Desenvolvimento e validação de um método para determinação de colesterol em farinha de carne e ossos em mistura de alimentos para ruminantes utilizando cromatografia gasosa.

Cecilia Muller Bandeira

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Type:	Dissertação de Mestrado
Title:	Desenvolvimento e validação de um método para determinação de colesterol em farinha de carne e ossos em mistura de alimentos para ruminantes utilizando cromatografia gasosa.
Authors:	Cecilia Muller Bandeira
First Advisor:	Jose Maria Ferreira
First Co-advisor:	Neura Bragagnolo
First Referee:	Eloisa de Oliveira Simoes Saliba
Second Referee:	Eduardo Souza Vieira Machado
Abstract:	presente trabalho teve como objetivo desenvolver e validar um método utilizando cromatografia para detecção de farinha de carne e ossos (FCO) em mistura de alimentos (ração) para ruminantes, pela determinação de colesterol, a fim de evitar a contaminação dos animais com a doença encefalopatia espongiforme bovina. Foram testados cinco métodos para o preparo da amostra e destes, a saponificação da amostra sem aquecimento foi selecionado. As melhores condições para saponificação e extração da matéria insaponificável foram definidas por planejamentos experimentais, fatorial e completo, com pontos centrais. A técnica de cromatografia gasosa (CG) foi escolhida devido a sua maior sensibilidade e melhor separação do pico de colesterol, na presença de outros esteróis. Foi utilizada coluna capilar polar de polietilenoglicol 30mx0,25mmx0,25µm e detector por ionização em chamas (DIC). As condições do CG foram: injeção 1 µL, injetor à 260 ºC, coluna à 100 ºC/2 min e à 260 ºC/48 min (15 ºC/min), fluxo 1,68 mL/min, gás de arraste hidrogênio e DIC à 300 ºC. A identificação do colesterol foi feita por comparação do tempo de retenção do padrão e da amostra e por co-cromatografia e a confirmação por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e espectrometria de massas (EM). Parâmetros da CLAE: fase móvel acetonitrila:isopropanol (98:02); coluna C18, 100x4,6mmx4µm (Chromolith), vazão 1 mL/min. Parâmetros do EM: analisador íon-trap, fonte APCI à 450 °C, modo positivo, corona à 4000 nA, dry gas N2 à 350 °C, fluxo 5 L/min, nebulizador à 65 psi, energia de fragmentação MS/MS 1,4 V, faixa de aquisição 100 a 700 (m/z). O método foi validado por seletividade, especificidade, linearidade, limite de detecção (LD), limite de quantificação (LQ), precisão, exatidão e robustez. O pico de colesterol apresentou excelente resolução e a CLAE-EM confirmou especificidade. Os coeficientes de determinação para avaliação da linearidade foram superiores a 0,9997. O LD e LQ foram 0,001 e 0,003 mg/g, respectivamente. A recuperação e coeficiente de variação (CV) nas amostras de ração fortificadas com padrão de colesterol (0,01; 0,025; 0,05; 0,1; 0,25 e 0,5 mg/mL) foram respectivamente de 84 a 86,7 % e de 2,9 a 4,0 %. As concentrações de colesterol obtidas na ração e na FCO foram, respectivamente 0,02 e 0,4 mg/g. O método proposto apresentou precisão, exatidão e a capacidade de detectar FCO na ração, pela determinação de colesterol, em concentrações superiores a 0,025 mg/g.
Abstract:	This work aimed at developing and validating a chromatographic method for detection meat and bone meals (MBM) in ruminant feed by cholesterol determination, focusing to avoid the animal contamination with bovine spongiform encephalopathy. Five methods for sample preparation were tested and from these, sample saponification without heating was chosen. The best conditions for saponification and extraction of unsaponified matter were defined using factorial and complete designs with central points. Gas chromatography (CG) was chosen due its higher sensibility and better separation of peak cholesterol at presence of other sterols. Was used polar capillary column of polyetileneglycol 30mx0,25mmx0,25µm and flame ionization detector (FID). GC conditions were: injection 1 µL, insert 260 ºC, column 100 ºC/2min and 260 ºC/48min (15 ºC/min), flow 1,68 mL/min, drag gas hydrogen and FID 300 ºC. Cholesterol was identified by comparison of retention times of the samples and standard and co-chromatography and confirmed by high performance liquid chromatography (HPLC) and mass spectrometry (MS). HPLC parameters: mobile phase acetonitrile:isopropanol (98:02); column C18, 100x 4,6mmx4µm (Chromolith), flow 1 mL/min. MS-MS parameters: íon-trap analyzer, APCI ionization source: 450 °C, positive mode, corona: 4000 nA, dry gas N2: 350°C, flow 5 L/min, nebulizer: 65 psi, MS/MS fragmentation energy 1,4 V, acquisition 100 to 700 (m/z). The method was validated by selectivity, specificity, linearity, detection limit (DL), quantification limit (QL), precision, trueness and robust. Cholesterol peak show excellent resolution and HPLC-MS confirmed specificity. Determination coefficient for linearity evaluation were higher than 0,9997. DL and QL were 0,001 and 0,003 mg/g, respectively. Recovery e variation coefficient (VC) at ruminant feed samples fortified with cholesterol standard (0,01; 0,025; 0,05; 0,1; 0,25 e 0,5 mg/mL) were respectively 84-86,7 % and 2,9-4,0 %. Cholesterol concentrations obtained from ruminant feed and MBM were, respectively 0,02 and 0,4 mg/g. The method show precision, trueness and capacity of detect MBM in ruminant feed by cholesterol determination in concentrations higher than 0,025 mg/g.
Subject:	Análise cromatográfica Ruminante Alimentação e rações Espectrometria de massa Farinha de carne e osso como ração
language:	Português
Publisher:	Universidade Federal de Minas Gerais
Publisher Initials:	UFMG
Rights:	Acesso Aberto
URI:	http://hdl.handle.net/1843/VETC-7AXM87
Issue Date:	28-Feb-2007
Appears in Collections:	Dissertações de Mestrado

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