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Type: Tese de Doutorado
Title: Retrotransposons nos genomas de fungos do complexo paracoccidioides: identificação, caracterização, distribuição e expressão
Authors: Marco Aurelio Soares
First Advisor: Patricia Silva Cisalpino
First Co-advisor: Jerônimo da Conceição Ruiz
Abstract: Evidências da literatura e a experiência prévia do nosso grupo indicaram a ocorrência de elementos genéticos móveis nos genomas de fungos do complexo Paracoccidioides. Objetivando a identificação e a caracterização de retrotransposons potencialmente ativos nestes genomas empregaram-se abordagens de bioinformática na análise de ESTs depositadas em banco de dados público do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). As 41558 ESTs foram reunidas num banco local e agrupadas por alinhamento, gerando 12922 grupos de sequências distribuídos em singlets (8110) e contigs (4812). Estes grupos foram comparados ao banco de dados não redundantes (NR, NCBI) e bancos especializados em elementos transponíveis (TE, RepBase e TEClass), por meio da ferramenta BLAST. Os resultados contra o NR mostraram que 10378 grupos apresentaram similaridade com sequências depositadas sendo que 142 apresentaram termo anotador característico de retrotransposons (transcriptase reversa foi o termo mais comum, com 84 registros). Contra os bancos específicos, 809 grupos revelaram similaridade, dos quais 342 com regiões de similaridade com retrotransposons; os outros 437 foram similares a transposons de DNA. Apenas 52 grupos foram comuns tanto ao NR quanto aos bancos específicos de elementos móveis. Destes, os que apresentaram os maiores valores de similaridade permitiram a identificação de cinco retrotransposons distintos nos genomas: - RtPb1, RtPb2, RtPb3, RtPb4 e RtPb5. Os elementos foram caracterizados e classificados nas ordens LTR e LINE, superfamílias Copia, Gypsy e I, sustentáveis por análises filogenéticas. As ORFs desses elementos revelaram a presença de regiões características correspondentes a endonucleases, integrases, proteases, RNAse H, transcriptases reversas e chromo-domínio. Foram identificadas as regiões de LTR dos elementos das superfamílias Copia e Gypsy (RtPb1, RtPb3, RtPb4 e RtPb5) e uma região de cauda poliA (RtPb2). Os elementos RtPb1 e RtPb2 (Araújo, 2008) cujas sequências completas não eram conhecidas tiveram-nas completamente caracterizadas e mapeadas in silico. O mapeamento genômico, in silico, permitiu, ainda, identificar 538 cópias distribuídas entre os cinco elementos (RtPb1=52; RtPb2=101; RtPb3=18; RtPb4=65 e RtPb5=302), nos três genomas estudados (Pb01=366; Pb03=57; Pb18=115) (www.broadinstitute.org). Análises moleculares, usando a metodologia primer walking, por meio da técnica de PCR permitiram a amplificação dos elementos inteiros. A identidade das sequências foi comprovada por sequenciamento e alinhamento da região das transcriptases reversas. A presença de cada elemento em 31 diferentes isolados do fungo foi comprovada. Análises por hibridização de Southern blots do DNA genômico em isolados representativos das quatro espécies filogenéticas conhecidas indicaram a presença desses elementos em múltiplas cópias. A expressão dos retrotransposons foi observada empregando-se a técnica de PCR quantitativo qRT-PCR que revelou padrões de expressão diferentes entre os isolados estudados. O elemento mais expresso foi o RtPb1 no isolado Pb01. As análises indicaram a expressão peculiar de sequências características de diferentes retrotransposons em padrões distintos nos isolados representativos das quatro espécies filogenéticas conhecida.
Abstract: Evidences from the literature and the previous experience of our research group indicate the occurrence of mobile genetic elements in the genomes of fungi of the Paracoccidioides species complex. Aiming to identify and characterize potentially active retrotransposons in these genomes we employed bioinformatics analysis of the EST deposited in NCBI public databases (www.ncbi.nlm.nih.gov). The 41,558 EST were assembled into a local bank and grouped by sequence alignments, generating 12,922 groups distributed in 8110 singlets and 4812 contigs. These groups were compared with the non-redundant database (NR, NCBI) and databases specialized in transposable elements (TE, RepBase and TEClass), through the BLAST tool. 10,378 groups presented similarity against NR, 142 with retrotransposons characteristic annotator terms as reverse transcriptase (the most common term, with 84 records). In specific banks, 809 groups were found, 342 of which showing regions of similarity to retrotransposons. The remaining 437 were similar to DNA transposons. Only 52 groups were common to both the TE specific and NR banks, and those that showed the highest similarity allowed the identification of five distinct elements in the genomes: - RtPb1, RtPb2, RtPb3, RtPb4 and RtPb5. The elements were characterized and classified in the LTR and LINE orders, superfamilies Copy, Gypsy and I, sustained by phylogenetic analyzes. The coding regions of these elements revealed the presence of characteristic regions corresponding to endonucleases, integrases, proteases, RNases H, reverse transcriptases and a chromo-domain. We identified LTR regions in elements of the Copy and Gypsy superfamilies (RtPb1, RtPb3, RtPb4 and RtPb5) and a poly-A tail LINE-like element (RtPb2). The elements RtPb1 and RtPb2 (Araújo, 2008) had their complete sequences mapped and characterized in silico. The genomic mapping in silico identified 538 copies of all five elements (RtPb1 = 52; RtPb2 = 101; RtPb3 = 18; RtPb4 = 65 and RtPb5 = 302) distributed in the three genomes studied (Pb01= 366; Pb03= 57; Pb18= 115) (www.broadinstitute.org). PCR allowed the amplification of the entire elements by primer walking method. The identity of the elements was confirmed by sequencing and alignment of the reverse transcriptase regions. The sequences were used to verify the presence of each element in the DNA of 31 different fungal isolates. Southern blots analysis of genomic DNA in isolates representative of each of the four known phylogenetic species indicated their presence in multiple copies. The expression of distinct retrotransposons was studied by RT-PCR and by quantitative qRT-PCR. The most expressed element is RtPb1 in isolate Pb01. The analysis showed different expression patterns between distinct fungal isolates. It was observed a peculiar expression of each different retrotransposon in fungal isolates each representative of a known and distinct phylogenetic species.
Subject: Microbiologia
Retroelementos
Paracoccidioides x
Elementos de DNA transponíveis
language: Português
Publisher: Universidade Federal de Minas Gerais
Publisher Initials: UFMG
Rights: Acesso Aberto
URI: http://hdl.handle.net/1843/BUBD-AEEMGN
Issue Date: 22-Mar-2013
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