Use este identificador para citar ou linkar para este item:
http://hdl.handle.net/1843/ICBD-8F8QSG| Tipo: | Dissertação de Mestrado |
| Título: | Padronização de um teste de diagnóstico para Estomatite Vesicular por PCR em tempo real |
| Autor(es): | Pedro Augusto Alves |
| Primeiro Orientador: | Giliane de Souza Trindade |
| Primeiro Coorientador: | Erna Geessien Kroon |
| Resumo: | A estomatite vesicular foi primeiramente descrita nos Estados Unidos em 1926 como uma doença vesicular de equinos e, subsequentemente de bovinos e suínos. A doença se caracteriza pela formação de vesículas principalmente na língua, lábios, mucosa oral, tetas e na banda coronária das patas desses animais. O vírus da estomatite vesicular, agente causador da doença, é um vírus de RNA senso negativo e envelopado que pertence ao gênero Vesiculovirus, da família Rhabdoviridae. A estomatite vesicular é clinicamante indistinguível de outras doenças vesiculares, como a febre aftosa, o exantema vesicular dos suínos e a doença vesicular dos suínos, quando equinos não estão envolvidos. Isso traz grandes implicações sócio-econômicas e, na falta de um diagnóstico clínico, o diagnóstico laboratorial torna-se urgente e imprescindível em caso de suspeita de estomatite vesicular. Neste trabalho, o material genético de uma amostra protótipo de VSV foi utilizado como molde em PCR convencional para obtenção de um plasmídio controle positivo da reação. A amostra protótipo foi caracterizada a partir do sequenciamento do plasmídio com o inserto de VSV. Para a qPCR, foram desenhados os iniciadores, em uma região conservada do gene L (RNA polimerase viral), a partir de sequências da amostra protótipo (VSIV) e de amostras de campo (VSAV e COCV). A padronização da reação com plasmídio controle foi feita com mix caseiro, sendo que a concentração final de cada iniciador foi de 1,25 mol/100L, com 10 M de dNTP e 2,0 mM de MgCl2. Os corantes utilizados foram o Evagreen para o sistema de detecção e o ROX® como referência passiva. A reação foi otimizada para aumentar a sensibilidade e os parâmetros finais foram os seguintes: 4,0 mol/100L de cada iniciador, 100 M de dNTP e 2,0 mM de MgCl2. Foram escolhidos os genes de -actina e HPRT bovinos para serem utilizados como normalizadores da reação. O teste apresentou resultados satisfatórios quando utilizado o mix comercial, mas com necessidade de aprimoramentos principalmente com relação aos iniciadores para ser utilizado no diagnóstico da estomatite vesicular bovina. |
| Abstract: | Vesicular stomatitis was first described in the United States in 1926 as a vesicular disease of horses, and subsequently of cattle and swine. The disease is characterized primarily by formation of vesicles on the tongue, lips, oral mucosa, teats and the coronary band of the animals feet. The vesicular stomatitis virus (VSV), the disease causative agent, its an enveloped negative strand RNA virus that belongs to Vesiculovirus genus, family Rhabdoviridae. Vesicular stomatitis is clinically indistinguishable from other vesicular diseases, like foot and mouth disease, swine vesicular exanthema and swine vesicular disease, when equines are not involved. This brings great socio-economic implications and in the absence of a clinical diagnosis, laboratory diagnosis becomes urgent and indispensable in case of suspicion of vesicular stomatitis. In this work, the genetic material of a VSV reference sample was used as template in conventional PCR to obtain a plasmid positive control of the reaction. The reference sample was characterized from the plasmid sequencing with VSV insert. For qPCR, primers were designed in a conserved region of the L gene (viral RNA polymerase), from the reference strain (VSIV) sequences and field samples (VSAV and COCV). The standardization of reaction with plasmid control was made with homemade mix, and the final concentration of each primer was 1,25 mol/100L, with 10 M of dNTP and 2,0 mM of MgCl2. The dyes used were Evagreen for detection system and ROX® as passive reference. The reaction was optimized to increase the sensitivity and the final parameters were as follows: 4,0 mol/100L of each primer, 100 M of dNTP and 2,0 mM of MgCl2. Genes of -actin and HPRT were chosen to be used as internal controls of reaction. The assay presented satisfactory results when using the commercial mix, but in need of improvements especially regard with primers for use in the diagnosis of bovine vesicular stomatitis. |
| Assunto: | Microbiologia |
| Idioma: | Português |
| Editor: | Universidade Federal de Minas Gerais |
| Sigla da Instituição: | UFMG |
| Tipo de Acesso: | Acesso Aberto |
| URI: | http://hdl.handle.net/1843/ICBD-8F8QSG |
| Data do documento: | 23-Dez-2010 |
| Aparece nas coleções: | Dissertações de Mestrado |
Arquivos associados a este item:
| Arquivo | Descrição | Tamanho | Formato | |
|---|---|---|---|---|
| mestrado_pedro_augusto.pdf | 3 MB | Adobe PDF | Visualizar/Abrir |
Os itens no repositório estão protegidos por copyright, com todos os direitos reservados, salvo quando é indicado o contrário.