≥75%; o aumento do número de consultas para controle do RNI (RC 0,742, IC 0,568– 0,965; p=0,026), o aumento do número de absenteísmo nas consultas de controle do RNI (RC 0,480, IC 0,285–0,776; p=0,004) e o aumento do número de ajuste de dose da varfarina (RC 0,319, IC 0,197–0,489; p<0,001) foram negativamente associados com TTR ≥75%.Os resultados sugerem que fatores sociodemográficos,clínicose genéticosinfluenciam a variabilidade de dose da varfarina, enquanto fatores sociodemográficos, clínicos, comportamentais e genéticos modificam a qualidade da terapia anticoagulante. Palavras-chave: Anticoagulantes. Varfarina. Sensibilidade à Varfarina. Polimorfismo Genético. Farmacogenética. CYP2C9. VKORC1. ABSTRACT Warfarin is widely used in the prevention of thromboembolic events. The International Normalized Ratio (INR) is the parameter of choice for monitoring the response to warfarin and Time in Therapeutic Range (TTR) is used to assess the quality of anticoagulation. The aim of this study was to (1) evaluate the association of CYP2C9*2 (rs1799853), CYP2C9*3 (rs1075910) and VKORC1-G1639A (rs9923231) and non-genetic factors with low doses of warfarin (<17.5 mg/week) and TTR and (2) to create algorithms for predicting warfarin doses and TTR.A retrospective cohort study that included 312 patients on chronic warfarin use recruited at an anticoagulation clinic (AC) of a Brazilian university hospital. The indications for oral anticoagulation included atrial fibrillation (AF), mechanical heart valve prosthesis or a history of ischemic stroke. Genotypes were determined using real-time Polymerase Chain Reaction (PCR) and TTR was calculated by the Rosendaal method. The association of sociodemographic, clinical, behavioral and pharmacotherapeutic and genetic data with warfarins doses and RNI recorded between 2009-2015 was investigated. For data analysis, multivariate regression and the Construction of the Receiver Operator Characteristic Curve (ROC) were performed.The mean age of the patients was 60.4 (± 13.5) years, 59.9% of them were female sex. Few patients (12.8%) used warfarin weekly doses <17.5mg. In the multivariate regression model, the variables associated with warfarin doses <17.5mg/week were target INR 2.00-3.00 [odds ratio (OR) 3.66, confidence interval (CI) 1.40-11.24; p= 0.013), genotype VKORC1 AA (OR 32,34, CI 11,39-102,91, p<0,001) and genotype CYP2C9 2/2, 2/3 or 3/3 (OR 15,34, IC 2, 99-82.78, p<0.001). The ROC curve presented an area of 82.8% (75.4-90.3%) and cutoff point of 0.18 with sensitivity and specificity of 67.5% and 87.5%, respectively. The mean TTR was 63.4%, and 122 (60.9%) patients had good quality of anticoagulation (TTR> 60%) and 64 (20.5%) had an excellent quality of anticoagulation (TTR ≥75%). In multivariate analysis, the increase in the number of reports of non-adherence to warfarin (OR 1.60, CI 1.11-2.35, p=0.013), the increase in absenteeism in the INR control visits (OR 1.66, CI 1.22-2.30, p=0.002) and the increase in the number of warfarin dose adjustments (OR 2.32, CI 1.87-2.96, p<0.001) increased the chance of patient presented TTR≤60%.The increase in the duration of follow-up (OR 1.001, CI 1.001-1.002, p<0.001) and target INR between 2.00 and 3.00 (OR 6.097, CI 2.358-17.844, p<0.001) increased the patient's chance of presenting TTR≥75%; the increase in the number of visits to control the INR (RC 0.742, CI 0.568-0.965, p=0.026), the increase in the number of absenteeism in the INR control visits (OR 0.480, IC 0.285-0.776, p=0.004) and the increase in the number of warfarin dose adjustments (RC 0.319; CI 0.197-0.489; p<0.001) were negatively associated with TTR ≥75%.These results suggest that sociodemographic, clinical and genetic factors influence the dose variability of warfarin, while sociodemographic, clinical, behavioral and genetic factors modify the quality of anticoagulant therapy. Key-words: anticoagulants, warfarin, warfarin sensitivity, genetic polymorphism, pharmacogenetics, CYP2C9, VKORC1. LISTA DE QUADROS Quadro 1 Relação entre fenótipos e genótipos CYP2C9*2, CYP2C9*3 e VKORC1 -G1639A 20 Quadro 2 Escore SAMe-TT2R2 25 Quadro 3 Protocolo da PCR utilizado na determinação dos genótipos CYP2C9*2, CYP2C9*3 e VKORC1–G1639A Quadro 4 Programa utilizado na amplificação para discriminação alélica dos polimorfismos CYP2C9*2, CYP2C9*3 e VKORC1–G1639A 34 Quadro 5 Técnicas estatísticas utilizadas na análise dos dados 35 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Síntese dos fatores da coagulação vitamina K dependentes e mecanismo de ação da varfarina 16 Figura 2 Fluxograma de seleção dos participantes 37 Figura 3 Distribuição das variáveis relativas ao tratamento com varfarina por ano de acompanhamento 44 Figura 4 Distribuição e correlação do TTR calculado por diferentes métodos, ao longo do tempo 45 Figura 5 Relação entre valores observados e estimados para a dose de varfarina 49 Figura 6 Análise de sensibilidade e especificidade do modelo de regressão logística para dose média de varfarina <17,5 mg/semana 51 Figura 7 Relação entre valores observados e estimados para o TTR Rosendaal 53 Figura 8 Análise de sensibilidade e especificidade do modelo de regressão logística para TTR ≤60% 55 Figura 9 Análise de sensibilidade e especificidade do modelo de regressão logística para TTR ≥75% 57 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Características sociodemográficas, comportamentais, clínicas e farmacoterapêuticas da população do estudo e comparação com a dose média semanal de varfarina e TTR 38 Tabela 2 Características sociodemográficas, comportamentais, clínicas e farmacoterapêuticas da população do estudo em pacientes de acordo com a dose média semanal de varfarina 40 Tabela 3 Características sociodemográficas, comportamentais, clínicas e farmacoterapêuticas da população do estudo de acordo com TTR ≤60% ou TTR >60% 41 Tabela 4 Características sociodemográficas, comportamentais, clínicas e farmacoterapêuticas da população do estudo em pacientes com TTR ≥75% ou TTR <75% 43 Tabela 5 Frequência dos genótipos CYP2C9 e VKORC1 em relação ao TTR e à dose média semanal de varfarina 46 Tabela 6 Análise da relação entre os genótipos CYP2C9 e VKORC1com TTR e dose média semanal de varfarina 47 Tabela 7 Variáveis que compõem o modelo de regressão gama para a dose média semanal de varfarina 48 Tabela 8 Variáveis que compõem o modelo de regressão logística para dose média de varfarina <17,5 mg/semana 50 Tabela 9 Variáveis que compõem o modelo de regressão gama para TTR 52 Tabela10 Estatísticas do modelo de regressão logística para TTR ≤60% 54 Tabela 11 Estatísticas do modelo de regressão logística para TTR ≥75% 56 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AIT Ataque isquêmico transitório AVC Acidente vascular cerebral CYP2C9 Citocromo P450-2C9 DNA Ácido desoxirribonucleico EDTA Ethylediaminetetraceticacid FA Fibrilação atrial IAM Infarto agudo do miocárdio IC Intervalo de confiança ISI Índice de sensibilidade internacional IMC Índice de massa corporal PCR Reação em cadeia da polimerase RC Razão de chance RFG Ritmo de filtração glomerular RNI Razão normalizada internacional ROC Receiveroperatorcharacteristic curve SNP Single nucleotidepolymorphisms TEP Tromboembolismo pulmonar TVP Trombose venosa profunda TP Tempo de protrombina TTR Time in therapeutic range TVP Trombose venosa profunda UFMG Universidade Federal de Minas Gerais VKOR Vitamina K epóxido redutase VKORC1 Complexo da vitamina K epóxido redutase, subunidade 1 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 13 2 REVISÃO DA LITERATURA 15 2.1 Prevenção de eventos tromboembólicos 15 2.2 Fatores relacionados à dose de varfarina 17 2.2.1 Polimorfismos CYP2C9*2, CYP2C9*3 e VKORC1 -G1639A 19 2.2.2 Algoritmos de predição de doses da varfarina 21 2.3 Qualidade da terapia anticoagulante com o uso devarfarina 23 2.3.1 Fatores relacionados ao TTR 25 3 OBJETIVOS 28 3.1 Objetivo geral 28 3.2 Objetivos específicos 28 4 MATERIAL E MÉTODOS 29 4.1 Revisão da literatura 29 4.2 Aspectos éticos 29 4.3 Desenho e local do estudo 30 4.4 Participantes 30 4.4.1 Seleção dos pacientes 30 4.4.2 Critérios de inclusão e exclusão 30 4.5 Coleta de dados 31 4.5.1 Variáveis 31 4.5.1.1 Variáveis dependentes 31 4.5.1.2 Variáveis independentes 32 4.5.1.2.1 Genotipagem 33 4.6 Análise estatística 34 5 RESULTADOS 37 5.1 Características da população estudada 37 5.2 Comparação das séries históricas de variáveis relativas ao tratamento com varfarina por ano de acompanhamento 44 5.3 Correlações das séries históricas dos diferentes métodos de cálculo do TTR por ano de acompanhamento do TTR ao longo do tempo e sua correlação 45 5.4 Características genéticas da população estudada 45 5.5 Relação entre dose média semanal de varfarina e fatores genéticos e não genéticos 47 5.6 Relação entre dose média de varfarina <17,5mg/semana e fatores genéticos e não genéticos 49 5.7 Relação entre TTR e fatores genéticos e não genéticos 51 5.8 Relação entre TTR ≤60% e fatores genéticos e não genéticos 53 5.9 Relação entre TTR ≥75% e fatores genéticos e não genéticos 55 6 DISCUSSÃO 58 6.1 Dose de varfarina 58 6.2 TTR 60 6.3 Limitações 64 6.4 Artigos a serem publicados 64 7 CONCLUSÃO 65 REFERÊNCIAS 66 ANEXO 80 APÊNDICES 82 13 1 INTRODUÇÃO O tratamento farmacológico de muitos pacientes com fibrilação atrial (FA) e prótese mecânica de válvula cardíaca inclui o uso crônico de anticoagulantes orais para prevenção de acidente vascular cerebral (AVC) isquêmico, uma das principais causas de incapacidade e morte em países ocidentais (LIP; WHITLOCK et al., 2012; DE CATERINA et al., 2013; FREEDMAN, POTPARA, LIP, 2016). A varfarina é um fármaco amplamente utilizado na prevenção primária e secundária de eventos tromboembólicos e seu efeito terapêutico é avaliado indiretamente pela determinação do tempo de protrombina, padronizado pela razão normalizada internacional (RNI). O RNI constitui o parâmetro de escolha para monitorar a resposta à varfarina e o tempo em que o RNI permanece na faixa terapêutica (TTR, do inglês, Time in Therapeutic Range) é utilizado na avaliação da qualidade da anticoagulação (AGENO et al., 2012; APOSTOLAKIS et al., 2013). Os resultados do TTR podem variar entre 0 e 100%. Pesquisa realizada em 100 clínicas de anticoagulação dos Estados Unidos encontrou TTR médio de 58%, variando de 38% a 69% entre os serviços (ROSE et al., 2011). O TTR ≤60% tem sido associado com resultados adversos, tais como AVC, hemorragia e mortalidade, sendo que diferentes fatores, intrínsecos e extrínsecos ao paciente, têm sido relacionados ao controle do TTR (WAN et al., 2008; HYLEK, 2013). O alcance do RNI ideal é limitado pela faixa terapêutica estreita da varfarina e pela grande variabilidade de doses requeridas para efeito antitrombótico. As doses de manutenção chegam a variar entre 10 e 20 vezes entre pacientes (AGENO et al., 2012). A relação entre a dose de varfarina e a resposta observada é determinada por fatores genéticos, sociodemográficos, clínicos e farmacoterapêuticos (UFER, 2005; BOTTON et al., 2011; WEN, LEE, 2013). Em algumas populações, cerca de 50% da variação da dose semanal da varfarina pode ser explicada por fatores genéticos e não genéticos, como: idade, peso, indicação terapêutica da varfarina e uso concomitante de amiodarona e sinvastatina (PERINI et al., 2008). Diferentes fatores mostram impacto no TTR. Em análises multivariadas de estudos observacionais, a presença de comorbidades e o uso de amiodarona estão relacionados ao controle inadequado do RNI, enquanto indivíduos do sexo masculino apresentam TTR maior (BAKER et al., 2009; MELAMED et al., 2011; COSTA et al., 2012; APOSTOLAKIS et al., 14 2013; SKOV et al., 2013; MEARNS et al., 2014; CIURUS, CICHOCKA-RADWAN, LELONEK, 2015; NELSON et al., 2015; DALLALZADEH et al., 2016). No Brasil, algumas investigações foram realizadas para identificar características com influência potencial sobre a efetividade e segurança da varfarina (LIMA et al., 2008; PERINI et al., 2008; ALMEIDA et al., 2011; SOARES et al., 2012), contudo, existe pouca evidência sobre osfatores genéticos e não genéticos relacionados ao TTR na população brasileira (COSTA et al., 2012; SANTOS et al., 2015). Sendo assim, esta pesquisa se justifica por ainda haver lacunas no conhecimento sobre os fatores relacionados à variabilidade interindividual de resposta terapêutica à varfarina e também porque existe a possibilidade de se acrescentar algo ao que se conhece sobre o assunto. Esse conhecimento pode auxiliar na identificação de pacientes com baixa resposta à terapia anticoagulante e no direcionamento de ações voltadas para o aumento da efetividade e segurança da varfarina nesses pacientes. A hipótese estudada foi a de que fatores presentes no início e durante o tratamento com a varfarina influenciariam a dose requerida e o TTR. O objetivo desse estudo foi investigar se fatores sociodemográficos, clínicos, farmacoterapêuticos, comportamentais e genéticos poderiam influenciar a resposta à varfarina em pacientes com fibrilação/flutter atrial, prótese mecânica de válvula cardíaca ou história de AVC. 15 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Prevenção de eventos tromboembólicos Segundo o Ministério da Saúde, as patologias que afetam o aparelho circulatório, incluindo as doenças cerebrovasculares, as doenças isquêmicas do coração e as arritmias cardíacas, são as principais causas de óbito da população brasileira, totalizando 27,7% de todas as causas em 2014 (BRASIL, 2016). A FA é a principal disfunção do ritmo cardíaco, está presente em 7% dos indivíduos com mais de 65 anos, sendo fator de risco independente para insuficiência cardíaca congestiva e mortalidade e morbidade por AVC (LIP, TSE, LANE, 2012; VOUKALIS, LIP, SHANTSILA, 2016). Pacientes que possuem prótese mecânica de válvula cardíaca, independentemente de sua posição (mitral ou aórtica) e do ritmo cardíaco, também têm alto risco para eventos tromboembólicos, sendo o risco maior para próteses em posição mitral (DE CATERINA et al., 2013). Todos esses pacientes têm predisposição à formação de trombos e podem se beneficiar com o uso de medicamentos anticoagulantes, temporariamente ou por tempo indeterminado (BJÖRCK et al., 2016; TERESHCHENKO et al., 2016). Os primeiros anticoagulantes orais comercializados foram os inibidores do efeito da vitamina K (varfarina, acenocumarol e femprocumona), sendo a varfarina o fármaco mais utilizado (LE HEUZEY et al., 2014; MEARNS et al., 2014; HUISMAN et al., 2015; IOANNOU et al., 2016). O efeito antitrombótico da varfarina é atribuído à sua ação anticoagulante resultante da interferência na síntese de quatro fatores da coagulação dependentes da vitamina K. Os fatores II, VII, IX e X requerem a carboxilação de resíduos de glutamato, via vitamina K reduzida, para exercerem sua atividade pró-coagulante. Durante a carboxilação, a vitamina K é oxidada ao 2,3-epóxido inativo e a enzima vitamina K epóxido redutase (VKOR) converte a vitamina K inativa em sua forma reduzida novamente. Assim, a vitamina K ativa é regenerada e ocorre síntese contínua dos fatores da coagulação II, VII, IX e X funcionais (Figura 1). A varfarina atua sobre a via de carboxilação indiretamente, ao inibir a VKOR (AGENO et al., 2012; HIRSH et al., 2003; ANSEL et al., 2008). Há redução de 10% a 40% da atividade biológica da VKOR em indivíduos que utilizam a varfarina. Considerando que as meias-vidas de eliminação dos fatores da coagulação variam entre seis e 60 horas, o efeito in vivo é uma redução sequencial na atividade dos fatores VII, IX, X e II. O efeito anticoagulante se 16 manifesta em 24h após a administração da varfarina; entretanto, em razão da longa meia-vida da protrombina (fator II), a efetividade da terapia anticoagulante geralmente é alcançada cinco dias após início da farmacoterapia (NUTESCU et al., 2016). Figura 1 – Síntese dos fatores da coagulação vitamina K dependentes e mecanismo de ação da varfarina. VKOR - vitamina K epóxido redutase. Elaborado pela autora. A avaliação da efetividade da varfarina é realizada a partir do cálculo do RNI, obtido por meio da determinação do tempo de protrombina (TP). A varfarina inibe a formação dos fatores II, VII, IX e X da coagulação, dependentes da vitamina K, e o TP é o exame laboratorial de escolha para monitoramento da intensidade da anticoagulação, pois reflete a deficiência nos fatores II, V, VII e X. O TP mede o tempo de formação do coágulo em plasma citratado pobre em plaquetas, após recalcificação e adição de fator tissular (tromboplastina). Como as tromboplastinas comercializadas apresentam diferentes graus de sensibilidadeà redução dos fatores da coagulação avaliados, cada lote de tromboplastina tem um índice de sensibilidade internacional (ISI), que compara a atividade da tromboplastina utilizada em relação à tromboplastina referência. Assim, o RNI é calculado dividindo o valor do TP do paciente pelo valor do TP do controle, elevado ao ISI (CARVALHO, SILVA, 1998). Na prática clínica, recomendam-se doses que mantenham o RNI entre 2,00-3,00 em pacientes com FA e 2,00-3,00 ou 2,50-3,50 em pacientes com prótese mecânica de válvula cardíaca, de acordo com a posição da válvula e condição clínica do paciente (AGENO et al., 2012). carboxilação VKOR Precursores dos fatores II, VII, IX e X Fatores II, VII, IX e X Vitamina K reduzida Vitamina K oxidada VARFARINA 17 A varfarina é eficaz na prevenção de eventos tromboembólicos, mas devido à grande variabilidade de doses para manter o RNI com valores dentro da faixa terapêutica, os pacientes necessitam de monitorizaçãofrequente, o que dificulta o emprego desse fármaco. Recentemente a indústria farmacêutica lançou anticoagulantes orais com novos mecanismos de ação – dabigatrana (inibidor da trombina), rivaroxabana, apixabana e edoxabana (inibidores do fator Xa) – e que não requerem monitoramento do RNI. Mas apesar da eficácia desses fármacos na prevenção de AVC, trombose venosa profunda (TVP) e tromboembolismo pulmonar (TEP) (CONNOLLY et al., 2008; GRANGER et al., 2011; PATEL et al., 2011; ALAMNEH, CHALMERS, BEREZNICKI, 2016), a varfarina é o único anticoagulante oral aprovado para prevenção de tromboembolismo em pacientes com prótese mecânica de válvula cardíaca (EIKELBOOM et al., 2013; ANGARAN et al., 2016; GÓMEZ-OUTES et al., 2016; VOUKALIS, LIP, SHANTSILA, 2016) e é o único amplamente distribuída pelo Sistema Único de Saúde (RENAME, 2014). 2.2 Fatores relacionados à dose de varfarina Características clínicas e demográficas, principalmente: idade, sexo, peso, altura, etnia e interações medicamentosas explicam 20% da variabilidade de dosesda varfarina (GAGE et al., 2008; KLEIN et al., 2009; ANDERSON et al., 2012; BOURGEOIS et al., 2016), enquanto as variantes alélicas nos genes CYP2C9*2, CYP2C9*3 e VKORC1 -G1639A representam aproximadamente 40% dessa variação (CALDWELL et al., 2007; TAKEUCHI et al., 2009; WADELIUS et al., 2009; JOHNSON et al., 2011; ANDERSON et al., 2012; ALMEIDA et al., 2014). A combinação de fatores clínicos e genéticos prediz em média 60% da variabilidade de dose da varfarina (GAGE et al., 2004; SCONCE et al., 2005; KLEIN et al., 2009; WADELIUS et al., 2009; YANG et al., 2010; ANDERSON et al., 2012; VERHOEF et al., 2013; BAZAN et al., 2014; CHO et al., 2016). Em modelos de regressão linear múltipla, sexo feminino e idade se relacionam negativamente com a dosede varfarina, assim comotratamento com amiodarona, uma ou duas variantes alélicas para os genótipos CYP2C9*2, CYP2C9*3 e VKORC1 -G1639A e doença renal crônica. Entretanto, pacientes com maior peso, altura ou índice de massa corporal (IMC), tabagistas e praticantes de atividade física regular podem requerer doses maiores de varfarina, bem como quando há ingestão de alimentos contendo vitamina K (TAKEUCHI et al., 2009; 18 NATHISUWAN et al., 2011; MAZZACCARA et al., 2013; KRISHNA et al., 2014; LIMDI et al., 2015; ROULEAU-MAILLOUX et al., 2016). O aumento de dez anos na idade reduz a necessidade semanal de varfarina em 7% (GAGE et al., 2008). Mulheres requerem menores doses de varfarina do que homens. Em qualquer idade, elas usam 4,5 mg/semana menos varfarina do que os homens (GARCIA et al., 2005). Indivíduos com ritmo de filtração glomerular (RFG) entre 30 e 59 mL/min/1,73m2 têm redução de 9,5%, e RFG <30 mL/min/1,73m2apresentam redução de 19% da dose de varfarina (LIMDI et al., 2010). Pacientes obesos podem ter aumento de até 30% na dose inicial de varfarina e a cada aumento de um ponto no IMC (entre 13,4 e 63,1 kg/m2) a dose de varfarina cresce 0,69 mg/semana (WALLACE et al., 2013; MUELLER et al., 2014; SELF et al., 2015). Tabagistas requerem 2,26 mg/semana ou 10% a mais de varfarina do que não tabagistas (GAGE et al., 2008; NATHISUWAN et al., 2011). Em relação às interações medicamentosas, a literatura cita inúmeros fármacos capazes de interagir com a varfarina e as interações potencialmente graves são frequentemente identificadas em usuários de varfarina, todavia, parece haver pouca concordância na literatura a respeito dessas interações (MALONE et al., 2004; JUURLINK, 2007). Martins e colaboradores (2011) encontraram baixa concordância ao comparar cinco fontes de informação que relatavam interações da varfarina com outros fármacos e ressaltaram que a ausência de padronização da terminologia utilizada e das recomendações, quando presentes, para a mesma interação, pode gerar consequências clínicas graves. Em outro estudo, os autores observaram heterogeneidade significativa no potencial de detecção de interações graves da varfarina entre cardiopatas chagásicos e não chagásicos, a partir de diferentes fontes de informação (MARTINS et al., 2013). Os principais mecanismos relacionados à interação da varfarina com outros fármacos são a inibição e indução de enzimas que participam do seu metabolismo. Enquanto a amiodarona inibe o metabolismo da varfarina ereduz, em média, 7,3mg nas doses semanais de varfarina (GARCIA et al., 2005; LIMDI et al., 2010), a carbamazepina aumenta o metabolismo gerando elevação de 49% nas doses utilizadas durante o tratamento (MANNHEIMER et al., 2016). Santos e colaboradores (2015) encontraram que amiodarona, carbamazepina e fenitoína estavam relacionados independentemente com a dose de varfarina. Perini e 19 colaboradores (2008) observaram que pacientes em uso de amiodarona ou de sinvastatina utilizaram doses menores de varfarina. 2.2.1 Polimorfismos CYP2C9*2, CYP2C9*3 e VKORC1 -G1639A O genoma humano possui cerca de 25.000 genes, organizados em sequências complexas de nucleotídeos. Variações nessas sequências, em regiões do DNA envolvidas na resposta farmacológica, podem alterar a farmacocinética e a farmacodinâmica dos fármacos, modificar a resposta esperada e expor o paciente à inefetividade e insegurança da farmacoterapia (METZGER, 2006). As variantes no DNA que ocorrem com frequência igual ou superior a 1%, em determinada população, são denominadas polimorfismos genéticos. A forma mais comum dos polimorfismos é a substituição de uma base nucleotídea (SNP, do inglês, Single Nucleotide Polymorphisms) (PIRMOHAMED, 2011; SHAH; SHAH, 2012). Considerando os relatos de SNP que podem modificar a resposta à varfarina, os princípios da farmacogenética têm sido aplicados na prática clínica com o objetivo de predizer a resposta de cada indivíduo aos fármacos (WADELIUS; PIRMOHAMED, 2007; STORELLI et al., 2016). Alguns polimorfismos genéticos podem contribuir para a variabilidade dose-resposta da varfarina (PIRMOHAMED, 2011; GOUDILING et al., 2015). Evidências mostram que o número de variantes alélicas CYP2C9*2 (rs1799853, C430T), CYP2C9*3 (rs1057910, A1075C) e VKORC1 -G1639A (rs9923231) são os principais preditores da dose de varfarina em adultos. Indivíduos com polimorfismos nesses genes requerem doses menores que as usuais para alcançar o efeito terapêutico desejado (HIGASHI et al., 2002; D`ANDREA et al., 2005; TAKEUCHI et al., 2009; SANTOS et al., 2013; BAKER, JOHNSON et al., 2016). A CYP2C9, codificada pelo gene citocromo P450-2C9 (CYP2C9, do inglês, cytochrome P450-2C9), localizado no cromossoma 10q23.33, é a principal enzima envolvida no metabolismo da varfarina. Mais de 30 variantes alélicas desse gene são conhecidas (HUMAN CYTOCHROME P450 ALLELE NOMENCLATURE DATABASE, 2016), sendo o CYP2C9*1 sua variante alélica mais comum, considerada como o alelo selvagem ou metabolizador normal. Os alelos CYP2C9*2, substituição de uma cisteína por uma arginina na posição 144 do exon 3, e CYP2C9*3, substituição de uma leucina por uma isoleucina na posição 359 do exon 7,metabolizam a varfarina mais lentamente, pois codificam enzimas com 20 atividade reduzida em 30% e 80%, respectivamente (LEE; GOLDSTEIN; PIEPER, 2002) (Quadro 1). Quadro 1 – Relação entre fenótipos e genótipos CYP2C9*2, CYP2C9*3 e VKORC1 -G1639A. Fenótipo CYP2C9 Genótipo CYP2C9 Atividadeenzimática normal *1/*1 Atividadeenzimáticaintermediária *1/*2 ou *1/*3 Atividadeenzimática reduzida *2/*2 ou *2/*3 ou *3/*3 Fenótipo VKORC1 Genótipo VKORC1 Atividadeenzimática normal GG Atividadeenzimáticaintermediária GA Atividade enzimática reduzida AA Comparando com os alelos selvagens em homozigose, os genótipos CYP2C9*1/*2, CYP2C9*1/*3, CYP2C9*2/*2, CYP2C9*2/*3 requerem doses 20%; 34%; 36% e 58% menores, respectivamente; já a homozigose para o alelo CYP2C9*3 associou-se à redução de 78% na dose utilizada (LINDH et al., 2009). Os alelos CYP2C9*2 e CYP2C9*3 explicam 12% da variação da dose de varfarina (WADELIUS et al., 2009). No Brasil, a frequência dos genótipos CYP2C9*1/*1, CYP2C9*1/*2 e CYP2C9*1/*3 foram 65%, 23% e 9%, respectivamente, em um estudo realizado com 279 usuários de varfarina descendentes de caucasianos atendidos em um hospital geral de Porto Alegre (BOTTON et al., 2011). Santos e colaboradores (2015) genotiparam 832 indivíduos, atendidos no Hospital do Coração, em São Paulo, e encontraram 74% deles com oalelo selvagem em homozigose, 22% com os alelos *2 ou *3 em heterozigose e 4% para as combinações dos alelos *2 e *3. Almeida e colaboradores (2014) estudaram 116 pacientes atendidos em clínica especializada no controle da anticoagulação, em Belo Horizonte, e encontraram frequências semelhantes para os genótipos CYP2C9*1/*1 e CYP2C9*1/*2 + CYP2C9*1/*3, sendo 69% e 21%, respectivamente. O alvo terapêutico da varfarina, a enzima VKOR, é codifica pelo gene complexo da vitamina K epóxido redutase, subunidade 1 (VKORC1, do inglês, vitamin K epoxide reductase complex, subunit 1), localizado no cromossoma16p11.2 (LI et al., 2004; ROST et al., 2004). Polimorfismos nesse gene podem aumentar a sensibilidade à varfarina ou, em casos raros, a resistência farmacodinâmica (LOEBSTEIN et al., 2007; YANG et al., 2010). O polimorfismo -G1639A em VKORC1 explica 27% da variação da dose de varfarina (WADELIUS et al., 2009) e os carreadores do alelo A variante necessitam de doses menores de varfarina do que aqueles que possuem o alelo G (GAGE et al., 2008). O alelo A altera o sítio de ligação do fator de transcrição do VKORC1 e promove menor transcrição do gene do que o alelo 21 selvagem G, o que reduz a sua expressão gênica e atividade enzimática (YUAN et al., 2005) (Quadro 1). Yang e colaboradores (2010) revelaram que, em caucasianos, carreadores de um ou dois alelos variantes requerem doses 25% e 50% menores, respectivamente. Estudo realizado em 72 cidades de cinco regiões do Brasil, envolvendo 1038 indivíduos da população em geral, mostrou 33% dos participantescom alelo A em homozigose (SOARES et al., 2012). Especificamente, entre pacientes acompanhados em um hospital universitário da Universidade de São Paulo que utilizavam varfarina (n=206), observou-se frequência de 13% para duas cópias do alelo A (SANTOS et al., 2013). A frequência dos genótipos GG, GA e AA foram 40%, 46% e 14%, respectivamente, em pacientes da região sul (BOTTON et al., 2011) e 47%, 40% e 12% em indivíduos da região sudeste do Brasil (SANTOS et al., 2015). Há evidências de que a incorporação de outros polimorfismos ou haplótipos do gene VKORC1, em modelos de predição clínica, não melhora a predição das doses iniciais de varfarina (GAGE et al., 2008; KLEIN et al., 2009). A maioria dos modelos de predição de dose da varfarina considera os genótipos CYP2C9*2, CYP2C9*3 e VKORC1 -G1639A, já que as variantes nesses genes estão fortemente associadas à redução das doses utilizadas (RIEDER et al., 2005; GAGE et al., 2008; LINDI; VEENSTRA, 2008; JORGENSEN et al., 2009; ALMEIDA et al., 2014). Porém, há cerca de 30 genes potencialmente envolvidos com a variação na resposta à varfarina, dentre os quais se destacam: CYP4F2 e MDR1. O impacto clínico desses genes sobre as doses de varfarina ainda não está bem esclarecido (WADELIUS; PIRMOHAMED, 2007), mas há evidências que o polimorfismo do gene CYP4F2 (rs2108622) promove redução da necessidade de doses da varfarina (DANESE et al., 2012) e que indivíduos com o genótipo 3435TT do gene MDR1 requerem doses maiores de varfarina (ALMEIDA et al., 2011). 2.2.2 Algoritmos de predição de doses da varfarina O conhecimento das características genéticas e não genéticas que influenciam a resposta à varfarina é importante para a construção de modelos que auxiliam na escolha da dose em pacientes que vão iniciar o uso desse fármaco (GAGE et al., 2004; KLEIN et al., 2009; PERINI et al., 2008). 22 Em 2004, foi publicado o primeiro algoritmo abordando a contribuição dos polimorfismos CYP2C9. O modelo farmacogenético com idade, sexo, IMC, etnia, RNI alvo, tratamento com amiodarona ou sinvastatina e genótipo CYP2C9*2/*3 explicou 39% da variação de dose (GAGE et al., 2004). No ano seguinte, Sconce e colaboradores (2005) publicaram algoritmo incorporando os genótipos CYP2C9*2, CYP2C9*3 e VKORC1 -G1639A e encontraram 55% de explicação da dose quando idade, altura e esses genótipos foram incluídos. Inúmeros modelos têm sido publicados desde então a partir de diversas populações em todo o mundo (VERHOEF et al., 2013) e um deles merece destaque. Em 2009, Klein e colaboradores propuseram um algoritmo com grande número de pacientes (n=4043). Eles explicaram 47% da variação de dose a partir de idade, peso, altura, etnia, tratamento com amiodarona, tratamento com carbamazepina, fenitoína ou rifampicina e dos genótipos CYP2C9*2/*3 e VKORC1 -G1639A (KLEIN et al., 2009). Cinco algoritmos trazem informações sobre a variabilidade de doses da varfarina na população brasileira (PERINI et al., 2008; SUAREZ-KURTZ et al., 2009; BOTTON et al., 2011, SUAREZ-KURTZ et al., 2015; SANTOS et al., 2015). O primeiro algoritmo foi publicado em 2008, a partir dos dados coletados de 390 indivíduos atendidos em clínica de anticoagulação de um hospital público do Rio de Janeiro. As doses de varfarina variaram entre 5 e 75 mg/semana, com média de 28,9; 32,9 e 35,3 mg/semana (p<0,001) em brancos, pardos e negros, respectivamente. Oito covariáveis foram identificadas e explicaram 51% da variação da dose semanal da varfarina. Idade, amiodarona, sinvastatina e os genótipos CYP2C9*2/*3/*5/*11 e VKORC1 -G1639A estão relacionadas às doses menores de varfarina, enquanto peso, doença tromboembólica e prótese mecânica de válvula cardíaca promovem aumento de dose. O polimorfismo VKORC1 -G1639A foi o principal preditor (PERINI et al., 2008). Logo em seguida, o mesmo grupo de pesquisadores publicou o segundo algoritmo, acrescentando uma covariável relativa à dose prescrita de varfarina ao valor RNI correspondente (RNI/dose semanal), o que gerou aumentodo poder preditivo para 61% (SUAREZ-KURTZ et al., 2009). Em 2011, Botton e colaboradores publicaram o terceiro algoritmo com dados de 302 pacientes com ancestralidade Europeia, selecionados em hospital público de Porto Alegre. Idade, peso, amiodarona, carbamazepina, beta-bloqueadores, diuréticos, anlodipino e os genótipos CYP2C9*2, CYP2C9*3 e VKORC1 -G1639A explicaram 58% da variação de doses semanal da varfarina. 23 A combinação das coortes do Rio de Janeiro (PERINI et al., 2008) e Porto Alegre (BOTTON et al., 2011) combinadas com a inclusão de outrosindivíduos gerou um quarto algoritmo (SUAREZ-KURTZ et al., 2015). Quase 900 pacientes foram incluídos e divididos em grupo algoritmo (n=584) e grupo validação (n=294). As covariáveis com significância estatística foram idade, peso, amiodarona, prótese mecânica de válvula cardíaca e genótipos CYP2C9*2, CYP2C9*3 e VKORC1 -G1639A. Esse modelo explicou 46% da variação de dose da varfarina (SUAREZ-KURTZ et al., 2015). O quinto algoritmo foi publicado em 2015 por Santos e colaboradores. O modelo de predição de dose foi derivado da coleta de dados de 368 indivíduos com RNI alvo entre 2,00-3,00, atendidos em hospital público de São Paulo. Eles identificaram nove covariáveis: idade, sexo, peso, altura, etnia, amiodarona, uso de indutores enzimáticos (carbamazepina ou fenitoína), genótipos CYP2C9*2 ou CYP2C9*3 e genótipo VKORC1 -G1639A que explicaram 40% da variação de dose da varfarina. As doses foram menores para sexo masculino, idade, uso de amiodarona, uma ou duas variantes alélicas CYP2C9*2, CYP2C9*3 e VKORC1 -G1639A (SANTOS et al., 2015). Os algoritmos que incluem fatores genéticos e clínicos são mais acurados em estimar a dose da varfarina, quando comparados com o uso de tabela de dose baseada apenas nos genótipos CYP2C9*2, CYP2C9*3 e VKORC1-G1639A, com dose empírica de 35 mg/semana ou com algoritmos que consideram apenas características clínicas (FINKELMAN et al., 2011). Entretanto, a predição de doses ainda é limitada pela baixa acurácia destes algoritmos (JONAS, McLEOND, 2009; ERIKSSON, WADELIUS, 2012). 2.3 Qualidade da terapia anticoagulante com o uso de varfarina O desafio da terapêutica anticoagulante é o alcance de um regime posológico que minimize o risco de trombose e que, ao mesmo tempo, não exponha o paciente a risco elevado para sangramentos. Usualmente, a dose da varfarina é ajustada empiricamente, a partir da dose média utilizada para a maioria dos indivíduos (2,5-5,0 mg/dia). O objetivo é utilizar uma dose que alcance um estado de anticoagulação com manutenção do RNI entre 2,00-3,00 na maioria dos pacientes com FA e 2,50-3,50 na maioria dos pacientes com prótese mecânica de válvula cardíaca. Esse estado caracteriza um TTR ideal igual a 100% (AGENO et al., 2012; SENOO, LAU, LIP, 2014). 24 Todavia, esse não é o comportamento observado na prática clínica (SCHEIN et al., 2016). Em metanálise incluindo 95 artigos publicados entre 1993 e 2013, para avaliar pacientes com FA em uso de varfarina, o TTR variou entre 44% e 72% entre os diferentes centros e em média foi igual a 61% (MEARNS et al., 2014). Similarmente, Wan e colaboradores (2008) encontraram variação grande do TTR (29%-75%), com média de 56%, em revisão sistemática que incluiu pacientes com FA. Pesquisa comparando o TTR em 15 países encontrou benefício no uso da varfarina na prevenção de AVC e eventos vasculares totais quando TTR médios estavam acima da mediana de 65%. O modelo populacional obtido nesse estudo sugere um limiar mínimo de 58% para pacientes com FA se beneficiarem da terapia com varfarina (CONNOLLY et al., 2008). A qualidade do manejo dos inibidores do efeito da vitamina K tem sido avaliadaa partir do TTR, utilizando diferentes pontos de corte: TTR≤60%, TTR≤65% ou TTR≤70% para baixa qualidade (CARRIER et al., 2014; DE CATERINA et al., 2013; SENOO, LAU, LIP, 2014; SCHEIN et al., 2016; VAZQUEZ et al., 2016) e TTR≥75% para alta qualidade da tromboprofilaxia com varfarina (WHITE et al., 2007). Em estudo que avaliou a anticoagulação em canadenses, cerca de 90% utilizavam varfarina e um em cada três desses tinha TTR<60% (ANGARAN et al., 2016). Em pesquisa conduzida na Inglaterra, um em cada quatro pacientes com FA não-valvular e em risco de AVC não estava adequadamente tratado (IOANNOU et al., 2016), enquanto White e colaboradores (2007) encontraram 33% de pacientes com TTR≥75% entre pacientes em uso de varfarina. Em estudo que avaliou o controle da anticoagulação oral em longo prazo, dos 2841 norte-americanos com FA (RNI alvo 2,00-3,00) tratados com varfarina, 40,7% tiveram TTR≥70% (controle adequado) entre quatro e nove meses do início de uso da varfarina e somente 57% desses mantiveram a alta qualidade da terapia anticoagulante por 10 a 15 meses após o início de uso da varfarina (DALLALZADEH et al., 2016). Muitos pacientes permanecem em estado insuficiente (RNI<2,00) ou elevado (RNI>3,00) de anticoagulação, aumentando o risco de eventos tromboembólicos e sangramentos, respectivamente (REYNOLDS et al., 2004; JOHNSON et al., 2011; MEARNS et al., 2014; BJÖRCK et al., 2016), que podem levar a atendimentos de emergência, hospitalização, prolongamento do tempo de internação e morte (WHITE et al., 2007; SCHULMAN et al., 2008; BUDNITZ et al., 2011; GUTHRIE et al., 2011). Taxas de tromboembolismo e hemorragia estão negativamente correlacionadas com o TTR (WAN etal., 2008). White e 25 colaboradores (2007) estratificaram os pacientes de acordo com o controle do RNI em controle adequado (TTR>75%), controle moderado (TTR 60-75%) e controle inadequado (TTR<60%). Eles observaram que pacientes com TTR<60% tiveram taxas maiores de mortalidade anual (4,20%) e sangramento maior (3,85%) em comparação com aqueles que atingiram um controle moderado (1,84% e 1,96%, respectivamente) e ou controle adequado do RNI (1,69% e 1,58%, respectivamente) (p<0,001). 2.3.1 Fatores relacionados ao TTR A qualidade da anticoagulação oral pode ser predita aplicando o escore SAMe-TT2R2, que é de fácil aplicação, pois engloba apenas fatores clínicos e demográficos, acessíveis aos profissionais de saúde. Esse escore prediz a probabilidade de controle inadequado do RNI em pacientes com FA antes de iniciar terapia com varfarina, a partir das seguintes características: sexo feminino, idade <60 anos, mais de duas comorbidades, não caucasiano, tabagismo e uso de amiodarona. Pacientes com zero ou um ponto no escore SAMe-TT2R2 indica potencial controle da anticoagulação e dois ou mais pontos, controle subótimo da anticoagulação (APOSTOLAKIS et al., 2013) (Quadro 2). Adicionalmente, o escore SAMe-TT2R2 é útil para predizer AVC, sangramento grave e morte (LIP et al., 2014). Em pacientes com controle inadequado do RNI, o uso de novos anticoagulantes orais pode ser uma alternativa aos inibidores do efeito da vitamina K (SENOO, LAU, LIP, 2014; VOUKALIS et al., 2016). Quadro 2 – Escore SAMe-TT2R2. Acrônimo Definição Pontos S Sexo feminino 1 A Idade<60 anos 1 M História médica1 1 e T Tratamento com amiodarona 1 T Tabagismo (nos últimos 2 anos) 2 R Etnia não branca 2 Máximo de pontos 8 1Mais de duas comorbidades: hipertensão, diabetes, doença da arterial coronariana/infarto do miocárdio, doença arterial periférica, insuficiência cardíaca congestiva, acidente vascular encefálico prévio, doença pulmonar, doença hepática ou renal. Análises multivariadas encontraram outras características influenciando o TTR em pacientes tratados com varfarina. Marcatto e colaboradores (2016) avaliaram retrospectivamente 443 pacientes tratados com varfarina por pelo menos 12 meses, em hospital de referência em Cardiologia em São Paulo, e a idade foi o único fator estudado que influenciou o TTR, entre sexo masculino, etnia autodeclarada, IMC, uso de amiodarona e genótipos CYP2C9 e 26 VKORC1 -G1639A. Pacientes idosos apresentaram TTR maior do que aqueles com idade <65 anos (67% vs. 60%, p=0,004). Em estudo retrospectivo que avaliou os dados de 23425 pacientes com FA não valvular e em uso de varfarina por pelo menos um ano, o controle inadequado do RNI, definido como TTR<55%, foi associado com insuficiência cardíaca (razão de chance [RC] 1,41; intervalo de confiança [IC] 95% 1,28–1,56), diabetes (RC 1,28; IC 95% 1,19–1,38) e AVC prévio (RC 1,15; IC 95% 1,04–1,27) (NELSON et al., 2013). Insuficiência cardíaca (RC 0,79; IC 95% 0,59–1,09) e RFG ≤45 mL/min /1,73m2 (RC 0,74; IC 95% 0,50–1,11) foram os únicos preditores de baixo controle em estudo que buscou identificar preditores de TTR≥70% (DALLALZADEH et al., 2016). Em uma coorte de 906 indivíduos com FA e tratados com varfarina por pelo menos seis meses, cerca de 30% desses apresentaram controle inadequado da anticoagulação (TTR<60%) e insuficiência cardíaca foi um preditor independente desse desfecho (RC 1,63; IC 95% 1,20–2,22) (MELAMED et al., 2011). Pacientes com FA e/ou tromboembolismo venoso apresentaram controle inadequado da anticoagulação (TTR<80%) quando houve hipertensão arterial (RC 2,74; IC 95% 1,06–7,10), obesidade (RC 1,11; IC 95% 1,02–1,21) e uso de amiodarona (RC 4,22; IC 95% 1,30–13,70) (CIURUS, CICHOCKA- RADWAN, LELONEK, 2015). Outros fatores apontam possibilidades para o controle adequado da anticoagulação. Costa e colaboradores (2012) acompanharam prospectivamente 134 pacientes atendidos em clínica de anticoagulação por 272 dias em média. O TTR médio foi igual a 64,7% e pacientes com controle adequado da anticoagulação (TTR≥66%) foram analisados separadamente daqueles com TTR inferior a 66%. Nesse estudo, consumo regular de vitamina K (RC 0,79; IC 95% 0,64–0,98), sexo masculino (RC 2,41; IC 95% 1,06–5,49), uso de varfarina por mais de dois meses (RC 3,23; IC 95% 1,25–8,36) e presença de suporte familiar (RC 3,32; IC 95% 1,16– 9,48) foram associados ao controle adequado do RNI. Pacientes europeus/ingleses têm TTR (diferença média 9,7; IC 95% 6,0–13,4) maior em comparação a norte-americanos (MEARNS et al., 2014). Meta-regressão incluindo oito estudos sugeriu que americanos com FA atendidos em clínicas de anticoagulação têm TTR 11% maior (IC 95% 2–20) do que aqueles tratados na atenção primária à saúde (BAKER et al., 2009). Outra meta-regressão encontrou redução de 7,2% (IC 95% 6,0–13,4) do TTR quando pacientes não são atendidos em clínicas de anticoagulação (MEARNS et al., 2014). Dallalzadeh e colaboradores (2016) identificaram 987indivíduos com FA e TTR≥70% no início do estudo e avaliaram a qualidade da 27 anticoagulaçãoseis meses depois. Somente57% persistiram com TTR≥70% e TTR inicial ≥90% foi o único preditor de alta qualidade da terapia anticoagulante (TTR≥70%). Há poucas evidências sobre a influência de características genéticas no TTR. Indivíduos com um (n=36) ou dois alelos *3 (n=6) no gene CYP2C9 mostraram tendência não significativa para apresentar TTR inferior ao de pacientes sem o alelo *3 variante (n=246) (69,8% vs. 74,7%, p=0,09), mas os pacientes com dois alelos variantes de CYP2C9*2/*3 + *3/*3 apresentaram TTR significativamente menor (60,5% vs. 74,3%, p=0,012) que aqueles *1/*1 + *1/*2 (SKOV et al., 2013). Entretanto, alguns trabalhos não identificaram variação significativa do TTR entre os subgrupos com e sem alelos variantes para CYP2C9 e VKORC1 -G1639A (BURMESTER et al., 2011; SANTOS et al., 2015; MARCATTO et al., 2016). Outros estudos abordam a relação do TTR com genótipos CYP2C9 e VKORC1 –G1639A, em modelos de predição de dose de varfarina (BELLEY-COTE et al., 2015). Anderson e colaboradores (2012) conduziram um ensaio clínico controlado aleatorizado que demonstrou superioridade do uso de algoritmo com informações genéticas (CYP2C9 e VKORC1 -G1639A) como guia para estimar a dose inicial da varfarina. O TTR do grupo com dose guiada (n=477) foi superior, após um e três meses de acompanhamento, ao do grupo controle (n=1866). Similarmente, ensaio clínico controlado aleatorizado, multicêntrico, mostrou aumento de 7% do TTR, três meses após o início do uso da varfarina guiada por genótipo, quando comparado com o uso de doses padrão (67,4% vs. 60,3%, p<0,001) (PIRMOHAMED et al., 2013). Contudo, a prescrição da varfarina guiada por genótipo, comparada com a prescrição de doses padrão, não melhorou o TTR nas primeiras quatro semanas (DAHAL et al., 2015). Comparada com a prescrição de doses guiadas apenas por fatores clínicos, a prescrição de varfarina guiada por genótipo e fatores clínicos não melhorou TTR no primeiro mês (KIMMEL et al., 2013) ou no terceiro mês de uso da varfarina (JONAS et al., 2013). Wen e colaboradores (2017) não observaram diferença no TTR (primeiros 90 dias de tratamento), anticoagulação excessiva (RNI≥4) ou eventos adversos no grupo com dose guiada por genótipo. 28 3 OBJETIVOS 3.1 Objetivogeral Avaliar a relação entre fatores genéticos e não genéticos e a resposta terapêutica à varfarina em indivíduos cardiopatas atendidos em ambulatório de referência em anticoagulação oral. 3.2 Objetivos específicos  caracterizar os pacientes atendidos no ambulatório de anticoagulação;  investigar a relação entrea dose média semanal de varfarina e características sociodemográficas, clínicas, comportamentais, farmacoterapêuticas e genotípicas (polimorfismos CYP2C9 e VKORC1);  investigar a relação entre TTR e características sociodemográficas, clínicas, comportamentais, farmacoterapêuticas e genotípicas (polimorfismos CYP2C9 e VKORC1);  elaborar modelo para predição de dose inicial de varfarina e sensibilidade ao fármaco;  elaborar modelo para predição de TTR e qualidade da terapia anticoagulante. 29 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Revisão da literatura A partir da base de dados PubMed, foi feita uma pesquisa para selecionar estudos envolvendo a investigação de fatores relacionados à resposta da varfarina.Asestratégias de busca incluíram termos indexados no Medical Subject Headings (MeSH) e termos não indexados:  Estratégia 1: (MH:D03.383.663.283.446.520.914 OR Varfarina OR Warfarin OR Warfarina OR MH:D27.505.954.502.119 OR Anticoagulant* OR "anticoagulante oral" OR "oral anticoagulant" OR "razãonormalizadainternacional" OR "RNI") AND ("time in therapeutic range" OR "TTR" OR "time in the therapeutic range");  Estratégia2: (MH D03.383.663.283.446.520.914 OR Varfarina OR Warfarin OR Warfarina OR MH D27.505.954.502.119 OR Anticoagulant* OR "anticoagulante oral" OR "oral anticoagulant" OR "razãonormalizadainternacional" OR "RNI") AND (predictor* OR factor*) AND (dosing OR dose) AND NOT (pediatric OR children). Também foi feita busca de trabalhos a partir da lista de referência dos artigos selecionados pela estratégia de busca.Estudos publicados entre 2000 e 2016, em inglês ou português, foram incluídos. 4.2 Aspectos éticos O estudo foi conduzido de acordo com os termos da Resolução 466/2012 do Conselho Nacional de Saúde. Todos os participantes foram esclarecidos sobre os aspectos relativos ao estudo e confirmaram desejo de participar por meio do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Apêndice A). O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) sob o parecer CAAE 23725213.5.0000.5149 (Anexo A) e o banco de amostras biológicas sob o parecer 0216/06. 30 4.3 Desenho e local do estudo Trata-se de estudo observacional, desenvolvido no ambulatório especializado para controle da anticoagulação oral do serviço de Hematologia do Hospital das Clínicas da UFMG que foi implantado em 2009 para acompanhar, semanalmente, pacientes em uso de anticoagulantes orais. A equipe é composta por médicos, farmacêuticos e enfermeiros, de acordo com suas necessidades individuais. A maioria dos pacientes realizou a coleta de sangue e os exames laboratoriais na Unidade Funcional de Patologia e Medicina Laboratorial do Hospital das Clínicas da UFMG. Todos os genótipos foram determinados no laboratório de Bioquímica Clínica da Faculdade de Farmácia da UFMG. 4.4 Participantes 4.4.1 Seleção dos pacientes Trata-se de amostra não probabilística em que todos os indivíduos assistidos no ambulatório de anticoagulação que obedeciam aos critérios para inclusão no estudo foramrecrutados e entrevistados no estudo. Posteriormente, realizou-se a coleta de sangue e de informações a partir do prontuário do paciente. Os participantes foram selecionados de forma consecutiva, no dia da consulta agendada para controle de RNI. 4.4.2 Critérios de inclusão e exclusão Incluíram-se no estudo pacientescom idade ≥18 anos, ambos os sexos, com pelo menos uma das seguintes indicações para uso de varfarina: fibrilação/flutter atrial, prótese mecânica de válvula cardíaca ou histórico de AVC ou acidente isquêmico transitório (AIT), usuários de varfarina em acompanhamento na clínica de anticoagulação por no mínimo dois meses no período 2009-2015. Os pacientes que não compareceram para coleta de sangue foram excluídos do estudo. 31 4.5 Coleta de dados Todas as informações foram coletadas em entrevistas aos pacientes realizadas entre fevereiro e dezembro de 2015 e por meio de consulta aos prontuários dos mesmos e ao banco de dados do ambulatório de anticoagulação, utilizando os protocolos apresentados nos Apêndices B e C.A frequência dos problemas de saúde, utilizados como critérios de inclusão, e das comorbidades foi verificada a partir dos prontuários dos pacientes. O Hospital das Clínicas dispõe de protocolos clínicos baseados em diretrizes internacionais para identificação e tratamento de doenças. 4.5.1 Variáveis 4.5.1.1 Variáveis dependentes Como variáveis resposta foram consideradas a dose média semanal de varfarina e o TTR, obtidos a partir dos dadosdos pacientes registrados durante as consultas na clínica de anticoagulação, entre agosto de 2009 e dezembro de 2015. A dose semanal de varfarina foi coletada no banco de dados da clínica de anticoagulação, sendo utilizada para calcular a dose semanal média utilizada pelo paciente durante o seu período máximo de seguimento.A dose semanal média foi analisada como variável contínua e dicotômica. Os pacientes foram divididos em dois grupos de acordo com a dose: <17,5 mg/semana e ≥17,5 mg/semana de varfarina. Esse ponto de corte foi escolhido a partir da definição de dose baixa proposta por REDMAN et al., 2008. O TTR foi calculado a partir dos valores de RNI, utilizando o número máximo de resultados RNI disponíveis, para cada paciente. Determinou-se o TP a partir de amostra obtida por punção venosa e adição de anticoagulante citrato, em coagulômetro automatizado utilizando tromboplastina comercial, seguindo rigorosamente as recomendações dos fabricantes. O TTR foi calculado por três métodos: Rosendaal, Rosendaal ajustado e percentagem de RNI na faixa terapêutica, conforme descrito a seguir:  Rosendaal: TTR = número de dias com RNI consecutivos dentro da faixa terapêutica/número de dias total do seguimento. Esse método assume que há uma relação linear entre dois resultados consecutivos de RNI (ROSENDAAL et al.,1993); 32  Rosendaalajustado: TTR = número de dias com RNI dentro da faixa terapêutica para cada período de RNI consecutivos com intervalo inferior a 57 dias entre os RNI/número de dias do seguimento no mesmo período. Em seguida, foi calculada a média desses resultados, obtendo o TTR Rosendaal ajustado. Esse cálculo foi realizado assumindo que uma interpolação linear em tempo superior a 56 dias não apresenta plausibilidade biológica (AZAR et al., 1996);  Percentagem de RNI na faixa terapêutica: TTR = número de resultados RNI na faixa terapêutica/número total de resultados RNI. O TTR calculado pelo método de Rosendaal foi analisado como variável contínua e dicotômica. TTR>60% indicou boa qualidade da terapia anticoagulante e TTR≥75% indicou ótima qualidade da terapia anticoagulante (WHITE et al., 2007;CONNOLLY et al., 2008). 4.5.1.2 Variáveis independentes Diferentes variáveis explicativas foram estudadas, conforme segue:  sociodemográficas: idade, idade >60 anos (idosos), sexo, educação, renda mensal familiar por pessoa (em dólar americano) e coabitação;  comportamentais: necessidade de auxílio para administração da varfarina, absenteísmo nas consultas para controle do RNI, relato de não administração à varfarina e uso excessivo de bebidas alcoólicas (definido como consumo diário de 60g de etanol, equivalente a quatro doses, nos últimos seis meses. Cada dose de etanol corresponde a aproximadamente 350mL cerveja, 43 mL de destilados com 40% etanol, 83mL de destilados com 18% etanol ou 142mL de destilados com 11% etanol) (SKINNER et al., 1984);  clínicas: indicação da varfarina, comorbidades, ocorrência de eventos tromboembólicos e hemorrágicos;  farmacoterapêuticas: dose média da varfarina, duração da terapia com varfarina, número de medicamentos em uso crônico (igual ou superior a 30 dias contínuos), uso de amiodarona, sinvastatina, carbamazepina, fenitoína, polifarmácia (cinco ou mais medicamentos), faixa terapêutica do RNI, tempo de acompanhamento na clínica de anticoagulação, número de consultas para controle de RNI e número de ajustes de dose da varfarina;  genotípicas: genótipos CYP2C9 (*1, *2 ou *3) e VKORC1 –G1639A (GG, GA ou AA). 33 As complicações hemorrágicas foram incluídas como dados descritivos e diferenciadas de acordo com a gravidade (SCHULMAN et al., 2009; MEHRAN et al., 2011; PATEL et al., 2011; HASS et al., 2012):  hemorragia grave: sangramento clinicamente evidente associado a qualquer um dos seguintes: óbito; envolvimento de sítio anatômico crítico (intracraniano, medular, pericárdico, articular, retroperitonial, ou intramuscular com síndrome do compartimento), queda de >2g/dL na concentração de hemoglobina, transfusão de >2 unidades de sangue total ou concentrado de hemácias, ou invalidez permanente;  hemorragia não grave clinicamente relevante: sangramento evidente que não atenda ao critério para sangramentos graves, mas que requeresse intervenção médica, interrupção temporária do tratamento, dor ou que interferisse negativamente nas atividades diárias;  hemorragia não grave: sangramentos que não atendem aos critérios de hemorragia grave e não grave clinicamente relevante. 4.5.1.2.1 Genotipagem Para a genotipagem, foram coletados 10 mL de sangue total em EDTA. O DNA genômico foi extraído por método de precipitação alcoólica, utilizando o kit Biopur® (Biometrix) e seguindo as instruções do fabricante. Os polimorfismos CYP2C9*2 (C_25625805-10) e CYP2C9*3 (C_2710489-10) no gene CYP2C9 e -G1639A no gene VKORC1 (C_30403261-20) foram determinados pelo método de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR, do inglês, Polymerase Chain Reaction) em tempo real, utilizando termociclador StepOne® (Applied Biosystems) e sonda para discriminação alélica TaqMan® (Applied Biosystems), conforme protocolos descritos nos Quadros 3 e 4, padronizados em trabalho prévio (ALMEIDA, 2014). Os resultados foram interpretados no software Step One® (Applied Biosystems). Em todos os ensaios, utilizou-se um branco da reação (tubo sem DNA) e dois controles com alelos pré-determinados CYP2C9*1, CYP2C9*2 ou CYP2C9*3 e VKORC1 -G1639G, - G1639A ou -A1639A. As análises foram repetidas com 10% das amostras e a reprodutibilidade foi de 100%. 34 Quadro 3 – Protocolo da PCR utilizado na determinação dos genótipos CYP2C9*2, CYP2C9*3 e VKORC1 –G1639A. Reagentes µL Genotyping Master Mix (2x) 5,0 Água deionizada 2,5 TaqMan SNP Genotyping assay 0,5 DNA genômico (5 a 132 ng/µL) 1,0 Quadro 4 – Programa utilizado na amplificação para discriminação alélica dos polimorfismos CYP2C9*2, CYP2C9*3 e VKORC1 –G1639A. Etapa Temperatura Tempo Ciclagem 1 60ºC 30 segundos 1 ciclo 2 95ºC 10 minutos 1 ciclo 3 95ºC 10 segundos 60 ciclos 60ºC 1 minuto 4 60ºC 30 segundos 1 ciclo Para avaliar se os polimorfismos estudados estão em equilíbrio genético na população investigada, o desvio de Hardy-Weinberg foi testado usando um teste exato disponível em http://genepop.curtin.edu.au/genepop_op1.html (nov 2016). O princípio de Hardy-Weinberg prediz que numa população em equilíbrio, as frequências alélicas e genotípicas mendelianas permanecerão constantes ao longo das gerações se fatores como mutação, seleção, migração, desvio meiótico e deriva genética não estiverem atuando sobre essa população (STRACHAN; READ, 2013). 4.6 Análise estatística O banco de dados foi validado por dupla digitação no software EpiData (versão 3.1, EpiData Assoc., Dinamarca). Em seguida, os dados foram transferidos para planilha única no Excel e a análise de todas as variáveis, incluindo construção da curva ROC, foi realizada no ambiente de programação R versão 3.2.5. A descrição das variáveis categóricas foi feita com frequências (absoluta e relativa) e, das variáveis quantitativas, através de medidas de tendência central (média) e de variabilidade (desvio-padrão). 35 As análises univariadas e multivariadas utilizando cada variável dependente contínua (TTR e dose média semanal de varfarina) e categórica dicotômica (TTR≤60% ou >60%, TTR≥75% ou <75%, dose média de varfarina <17,5mg/semana ou ≥17,5mg/semana) foram realizadas de acordo com o Quadro 5. Valor p<0,05 foi considerado estatisticamente significativo. A dose média semanal de varfarina e o TTR correspondente aos valores médios dos seis anos de acompanhamento (2009-2015) foram analisados como variáveis dependentes nos diferentes modelos de regressão. Quadro 5 – Técnicas estatísticas utilizadas na análise dos dados. Variável dependente Variável independente Testes utilizados para análise univariada Modelos utilizados para análise multivariada Contínua Categórica dicotômica (k = 2) Teste t para duas médias Modelo de regressão linear ou gama (função identidade) Categórica politômica (3 < k < 8) Análise de variância, seguida de teste post hoc de Dunnet Contínua Teste t para coeficiente de correlação de Pearson Categórica dicotômica Categórica dicotômica (k = 2) Teste qui-quadrado de Pearson com valor p obtido por simulação de Monte Carlo Modelo de regressão logística Categórica politômica (3 < k < 8) Contínua Teste t para duas médias Variáveis independentes contínuas incluídas nas análises univariadas: idade (anos), escolaridade (anos), renda mensal familiar por pessoa (dólar americano), tempo de acompanhamento na clínica anticoagulação (dias), consultas para controle da RNI (n), dose média de varfarina (mg/semana), duração da terapia com varfarina (dias), ajustes de dose da varfarina (n) e medicamentos em uso crônico (n). Variáveis independentes dicotômicas incluídas nas análises univariadas: idade >60 anos (sim/não), sexo (masculino/feminino), coabitação (sim/não), consumo excessivo de bebidas alcoólicas (sim/não), hipertensão arterial sistêmica (sim/não), dislipidemia (sim/não), insuficiência cardíaca (sim/não), diabetes mellitus (sim/não), neoplasia ativa (sim/não), disfunção hepática grave (sim/não), hemorragia grave (sim/não), hemorragia não grave 36 clinicamente relevante (sim/não), hemorragia não grave (sim/não), evento tromboembólico (sim/não), RNI alvo (2,00-3,00 ou 2,50-3,50), polifarmácia (sim/não), uso concomitante de medicamentos descritos em algoritmos de predição de dose (sinvastatina, amiodarona, carbamazepina e fenitoína) (PERINI et al., 2008; KLEIN et al., 2009; SANTOS et al., 2015) (sim/não), auxílio para administração da varfarina (sim/não), genótipos CYP2C9 (*1, *2 ou *3; *1/*1 ou não *1/*1; *1/*2 ou não *1/*2; *1/*3 ou não *1/*3; *2/*2 ou não *2/*2; *3/*3 ou não *3/*3) e VKORC1 –G1639A (GG, GA ou AA; AA ou [GG + GA]; GG ou [AA + GA]). Variáveis independentes politômicas incluídas nas análises univariadas: indicação da terapia anticoagulante (fibrilação/flutter atrial, prótese mecânica de válvula cardíaca ou prevenção secundária de AVC/AIT), tempo de acompanhamento na clínica anticoagulação (anos), relato de não administração da varfarina (n), absenteísmo (n), genótipos CYP2C9 (*1, *2 ou *3; *1/*1 ou [*1/*2 +*1/*3] ou [*2/*2 ou *2/*3 ou *3/*3]) e VKORC (GG ou GA ou AA). As variáveis independentes cujo teste de hipótese atingiu p<0,20 foram incorporadas inicialmente para a modelagem das variáveis dependentes. Análise diagnóstica foi realizada para cada modelo considerando a adequação de suas respectivas suposições. Os modelos de regressão apresentados possuem somente variáveis independentes cujos coeficientes apresentaram diferença de zero estatisticamente significativa (p<0,05). Nos modelos de regressão logística, a medida da RC foi utilizada para quantificar a direção da relação encontrada, tendo sido expressa com seu respectivo IC a 95%. Posteriormente, a Curva Característica de Operação do Receptor (ROC, do inglês, Receiver Operator Characteristic Curve) foi gerada para cada modelo e os valores de corte foram escolhidos a fim de maximizar a soma da sensibilidade e especificidade. 37 5 RESULTADOS A Figura 2 mostra o processo de seleção dos participantes do estudo. Aproximadamente 4% foram excluídos devido a causas não relacionadas ao uso da varfarina. Figura 2 – Fluxograma de seleção dos participantes. 5.1 Características da população estudada Do total de 312 pacientes, a idade média foi igual a 60,4 (±13,5) anos. Houve predomínio de mulheres (n=187;59,9%) e maiores de 60 anos (n=170;54,5%), com 4,9 anos de escolaridade e renda mensal por pessoa igual a US$269, em média. Os pacientes foram acompanhados, em média, por 1.269 ± 599 dias, variando entre 73 e 2263 dias e apenas 1,3% (n=4) frequentaram o ambulatório por menos de 12 meses. A varfarina foi utilizada, em média, por 5,1 anos, principalmente (n=232; 74,4%) para tratamento de FA (Tabela 1). A dose média semanal variou entre 8 e 119 mg e 75% (n=234) dos indivíduos utilizaram até 35 mg/semana de varfarina. A dose média de varfarina foi menor entre maiores de 60 anos (28,4 mg/semana vs. 33,8 mg/semana; p=0,002) e entre os pacientes que apresentaram IAM (23,1 mg/semana vs. 31,5mg/semana, p<0,001). A dose terapêutica da varfarina também foi diferente de acordo com indicação da terapia anticoagulante. Indivíduos com prótese mecânica de valva cardíaca utilizaram doses mais elevadas de varfarina em relação àqueles sem prótese (35,1 mg/semana vs. 28,3 mg/semana; p<0,001). Pacientes com RNI alvo entre 2,50-3,50 utilizaram, em média, 36,5 mg de varfarina semanalmente e aqueles com RNI alvo entre 2,00-3,00 usaram, em média, 28,3 mg de varfarina a cada semana (p<0,001) (Tabela 1). Pacientes excluídos (n=14)  Sem coleta de sangue (n=7)  Não aceitaram participar (n=7) Pacientes incluídos na análise (n=312) Pacientes avaliados para elegibilidade (n=326) 38 O TTR variou entre 6% e 99%, com 61% dos pacientes apresentando boa qualidade da terapia anticoagulante (TTR>60%) e somente 20% com ótima qualidade (TTR≥75%). O TTR dos homens foi superior ao das mulheres (66,3% vs. 61,3%; p=0,002). De acordo com o RNI alvo a ser alcançado, houve diferença no TTR: pacientes com RNI alvo entre 2,50-3,50 apresentaram TTR menor do que aqueles com RNI alvo entre 2,00-3,00 (60,0% x 64,8%; p=0,004) (Tabela 1). Indivíduos em polifarmácia (n=229; 73,4%) apresentaram tendência a apresentar um TTR menor do que aqueles que utilizavam até quatro medicamentos por dia (62,5% vs. 65,6%; p=0,05). Observou-se aumento do TTR de acordo com o aumento do tempo de seguimento (p<0,001). As faltas nas consultas para controle de RNI foram frequentes, 81% (n=253) dos pacientes faltaram a pelo menos uma consulta e quanto maior o absenteísmo menor o TTR observado (p<0,001). Aproximadamente 55% (n=173) dos indivíduos relataram não utilizar a varfarina pelo menos uma vez ao longo do estudo e houve redução gradativa do TTR com o aumento do número de relatos de não administração da varfarina (p<0,001). Não houve diferença entre o TTR médio observado entre os pacientes que sofreram ou não IAM (61,2% vs. 63,5%, p=0,549) (Tabela 1). Tabela 1 – Características sociodemográficas, comportamentais, clínicas e farmacoterapêuticas da população do estudo e comparação com a dose média semanal de varfarina e o TTR. Características Total (n=312) Dose varfarina (mg/semana) TTR (%) Média (DP) Valor p Média (DP) Valor p Idade, média (DP) 60,4 (13,5) - 0,000 - 0,212 Idade >60 anos, n (%) 170 (54,5) 28,4 (15,4) 0,002 64,7 (12,4) 0,068 Sexo, n (%) Feminino Masculino 187 (59,9) 125 (40,1) 31,1 (15,8) 30,4 (15,3) 0,685 61,3 (14,1) 66,3 (13,6) 0,002 Escolaridade – anos, média (DP) 4,9 (3,3) - 0,035 - 0,952 Renda mensal familiar por pessoa – US dólares,média (DP) 269,0 (178,5) - 0,465 - 0,022 Coabitação, n (%) 280 (89,7) 30,9 (15,1) 0,903 63,3 (14,2) 0,974 Consumo excessivo bebidas alcoólicas, n (%) 5 (1,6) 27,6 (9,5) 0,486 58,6 (9,2) 0,316 Indicação da terapia anticoagulante, n (%)1 Fibrilação/Flutter atrial Prótese mecânica de valva cardíaca PrevençãoAVC/AIT secundário 232 (74,4) 118 (37,8) 45 (14,4) 29,2 (14,1) 35,1 (17,2) 32,3 (20,9) 0,004 <0,001 0,597 63,4 (14,4) 62,1 (12,9) 62,2 (15,8) 0,895 0,221 0,596 RNI alvo, n (%) 2,00-3,00 2,50-3,50 215 (68,9) 97 (31,1) 28,3 (13,9) 36,5 (17,6) <0,001 64,8 (14,4) 60,0 (12,8) 0,004 Duração da terapia anticoagulante– anos, média (DP) 5,1 (3,9) - 0,481 - 0,013 Duração da terapia anticoagulante– dias, média (DP) 2022,2 (1424,6) - 0,463 - 0,017 Tempo de acompanhamento– dias,média (DP) 1269,1 (598,8) - 0,987 - <0,001 39 Tabela 1 – Características sociodemográficas, comportamentais, clínicas e farmacoterapêuticas da população do estudo e comparação com a dose média semanal de varfarina e o TTR (continuação). Características Total (n=312) Dose varfarina (mg/semana) TTR (%) Média (DP) Valor p Média (DP) Valor p Tempo de acompanhamento– anos, n (%) 0 1 2 3 4 5 6 4 (1,3) 18 (5,8) 85 (27,2) 69 (22,1) 34 (10,9) 44 (14,1) 58 (18,6) 20,1 (7,6) 33,1 (17,1) 30,8 (16,6) 31,1 (14,8) 29,9(15,1) 34,8 (19,2) 28,2 (11,4) 0,836 50,7 (37,8) 54,7 (20,7) 60,6 (12,6) 63,1 (13,6) 65,7 (10,8) 65,1 (14,6) 68,3 (11,0) <0,001 Comorbidades, n (%) Hipertensão arterial sistêmica Dislipidemia Insuficiência cardíaca Diabetes mellitus Neoplasia ativa Disfunção hepática grave 190 (60,9) 114 (36,5) 100 (32,0) 41 (13,1) 4 (1,3) 1 (0,3) 32,0 (17,4) 32,5 (16,7) 30,9 (15,0) 35,5 (18,3) 37,2 (11,0) 25,2 0,091 0,180 0,992 0,082 0,324 - 63,6 (14,1) 62,3 (15,7) 62,1 (15,6) 65,3 (16,6) 59,7 (6,2) 50,6 0,647 0,357 0,339 0,413 0,331 - Medicamentos uso crônico, média (DP) 5,9 (2,0) - 0,382 - 0,056 Medicamentos, n (%) Polifarmácia Sinvastatina Amiodarona Carbamazepina Fenitoína 229 (73,4) 139 (44,5) 33 (10,6) 4 (1,3) 4 (1,3) 31,1 (15,9) 30,1 (13,5) 30,9 (13,8) 26,0 (3,5) 33,1 (19,6) 0,576 0,418 0,978 0,056 0,832 62,5 (15,1) 63,2 (15,1) 65,9 (15,1) 53,7 (10,8) 52,8 (13,3) 0,050 0,918 0,311 0,167 0,207 Consultas anuais controle de RNI, média (DP) 10,7 (2,4) - 0,991 - <0,001 Absenteísmo, n (%) 0 1 2 3 4 5 59 (18,9) 137 (43,9) 78 (25,0) 34 (10,9) 3 (1,0) 1 (0,3) 29,6 (15,3) 30,5 (15,1) 30,6 (14,5) 35,9 (20,3) 21,1 (4,3) 36,7 (*) 0,216 69,1 (13,5) 64,3 (12,1) 61,3 (16,4) 54,1 (11,8) 70,6 (12,2) 48,4 (*) <0,001 Relato de não administração da varfarina, n (%) 0 1 2 3 4 139(44,5) 129(41,4) 33(10,6) 10(3,2) 1(0,3) 28,7 (11,5) 33,0 (18,7) 33,1 (17,7) 25,5 (11,2) 34,7 (*) 0,216 68,4 (12,7) 61,0 (14,2) 55,3 (12,0) 49,1 (8,4) 68,8 (*) <0,001 Ajustes anuais dose da varfarina, média (DP) 3,3 (1,8) - 0,212 - <0,001 Auxílio para administração da varfarina, n (%) 36 (11,5) 31,5 (15,7) 0,807 60,9 (13,5) 0,253 Dose de varfarina, n (%) < 17,5 mg/semana ≥ 70 mg/semana 312 (100) 40 (12,8) 9 (2,9) 30,9 (15,6) 13,7 (2,6) 90,8 (14,4) - - - - 65,6 (15,0) 60,2 (11,4) <0,001 0,314 0,433 TTR, n (%) ≤ 60% ≥ 75% 312 (100) 122 (39,1) 64 (20,5) - 32,8 (18,3) 27,4 (13,0) 0,049 0,105 0,024 63,3 (14,1) 49, 6 (9.9) 81,3 (5,2) - - - Hemorragia, n (%) Grave Grave clinicamente relevante Não grave 2 (0,6) 0 91 (29,2) 24,0 (10,0) - 60,67 (12,8) 0,512 - 0,549 50,0 (17,4) - 31,3 (15,9) 0,472 - 0,847 Eventos tromboembólicos, n (%)2 IAM AVC/AIT TVP TEP 64 (20,5) 25 (8,0) 41 (13,1) 2 (0,6) 3(1,0) 28,5 (18,0) 23,1 (8,4) 32,2 (20,9) 24,1 (3,5) 31,9 (20,0) 0,233 <0,001 0,640 0,188 0,938 62,9 (17,3) 61,2 (18,2) 62,3 (16,4) 64,8 (18,7) 68,2 (28,1) 0,837 0,549 0,667 0,929 0,791 DP, desvio padrão. AVC, acidente vascular encefálico. AIT, ataque isquêmico transitório. RNI, razão normalizada internacional. TTR, time in therapeutic range. IAM, infarto agudo do miocárdio. TVP, trombose venosa profunda. TEP, tromboembolismo pulmonar. 1 US dólar = 2,5 reais.1Pacientes podiam apresentar uma ou mais indicações para uso da varfarina.2Pacientes podiam apresentar um ou mais eventostromboembólicos. As Tabelas 2, 3 e 4 mostram todas as variáveis independentes de acordo com dose média de varfarina < 17,5 mg/semana ou ≥ 17,5 mg/semana, TTR≤60% ou TTR>60% e TTR≥75% ou TTR<75%, respectivamente. 40 A Tabela 2 mostra que a idade média dos indivíduos que utilizaram dose média de varfarina <17,5 mg/semana foi maior em relação àqueles que utilizaram doses ≥17,5 mg/semana (64,1 vs. 59,8 mg/semana, p=0,024). RNI alvo entre 2,00-3,00 (n=215, 69%) ou 2,50 a 3,50 (n=97, 31%) e ocorrência de IAM (n=25, 8%) também estão associados com dose semanal de varfarina dicotomizada, p=0,024 e p=0,029, respectivamente. Tabela 2 – Características sociodemográficas, comportamentais, clínicas e farmacoterapêuticas da população do estudo em pacientes de acordo com dose média semanal de varfarina. Características Total (n=312) Dose média varfarina Valor p <17,5mg/semana (n=40) ≥17,5mg/semana (n=272) Idade, média (DP) 60,4 (13,5) 64,1 (10,5) 59,8 (13,8) 0,024 Idade > 60 anos, n (%) 170 (54,5) 23 (7,4) 147 (47,1) 0,744 Sexo, n (%) Feminino Masculino 187 (59,9) 125 (40,1) 22 (7,0) 18 (5,8) 165 (52,9) 107 (34,3) 0,606 Escolaridade – anos, média (DP) 4,9 (3,3) 4,9 (2,9) 4,9 (3,3) 0,947 Renda mensal familiar por pessoa – US dólares, média (DP) 269,0 (178,5) 251,4 (145,6) 271,6 (182,9) 0,434 Coabitação, n (%) 280 (89,7) 33 (10,6) 247 (79,2) 0,170 Consumo excessivo de bebidas alcoólicas, n (%) 5 (1,6) 1 (0,3) 4 (1,3) 1,000 Indicação da terapia anticoagulante, n (%)1 Fibrilação/Flutter atrial Prótese mecânica de valva cardíaca Prevenção AVC/AIT secundário 232 (74,4) 118 (37,8) 45 (14,4) 33 (10,6) 10 (3,2) 7 (2,2) 199 (63,8) 108 (34,6) 38 (12,2) 0,226 0,088 0,621 RNI alvo, n (%) 2,00-3,00 2,50-3,50 215 (68,9) 97 (31,1) 34 (10,9) 6 (1,9) 181 (58,0) 91 (29,2) 0,029 Duração da terapia anticoagulante– anos, média (DP) 5,1 (3,9) 1942,1 (1370,1) 2034,0 (1434,5) 0,695 Duração da terapia anticoagulante– dias, média (DP) 2022,2 (1424,6) 4,9 (3,7) 5,11 (3,9) 0,714 Tempo de acompanhamento– dias,média (DP) 1269,1 (598,8) 1177,1 (630,7) 1282,6 (594,0) 0,325 Tempo de acompanhamento– anos, n (%) 0 1 2 3 4 5 6 4 (1,3) 18 (5,8) 85 (27,2) 69 (22,1) 34 (10,9) 44 (14,1) 58 (18,6) 1 (0,3) 2 (0,6) 16 (5,1) 7 (2,2) 3 (1,0) 2 (0,6) 9 (2,9) 3 (1,0) 16 (5,1) 69 (22,1) 62 (19,9) 31 (9,9) 42 (13,5) 49 (15,7) 0,279 Comorbidades, n (%) Hipertensão arterial sistêmica Dislipidemia Insuficiência cardíaca Diabetes mellitus Neoplasia ativa Disfunção hepática grave 190 (60,9) 114 (36,5) 100 (32,0) 41 (13,1) 4 (1,3) 1 (0,3) 24(7,7) 14 (4,5) 11(3,5) 4 (1,3) - - 166 (53,2) 100 (32,0) 89 (28,5) 37 (11,9) 4 (1,3) 1 (0,3) 1,000 0,865 0,603 0,617 0,667 1,000 Medicamentosuso crônico, média (DP) 5,9 (2,0) 5,7 (2,33) 5,9 (2,01) 0,680 Medicamentos, n (%) Polifarmácia Sinvastatina Amiodarona Carbamazepina Fenitoína 229 (73,4) 139 (44,5) 33 (10,6) 4 (1,3) 4 (1,3) 27 (8,6) 17 (5,4) 3 (1,0) - 1 (0,3) 202 (64,7) 122 (39,1) 30 (9,6) 4(1,3) 3 (1,0) 0,438 0,867 0,580 0,661 1,000 Consultas anuais controle de RNI, média (DP) 10,7 (2,4) 10,7 (2,8) 10,7 (2,3) 0,908 Absenteísmo, n (%) 253 (81,1) 31 (9,9) 222 (71,1) 0,908 Relato de não administração da varfarina, n (%) 173 (55,5) 21(6,7) 152 (48,7) 0,433 Ajustes anuais de dose da varfarina, média (DP) 3,3 (1,8) 2,9 (1,9) 3,4 (1,8) 0,208 41 Tabela 2 – Características sociodemográficas, comportamentais, clínicas e farmacoterapêuticas da população do estudo em pacientes de acordo com dose média semanal de varfarina (continuação). Características Total (n=312) Dose média varfarina Valor p <17,5mg/semana (n=40) ≥17,5mg/semana (n=272) Auxílio para administração da varfarina, n (%) 36 (11,5) 4 (1,3) 32(10,3) 0,783 Dose de varfarina, n (%) < 17,5 mg/semana ≥ 70 mg/semana 312 (100) 40 (12,8) 9 (2,9) 13,7 (2,6) 40 (12,8) - 33,4 (15,1) - 9 (2,9) - - - TTR, n (%) ≤ 60% ≥ 75% 312 (100) 122 (39,1) 64 (20,5) 65,6 (15,0) 14 (4,5) 11 (3,5) 63,0 (14,0) 108 (34,6) 53 (17,0) 0,314 0,607 0,278 Hemorragia, n (%) Grave Não grave clinicamente relevante Não grave 2 (0,6) 0 91 (29,2) 1(0,3) - 8 (8,8) 1(0,3) - 83 (91,2) 1,000 - 0,194 Eventos tromboembólicos, n (%)2 IAM AVC/AIT TVP TEP 25 (8,0) 41 (13,1) 2 (0,6) 3 (1,0) 8 (2,6) 6 (1,9) 0 1 (0,3) 17 (5,4) 35 (11,2) 2 (0,6) 2 (0,6) 0,010 0,788 1,000 0,354 DP, desvio padrão. AVC, acidente vascular encefálico. AIT, ataque isquêmico transitório. RNI, razão normalizada internacional. TTR, time in therapeutic range. IAM, infarto agudo do miocárdio. TVP, trombose venosa profunda. TEP, tromboembolismo pulmonar. 1 US dólar = 2,5 reais.1Pacientes podiam apresentar uma ou mais indicações para uso da varfarina.2Pacientes podiam apresentar um ou mais eventostromboembólicos. Na comparação entre pacientes com TTR≤60% ou TTR>60%, observou-se que sexo, idade >60 anos, RNI alvo, tempo de acompanhamento, número de consultas anuais para controle de RNI, absenteísmo nas consultas para controle de RNI, número de ajustes de dose da varfarina, número de relatos de não administração da varfarina e ocorrência de hemorragianão grave estão associados com TTR dicotomizado. Enquanto que a média de medicamentos em uso crônico foi maior nos pacientes com TTR≤60% (Tabela 3). Tabela 3 – Características sociodemográficas, comportamentais, clínicas e farmacoterapêuticas da população do estudo de acordocomTTR ≤60%ou TTR >60%. Características Total (n=312) TTR ≤ 60% (n=122) TTR > 60% (n=190) Valor p Idade, média (DP) 60,4 (13,5) 58,8 (13,6) 61,4 (13,3) 0,095 Idade >60 anos, n (%) Sim Não 170(54,5) 142(45,5) 57 (18,3) 65 (20,8) 113(36,2) 77 (24,7) 0,034 Sexo, n (%) Feminino Masculino 187 (59,9) 125 (40,1) 86 (27,6) 36 (11,5) 101 (32,4) 89 (28,5) 0,003 Escolaridade –anos, média (DP) 4,9 (3,3) 5,0 (3,3) 4,9 (3,3) 0,843 Renda mensal familiar por pessoa – US dólares, média (DP) 269,0 (178,5) 250,3 (183,7) 281,0 (174,5) 0,144 Coabitação, n (%) Sim Não 280 (89,7) 32 (10,2) 106 (34,0) 16 (5,1) 174 (55,8) 16 (5,1) 0,256 Consumo excessivo de bebidas alcoólicas, n (%) Sim Não 5 (1,6) 307 (98,4) 106 (34,0) 16 (5,1) 174 (55,8) 16 (5,1) 1,000 Indicação da terapia anticoagulante, n (%)1 Fibrilação/Flutter atrial Prótese mecânica de valva cardíaca Prevenção AVC/AIT secundário 232 (74,4) 118 (37,8) 45 (14,4) 90 (28.85) 50 (16,0) 19 (6,1) 142 (45,5) 68 (21,8) 26 (8,3) 0,899 0,394 0,745 RNI alvo, n (%) 2,00-3,00 2,50-3,50 215 (68,9) 97 (31,1) 73 (23,4) 49 (15,7) 142 (45,5) 48 (15,4) 0,003 42 Tabela 3 – Características sociodemográficas, comportamentais, clínicas e farmacoterapêuticas da população do estudo de acordo comTTR≤60%ou TTR>60% (continuação). Características Total (n=312) TTR ≤ 60% (n=122) TTR > 60% (n=190) Valor p Duração da terapia anticoagulante– anos, média (DP) 5,1 (3,9) 4,6 (3,8) 5,4 (4,0) 0,092 Duração da terapia anticoagulante– dias, média (DP) 2022,2 (1424,6) 1856,9 (1379,8) 2128,3 (1446,2) 0,097 Tempo de acompanhamento– dias,média (DP) 1269,1 (598,8) 1145,3 (585,7) 1348,6 (595,2) 0,003 Tempo de acompanhamento– anos, n (%) 0 1 2 3 4 5 6 4 (1,3) 18 (5,8) 85 (27,2) 69 (22,1) 34 (10,9) 44 (14,1) 58 (18,6) 2 (0,6) 11 (3,5) 38 (12,2) 27 (8,6) 13 (4,2) 17 (5,4) 14 (4,5) 2 (0,6) 7 (2,2) 47 (15,1) 42 (13,5) 21 (6,7) 27 (8,6) 44 (14,1) 0,112 Comorbidades, n (%) Hipertensão arterial sistêmica Dislipidemia Insuficiência cardíaca Diabetes mellitus Neoplasia ativa Disfunção hepática grave 190 (60,9) 114 (36,5) 100 (32,0) 41 (13,1) 4 (1,3) 1 (0,3) 74 (23,7) 49 (15,7) 45 (14,4) 16 (5,1) 3 (1,0) 1 (0,3) 116 (37,2) 65 (20,8) 55 (17,6) 25 (8,0) 1 (0,3) - 1,000 0,342 0,170 1,000 0,303 0,376 Medicamentosuso crônico, média (DP) 5,9 (2,0) 6,2 (2,1) 5,6 (2,0) 0,012 Medicamentos, n (%) Polifarmácia Sinvastatina Amiodarona Carbamazepina Fenitoína 229 (73,4) 139 (44,5) 33 (10,6) 4 (1,3) 4 (1,3) 96 (30,7) 53 (16,9) 9 (2,8) 2 (0,6) 2 (0,6) 133 (42,6) 86 (27,6) 24 (7,6) 2 (0,6) 2 (0,6) 0,119 0,823 0,192 1,000 1,000 Consultas anuais controle de RNI, média (DP) 10,7 (2,4) 11,4 (2,7) 10,2 (2,0) <0,001 Absenteísmo, n (%) 253 (81,1) 108 (34,6) 145 (46,5) <0,001 Relato de não administraçãoda varfarina, n (%) 173 (55,5) 86 (27,6) 87 (27,9) <0,001 Ajustes anuais de dose da varfarina, média (DP) 3,3 (1,8) 4,5 (1,7) 2,5 (1,5) <0,001 Auxílio para administração da varfarina, n (%) 36 (11,5) 18 (5,8) 18 (5,8) 0,199 Dose de varfarina, n (%) < 17,5 mg/semana ≥ 70 mg/semana 312 (100) 40 (12,8) 9 (2,9) 32,8 (18,3) 14 (4,5) 5 (1,6) 29,6(13,5) 26 (8,3) 4 (1,3) 0,105 0,597 0,490 TTR, n (%) ≤ 60% ≥ 75% 312 (100) 122 (39,1) 64 (20,5) 49,6 (9,9) 122 (39,1) - 72,1 (8,1) - 64 (20,5) <0,001 - - Hemorragia, n (%) Grave Não grave clinicamente relevante Não grave 2 (0,6) 0 91 (29,2) 1 (0,3) - 44 (48,4) 1 (0,3) - 47 (51,6) 1,000 - 0,044 Eventos tromboembólicos, n (%)2 IAM AVC/AIT TVP TEP 25 (8,0) 41 (13,1) 2 (0,6) 3 (1,0) 10 (3,2) 17 (5,4) 1 (0,3) 1 (0,3) 15 (4,8) 24 (7,7) 1 (0,3) 2 (0,6) 1,000 0,849 1,000 1,000 DP, desvio padrão. AVC, acidente vascular encefálico. AIT, ataque isquêmico transitório. RNI, razão normalizada internacional. TTR, time in therapeutic range. IAM, infarto agudo do miocárdio. TVP, trombose venosa profunda. TEP, tromboembolismo pulmonar. 1 US dólar = 2,5 reais.1Pacientes podiam apresentar uma ou mais indicações para uso da varfarina.2Pacientes podiam apresentar um ou mais eventostromboembólicos. Na comparação entre pacientes com TTR≥75% ou TTR<75%, observou-se que sexo, prótese mecânica de válvula cardíaca, RNI alvo, tempo de acompanhamento, número de consultas anuais para controle de RNI, absenteísmo nas consultas para controle de RNI, número de ajustes de dose da varfarina e número de relatos de não administração da varfarina estão associados com TTR dicotomizado. Enquanto que a dose média semanal de varfarina foi maior nos pacientes com TTR<75% (Tabela 4). 43 Tabela 4 – Características sociodemográficas, comportamentais, clínicas e farmacoterapêuticas da população do estudo em pacientes com TTR≥75%ou TTR<75%. Características Total (n=312) TTR ≥ 75% (n=64) TTR < 75% (n=248) Valor p Idade, média (DP) 60,4 (13,5) 59,8 (14,4) 60,5 (13,3) 0,743 Idade >60 anos, n (%) 170(54,5) 36(11,5) 134(42,9) 0,785 Sexo, n (%) Feminino Masculino 187 (59,9) 125 (40,1) 31(9,9) 33(10,6) 156(50,0) 92(29,5) 0,047 Escolaridade – anos, média (DP) 4,9 (3,3) 5,3 (3,4) 4,8 (3,2) 0,277 Renda mensal familiar por pessoa – US dólares, média (DP) 269,0 (178,5) 266,7(161,9) 269,5(182,8) 0,904 Coabitação, n (%) 280 (89,7) 59(18,9) 221(70,8) 0,493 Consumo excessivo de bebidas alcoólicas, n (%) 5 (1,6) - 5(1,6) 0,378 Indicação da terapia anticoagulante, n (%)1 Fibrilação/Flutter atrial Prótese mecânica de valva cardíaca Prevenção AVC/AIT secundário 232 (74,4) 118 (37,8) 45 (14,4) 50(16,0) 16(5,1) 8(2,6) 182(58,3) 102(32,7) 37(11,9) 0,540 0,023 0,696 RNI alvo, n (%) 2,00-3,00 2,50-3,50 215 (68,9) 97 (31,1) 56(17,9) 8(2,6) 159 (51,0) 89(28,5) <0,001 Duração da terapia anticoagulante– anos, média (DP) 5,1 (3,9) 5,9 (4,7) 0-28(3;5;8) 0,119 Duração da terapia anticoagulante– dias, média (DP) 2022,2 (1424,6) 1457,7 (599,3) 1220,4 (590,2) 0,151 Tempo de acompanhamento– dias,média (DP) 1269,1 (598,8) 2292,0 (1748,6) 1952,6 (1323,5) 0,006 Tempo de acompanhamento– anos, n (%) 0 1 2 3 4 5 6 4 (1,3) 18 (5,8) 85 (27,2) 69 (22,1) 34 (10,9) 44 (14,1) 58 (18,6) 1 (0,3) 3 (1,0) 9 (2,9) 14 (4,5) 8 (2,6) 11 (3,5) 18 (5,8) 3 (1,0) 15 (4,8) 76 (24,4) 55 (17,6) 26 (8,3) 33 (10,6) 40 (12,8) 0,115 Comorbidades, n (%) Hipertensão arterial sistêmica Dislipidemia Insuficiência cardíaca Diabetes mellitus Neoplasia ativa Disfunção hepática grave 190 (60,9) 114 (36,5) 100 (32,0) 41 (13,1) 4 (1,3) 1 (0,3) 40(12,8) 23(7,4) 21(6,7) 12(3,8) - - 150(48,1) 91 (29,2) 79(25,3) 29(9,3) 4(1,3) 1(0,3) 0,770 1,000 1,000 0,145 0,603 1,000 Medicamentosuso crônico, média (DP) 5,9 (2,0) 5,9 (2,13) 5,8 (2,03) 0,614 Medicamentos, n (%) Polifarmácia Sinvastatina Amiodarona Carbamazepina Fenitoína 229 (73,4) 139 (44,5) 33 (10,6) 4 (1,3) 4 (1,3) 48(15,4) 28 (9,0) 9(2,9) - - 181(58,0) 111(35,6) 24(7,7) 4(1,3) 4(1,3) 0,757 0,906 0,358 0,575 0,573 Consultas anuais controle de RNI, média (DP) 10,7 (2,4) 9,3 (1,6) 11,1 (2,4) <0,001 Absenteísmo, n (%) 253 (81,1) 39 (12,5) 214 (68,6) 0,000 Relato de não administração da varfarina, n (%) 173 (55,5) 18 (5,7) 155 (49,7) 0,000 Ajustes anuais de dose da varfarina, média (DP) 3,3 (1,8) 1,6 (0,9) 3,7 (1,7) <0,001 Auxílio para administração da varfarina, n (%) 36 (11,5) 4 (1,3) 32 (10,3) 0,178 Dose de varfarina (mg/semana) < 17,5 mg/semana, n (%) ≥ 70 mg/semana, n (%) 312 (100) 40 (12,8) 9 (2,9) 27,4 (13,0) 11 (3,5) 1 (0,3) 31,8 (16,1) 29 (9,3) 8 (2,6) 0,024 0,293 0,693 TTR, n (%) ≤ 60% ≥ 75% 312 (100) 122 (39,1) 64 (20,5) 81,3 (5,2) - 64 (20,5) 58,7(11,7) 122 (39,1) 248 (79,5) <0,001 - <0,001 Hemorragia, n (%) Grave Não grave clinicamente relevante Não grave 2 (0,6) 0 91 (29,2) 1(0,3) - 13 (14,2) 1(0,3) - 78 (86,8) 1,000 - 0,084 Eventos tromboembólicos, n (%)2 IAM AVC/AIT TVP TEP 25 (8,0) 41 (13,1) 2 (0,6) 3(1,0) 7 (2,2) 8 (2,6) 1(0,3) 1(0,3) 18 (5,8) 33 (10,6) 1(0,3) 2 (0,6) 0,431 1,000 0,349 1,000 DP, desvio padrão. AVC, acidente vascular encefálico. AIT, ataque isquêmico transitório. RNI, razão normalizada internacional. TTR, time in therapeutic range. IAM, infarto agudo do miocárdio. TVP, trombose venosa profunda. TEP, tromboembolismo pulmonar. 1 US dólar = 2,5 reais.1Pacientes podiam apresentar uma ou mais indicações para uso da varfarina.2Pacientes podiam apresentar um ou mais eventostromboembólicos. 44 5.2 Comparações das séries históricas de variáveis relativas ao tratamento com varfarina por ano de acompanhamento. Todas as variáveis foram analisadas quanto a sua distribuição ao longo do acompanhamento da coorte e apresentaram um comportamento similar, com exceção do primeiro ano em que poucos indivíduos foram assistidos (n=15). Nota-se assimetria à direita na distribuição de grande parte das variáveis, em todos os anos de acompanhamento (Figura 3). Figura 3 – Distribuição das variáveis relativas ao tratamento com varfarina por ano de acompanhamento. 45 5.3 Correlações das séries históricas dos diferentes métodos de cálculo do TTR por ano de acompanhamento ao longo do tempo e sua correlação Os valoresdo TTR mostraram comportamento homogêneo ao longo do tempo e estão altamente correlacionados em todos os anos avaliados (p<0,01) (Figura 4). Figura 4 – Distribuição e correlação do TTR calculado por diferentes métodos, ao longo do tempo. 5.4 Características genéticas da população estudada Todos os polimorfismos estavam sob o equilíbrio de Hardy-Weinberg (p>0,025). A avaliação da relação entre os genótipos estudados, a dose média semanal de varfarina e o TTR mostrou relações significativas e não significativas. Os polimorfismos do gene CYP2C9 não mostraram relação com o TTR (p=0,547), porém com a dose média de varfarina observou-se que metabolizadores extensivos (CYP2C9 *1/*1) necessitaram de doses maiores de varfarina do que indivíduos metabolizadores intermediários 46 (CYP2C9 *1/*2 ou *1/*3) e fracos (CYP2C9 *2/*2 ou *3/*3 ou *2/*3) (p<0,001). A análise da relação entre os genótipos CYP2C9*2 e CYP2C9*3, a dose média semanal de varfarina e o TTR se encontra nas Tabelas 5 e 6. Para o polimorfismo -G1639A VKORC1, quando o modelo de herança recessiva [AA x (GA + GG)] foi analisado, pacientes com genótipo AA utilizaram doses menores de varfarina (19,0mg/semana vs. 32,2mg/semana, p<0,001) e apresentaram TTR maior (68,2% vs. 62,8%, p=0,017). Considerando o modelo de herança dominante [GG vs. (GA + AA)], também observamos que aqueles pacientes com um ou dois alelos A necessitam de doses menores de varfarina (25,3mg/semana vs. 36,9mg/semana, p<0,001). A dose média semanal de varfarina variou consideravelmente entre os genótipos GG, GA e AA (p<0,001). A análise da relação entre os genótipos -G1639A VKORC1, a dose média semanal de varfarina e o TTR se encontra nas Tabelas 5 e 6. Tabela 5 – Frequência dos genótipos CYP2C9 e VKORC1 em relação ao TTR e à dose média semanal de varfarina. Genótipos n (%) n (%)quando TTR ≤60% Valor p n (%)quando TTR ≥75% Valor p n (%)quando dose média <17,5 (mg/semana) Valor p CYP2C9 *1/*1 227 (72,8) 88 (28,2) 0,868 45 (14,4) 0,926 22 (7,0) 0,002 *1/*2 + *1/*3 77 (24,7) 30 (9,6) 17 (5,4) 14 (4,9) *2/*2 + *2/*3 + *3/*3 8 (2,6) 4 (1,3) 2 (0,6) 4 (1,3) *1/*1 227 (72,8) 88 (28,2) 0,899 45 (14,4) 0,626 22 (7,0) 0,007 Não *1/*1 85 (27,2) 34 (10,9) 19 (6,1) 18 (5,8) *1/*2 51 (16,3) 106 (34,0) 0,284 13 (4,2) 0,339 8(2,6) 0,647 Não *1/*2 261 (83,6) 16 (5,1) 51 (16,3) 32 (10,3) *1/*3 26 (8,3) 14 (4,5) 0,154 4 (1,3) 0,622 6 (1,9) 0,110 Não *1/*3 286 (91,7) 108 (34,6) 60 (19,2) 34 (10,9) *2/*2 4 (1,3) 3 (1,0) 0,299 1 (0,3) 1,000 2 (0,6) 0,088 Não *2/*2 308 (98,7) 119 (38,1) 63 (20,2) 38(12,2) *2/*3 3 (1,0) 1 (0,3) 1,000 1 (0,3) 1,000 1 (0,3) 0,343 Não *2/*3 309 (99,0) 121 (38,8) 63 (20,2) 39 (12,5) *3/*3 1 (0,3) 0 1,000 0 1,000 1 (0,3) 0,135 Não *3/*3 311(99,7) 122 (39,10) 64 (20,5) 39 (12,5) *2 62 (9,9) 23 (3,7) 0,536 16 (2,6) 0,479 13 (2,1) 0,002 *3 31 (5,0) 15 (2,4) 5 (0,8) 9 (1,4) *1 531 (85,1) 206 (33,0) 107 (17,1) 58 (9,3) VKORC1 GG 149 (47,8) 61 (19,5) 0,415 25 (8,0) 0,089 7 (2,2) <0,001 GA 131 (42,0) 52 (16,7) 28 (9,0) 15( 4,8) AA 32 (10,2) 9 (2,9) 11 (3,5) 18 (5,8) GG 149( 47,8) 61 (19,5) 0,563 25 (8,0) 0,122 7 (2,2) <0,001 GA + AA 163 (52,2) 61 (19,5) 39 (12,5) 33(10,6) AA 32 (10,2) 9 (2,9) 0,167 11 (3,5) 0,064 18 (5,8) <0,001 GA + GG 280 (89,7) 113 (36,2) 53 (17,0) 22 (7,0) G 429 (68,8) 174 (27,9) 0,269 78 (12,5) 0,032 29 (4,6) <0,001 A 195 (31,3) 70 (11,2) 50 (8,0) 51 (8,2) 47 Tabela 6 – Análise da relação entre os genótipos CYP2C9 e VKORC1 com TTR e dose média semanal de varfarina. Genótipos TTR % Média (DP) Valor p Dose média varfarina (mg/semana) Valor p CYP2C9 *1/*1 63,5 (14,4) 0,547 33,0 (15,0) < 0,0011 *1/*2 +*1/*3 63,4 (12,6) 25,9 (16,1) *2/*2 + *2/*3 + *3/*3 58,1 (19,8) 17,3 (7,5) VKORC1 GG 62,8 (13,4) 0,155 36,9 (18,4) < 0,0012 GA 62,7 (15,3) 26,9 (9,2) AA 68,2 (11,4) 19,0 (8,6) GG 62,8 (13,4) 0,525 36,9 (18,4) < 0,001 GA + AA 63,8 (14,7) 25,3 (9,6) AA 68,2 (11,4) 0,017 19,0 (8,6) < 0,001 GA + GG 62,8 (14,3) 32,2 (15,6) 1Teste de Dunnet p<0,05 para todos, referência *1/*1, 2 Teste de Dunnet p<0,05 para todos, referência GG. DP = desvio padrão. 5.5 Relação entre dose média semanal de varfarina e fatores genéticos e não genéticos Inicialmente, foi realizada a análise univariada, tendo como variável dependente a dose média semanal de varfarina. As variáveis com valor p<0,20 incluídas no modelo de regressão preliminar foram: idade (anos), educação (anos), hipertensão arterial sistêmica (sim/não), dislipidemia (sim/não), diabetes mellitus (sim/não), uso de carbamazepina (sim/não), fibrilação atrial/flutter (sim/não), prótese mecânica de valva cardíaca (sim/não), RNI alvo (2,00-3,00 ou 2,50-3,50), TTR (%), IAM (sim/não), TVP (sim/não), genótipo CYP2C9 [1/1 vs. (1/2 ou 1/3) vs. (2/2 ou 2/3 ou 3/3) e genótipo VKORC1 (GG vs. GA vs.AA)]. Inicialmente, utilizou-se o modelo de regressão linear múltipla. No entanto, diversas suposições quanto à estrutura dos resíduos não foram respeitadas, o que contra indica a utilização deste modelo. Como a dose semanal de varfarina é uma variável que não assume valores negativos, é contínua e tem distribuição assimétrica, a distribuição gama é uma candidata natural para modelar esta variável. Logo, o modelo de distribuição gama foi testado e utilizado. Pois, além de apresentar coeficientes significativos (diferentes de zero), o modelo apresentou boa qualidade de ajuste e respeito às suposições. O modelo de regressão gama final está apresentado na Tabela 7. 48 Tabela 7 – Variáveis que compõem o modelo de regressão gama para a dose média semanal de varfarina. Termo Coeficiente estimado Erro padrão do coeficiente Valor t Valor p Intercepto 50,080 3,035 16,50 < 0,001 Idade (anos) -0,172 0,049 -3,52 < 0,001 Hipertensão arterial sistêmica 3,369 1,179 2,86 0,005 Diabetesmellitus 4,409 1,958 2,25 0,025 RNI alvo 2,00-3,00 -6,890 1,573 -4,38 < 0,001 VKORC1 GA -8,211 1,381 -5,95 < 0,001 VKORC1 AA -16,054 1,608 -9,98 < 0,001 CYP2C9 1/2 ou 1/3 -5,890 1,233 -4,78 < 0,001 CYP2C9 2/2 ou 2/3 ou 3/3 -12,905 2,404 -5,37 < 0,001 RNI, razão normalizada internacional. A equação derivada do modelo é a seguinte: dose média semanal de varfarina (mg) = 50,08 - 0,172 x (idade em anos) + 3,369 x (1, se o paciente tem hipertensão arterial sistêmica, caso contrário 0) + 4,409 x (1, se o paciente tem diabetes mellitus, caso contrário 0) -6,890 x (1, se RNI alvo entre 2,00-3,00, caso contrário 0) -8,211 x (1, se genótipo VKORC1 GA, caso contrário 0) - 16,054 (1, se genótipo VKORC1 AA, outro 0) - 5,890 (1, se genótipo CYP2C9 1/2 ou 1/3, caso contrário 0) - 12,905 (1, se genótipo CYP2C9 2/2 ou 2/3 ou 3/3, caso contrário 0). Observa-se na Tabela 7que para cada aumento de dez anos na idade, a dose de varfarina reduz 1,72 mg. A presença de um ou doisalelos Apara o polimorfismo VKORC1 -1639G>A reduz a dose de varfarina semanal em 8,2 e 16,1 mg, respectivamente,o que corresponde a uma de redução de 16,4% e 32,1% da dose utilizada por pacientes com alelos selvagens em homozigose. Comportamento semelhante é observado em indivíduos metabolizadores intermediários (CYP2C9 *1/*2 ou *1/*3) e fracos (CYP2C9 *2/*2 ou *3/*3 ou *2/*3), que utilizam doses menores 5,9 e 12,9 mg menores, respectivamente, o que corresponde a uma de redução de 11,8% e 25,8% da dose utilizada por pacientes com alelos selvagens em homozigose. Pacientes com meta terapêutica do RNI entre 2,00-3,00 utilizam 6,9 mg menos de varfarina do que aqueles com alvo entre 2,50-3,50. Contudo, pacientes com hipertensão arterial sistêmicae diabetes mellitus têm aumento da dose semanal necessária de varfarina em cerca de 3,4 e 4,4 mg, respectivamente. 49 O poder preditivo do modelo foi baixo para sua utilização na predição de doses iniciais de varfarina (pseudo R2=0,44), indicado pela Figura 5, que apresenta a relação entre os valores reais de dose e aqueles estimados pelo modelo. Esperava-se que a maioria dos pontos estivesse sobre a reta indicando uma boa qualidade do ajuste, mas o que se nota é uma grande dispersão em torno da reta. Figura 5 – Relação entre valores observados e estimados para a dose de varfarina. 5.6 Relação entre dose média de varfarina < 17,5 mg/semana e fatores genéticos e não genéticos Tomando a dose média de varfarina <17,5 mg/semana como variável dependente, as seguintes variáveis com valor p<0,20 na análise univariada foram incluídasno modelo de regressão inicial: idade (anos), coabitação (sim/não), prótese mecânica de valva cardíaca (sim/não), eventos hemorrágicos não graves (n), tromboembolismo (sim/não), infarto agudo do miocárdio (sim/não), genótipo da VKORC1 (GG vs. GA vs. AA) e genótipo CYP2C9 [1/1 vs.(1/2 ou 1/3)vs.(2/2 ou 2/3 ou 3/3)]. O modelo de regressão logística final que incluiu somente variáveis com coeficientes diferentes de zero está apresentado na Tabela 8. 50 Tabela 8 – Variáveis que compõem o modelo de regressão logística para dose média de varfarina <17,5 mg/semana. Termo Coeficiente estimado Erro padrão do coeficiente Valor z Valor p Razão de chances (95% IC) Intercepto -4,312 0,616 -7,00 < 0,001 * - RNI 2,00 a 3,00 1,297 0,524 2,47 0,013 * 3,66 (1,40-11,24) VKORC1 GA 0,887 0,493 1,80 0,072 2,43 (0,95-6,74) VKORC1 AA 3,476 0,557 6,25 < 0,001 * 32,34 (11,39-102,91) CYP2C9 1/2 + 1/3 0,561 0,439 1,28 0,202 1,75 (0,72-4,10) CYP2C9 2/2 + 2/3 + 3/3 2,730 0,825 3,31 < 0,001 * 15,34 (2,99-82,78) RNI, razão normalizada internacional.A classe de referência do modelo foi a dose média de varfarina ≥17,5 mg/semana e as razões de chance são de pertencer ao grupo dose média de varfarina <17,5 mg/semana em relação à classe de referência. A equação derivada do modelo é a seguinte: logaritmo natural (dose média semanal de varfarina <17,5mg/dose média semanal de varfarina ≥17,5mg) = - 4,312 + 1,297 x (1, se RNI alvo entre 2,00 e 3,00, caso contrário 0) + 0,887 x (1, se genótipo VKORC1 GA, caso contrário 0) + 3,476 (1, se genótipo VKORC1 AA, caso contrário 0) + 0,561 (1, se genótipo CYP2C9 1/2 ou 1/3, caso contrário 0) + 2,730 (1, se genótipo CYP2C9 2/2 ou 2/3 ou 3/3, caso contrário 0). A transformação dos coeficientes da regressão nos informa a RC associada a cada variável. Indivíduos com RNI alvo entre 2,00-3,00 têm chance 2,66 vezes maior de usarem dose média de varfarina <17,5mg/semana do que aqueles com RNI alvo entre 2,50-3,50. A presença dos alelos polimórficos CYP2C9 e VKORC1 aumenta a chance de baixa dose, sendo que há um efeito dependente do número de cópias alélicas. Indivíduos com genótipos que incluem combinações dos alelos 2 e 3 da CYP2C9 têm chance 14,3 vezes maior de usarem dose média de varfarina <17,5mg/semana e aqueles com homozigose de AA do VKORC1têm chance 31,3 vezes maior de usarem dose média de varfarina <17,5mg/semana (Tabela 8). A curva ROC do modelo apresentou área sobre a curva de 82,8% (75,4%-90,3%) e o valor de corte escolhido foi de 0,18,com sensibilidade de 67,5% e especificidade de 87,5% (Figura 6). 51 Figura 6 – Análise de sensibilidade e especificidade do modelo de regressão logística para dose média de varfarina <17,5 mg/semana. Linha vermelha representa a sensibilidade e linha azul representa a especificidade. 5.7 Relação entre TTR e fatores genéticos enão genéticos Inicialmente, foi realizada uma análise univariada, tendo como variável dependente o TTR. As variáveis com valor p<0,20 incluídas no modelo de regressão preliminar foram: idade >60 anos (sim/não), sexo (masculino/feminino), renda (US$), tempo de acompanhamento (dias), polifarmácia (sim/não), medicamentos em uso crônico (n),uso de carbamazepina (sim/não), duração da terapia com varfarina (dias), relato de não administração da varfarina (n), RNI alvo (2,00-3,00 ou 2,50-3,50), consultas para controle do RNI (n), absenteísmo (n), ajustes de dose da varfarina (n), dose média de varfarina (mg/semana), hemorragia não grave (n) e genótipo VKORC1 (GG vs. GA vs. AA) e genótipo CYP2C9 [1/3 vs. (1/1 +1/2 + 2/2 + 2/3 + 3/3)]. Inicialmente, utilizou-se o modelo de regressão linear múltipla. No entanto, diversas suposições quanto à estrutura dos resíduos não foram respeitadas, o que contra indica a utilização deste modelo. Como o TTR é uma variável que não assume valores negativos, é contínua e tem distribuição assimétrica, a distribuição gama é uma candidata natural para modelar esta variável. Logo, o modelo de distribuição gama foi testado e utilizado. Pois, além de apresentar coeficientes significativos, o modelo apresentou boa qualidade de ajuste e respeito às suposições. O modelo de regressão gama final está apresentado na Tabela 9. 52 Tabela 9 – Variáveis que compõem o modelo de regressão gama para TTR. Termo Coeficiente estimado Erro padrão do coeficiente Valor t Valor p Renda (US$) 0,004 0,002 2,379 0,018 Tempo de acompanhamento (dias) 0,005 0,001 4,116 < 0,001 Relato de não administração da varfarina (n) -2,942 0,826 -3,561 < 0,001 Ajustes da dose de varfarina (n) -2,930 0,339 -8,641 < 0,001 RNI alvo entre 2,00-3,00 67,774 2,384 28,427 < 0,001 RNI alvo entre 2,50-3,50 63,643 2,865 22,217 < 0,001 RNI, razão normalizada internacional. A equação derivada do modelo é a seguinte: TTR (%) = 0,004 x (renda em US$) + 0,005 x (tempo de acompanhamento do paciente em dias) - 2,942 x (número de relatos de não administração da varfarina) - 2,930 x (número de ajustes de dose da varfarina) + 67,774 x (1, se RNI alvo entre 2,00-3,00, caso contrário 0) + 63,643 x (1, se RNI alvo entre 2,50-3,50, caso contrário 0). A Tabela 9 mostra que para cada relato de não administração da varfarina e para cada ajuste de dose da varfarina realizado pelos profissionais de saúde, o TTR reduz em aproximadamente três unidades ou 3%, enquanto que um aumento do TTR é esperado quando há aumento da renda familiar por pessoa ou aumento do tempo de acompanhamento do paciente no ambulatório. Para cada ano de seguimento do indivíduo no ambulatório o TTR aumenta em 1,8 unidades ou 1,8%. Em relação à meta do RNI, observou-se que pacientes com meta entre 2,00-3,00 apresentam TTR 4,1 unidades maior em relação àqueles com RNI entre 2,50-3,50. O poder preditivo do modelo foi baixo (pseudo R2 = 0,30), o que é indicado pela Figura 7 que apresenta a relação entre os valores reais de TTR e aqueles estimados pelo modelo. Esperava- se que a maioria dos pontos estivesse sobre a reta indicando uma boa qualidade do ajuste, mas o que se nota é uma grande dispersão em torno da reta. 53 Figura 7 – Relação entre valores observados e estimados para o TTR Rosendaal. 5.8 Relação entre TTR ≤ 60% e fatores genéticose não genéticos Tomando o TTR≤60% como variável dependente, as seguintes variáveis com valor p<0,20 na análise univariada foram incluídasno modelo de regressão inicial: idade >60 anos (sim/não), sexo, renda (US$), insuficiência cardíaca (sim/não), tempo de acompanhamento (dias), polifarmácia (sim/não), medicamentos em uso (n), uso de amiodarona (sim/não), duração da terapia com varfarina (dias), auxílio de terceiros para administração de varfarina (sim/não), relato de não administração da varfarina (n), RNI alvo (2,00-3,00 ou 2,50-3,50), número de consultas para controle do RNI (n), absenteísmo (n), ajustes de dose da varfarina (n), dose média de varfarina (mg/semana), eventos hemorrágicos não graves (n), genótipo VKORC1 [AA vs. (GA + GG)]. O modelo de regressão logística que incluiu somente variáveis com coeficientes diferentes de zero está apresentado na Tabela 10. 54 Tabela 10 – Estatísticas do modelo de regressão logística para TTR≤60%. Termo Coeficiente estimado Erro padrão do coeficiente Valor z Valor p Razão de chances (95% IC) Intercepto -4,392 0,507 -8,66 < 0,001 - Relato de não administração da varfarina (n) 0,471 0,190 2,48 0,013 1,60 (1,11 - 2,35) Ajustes de dose da varfarina (n) 0,842 0,116 7,24 < 0,001 2,32 (1,87 - 2,96) Absenteísmo (n) 0,507 0,162 3,14 0,002 1,66 (1,22 - 2,30) A classe de referência do modelo foi o TTR>60% e as razões de chance são de pertencer ao grupo TTR≤60% em relação à classe de referência. A equação derivada do modelo é a seguinte: logaritmo natural (TTR≤60%/TTR>60%) = - 4,392 + 0,471 x (número de relatos de não administração da varfarina) + 0,842 x (número de ajustes de dose da varfarina) + 0,507 x (número de faltas nas consultas para controle do RNI). A cada novo relato de não administração da varfarina a chance do indivíduo ter o TTR≤60%, em relação à chance de ser TTR>60%, aumenta, aproximadamente, uma vez. Aumento similar é visto a cada consulta que o paciente deixa de comparecer no ambulatório de anticoagulação. Acada novo ajuste de dose de varfarina realizadoa chance de se tornar do grupo TTR≤60% é 1,3 vezes maior (Tabela 10). A curva ROC do modelo apresentou área sobre a curva de 86,6%, com intervalo de confiança de 95% entre 82,4%-90,7% e o valor de corte escolhido foi de 0,37 que gera sensibilidade de 87,7% e especificidade de 76,8% (Figura 8). 55 Figura 8 – Análise de sensibilidade e especificidade do modelo de regressão logística para TTR≤60%. Linha vermelha representa a sensibilidade e linha azul representa a especificidade. 5.9 Relação entre TTR≥75% e fatores genéticos e não genéticos Tomando o TTR≥75% como variável dependente, as seguintes variáveis com valor p<0,20 na análise univariada foram incluídasno modelo de regressão inicial: sexo, diabetes mellitus (sim/não), tempo de acompanhamento (dias), duração da terapia com varfarina (dias), auxílio de terceiros para a administração de varfarina (sim/não), relato de não administração da varfarina (n), prótese mecânica de valva cardíaca (sim/não), RNI (2,00-3,00 ou 2,50-3,50), consultas para o controle da RNI (n), absenteísmo (n), ajustes de dose da varfarina (n), dose média de varfarina (mg/semana), genótipos do VKORC1 (AA vs. GA vs. GG) e presença do alelo CYP2C912 (sim/não). O modelo de regressão logística que incluiu somente variáveis com coeficientes diferentes de zero está apresentado na Tabela 11. 56 Tabela 11 – Estatísticas do modelo de regressão logística para TTR ≥75%. Termo Coeficiente estimado Erro padrão do coeficiente Valor z Valor p Razão de chances (95% IC) Intercepto 1,876 1,122 1,67 0,095 - Tempo de acompanhamento (dias) 0,001 0,000 3,51 < 0,001 1,001 (1,001 - 1,002) RNI alvo entre 2,00-3,00 1,808 0,512 3,53 < 0,001 6,097 (2,358 - 17,844) Consultas controle do RNI (n) -0,298 0,134 -2,22 0,026 0,742 (0,568 - 0,965) Absenteísmo (n) -0,735 0,254 -2,89 0,004 0,480 (0,285 - 0,776) Ajustes da dose de varfarina (n) -1,142 0,230 -4,97 < 0,001 0,319 (0,197 - 0,489) RNI, razão normalizada internacional. A classe de referência do modelo foi o TTR <75% e as razões de chance são de pertencer ao grupo TTR ≥75% em relação à classe de referência. A equação derivada do modelo é a seguinte: logaritmo natural (TTR≥75%/TTR<75%) = + 1,876 + 0,001 x (tempo de acompanhamento do paciente em dias) + 1,808 x (1, se RNI alvo entre 2,00-3,00, caso contrário 0) - 0,298 x (número de consultas para controle do RNI) - 0,735 x (número de faltas nas consultas para controle do RNI) - 1,142x (número de ajustes de dose da varfarina). Nota-se que o aumento de 30 dias na duração do acompanhamento aumenta 0,03 vezes a chance do indivíduo apresentar TTR≥75% e que indivíduos com RNI alvo entre 2,00-3,00 têm aproximadamente chance cinco vezes maior de terem um TTR≥75% do que aqueles com RNI alvo entre 2,50-3,50. O aumento de uma unidade no número de consultas para o controle do RNI, no número de absenteísmos e no número de ajustes de dose da varfarina diminui a chance do um indivíduo ter TTR≥75% em 0,35, 1,08 e 2,12 vezes, respectivamente (Tabela 11). A curva ROC do modelo apresentou área sobre a curva de 91,8% (88,7%-95,0%) e o valor de corte escolhido foi de 0,22 que gera sensibilidade de 89,1% e especificidade de 82,6% (Figura 9). 57 Figura 9 – Análise de sensibilidade e especificidade do modelo de regressão logística para TTR≥75%. Linha vermelha representa a sensibilidade e linha azul representa a especificidade. 58 6 DISCUSSÃO O estudo foi realizado em clínica especializada no controle da anticoagulação para identificação de características relacionadas à dose de varfarina e à qualidade da terapia anticoagulante, avaliada pelo TTR. Fatores sociodemográficos, clínicos e polimorfismos dos genes CYP2C9 e VKORC1 foram associados à variação de dose de varfarina e ao TTR. Adicionalmente, identificamos dois fatores comportamentais modificando o TTR relato de não administração da varfarina e absenteísmo nas consultas para controle do RNI. Os resultados do acompanhamento de pacientes com FA ou prótese mecânica de válvula cardíaca, em ambiente de prática clínica real, mostraram que 13% dos indivíduos utilizaram menos de 17,5 mg/semana de varfarina, 61% apresentaram controle do RNI (TTR≥60%) e somente 20% ótima qualidade da terapia anticoagulante (TTR ≥75%). 6.1 Dose de varfarina A investigação da relação dos polimorfismos nos genes CYP2C9 e VKORC1 e fatores não genéticos com o uso de doses de varfarina <17,5mg/semana mostrou que RNI alvo e os polimorfismos CYP2C9*2 e CYP2C9*3 do gene CYP2C9 e -G1639A do gene VKORC1 foram associados à dose requerida. O ponto forte desse estudo foi a identificação de fatores preditores de dose semanal de varfarina <17,5mg e a obtenção de uma equação matemática, por meio de um modelo de regressão logística, que permitiu predizer a dose requerida de varfarina e, posteriormente, com aplicação desses resultados em uma curva ROC e determinação de um cut-off, permitiu estratificar os pacientes em risco de sensibilidade à varfarina (doses <17,5mg/semana). A influência dos polimorfismos CYP2C9*2 e CYP2C9*3 do gene CYP2C9 e -G1639A do gene VKORC1 na dose da varfarina já foi observada em várias populações. Carreadores de alelos polimórficos para esses genes requerem doses menores da varfarina (LINDH et al., 2009; YANG et al., 2010). Na amostra estudada, observou-se redução de 11,8% e 25,8% da dose utilizada por pacientes com alelos polimórficos do gene CYP2C9 em heterozigose e homozigose, respectivamente. A enzima CYP2C9 participa do metabolismo da varfarina e o alelo CYP2C9*1 selvagem apresenta maior frequência nas populações e é o responsável pela metabolização normal desse fármaco (BOTTON et al., 2011, SANTOS et al., 2015). Os 59 alelos CYP2C9*2 e CYP2C9*3 codificam enzimas com atividade reduzida em 30% e 80%, respectivamente, e metabolizam a varfarina mais lentamente. Juntos eles explicam 12% da variação da dose de varfarina (TAKEUCHI et al., 2009; ANDERSONet al., 2012). No presente estudo, os carreadores -G1639A e -A1639A do gene VKORC1 utilizaram dose 16,4% e 32,1% menores do que a dose utilizada por pacientes com alelos selvagens em homozigose -G1639G, respectivamente. O polimorfismo VKORC1 -G1639A explica 27% da variação da dose de varfarina (WADELIUS et al., 2009) e os carreadores do alelo A variante necessitam de doses menores de varfarina do que aqueles que possuem o alelo G (GAGE et al., 2008). O alelo A altera o sítio de ligação do fator de transcrição do VKORC1 e promove menor transcrição do gene quando comparado ao alelo G selvagem, o que reduz a sua expressão gênica (YUAN et al., 2005). Yang e colaboradores (2010) revelaram que, em caucasianos, carreadores de um ou dois alelos variantes requerem doses 25% e 50% menores, respectivamente. O efeito antitrombótico da varfarina está relacionado à redução da síntese dos fatores da coagulação dependentes da vitamina K (II, VII, IX e X) devido à inibição da atividade enzimática da proteína VKOR, que participa da síntese desses fatores (OWEN et al., 2010). Quanto menor o nível de anticoagulação a ser alcançado, menor inibição enzimática da VKOR e menor quantidade de varfarina serão necessárias para alcance da meta terapêutica. Em relação à meta de RNI, já era esperado observar menor necessidade de doses para pacientes com RNI alvo entre 2,00-3,00. O resultado encontrado pode refletir a adequação do protocolo institucional utilizado para manejo da dose da varfarina a partir de diferentes porcentagens de ajustes de acordo com o RNI alvo desejado. Alguns estudos identificaram o aumento da idade como fator associado ao uso de menores doses de varfarina (PERINI et al., 2008; SUAREZ-KURTZ et al., 2009; BOTTON et al., 2011, VERHOEF et al., 2013; SUAREZ-KURTZ et al., 2015; SANTOS et al., 2015) ou de sensibilidade (doses ≤21mg/semana) à varfarina (SALEH, 2016). Nesse estudo, a análise univariada mostrou que a idade se relacionou negativamente com a dose de varfarina. Para cada ano adicional na idade, a dose de varfarina reduziu 0,17mg/semana. A varfarina é transformada em metabólitos inativos por enzimas do citocromo P450 hepático e com o envelhecimento pode haver diminuição do seu metabolismo (UFER, 2005; POLASEK et al., 2013). Garcia e colaboradores (2005) observaram que o aumento de um ano na idade reduziu 60 a necessidade semanal de varfarina em 0,4 mg. Khoury e Sheikh-Taha (2014) também observaram o uso de menores doses da varfarina com o avançar da idade. Quando se considera a aplicabilidade clínica dos resultados desse estudo, deve-se ponderar alguns aspectos. Embora o modelo de regressão logística não tenha conseguido estratificar corretamente todos os pacientes sensíveis à varfarina, obteve-se um bom valor preditivo, o que reforça a sua utilidade futura na conduta clínica, já que a escolha da dose a ser prescrita a partir do modelo de predição do uso de doses baixas de varfarina poderá levar à redução do risco de sangramento nos pacientes sensíveis. Vale destacar também que os modelos de regressão linear para predição de doses iniciais da varfarina apresentam baixo poder preditivo, com R2 ajustado variando entre 24% e 69% (FRANCIS et al., 2014), demonstrando que a dose inicial pode ser predita incorretamente para muitos pacientes. Assim, a predição do uso de doses baixas pode ser uma alternativa para melhorar a segurança da terapia anticoagulante com varfarina. Entretanto, deve-se levar em considerar questões técnicas, logísticas e econômicas que podem limiar a realização da genotipagem para determinar a escolha da dose inicial de varfarina em países em desenvolvimento como o Brasil. Outra observação importante se refere à pequena proporção de pacientes com alelos polimórficos para CYP2C9 (18/85; 21,2%) e para VKORC1 (33/163; 20,2%), em homozigose ou heterozigose, que utilizou doses baixas de varfarina durante o tratamento. Em outras palavras, muitos pacientes com alelos polimórficos não utilizaram doses baixas de varfarina. Esse achado corrobora as evidências que a variabilidade de doses de varfarina é multifatorial (PERINI et al., 2008; SUAREZ-KURTZ et al., 2009; BOTTON et al., 2011, VERHOEF et al., 2013; SUAREZ-KURTZ et al., 2015; SANTOS et al., 2015), mas mesmo assim a inclusão dos polimorfismos é essencial, pois ditam grande parte da resposta. Os genótipos CYP2C9 e VKORC1 influenciaram o uso de doses baixas em maior magnitude que o RNI alvo. 6.2 TTR O TTR médio dos pacientes com dois alelos variantes para o gene VKORC1 –G1639A foi maior em relação ao TTR de pacientes com uma ou nenhuma variante alélica, quando o modelo de herança recessiva foi analisado (AA vs. GA + GG). Há poucas evidências sobre a influência de características genéticas no TTR. Skov e colaboradores (2013) mostraram que 61 seis pacientes com dois alelos variantes de CYP2C9 (*2/*3 ou *3/*3) apresentaram TTR significativamente menor (60,5% vs. 74,3%, p=0,012) do que os outros pacientes (*1/*1 + *1/*2). Outros trabalhos não identificaram variação significativa do TTR entre os subgrupos com e sem alelos variantes para VKORC1 -G1639A e CYP2C9 (BURMESTER et al., 2011; SANTOS et al., 2015; MARCATTO et al.; 2016). Entretanto, os resultados desses estudos podem estar relacionados ao número limitado de pacientes com alelos polimórficos, principalmente para o gene CYP2C9. Além da relação entre TTR e fatores genéticos, nós também identificamos sete fatores associados independentemente com a qualidade da terapia anticoagulante, sendo dois presentes no início do tratamento – renda familiar por pessoa e RNI alvo entre 2,00-3,00 – e cinco observados no decorrer do tratamento – tempo de acompanhamento, relato de não administração da varfarina, ajustes de dose da varfarina, número de consultas para controle de RNI e absenteísmo nas consultas para controle da RNI. Três desses fatores estão relacionados ao controle inadequado da anticoagulação (TTR≤60%): relato de não administraçãode varfarina, ajustes de dose da varfarina e absenteísmo nas consultas para controle do RNI. E dois fatores se relacionam com a ótima qualidade da terapia anticoagulante (TTR≥75%): RNI alvo entre 2,00-3,00 e tempo de acompanhamento estão positivamente relacionados, enquanto ajustes de dose da varfarina, absenteísmo nas consultas para controle do RNI e número de consultas para controle de RNI se relacionam negativamente. No presente estudo, o aumento da renda familiar mensal por pessoa e o aumento do tempo de acompanhamento ambulatorial foram preditores do TTR. Uma hipótese para esses resultados seria que pacientes com maior renda ou com mais tempo de acompanhamento pela equipe multiprofissional, teriammelhor entendimento sobre a terapêutica com a varfarina, maior adesão ao tratamento e, consequentemente, maior TTR. Praxedes e colaboradores (2016) identificaram que o nível de conhecimento sobre a terapêutica com a varfarina, avaliada pela versão brasileira do Oral Anticoagulation Knowledge (OAK) Test, correlaciona-se positivamente com o TTR. Costa e colaboradores (2012) identificaram que pacientes tratados com varfarina por mais de dois meses têm maior chance de ter TTR ≥66%, assim como aqueles do sexo masculino ou que têm habilidade funcional e cognitiva para utilizarem medicamentos conforme a prescrição. Porém, em metanálise incluindo 95 artigos publicados entre 1993 e 2013 para avaliar pacientes com FA em uso de varfarina, não houve diferença 62 significativa no TTR de indivíduos com menos ou mais de um ano de uso da varfarina (MEARNS et al., 2014). A relação entre RNI alvo e TTR é pouco pesquisada entre os estudos que avaliam fatores preditores do TTR. Nesse trabalho, os pacientes apresentaramTTR 4% maior em pacientes com RNI alvo entre 2,00-3,00 em relação àqueles com RNI alvo entre 2,50-3,50. Considerando que pacientes com RNI alvo entre 2,50-3,50 apresentam mais RNIs fora da meta, pois o TTR é menor para esses pacientes, a melhor qualidade da anticoagulação em pacientes com alvo entre 2,00-3,00 pode ser explicadapelo menor número de ajustes de dose da varfarina, pela equipe de saúde, quando o RNI está fora da faixa terapêutica, mas perto do limite inferior ou superior pré-determinado para o paciente.Uma explicação poderia ser que os profissionais de saúde estariam sendo mais rigorosos nos ajustes de doses em pacientes com RNI alvo entre 2,50-3,50 devido ao risco tromboembólico aumentado para os pacientes com prótese metálica de válvula cardíaca. Skov e colaboradores (2013) também observaram diferença aproximada de 4% no TTR entre esses grupos. Indivíduos com intervalo entre 2,50- 3,50tiveram TTR médio igual a 69,7%, enquanto o TTR dos indivíduos com alvo entre 2,00- 3,00 foi 74,0%, porém essa diferença não foi significativa. A adesão à varfarina é ponto fundamental para o sucesso da terapia anticoagulante. É esperado que pacientes sem adesão à varfarina não alcancem o efeito anticoagulante desejado (OBAMIRO, CHALMERS, BEREZNICKI, 2016). Yao e colaboradores (2016) observaram que apenas 40% dos pacientes utilizam a varfarina em pelo menos 80% dos dias de tratamento. Nesse estudo, a adesão ao tratamento não foi avaliada por meio de questionários padronizados com esse objetivo devido à indisponibilidade desses instrumentos de medida na língua portuguesa. Optou-se por avaliar o número de relatos de não administração da varfarina. Comportamento semelhante foi observado no número de consultas para controle de RNI e absenteísmo. Observou-se redução do TTR de acordo com o aumento do absenteísmo. Esse resultado mostra que o acompanhamento do paciente pela equipe de saúde é importante para melhorar a qualidade da terapia anticoagulante. Em relação ao número de consultas,os resultados mostram queda do TTR quando há aumento de consultas para controle de RNI. A interpretação é que pacientes com maior número de consultas são aqueles que não estão obtendo controle da RNI, e por isso, precisam retornar para correção de dose da varfarina. 63 Aumentar o número de consultas pode significar, indiretamente, mais ajustes de dose da varfarina. Dois estudos avaliaram grandes coortes de pacientes em uso de varfarina e também objetivaram a identificação de preditores demográficos e clínicos do TTR. Nos Estados Unidos, 124 619 pacientes com TTR médio igual a 61% foram avaliados e entre aqueles que utilizavam a varfarina por mais de seis meses (n=104 505), sexo feminino, idade <55 anos e quatro ou mais hospitalizações se relacionaram com a redução do controle da anticoagulação. Várias hospitalizações foi o principal preditor, com redução igual a 9,4% do TTR. Uso de múltitiplos medicamentos e presença de diferentes comorbidades também impactaram negativamente no TTR. Os autores também observaram que a distância da residência do paciente até a clínica de anticoagulação não impactou no TTR (ROSE et al., 2010). Em outra coorte, 29 717 pacientes com FA e 19 113 com história de TEV atendidos na atenção primária em saúde da Inglaterra foram investigados nos primeiros 12 meses de uso da varfarina. A partir do modelo de regressão multivariada, observou-se que sexo feminino, idade <45 anos, IMC<18,5kg/m2, tabagismo, várias comorbidades e repetidas hospitalizações se associaram com redução do TTR (MACEDO et al., 2015). O ponto forte desse estudo foi a identificação de fatores comportamentais que podem modificar a qualidade da terapia anticoagulante, por meio da curva ROC. Essa análise possibilitou a seleção de ponto de corte para estratificação dos pacientes entre os grupos, a partir da maximização da soma entre a sensibilidade e especificidade da amostra. O modelo logístico para avaliação da qualidade da terapia anticoagulante gerou uma sensibilidade de87,7% e especificidade de 76,8%, entre os grupos TTR≤60% ou TTR>60%. Buscando fatores que indicam ótima qualidade da terapia anticoagulante, a sensibilidade foi igual a 89,1% e especificidade igual a 82,6%. Os principais resultados desse estudo foram a identificação de polimorfismo do gene VKORC1 e de fatores comportamentais que influenciam o TTR, relato de não administração da varfarina e absenteísmo nas consultas para controle da RNI são características que não podem ser identificadas no início do tratamento com o varfarina. Elas mostram o comportamento do paciente durante o tratamento e são passíveis de modificação pelo paciente com orientação da equipe de saúde. O conhecimento de novas características associadas à variação do TTR é útilno direcionamento de ações para modificação desses fatores, tais como, 64 o desenvolvimento de programas de incentivo ao uso contínuo da varfarina e ao comparecimento nas consultas para controle da RNI. Os resultados também sugerem que a correção de dose da varfarina, quando a meta terapêutica não é atingida, deve ser ponto de atenção entre os profissionais de saúde e alvo para futuras pesquisas. 6.3 Limitações Existem algumas limitações nesse estudo. Primeiramente, o número de participantes foi insuficiente para avaliar os desfechos ideais de efetividade e segurança da varfarina, que seriam a ocorrência de eventos tromboembólicos e hemorrágicos. Segundo, algumas covariáveis como altura, peso, IMC, tabagismo, etnia e ingestão de vitamina K, que podem estar associadas à variação de dose da varfarina e ao TTR, não foram avaliadas.Não foi realizada a investigação de ancestralidade, que seria o procedimento indicado considerando o elevado grau de miscigenação da população brasileira. Terceiro, nossos resultados são derivados de um único ambulatório de anticoagulação, sendo assim, os dados devem ser validados em outras populações. Além disso, o tamanho limitado de pacientes com genótipos CYP2C9*2/*2, *2/*3 ou *3/*3 e VKORC1 –A1639A pode ser insuficiente para demonstrar associação significativa com o TTR. Por fim, os dados foram coletados a partir de prontuários, o que pode gerar limitações na recuperação de informações. 6.4 Artigos a serem submetidos Artigo 1 (Apêndice D): Algoritmo para predição de uso de doses baixas de varfarina a partir de polimorfismos nos genes CYP2C9 e VKORC1 e RNI alvo. Periódico: British Journal of Clinical Pharmacology Online ISSN: 1365-2125 Fator de impacto: 3.83 Artigo 2: Fatores preditores de qualidade do controle da terapia anticoagulante oral com varfarina em pacientes cardiopatas Periódico: Journal of Thrombosis and Haemostasis Online ISSN: 1538-7836 Fator de impacto: 5.565 65 7 CONCLUSÃO Algumas características sociodemográficas, clínicas e genéticas influenciam a variabilidade de dose da varfarina e a qualidade da terapia anticoagulante, avaliada pelo TTR. A dose média semanal de varfarina variou consideravelmente entre os genótipos dos polimorfismos CYP2C9 e VKORC1 e há um efeito dependente do número de cópias alélicas. Indivíduos com homozigose para o alelo mutante utilizam doses menores. Quando o modelo de herança recessiva [AA x (GA + GG)] para o polimorfismo -G1639A VKORC1 foi analisado, pacientes com genótipo AA utilizaram doses menores de varfarina e apresentaram TTR maior. Apenas idade e os polimorfismos CYP2C9*2 e CYP2C9*3 do gene CYP2C9 e -G1639A do gene VKORC1 permitem a estratificação dos pacientes em relação ao uso de doses baixas de varfarina. Fatores comportamentais modificam apenas a qualidade da terapia anticoagulante. Relato de não administração da varfarina e absenteísmo nas consultas para controle do RNI influenciam negativamente o TTR e podem ser passíveis de modificação pelo paciente acompanhado pela equipe de saúde. O conhecimento desses fatores é importante na estratificação dos pacientes de acordo com características que significativamente influenciam a resposta anticoagulante para, assim, direcionar ações assistenciais que podem melhorar a efetividade e segurança da varfarina em cenários reais de prática clínica assistencial. 66 REFERÊNCIAS Ageno W et al. Oral anticoagulant therapy: Antithrombotic Therapy and Prevention of Thrombosis, 9th ed: American College of Chest Physicians Evidence-Based Clinical Practice Guidelines. 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Estamos fazendo uma pesquisa para conhecer características que interferem no tratamento com a varfarina e assim poder melhorar o atendimento das pessoas que usam esse remédio. Queremos convidá-lo(a) para participar como voluntário(a). Não haverá custos nem ressarcimento para participar no estudo. Se você quiser participar, saiba que todas as suas informações serão codificadas por números, que não permitem sua identificação. Nós vamos divulgar os resultados da pesquisa em encontros e revistas científicas, mas seu nome nunca será revelado. Para participar, um técnico treinado vai coletar 10 mL de sangue, com agulha e tubos descartáveis, para fazer exames de sangue e exames genéticos, quando você vier fazer seu exame de rotina do RNI. A coleta de sangue pode doer um pouco, por causa da picada da agulha, e podem aparecer manchas roxas no local da picada que desaparecerão espontaneamente. Também faremos uma entrevista de cerca de 20 minutos, sobre seu estado de saúde, quando você vier fazer sua consulta de rotina. A pesquisa tem duração de aproximadamente 1 ano e você será informado(a) sobre os resultados de todos os exames, Poderemos solicitar exame para doença de Chagas e caso esse exame dê resultado positivo, vamos encaminhá-lo(a) para acompanhamento médico no CTR-DIP. Depois que os exames forem feitos, o sangue será descartado segundo normas da Vigilância Sanitária, mas se você permitir, seu DNA ficará congelado em um banco de amostras biológicas (autorizado pelo COEP-UFMG ETIC 0216/06) e poderá ser usado em pesquisas futuras. Toda nova pesquisa que usar suas informações e amostras de DNA será realizada apenas se ela for aprovada novamente por um Comitê de Ética em Pesquisa. 83 Se você não quiser participar, por favor, marque essa opção: ( ) Não aceito participar dessa pesquisa. Se você quiser participar, por favor, escolha uma das seguintes opções: ( ) Aceito participar dessa pesquisa, mas não concordo com congelamento do DNA. ( ) Aceito participar dessa pesquisa e concordo com o congelamento do DNA. No futuro, se o DNA for usado em novas pesquisas, quero que entrem em contato comigo para eu escolher se vou concordar ou não com a nova pesquisa. ( ) Aceito participar dessa pesquisa e concordo com o congelamento do DNA. No futuro, se o DNA for usado em novas pesquisas, os pesquisadores não precisam entrar em contato comigo para eu escolher se vou concordar ou não com a nova pesquisa. Mesmo aceitando participar, você pode desistir em qualquer momento e por qualquer motivo, sem prejuízo no atendimento recebido pelos profissionais de saúde do ambulatório. Declaro que recebi uma via desse documento, tive oportunidade de ler esse documento, discutir os procedimentos, escolher minha forma de participação e esclarecer todas as minhas dúvidas. NOME COMPLETO PACIENTE __________________________________________ TELEFONE __________________________________________ ENDEREÇO __________________________________________ ASSINATURA DO PACIENTE __________________________________________ NOME COMPLETO PESQUISADOR __________________________________________ Belo Horizonte, _______ de ________________________ de __________. Se você tiver dúvidas em relação aos procedimentos da pesquisa: entre em contato com os pesquisadores pelos telefones: (31) 8807-2463 Farmacêutica Aline Mourão ou (31) 3409- 6937 Profa, Maria Auxiliadora. Se você tiver dúvidas em relação aos aspectos éticos: entre em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Minas Gerais,Av, Antônio Carlos, 6627, Unidade Administrativa II, sala 2005, Campus Pampulha, Belo Horizonte, Minas Gerais, (31) 3409- 4592. 84 APÊNDICE B – Protocolo para recrutamento dos pacientes 1 - Data __ __ / __ __ / __ __ 2 - Número de registro na pesquisa __ __ __ __ ____ 3 - Númerodo prontuário __ __ __ __ __ __ 4- Nome_____________________________________________________________________________________ 5 - Sexo (0) M (1) F 6 - Data de nascimento __ __ / __ __ / __ __ 7 - Educação (anos) ________________ 8 - Renda mensal por pessoa (reais) ________________ 9 – RNI alvo (0) 2,50 a 3,50 (1) 2,00 a 3,00 10 - Critérios de inclusão Uso de varfarina a pelo menos 2 meses (0) Não (1) Sim Idade igual ou superior a 18 anos (0) Não (1) Sim Fibrilação atrial (qualquer tipo) (0) Não (1) Sim Prótese mecânica de válvula cardíaca mitral (0) Não (1) Sim Prótese mecânica de válvula cardíaca aórtica (0) Não (1) Sim Acidente vascular encefálico prévio (0) Não (1) Sim 11 - Paciente aceita participar após apresentação do TCLE? (0) Não (1) Sim NÃO 13 - Motivo de recusa _________________________________________________________________ 14 - Paciente autoriza uso das informações coletadas? (0) Não (1) Sim SIM Registrar respostas para as perguntas 15 a 17 no encerramento da pesquisa ou em caso de abandono do estudo 12 - Paciente completou o período de acompanhamento? (0) Não (1) Sim NÃO 16 - Motivo da descontinuação Decisão do paciente (0) Não (1) Sim Impossibilidade de comparecimento às consultas (0) Não (1) Sim Interrupção do tratamento por motivo não relacionado ao uso do anticoagulante (0) Não (1) Sim Interrupção do tratamento por motivo relacionado ao uso do anticoagulante (0) Não (1) Sim Qual? __________________________________________________________ Óbito não relacionado ao uso do anticoagulante (0) Não (1) Sim Óbito relacionado ao uso do anticoagulante (0) Não (1) Sim Qual? __________________________________________________________ Outra causa de abandono do estudo (0) Não (1) Sim Qual? __________________________________________________________ 17 - Paciente autoriza uso das informações coletadas? (0) Não (1) Sim SIM Encerrar registro de informações 85 APÊNDICE C – Protocolo para coleta de dados 13 - Duração do tratamento com a varfarina (meses) _________________ 14 - Coabitação (paciente reside com uma ou mais pessoas) (0) Não (1) Sim 15 - Necessidade de auxílio para administração da varfarina (0) Não (1) Sim 16 - Número de medicamentos em uso crônico (incluindo a varfarina) _________________ 17 - Medicamentos em uso crônico (igual ou superior a 30 dias contínuos) (0) Não (1) Sim Amiodarona (0) Não (1) Sim Sinvastatina (0) Não (1) Sim Hidroclorotiazida (0) Não (1) Sim Furosemida (0) Não (1) Sim Enalapril (0) Não (1) Sim Captopril (0) Não (1) Sim Losartana (0) Não (1) Sim Propranolol (0) Não (1) Sim Atenolol (0) Não (1) Sim Carvedilol Espironolactona (0) Não (1) Sim Ácido acetil salicílico 100 mg (0) Não (1) Sim Levotiroxina (0) Não (1) Sim Outro _________________________________________________________________ (0) Não (1) Sim Outro _________________________________________________________________ (0) Não (1) Sim Outro _________________________________________________________________ (0) Não (1) Sim Outro _________________________________________________________________ (0) Não (1) Sim Outro _________________________________________________________________ (0) Não (1) Sim Outro _________________________________________________________________ (0) Não (1) Sim 18 - Comorbidades (0) Não (1) Sim Doença de Chagas (0) Não (1) Sim Infarto agudo do miocárdio (IAM) (0) Não (1) Sim Acidente vascular encefálico (AVC) ou ataque isquêmico transitório(AIT) (0) Não (1) Sim Insuficiência cardíaca (0) Não (1) Sim Hipertensão arterial sistêmica (HAS) (0) Não (1) Sim Diabetes mellitus(DM) (0) Não (1) Sim Dislipidemia (0) Não (1) Sim Neoplasia ativa (0) Não (1) Sim Disfunção hepática grAVC (0) Não (1) Sim Doença renal crônica (DRC) (0) Não (1) Sim Hipotireoidismo (0) Não (1) Sim Outra _________________________________________________________________ (0) Não (1) Sim Outra _________________________________________________________________ (0) Não (1) Sim Outra _________________________________________________________________ (0) Não (1) Sim Outra _________________________________________________________________ (0) Não (1) Sim Outra _________________________________________________________________ (0) Não (1) Sim Outra _________________________________________________________________ (0) Não (1) Sim 19 - Tromboembolismo (0) Não (1) Sim Tipo de evento __________________________________________________ 20 - Hemorragia (0) Não (1) Sim Tipo de evento __________________________________________________ 21 - Uso de bebidas alcoólicas (0) Não (1) Sim 86 APÊNDICE D – Artigo sobre dose de varfarina Algoritmo para predição de uso de doses baixas de varfarina a partir de polimorfismos nos genes CYP2C9 e VKORC1 e RNI alvo Aline de Oliveira Magalhães Mourão, RPh, ScM1, Karina Braga Gomes, RPh, PhD2, Edna Afonso Reis,BStat, PhD2,3, Renan Pedra de Souza,PhD4, Emílio Itamar de Freitas Campos, RPh1, Daniel Dias Ribeiro, MD, PhD5, Manoel Otávio da Costa Rocha, MD, PhD1,5, Maria Auxiliadora Parreiras Martins, RPh, PhD1,2,5* 1Faculdade de Medicina, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Prof. Alfredo Balena, 190, Bairro Santa Efigênia, Belo Horizonte, Minas Gerais 30130-100, Brazil. 2Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Pres. Antônio Carlos, 6627, Pampulha, Belo Horizonte, Minas Gerais 31270-901, Brazil. 3Instituto de Ciências Exatas, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Pres. Antônio Carlos, 6627, Pampulha, Belo Horizonte, Minas Gerais 31270-901, Brazil. 4Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Pres. Antônio Carlos, 6627, Pampulha, Belo Horizonte, Minas Gerais 31270-901, Brazil. 5Hospital das Clínicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Prof. Alfredo Balena, 110, Bairro Santa Efigênia, Belo Horizonte, Minas Gerais 30130-100, Brazil. *Correspondence: Maria Auxiliadora Parreiras Martins, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Antônio Carlos, 6627, Campus Pampulha, Belo Horizonte, Minas Gerais, CEP 31270-901, Brasil. E-mail: auxiliadorapmartins@hotmail.com Running head: Preditores de sensibilidade à varfarina em modelo de regressão. Keywords: warfarin, drug therapy, administration and dosage, genetic polymorphism, warfarin sensitivity. Word count: excluding the title page, summary, references, tables, and figures. Number of tables/figures: 4/x 87 RESUMO Objetivo Varfarina é amplamente utilizada na prevenção de eventos tromboembólicos. Existe grande variação nas doses interindividuais e intraindividuais durante o tratamento. A dose de manutenção pode variar de 8,1 até 245mg de varfarina por semana. O objetivo desse estudo foi avaliar a associação dos polimorfismos CYP2C9*2 (rs1799853), CYP2C9*3 (rs1075910) e VKORC1 -G1639A (rs9923231) e fatores não genéticos com doses baixas de varfarina (<17,5mg/semana) e criar um algoritmo de predição de sensibilidade ao fármaco. Métodos Esse é um estudo de coorte retrospectivo que incluiu 312 pacientes em uso crônico de varfarina recrutados em clínica de anticoagulação (CA) de hospital universitário brasileiro. A indicação da anticoagulação oral incluiu fibrilação atrial (FA), prótese mecânica de válvula cardíaca ou histórico de acidente vascular encefálico isquêmico. Foi investigada a associação de dados sociodemográficos, clínicos e de polimorfismos genéticos da varfarina com doses registradas entre 2009-2015. Para análise dos dados, foi feita regressão logística multivariada e construção da Curva Característica de Operação do Receptor (ROC). Resultados Aidademédia dos pacientes foi 60,4 (±13,5) anos, sendo 59,9% do sexo feminino. Poucopacientes (12,8%) utilizaram doses semanais <17,5mg de varfarina. No modelo de regressão multivariada, as variáveis associadas com doses de varfarina <17,5 mg/semana foram Razão Normalizada Internacional (RNI) alvo 2,00-3,00 [razão de chance (RC) 3,66, intervalo de confiança (IC)95% 1,40-11,24; p=0,013], genótipo VKORC1 AA (RC 32,34, IC95% 11,39-102,91; p<0,001) e genótipo CYP2C9 2/2, 2/3 ou 3/3 (RC 15,34, IC95% 2,99- 82,78; p<0,001). A curva ROC apresentou área de 82,8% (75,4-90,3%) e cut-off de 0,18 com sensibilidade e especificidade de 67,5% e 87,5%, respectivamente. Conclusão Os polimorfismos CYP2C9*2 e CYP2C9*3 dos genes CYP2C9, -G1639A do gene VKORC1 e RNI alvo são fatores associados independentemente com sensibilidade à varfarina. Aproximadamente 77% dos pacientes com predisposição ao uso de doses baixas de varfarina podem ser identificados apenas com conhecimento dessas três variáveis. Palavras-chave: Anticoagulantes. Varfarina. Sensibilidade à Varfarina. Polimorfismo Genético. Farmacogenética. CYP2C9. VKORC1. 88 O que é conhecido sobre esse assunto:  Na prática clínica, existe grande variação nas doses terapêuticas de manutenção da varfarina.  Cerca de 20% da variabilidade de doses está relacionada a fatores clínicos e 40% ligada às variantes genéticas de CYP2C9*2, CYP2C9*3 e VKORC1 -G1639A.  Polimorfismos CYP2C9*2, CYP2C9*3 e VKORC1 -G1639A contribuem para redução das doses requeridas de varfarina. O que esse estudo adiciona:  RNI alvo e os polimorfismos -G1639A do gene VKORC1, CYP2C9*2 e CYP2C9*3 dos genes CYP2C9 permitem identificação de 77% dos pacientes com predisposição ao uso de doses baixas de varfarina (<17,5mg/semana).  Indivíduos homozigotos VKORC1 AA têm chance 31 vezes maior de usarem dose baixa de varfarina.  Indivíduos com genótipos que incluem combinações dos alelos 2 e 3 da CYP2C9 têm chance 14 vezes maior de usarem dose baixa de varfarina. 89 INTRODUÇÃO O tratamento farmacológico de muitos pacientes com fibrilação atrial (FA) e prótese mecânica de válvula cardíaca inclui o uso crônico de anticoagulantes orais para prevenção de acidente vascular cerebral (AVC), uma das principais causas de incapacidade e morte em países ocidentais (TERESHCHENKO etal., 2016). A varfarina é amplamente utilizada na prevenção primária e secundária de eventos tromboembólicos e seu efeito terapêutico é avaliado indiretamente pela determinação do tempo de protrombina, padronizado pela razão normalizada internacional (RNI). No entanto, o alcance do RNI ideal é dificultado pelo índice terapêutico estreito da varfarina e pela ampla variabilidade de doses requeridas para efeito antitrombótico (AGENO etal., 2012). A dose média de manutenção da varfarina está em torno de 28mg/semana (KLEIN et al., 2009; ANDERSON et al., 2012). No entanto, esta dose pode variar enormemente, uma vez que se observam indivíduos utilizando de 8,1 até 245mg de varfarina semanalmente (ALMEIDA et al., 2014). Indivíduos que necessitam de doses menores da varfarina e recebem doses usuais, podem estar em risco de anticoagulação excessiva, ao passo que doses insuficientes podem elevar o risco de eventos tromboembólicos (KLEIN et al., 2009). Essa variação é explicada por características demográficas, clínicas e genéticas. Enquanto idade, sexo, peso, altura, etnia e interações medicamentosas explicam 20% da variabilidade de doses (GAGE et al., 2008; KLEIN et al., 2009; ANDERSON et al., 2012; BOURGEOIS et al., 2016), as variantes alélicas para os genes CYP2C9 e VKORC1 representam aproximadamente 40% dessa variação (CALDWELL et al., 2007; TAKEUCHI et al., 2009; WADELIUS et al., 2009; JOHNSON et al., 2011; ANDERSON et al., 2012; ALMEIDA et al., 2014). A CYP2C9 é a principal enzima envolvida no metabolismo da varfarina, sendo codificada pelo gene citocromo P450-2C9 (CYP2C9, do inglês, cytochrome P450-2C9), localizado no cromossoma 10q23.33. O CYP2C9*1 é sua variante alélica mais comum, considerada como o alelo selvagem ou metabolizador normal. Os alelos CYP2C9*2, substituição de uma cisteína por uma arginina na posição 144 do exon 3, e CYP2C9*3, substituição de uma leucina por uma isoleucina na posição 359 do exon 7, metabolizam a varfarina mais lentamente, pois codificam enzimas com atividade reduzida em 30% e 80%, respectivamente (LEE; 90 GOLDSTEIN; PIEPER, 2002). O alvo terapêutico da varfarina, a enzima vitamina K epóxido redutase (VKOR), é codifica pelo gene complexo da vitamina K epóxido redutase, subunidade 1 (VKORC1, do inglês, vitamin K epoxide reductase complex, subunit 1), localizado no cromossoma 16p11.2 (LI et al., 2004; ROST et al., 2004). Polimorfismos nesse gene podem aumentar a sensibilidade à varfarina ou, em casos raros, aumentar a resistência farmacodinâmica (LOEBSTEIN et al., 2007; YANG et al., 2010). Ao polimorfismo -G1639A em VKORC1 foram atribuídos 27% da variação da dose (WADELIUS et al., 2009) e os carreadores do alelo A variante necessitam de doses menores de varfarina do que aqueles que possuem o alelo G (GAGE et al., 2008). O alelo A altera o sítio de ligação do fator de transcrição do VKORC1 e promove menor transcrição do gene VKORC1 do que o alelo selvagem G, o que reduz a sua expressão gênica e atividade enzimática (YUAN et al., 2005). O conhecimento de fatores relacionados à sensibilidade à varfarina pode auxiliar na estratificação de risco para o manejo adequado das doses e prevenção de eventos adversos relacionados ao medicamento. O objetivo desse estudo foi avaliar a associação dos polimorfismos CYP2C9*2 (rs1799853), CYP2C9*3 (rs1075910) e VKORC1-G1639A (rs9923231) e fatores não genéticos com doses de manutenção da varfarina <17,5mg/semana e aplicá-los a um modelo de regressão logística, com criação de um algoritmo de predição de sensibilidade ao medicamento. MÉTODOS Desenho do estudo e cenário Trata-se de estudo de coorte retrospectivo, desenvolvido em uma clínica de anticoagulação (CA) de um hospital público de ensino, localizado na região sudeste do Brasil. Esse serviço é multidisciplinar e a equipe é composta por médicos, enfermeiros e farmacêuticos. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em pesquisa da Universidade Federal de Minas Gerais. Todos os participantes assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Participantes Considerou-se como critérios de inclusão: idade ≥18 anos, ambos os sexos, com pelo menos uma das seguintes indicações para uso de varfarina: fibrilação/flutter atrial, prótese mecânica de válvula cardíaca ou histórico de AVC ou acidente isquêmico transitório (AIT), usuários de 91 varfarina em acompanhamento na CA por no mínimo dois meses no período 2009-2015. Os participantes foram selecionados de forma consecutiva, no dia da consulta agendada para controle de RNI. Coleta de Dados Todas as informações foram coletadas em entrevistas aos pacientes realizadas entre fevereiro e dezembro de 2015. Os dados foram complementados e confirmados por meio de consulta aos prontuários médicos e ao banco de dados da CA. As seguintes informações foram coletadas: idade, sexo, escolaridade (em anos), renda mensal familiar por pessoa (em dólar americano), coabitação, consumo excessivo de bebidas alcoólicas (definido como consumo diário de ≥60g de etanol) (SKINNER et al., 1984), indicação da terapia anticoagulante, RNI alvo, duração da terapia anticoagulante (em anos), tempo de acompanhamento na CA (em anos), comorbidades, medicamentos em uso crônico (≥30 dias), uso concomitante de medicamentos descritos em algoritmos de predição de dose (sinvastatina, amiodarona, carbamazepina e fenitoína) (PERINI et al., 2008; KLEIN et al., 2009; SANTOS et al., 2015). A dose semanal de varfarina foi coletada no banco de dados da CA sendo utilizada para calcular a dose semanal média utilizada pelo paciente durante o seu período máximo de seguimento na CA. Os pacientes foram divididos em dois grupos de acordo com a dose: <17,5 mg/semana e ≥17,5 mg/semana de varfarina. O ponto de corte da dose foi definido a partir da definição de dose baixa proposta por REDMAN et al., 2008. Genotipagem O DNA genômico foi extraído a partir de amostras de sangue total coletadas em anticoagulante do tipo EDTA, utilizando-se o kit Biopur® (Biometrix) e seguindo as instruções do fabricante. Os polimorfismos CYP2C9*2 (rs1799853, C_25625805-10) e CYP2C9*3 (rs1057910, C_2710489-10) no gene CYP2C9e -G1639A no gene VKORC1 (rs9923231, C_30403261-20)foram determinados pelo método de PCR Real Time, em termociclador StepOne® (Applied Biosystems), utilizando ensaio de discriminação alélica TaqMan® (Applied Biosystems). Os resultados foram interpretados no software StepOne® (Applied Biosystems).Em todos os ensaios, utilizou-se um controle branco da reação (sem DNA) e dois controles com genótipo já conhecido (CYP2C9*1, CYP2C9*2 ou CYP2C9*3 e G1639G, G1639A ou A1639A). As análises foram repetidas com 10% das amostras e a reprodutibilidade foi de 100%. 92 Análise Estatística O banco de dados foi validado por dupla digitação no software EpiData (versão 3.1, EpiData Assoc., Dinamarca). Em seguida os dados foram transferidos para planilha única no Excel e a análise das variáveis foi realizada no ambiente de programação R versão 3.2.5.A descrição das variáveis foi realizada usando medidas de frequência e tendência central. Na análise univariada, a dose semanal média de varfarina foi considerada variável dependente dicotômica (<17,5mg/semana ou ≥17,5mg/semana) para testar as associações com as variáveis independentes contínuas (idade, escolaridade, renda mensal, duração da terapia anticoagulante, tempo de acompanhamento na CA, medicamentos em uso crônico) e categóricas (sexo, coabitação, uso excessivo de bebidas alcoólicas, indicação da terapia anticoagulante, RNI alvo, comorbidades, uso concomitante de sinvastatina, amiodarona, carbamazepina e fenitoína e os genótipos CYP2C9 e VKORC1). A associação com as variáveis independentes categóricas foi verificada por meio do teste qui-quadrado de Pearson com valor p obtido por simulação de Monte Carlo, enquanto a associação com as variáveis independentes contínuas foi verificada por meio do teste t para duas médias. As variáveis independentes, cujo teste de hipótese atingiu p<0,20 na análise univariada, foram incorporadas inicialmente no modelo de regressão logística. A seleção das variáveis de importância na determinação da dose de varfarina foi baseada em estudos prévios (GAGE et al., 2008; PERINI et al., 2008; KLEIN et al., 2009; BOTTON et al., 2011, ANDERSON et al., 2012; SANTOS et al., 2015; BOURGEOIS et al., 2016). Análise diagnóstica foi realizada considerando a adequação de suas respectivas suposições. No modelo de regressão logística final foram mantidas apenas as variáveis independentes com coeficientes diferentes de zero (p<0,05). Posteriormente, aplicou-se a fórmula gerada no modelo de regressão em uma Curva Característica de Operação do Receptor (ROC) e o cut-off, que define o valor a partir do qual há sensibilidade à varfarina (doses requeridas <17,5mg/semana), foi estabelecido com base no ponto da curva onde a soma da sensibilidade e especificidade foi maior. Valores p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos. RESULTADOS Análise descritiva e univariada Foram considerados elegíveis 319 pacientes, sendo 312 incluídos no estudo, já que para sete pacientes não foi possível coletar a amostra de sangue.A idade média foi 60,4 (±13,5) anos e 93 predomínio de mulheres (187; 59,9%). Observou-se média de 4,9 (±3,3) anos de escolaridade e renda mensal familiar por pessoa igual a US$269 (±178,5). A maioria dos pacientes relatou coabitação (280; 89,7) e que não fazia uso excessivo de bebidas alcoólicas (307; 98,4%). Os pacientes foram acompanhados, em média, por 3,8 (±1,6) anos e apenas 4 (1,3%) frequentaram o ambulatório por menos de 1 ano. O tempo médio de uso de varfarina foi 5,1 (±3,9) anos, sendo indicada principalmente para tratamento de FA (n=232; 74,4%), com predominância de RNI alvo 2,00-3,00 (215; 68,9%). A principal comorbidade observada foi hipertensão (190; 60,9%), sendo o número médio de medicamentos em uso crônico igual a 5,9 (±2,0). A dose média semanal de varfarina foi 30,9 (±15,6) mg/semana, variando entre 8 e 119 mg. Para os pacientes que utilizaram doses <17,5 mg/semana de varfarina, a dose média foi 13,7 (±2,6) mg/semana, e 33,4 (±15,1) mg/semana para os pacientes com doses ≥17,5 mg/semana. Aproximadamente75% (n=234) dos indivíduos utilizaram até 35mg/semana de varfarina e 12,8% (n=40) usaram doses <17,5 mg/semana. A descrição detalhada das características clínicas dos pacientes está apresentada na Tabela 1. Na análise univariada, as características sociodemográficas e clínicas independentemente relacionadas à dose média de varfarina foram idade e RNI alvo. Os pacientes que utilizaram doses <17,5 mg/semana de varfarina apresentaram idade média maior do aqueles que utilizaram doses ≥17,5 mg/semana (p=0,024). A frequência de pacientes com RNI alvo entre 2,50-3,50 foi menor no grupo de pacientes que requereram doses menores que 17,5 mg/semana (p=0,029). 94 Tabela 1 – Características comportamentais, clínicas e farmacoterapêuticas dos pacientes de acordo com a dose média semanal de varfarina. Características Total (n=312) Dose média varfarina Valor p <17,5mg/semana (n=40) ≥17,5mg/semana (n=272) Idade, média (DP) 60,4 (13,5) 64,1 (10,5) 59,8 (13,8) 0,024 Sexo, n (%) Feminino Masculino 187 (59,9) 125 (40,1) 22 (7,0) 18 (5,8) 165 (52,9) 107 (34,3) 0,606 Escolaridade – anos, média (DP) 4,9 (3,3) 4,9 (2,9) 4,9 (3,3) 0,947 Renda mensal familiar por pessoa – US dólares, média (DP) 269,0 (178,5) 251,4 (145,6) 271,6 (182,9) 0,434 Coabitação, n (%) Sim Não 280 (89,7) 32 (10,2) 33 (10,6) 7 (2,2) 247 (79,2) 25 (8,0) 0,170 Consumo excessivo de bebidas alcoólicas, n (%) Sim Não 5 (1,6) 307 (98,4) 1 (0,3) 39 (12,5) 4 (1,3) 268 (85,9) 1,000 Indicação da terapia anticoagulante, n (%) Fibrilação/Flutter atrial Prótese mecânica de valva cardíaca Prevenção AVC/AIT secundário 232 (74,4) 118 (37,8) 45 (14,4) 33 (10,6) 10 (3,2) 7 (2,2) 199 (63,8) 108 (34,6) 38 (12,2) 0,226 0,088 0,621 RNI alvo, n (%) 2,00-3,00 2,50-3,50 215 (68,9) 97 (31,1) 34 (10,9) 6 (1,9) 181 (58,0) 91 (29,2) 0,029 Duração da terapia anticoagulante– anos, média (DP) 5,1 (3,9) 4,9 (3,7) 5,1 (3,9) 0,714 Tempo de acompanhamento na clínica de anticoagulação – anos, média (DP) 3,8 (1,6) 3,2 (1,7) 3,5 (1,6) 0,325 Comorbidades, n (%) Hipertensão arterial sistêmica Dislipidemia Insuficiência cardíaca Diabetes mellitus Neoplasia ativa Disfunção hepática grave 190 (60,9) 114 (36,5) 100 (32,0) 41 (13,1) 4 (1,3) 1 (0,3) 24 (7,7) 14 (4,5) 11 (3,5) 4 (1,3) - - 166 (53,2) 100 (32,0) 89 (28,5) 37 (11,9) 4 (1,3) 1 (0,3) 1,000 0,865 0,603 0,617 0,667 1,000 Medicamentos de uso crônico, média (DP) 5,9 (2,0) 5,7 (2,3) 5,9 (2,0) 0,680 Medicamentos, n (%) Sinvastatina Amiodarona Carbamazepina Fenitoína 139 (44,5) 33 (10,6) 4 (1,3) 4 (1,3) 17 (5,4) 3 (1,0) - 1 (0,3) 122 (39,1) 30 (9,6) 4(1,3) 3 (1,0) 0,867 0,580 0,661 1,000 DP, desvio padrão. AVC, acidente vascular encefálico; AIT, ataque isquêmico transitório. RNI, razão normalizada internacional. 1 US dólar = 2,5 Reais. Análise dos fatores genéticos Polimorfismos dos genes CYP2C9 e VKORC1 mostraram relação com a dose de varfarina. Observou-se que metabolizadores extensivos (CYP2C9 *1/*1) necessitaram de doses maiores de varfarina do que indivíduos metabolizadores intermediários (CYP2C9 *1/*2 ou *1/*3) e fracos (CYP2C9 *2/*2 ou *3/*3 ou *2/*3) (p<0,001). Para o polimorfismo VKORC1- G1639A, observou-se que o genótipo AA foi relacionado a menores doses de varfarina (p<0,001). Este dado foi corroborado quando o modelo de herança recessiva [AA x (GA + GG)] foi analisado (19,0mg/semana vs. 32,2mg/semana, p<0,001). Considerando o modelo de herança dominante [GG vs. (GA + AA)], também observamos que aqueles pacientes com um ou dois alelos A necessitaram de doses menores de varfarina (25,3mg/semana vs. 36,9mg/semana, p<0,001). A análise da relação entre os genótipos de CYP2C9 e VKORC1 e a dose média semanal de varfarina são mostradas na Tabela 2. 95 Tabela 2 – Análise da relação entre os genótipos CYP2C9 e VKORC1 e dose média semanal de varfarina. Genótipos n (%) Dose média varfarina (mg/semana) Valor p n (%)quando dose média <17,5 (mg/semana) Valor p CYP2C9 *1/*1 227 (72,8) 33,0 (15,0) < 0,001*1 22 (7,0) 0,002 *1/*2 +*1/*3 77 (24,7) 25,9 (16,1) 14 (4,5) *2/*2 + *2/*3 + *3/*3 8 (2,6) 17,3 (7,5) 4 (1,3) VKORC1 GG 149( 47,8) 36,9 (18,4) < 0,001*2 7 (2,2) <0,001* GA 131 (42,0) 26,9 (9,2) 15( 4,8) AA 32 (10,2) 19,0 (8,6) 18 (5,8) GG 149( 47,8) 36,9 (18,4) < 0,001* 7 (2,2) <0,001* GA + AA 163 (52,2) 25,3 (9,6) 33(10,6) AA 32 (10,2) 19,0 (8,6) < 0,001* 18 (5,8) <0,001* GA + GG 280 (89,7) 32,2 (15,6) 22 (7,0) 1Teste de Dunnet p <0,05 para todos, referência *1/*1, 2Teste de Dunnet p <0,05 para todos, referência GG. *p<0,05 foi estatisticamente significativo. Predição de doses pelo modelo de regressão logística As variáveis que apresentaram p<0,20 na análise univariada e que foram testadas no modelo de regressão logística multivariada incluíram idade (p=0,024), coabitação (p=0,170), prótese mecânica de prótese cardíaca (p=0,088), uso de sinvastatina (p=0,073), RNI alvo (p=0,029) e genótipos CYP2C9 [1/1 vs. (1/2 + 1/3) vs. (2/2 + 2/3 + 3/3); p<0,001] e VKORC1 (GG vs. GA vs. AA; p<0,001). O modelo de regressão logística final incluiu somente variáveis com coeficientes diferentes de zero e está apresentado na Tabela 3. Tabela 3 – Modelo de regressão logística para dose média de varfarina <17,5 mg/semana. Termo Coeficiente estimado Erro padrão do coeficiente Valor z Valor p Razão de chances (95% IC) Intercepto -4,312 0,616 -7,00 < 0,001 * - RNI 2,00 a 3,00 1,297 0,524 2,47 0,013 * 3,66 (1,40-11,24) VKORC1 GA 0,887 0,493 1,80 0,072 2,43 (0,95-6,74) VKORC1 AA 3,476 0,557 6,25 < 0,001 * 32,34 (11,39-102,91) CYP2C9 1/2 + 1/3 0,561 0,439 1,28 0,202 1,75 (0,72-4,10) CYP2C9 2/2 + 2/3 + 3/3 2,730 0,825 3,31 < 0,001 * 15,34 (2,99-82,78) IC, intervalo de confiança. RNI, Razão Normalizada Internacional. A classe de referência do modelo foi a dose média de varfarina ≥17,5 mg/semana e as razões de chance são pertencem ao grupo dose média de varfarina <17,5 mg/semana em relação à classe de referência. *p<0,05 foi estatisticamente significativo. A equação derivada do modelo é a seguinte: logaritmo natural (dose média semanal de varfarina <17,5mg/dose média semanal de varfarina ≥17,5mg) = - 4,312 + 1,297 x (1, se RNI alvo entre 2,00 e 3,00, caso contrário 0) + 0,887 x (1, se genótipo VKORC1 GA, caso contrário 0) + 3,476 (1, se genótipo VKORC1 AA, caso contrário 0) + 0,561 (1, se genótipo CYP2C9 1/2 ou 1/3, caso contrário 0) + 2,730 (1, se genótipo CYP2C9 2/2 ou 2/3 ou 3/3, caso contrário 0). 96 A transformação dos coeficientes da regressão nos informa a razão de chances (RC) associada a cada variável. Indivíduos com RNI alvo entre 2,00-3,00 têm chance 2,66 vezes maior de usarem dose média de varfarina <17,5mg/semana do que aqueles com RNI alvo entre 2,50- 3,50. A presença dos alelos polimórficos CYP2C9 e VKORC1 aumenta a chance de baixa dose, sendo que há um efeito dependente do número de cópias alélicas. Indivíduos com genótipos que incluem combinações dos alelos 2 e 3 da CYP2C9 têm chance 14,3 vezes maior de usarem dose média de varfarina <17,5mg/semana e aqueles com homozigose de AA do VKORC1 têm chance 31,3 vezes maior de usarem dose média de varfarina <17,5mg/semana. Quando a fórmula é aplicada a cada paciente, obteve-se um valor que foi utilizado para traçar a curva ROC, novamente considerando como variável desfecho o uso de doses médias de varfarina <17,5mg/semana. A curva ROC do modelo apresentou área de 82,8% (75,4%- 90,3%) e o melhor valor do cut-off foi de 0,18 cuja sensibilidade foi 67,5% e especificidade foi 87,5% (Figura 1). Figura 1 – Análise de sensibilidade e especificidade do modelo de regressão logística para dose média de varfarina <17,5mg/semana.Linha vermelha representa a sensibilidade e linha azul representa a especificidade. 97 DISCUSSÃO A investigação da relação dos polimorfismos nos genes CYP2C9 e VKORC1 e fatores não genéticos com o uso de doses de varfarina <17,5mg/semana mostrou que o RNI alvo e os polimorfismos CYP2C9*2 e CYP2C9*3 do gene CYP2C9 e -G1639A do gene VKORC1 foram associados independentemente à dose requerida. O ponto forte desse estudo foi a identificação de fatores preditores de dose semanal de varfarina <17,5mg e a obtenção de uma equação matemática, por meio de um modelo de regressão logística, que permitiu predizer a dose requerida de varfarina e, posteriormente, com aplicação desses resultados em uma curva ROC e determinação de um cut-off, permitiu estratificar os pacientes em risco de sensibilidade à varfarina (doses <17,5mg/semana). A influência dos polimorfismos CYP2C9*2 e CYP2C9*3 do gene CYP2C9 e -G1639A do gene VKORC1 na dose da varfarina já foi observada em várias populações. Carreadores de alelos polimórficos para esses genes requerem doses menores da varfarina (LINDH et al., 2009; YANG et al., 2010). Na população estudada, observou-se redução de 11,8% e 25,8% da dose utilizada por pacientes com alelos selvagens do gene CYP2C9 em heterozigose e homozigose, respectivamente. A enzima CYP2C9 participa do metabolismo da varfarina e o alelo CYP2C9*1 selvagem apresenta maior frequência nas populações e é o responsável pela metabolização normal desse fármaco (BOTTON et al., 2011, SANTOS et al., 2015). Os alelos CYP2C9*2 e CYP2C9*3 codificam enzimas com atividade reduzida em 30% e 80%, respectivamente, e metabolizam a varfarina mais lentamente. Juntos eles explicam 12% da variação da dose de varfarina (TAKEUCHI et al., 2009; ANDERSONet al., 2012). No presente estudo, os carreadores -G1639A e -A1639A do gene VKORC1 utilizaram dose 16,4% e 32,1% menores do que a dose utilizada por pacientes com alelos selvagens em homozigose-G1639G, respectivamente. O polimorfismo VKORC1-G1639A explica 27% da variação da dose de varfarina (WADELIUS et al., 2009) e os carreadores do alelo A variante necessitam de doses menores de varfarina do que aqueles que possuem o alelo G (GAGE et al., 2008). O alelo A altera o sítio de ligação do fator de transcrição do VKORC1 e promove menor transcrição do gene quando comparado ao alelo G selvagem, o que reduz a sua expressão gênica (YUAN et al., 2005). Yang e colaboradores (2010) revelaram que, em caucasianos, carreadores de um ou dois alelos variantes requerem doses 25% e 50% menores, respectivamente. 98 O efeito antitrombótico da varfarina está relacionado à redução da síntese dos fatores da coagulação dependentes da vitamina K (II, VII, IX e X) devido à inibição da atividade enzimática da proteína VKOR, que participa da síntese desses fatores (OWEN et al., 2010). Quanto menor o nível de anticoagulação a ser alcançado, menor inibição enzimática da VKOR e menor quantidade de varfarina serão necessárias para alcance da meta terapêutica. Em relação à meta de RNI, já era esperado observar menor necessidade de doses para pacientes com RNI alvo entre 2,00-3,00. O resultado encontrado pode refletir a adequação do protocolo institucional utilizado para manejo da dose da varfarina a partir de diferentes porcentagens de ajustes de acordo com o RNI alvo desejado. Alguns estudos identificaram o aumento da idade como fator associado ao uso de menores doses de varfarina (PERINI et al., 2008; SUAREZ-KURTZ et al., 2009; BOTTON et al., 2011, VERHOEF et al., 2013; SUAREZ-KURTZ et al., 2015; SANTOS et al., 2015) ou de sensibilidade (doses ≤21mg/semana) à varfarina (SALEH, 2016). Nesse estudo, a análise univariada mostrou que a idade se relacionou negativamente com a dose de varfarina. Para cada ano adicional na idade, a dose de varfarina reduziu 0,17mg/semana. Entretanto, a idade não se manteve como variável preditora no modelo de regressão logística. A varfarina é transformada em metabólitos inativos por enzimas do citocromo P450 hepático e com o envelhecimento pode haver diminuição do seu metabolismo (UFER, 2005; POLASEK et al., 2013). Garcia e colaboradores (2005) observaram que o aumento de um ano na idade reduziu a necessidade semanal de varfarina em 0,4 mg. Khoury e Sheikh-Taha (2014) também observaram o uso de menores doses da varfarina com o avançar da idade. Quando se considera a aplicabilidade clínica dos resultados desse estudo, deve-se ponderar alguns aspectos. Embora o modelo de regressão logística não tenha conseguido estratificar corretamente todos os pacientes sensíveis à varfarina, obteve-se um bom valor preditivo, o que reforça a sua utilidade futura na conduta clínica, já que aescolha da dose a ser prescrita a partir do modelo de predição do uso de doses baixas de varfarina poderálevar à redução do risco de sangramento nos pacientes sensíveis. Vale destacar também queos modelos de regressão linear para predição de doses iniciais da varfarina apresentam baixo poder preditivo, com R2 ajustado variando entre 24% e 69% (FRANCIS et al., 2014), demonstrando que a dose inicial pode ser predita incorretamente para muitos pacientes. Assim, a predição do uso de doses baixas pode ser uma alternativa para melhorar a segurança da terapia anticoagulante com varfarina. 99 Outra observação importante se refere à pequena proporção de pacientes com alelos polimórficos para CYP2C9 (18/85; 21,2%) e para VKORC1(33/163; 20,2%), em homozigose ou heterozigose, que utilizou doses baixas de varfarina durante o tratamento. Em outras palavras, muitos pacientes com alelos polimórficos não utilizaram doses baixas de varfarina. Esse achado corrobora as evidências que a variabilidade de doses de varfarina é multifatorial, mas mesmo assim a inclusão dos polimorfismos é essencial, pois ditam grande parte da resposta. Os genótipos CYP2C9 e VKORC1 influenciaram o uso de doses baixas em maior magnitude que o RNI alvo. Existem algumas limitações nesse estudo. Primeiramente, algumas covariáveis como IMC, tabagismo e ingestão dietética de vitamina K, que podem estar associadas à variação de dose da varfarina, não foram avaliadas. Segundo, nossos resultados são derivados de um único ambulatório de anticoagulação, sendo assim, os dados precisam ser validados em outras populações. E por fim, muitos dados foram coletados a partir de prontuários, o que pode gerar limitações na recuperação de informações. Em conclusão, RNI alvojuntamente com os polimorfismos CYP2C9*2 e CYP2C9*3 do gene CYP2C9 e -G1639A do gene VKORC1 permitiram e estratificação dos pacientes em relação ao uso de doses baixas de varfarina. O conhecimento desses fatorestraz grande contribuição para o manejo dos pacientes, já que a identificação prévia de sensibilidade à varfarina é importante para não expor esses indivíduos a doses altas e risco excessivo de anticoagulação. Financiamento. Esse estudo foi financiado pelo Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde: Infectologia e Medicina Tropical da Universidade Federal de Minas Gerais, pela Pró- Reitoria de Pesquisa da Universidade Federal de Minas Gerais e pela Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG) MOC Rocha, RP Souza e KB Gomes são pesquisadores do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). REFERÊNCIAS Ageno W, Gallus AS, Wittkowsky A, Crowther M, Hylek EM, Palareti G. Oral anticoagulant therapy: Antithrombotic Therapy and Prevention of Thrombosis, 9th ed: American College of Chest Physicians Evidence-Based Clinical Practice Guidelines. Chest. 2012;141(2 Suppl):44- 88. 100 Almeida VC, Ribeiro DD, Gomes KB, Godard AL. Polymorphisms of CYP2C9, VKORC1, MDR1, APOE and UGT1A1 genes and the therapeutic warfarin dose in Brazilian patients with thrombosis: a prospective cohort study. Mol Diagn Ther. 2014;18(6):675-683. 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