ESTUDO QUÍMICO, FARMACOLÓGICO E APLICAÇÃO DE MÉTODOS COMPUTACIONAIS NA ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DE CONSTITUINTES QUÍMICOS DE FOLHAS DE Maytenus acanthophylla REISSEK (CELASTRACEAE) DJALMA MENEZES DE OLIVEIRA UFMG-ICEx/DQ. 906a T. 398a DJALMA MENEZES DE OLIVEIRA ESTUDO QUÍMICO, FARMACOLÓGICO E APLICAÇÃO DE MÉTODOS COMPUTACIONAIS NA ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DE CONSTITUINTES QUÍMICOS DE FOLHAS DE Maytenus acanthophylla REISSEK (CELASTRACEAE) UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS Belo Horizonte 2012 Tese apresentada ao Departamento de Química do Instituto de Ciências Exatas da Universidade Federal de Minas Gerais, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do grau de Doutor em Ciências - Química. Oliveira, Djalma Menezes de O48e ESTUDO QUÍMICO, FARMACOLÓGICO E APLICAÇÃO DE MÉTODOS 2012 COMPUTACIONAIS NA ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DE CONSTITUINTES T QUÍMICOS DE FOLHAS DE Maytenus acanthophylla REISSEK (CELASTRACEAE)/ Djalma Menezes de Oliveira. Belo Horizonte: UFMG, ICEx, DQ, 2012. 286f. : il. Orientadora: Grácia Divina de Fátima Silva. Colaboradores: Tania M. de Almeida Alves, Lucienir Pains Duarte e Sidney Augusto Vieira Filho. Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Minas Gerais. Departamento de Química. Bibliografia p.286. 1 – Química Orgânica. 2 – Fitoquímica. 3 – Celastraceae. 4 – Maytenus acanthophylla. 5 - Triterpenos pentacíclicos. I - Título II – Orientador CDU 043 O trabalho descrito nesta tese foi realizado sob a orientação da Professora Doutora Grácia Divina de Fátima Silva. O trabalho descrito nesta tese foi realizado com as colaborações dos Professores Doutores Tânia Maria de Almeida Alves (CPQRR/FIOCRUZ), Lucienir Pains Duarte (UFMG) e Sidney Augusto Vieira Filho (UFOP). Agradecimentos Oliveira, DM (2012) Dedico este trabalho à minha família, pela paciência e apoio nesta difícil tarefa e grande realização. A Isabel, Renata, Carol, esposa e filhas, e a Rafael, filho e químico como eu. Agradecimentos Oliveira, DM (2012) ∴ Ordo ab Chao ∴ Agradecimentos Oliveira, DM (2012) Cada planta é uma coluna solar que contribui para sustentar o Planeta. Agradecimentos Oliveira, DM (2012) AGRADECIMENTOS ESPECIAIS À Profa. Dra. Grácia Divina de Fátima Silva, orientadora, pela transferência de conhecimento fitoquímico e acolhimento da minha proposta de estudo e, principalmente pela sua poderosa capacidade administrativa e senso de justiça. À Profa. Dra. Lucienir Pains Duarte, por muito do que aprendi sobre interpretação de dados de RMN, pela amizade e bondade. Ao Bibo, o que nunca diz não, pelo inestimável apoio, um verdadeiro frater. As suas ideias e conselhos contribuíram muito para desenvolver os trabalhos e inocular doses de incentivos contra o inevitável desânimo de alguns momentos abstrusos. Agradeço aos membros da pré-banca, os professores Jarbas Resende e Rosemeire Brondi, pela inestimável contribuição que deram para melhorar essa tese. À Vany Ferraz, por suas verdadeiras aulas de cromatografia, simpatia, amizade e cumplicidade na compreensão ao demasiado humano. Ao dileto casal André Ferraz e Tuane, pelo rancho e apoio nas minhas vindas a BH na etapa final de correções. Ao inestimável apoio e colaboração dos pesquisadores chefes do LQPN no Centro de Pesquisas René Rachou, Dra Tânia Alves e Dr. Carlos Zani. A eles devo a possibilidade de ter obtido substâncias novas. A todo o pessoal com quem trabalhei e hoje me orgulho de cooperar no LQPN/CPQRR. Ao Ezequias (irmão nordestino). A Betânia Cota e Carolina Moreira. À Patrícia, Daniela e Susana pela realização de ensaios e amizade. A Marcinha pela simpática atenção e suporte administrativo. À Luciana Guimarães pela valorosa parceria na representação dos alunos no colegiado da pós e pelos seus primorosos dotes para executar cálculos quânticos e físico-químicos. Ao professor Hélio por acreditar na proposta de parceria que deu fruto, um excelente artigo científico. Ao amigo e parceiro de moradia em BH, Rodrigo Lassarote Lavall. Grande na estatura, mas, maior ainda no companheirismo e sensatez. À Roqueline, pela amizade e na contribuição de idéias para seguir aproveitando o tudo das mínimas quantidades e obter o máximo de moléculas novas. Agradecimentos Oliveira, DM (2012) Ao Professor Marcelo Henrique dos Santos pelos testes biológicos e ideias, e acima de tudo, pela amizade sincera. À Dra. Ivana, competência e simpatia do LAREMAR da UFMG. À Ana Cristina Morgado, pela amizade, simpatia, atenção e dicas preciosas que resultaram em excelentes espectros no IV. À Professora Dorila Pilo Veloso pelas motivadoras conversas nos entrementes das horas extras realizadas em fins de semana e feriados. À Professora Rute Figueiredo por suas “doces” e importantes dicas de como lidar com carboidratos. A Professora Elaine do DCB pela atenção e disponibilidade para realizar ensaios que valorizam este trabalho. À colega, Perpétua, pela amizade e pelas deliciosas pamonhas trazidas de Patos de Minas. A Ana Paula Fontes pela amizade e simpatia. Também portadora de deliciosos quitutes Patenses. À colega Glória Meléndez pela preocupação com o progresso dos trabalhos e incentivo. Ao colega Fernando, que avia o melhor café de laboratório, um elixir para as funções cerebrais debilitadas pela “leseira” de pós-almoço. Ao professor Rochel, homem de ciência e empreendedorismo, pela atenção e exemplo. Aos professores Fernando Carazza pela amizade, prosa e sinceridade em suas acertadas análises de contratempos do cotidiano. À Paulette, pelo cuidado e prontidão com que atende aos pós-graduandos. Ao Professor Dr. Wagner Mussel pela parceria no desafiante estudo de um triterpeno por difração de raios-X de pó que, felizmente, rendeu um relato científico que muito me orgulha neste estudo. À Profa. Dra. Vanderlúcia (UESB), pela amizade, pelo apoio e esforços para a minha vinda à UFMG. À professora Maria Irene Yoshida pelas aulas teóricas e análises térmicas experimentais que muito aqueceram este estudo de conhecimento e informações. Agradecimentos Oliveira, DM (2012) Ao Sr. Antenor Lima (Maracás, Bahia) pela coleta e localização da planta, a musa Maytenus, inspiradora deste estudo. À professora Rita Maria Carvalho-Okano, da UFV, pela paciência e identificação da planta. A Dra Cristina, botânica da UFOP, que confirmou a identidade botânica de um espécime da planta. À Professora Esperanza Cortez da Faculdade de Odontologia pela parceria e brilhante coordenação de estudos que culminaram em um invento com pedido de patente. Ao Sr. Romário, mestre da arte da hialotécnica, decano servidor da infraestrutura da UFMG e seu pupilo Wladimir. Ao amigo Anderson, mecânico fantástico, antes de tudo pela amizade e descontração, depois, pela atenção profissional. Enfim, a todo pessoal da infraestrutura, uma grande família competente do DQ da UFMG. Aos estagiários e alunos de IC Juliana, Sara, Graziely, Leonardo Taffas, Vivian, Priscilla, Eric, Karina, Isabel, Daniel, Salomão, Débora, Paulo (que calma!), Lorena, Isabela e Tatiana, Elaine, por terem contribuído com tanto para com o nosso trabalho de pós-graduandos. Aos amigos do curso de pós-graduação, Daniel, Luis Cláudio (Bituca), Maurício, Ênio, Jonas, Jarbas (agora Prof. Dr. Jarbas), Géssy, Humberto, Fred, Mauro, Erúzia, Alexandre, Mara, Idelfonso, Lilian, Luciano, Fernando, Silmara, José Luis, Goiano, Esperanza Burgos, Ana Mena, Gustavo, Jackson Lamonier, Érica, Maria Meneses, Gallota, Zaqueu, Joabe, Herusa, Anayive, Cláudia e Cláudia (Manaus), Paulo, Marcos, João, Angélica, Paterson, Frank, Fabiano, Flávia, Luis, Ângelo, Rogério, Patrícia, Kelly, Daniele, Alessandra, Luíza e Rodrigão. À colega Silmara (UESB). A todos pela simpatia e sinergia. A todos os professores do Departamento de Química que contribuíram para a conclusão desse trabalho. Ao governo da Bahia, através da PPG-UESB, pelo suporte financeiro. O ser humano é ao mesmo tempo singular e múltiplo. (...) Devemos ver também que todo ser, mesmo aquele fechado na mais banal das vidas, constitui ele próprio um Cosmo. Traz em si multiplicidades interiores, personalidades virtuais (...). Cada qual contém em si galáxias de sonhos e de fantasmas... (Edgar Morin). Muito obrigado a todos! Sumário Oliveira, DM (2012) SUMÁRIO ÍNDICE DE FIGURAS................................................................................................................... i ÍNDICE DE TABELAS ................................................................................................................. xii ÍNDICE DE ESQUEMAS .......................................................................................................... xvii ABREVIATURAS, ACRÔNIMOS, SIGLAS E SÍMBOLOS ........................................................... xviii OBJETIVO ............................................................................................................................... xxi RESUMO ................................................................................................................................ xxii ABSTRACT ............................................................................................................................ xxiii CAPÍTULO 1 INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 1 Química dos Produtos Naturais: 50 anos de pesquisas ................................................... 2 A Família Celastraceae ...................................................................................................... 4 Constituintes Químicos do gênero Maytenus ........................................................ 5 Maytenus acanthophylla Reissek ............................................................................ 8 Classificação Botânica ................................................................................... 10 Constituintes químicos isolados de raiz de M. acanthophylla ...................... 11 CAPÍTULO 2 PARTE EXPERIMENTAL ................................................................................................12 Materiais e Métodos ....................................................................................................... 13 Estudo Fitoquímico .......................................................................................................... 16 Preparo dos extratos das folhas ............................................................................. 17 Extrato das sementes (HESMA) .............................................................................. 17 Preparo do extrato rico em guta-percha (GHEMA) ................................................ 18 Fracionamento do extrato FHEMA ......................................................................... 18 Resumo do fracionamento de FHEMA .......................................................... 23 Isolamento de 1,4 trans-poliisopreno de GHEMA ................................................. 24 Fracionamento do extrato SHEMA ......................................................................... 25 Resumo do fracionamento de SHEMA .......................................................... 32 Fracionamento do extrato FAEMA ......................................................................... 32 Resumo do fracionamento de FAEMA .......................................................... 37 Estudo fitoquímico do extrato SEMA ..................................................................... 38 Sumário Oliveira, DM (2012) Identificação dos monossacarídeos de SEMA por CGAR ........................................ 39 Derivatização de monossacarídeos a acetatos de alditóis ............................ 40 Per-O-acetilação de SEMA ............................................................................. 41 Resumo do estudo fitoquímico de SEMA ...................................................... 42 Estudo analítico de SEMA, FOMMA e FAMMA por CLAE ....................................... 42 Análise por CLAE em escala semi-preparativa de FAMMA ........................... 43 Estudo por difratometria de raios X ................................................................................ 44 CAPÍTULO 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................ 45 Métodos aplicados na Elucidação Estrutural dos Constituintes Isolados ....................... 46 MATCH-5 – Um banco de dados de espectros de RMN de 13C de TTPC’s ..................... 48 DETERMINAÇÕES ESTRUTURAIS DOS COMPOSTOS OBTIDOS ............................................50 Mistura de hidrocarbonetos (1) ....................................................................................... 51 Esqualeno (2) ................................................................................................................... 53 1,4–trans-poliisopreno (3) ............................................................................................... 59 Álcool graxo (4) ................................................................................................................ 68 Revisão da elucidação estrutural da friedelina (5) .......................................................... 72 Estudo conformacional de 5 por difração de raios-X de pó ............................................ 82 Mistura de friedelina (5) e 3β-friedelinol (6) ................................................................... 87 3β-friedelinol (6) .............................................................................................................. 89 3α-friedelinol (7) .............................................................................................................. 93 Lupeol (8) ......................................................................................................................... 97 3β-O-Acetato de lupeoíla (9) ......................................................................................... 102 Mistura de 3β-esteariloxi-Olean-12-eno (10) e 3β-esteariloxi-urs-12-eno (11) ........... 107 3β-esteariloxi-urs-12-eno (11) ....................................................................................... 111 β-Amirina, 3β-esteariloxi-Olean-12-eno (12) ................................................................ 116 28-Hidroxi-3-Oxo-friedelano (canofilol, 13) ................................................................... 120 3β,16β-Dihidroxifriedelano (pachysandiol B, 14) .......................................................... 124 3β,24-di-Hidroxifriedelano (15) e 3β,24-di-acetoxifriedelano (15a) ............................. 141 3β-sitosterol (16) ........................................................................................................... 148 Ácido graxo eicosanóico (17) ......................................................................................... 152 Mistura de monossacarídeos (18) ................................................................................. 154 Galactitol (19) e hexa-acetato de galactitol (19a) ......................................................... 159 Identificação de Flavonoides Glicosídicos em SEMA por CLAE/IES-EM ........................ 167 3-O-{[α-L-ramnopiranosila(1→6)][α-L-ramnopiranosila(1→2)]}-β-D- galactopirano-sídeo de quercetina (20) ........................................................................ 172 Sumário Oliveira, DM (2012) 3-O-{[α-L-ramnopiranosil(1→6)]-O-[β-D-xilopiranosil(1→3)-O-α-L- ramnopiranosil-(1→2)]}-β-D-galactopiranosídeo de quercetina (21) ........................... 181 3-O-{[α-L-ramnopiranosil(1→6)]-O-[β-D-xilopiranosil(1→3)-O-α-L- ramnopiranosil-(1→2)]}-β-D-galactopiranosídeo de canferol (22) ............................... 202 3-O-{[α-L-ramnopiranosil(1→6)]-O-[β−D-xilopiranosil(1→3)-O-α-L- ramnopiranosil-(1→2)]}-β-D-galactopiranosídeo de isoramnetina (23) ....................... 219 CAPÍTULO 4 DADOS FÍSICO-QUÍMICOS DOS COMPOSTOS ........................................................ 231 CAPÍTULO 5 ENSAIOS BIOLÓGICOS ............................................................................................. 245 ENSAIOS DE AÇÃO ANALGÉSICA EM COBAIAS .............................................................. 246 CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DOS COMPOSTOS 21 e 22 ........................................... 248 ENSAIOS BACTERIOLÓGICOS DO EXTRATO HIDROMETANÓLICO DE FOLHAS DE M. acanthophylla ........................................................................................................... 250 ENSAIO DE TOXICIDADE DE EXTRATOS PARA CÉLULAS TUMORAIS HUMANAS ........... 252 ENSAIOS PARA AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE LEISHMANICIDA DOS EXTRATOS FHEMA, FAEMA, FOMMA E SEMA. ................................................................................ 255 ENSAIO PARA ATIVIDADE FUNGICIDA DOS EXTRATOS FHEMA, FAEMA, FOMMA E SEMA ........................................................................................................................... 258 ENSAIO DA PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS MONONUCLEARES DO SANGUE PERI- FÉRICO HUMANO (PBMC) ............................................................................................. 259 ENSAIOS DE INIBIÇÃO DE SÍNTESE DE ATP .................................................................... 262 CONCLUSÃO ................................................................................................... 265 Referências Bibliográficas.............................................................................. 268 Lista de Figuras i Oliveira, DM (2012) ÍNDICE DE FIGURAS Capítulo 1 - Introdução Figura Título pp. Figura 1.1: Funções ecológicas do metabolismo secundário de plantas, adaptada do artigo escrito por Hartmann. 2 Figura 1.2: Quantidades relativas de TTPC’s isolados de Maytenus no NEPLAM/ICEx/UFMG. Fontes: Teses do NEPLAM/ICEx/UFMG (1990-2009) e site: zeus.qui.ufmg.br/~neplam/celastraceae.html. 5 Figura 1.3: Estruturas químicas de alguns TTPC’s bioativos isolados de Maytenus sp. 6 Figura 1.4: Flavonoides isolados de espécies Maytenus (Brasil). 7 Figura 1.5: Aspecto da morfologia externa dos ramos e frutos de M. acanthophylla (ilustração gentilmente cedida por Carvalho-Okano). 8 Figura 1.6: Aspectos das folhas ((a) e (b)) e dos frutos (c) de M. acanthophylla. Aspectos das folhas ((d) e (e)) e dos frutos (f) de M. ilicifolia. Fotos: (a) e (d): florabrasiliensis.cria.org.br (25/08/2009); (b), (c), e (e): próprias; (f): Fernanda Marques/Ciencia Hoje online (19/08/09). 9 Figura 1.7: Classificação botânica de Maytenus acanthophylla Reissek segundo os sistemas de Cronquist e Takhtajan. 10 Figura 1.8: Constituintes químicos isolados de raiz de M. acanthophylla Reissek. 11 Capítulo 2 - Experimental Figura Título pp. Figura 2.1: Reação de per-O-acetilação do galactitol (19), componente principal de SEMA, a hexa-acetato de galactitol (19a). 41 Figura 2.2: Sistema de refluxo utilizado para conduzir a reação de per-O-acetilação do extrato SEMA. 41 Capítulo 3 - Resultados e Discussão Figura Título pp. Figura 3.1: Fluxograma simplificado dos passos seguidos na elucidação estrutural de compostos isolados no estudo fitoquímico de Maytenus acanthophylla. Notas: BD: banco de dados; CASE: Computer-Aided Structure Elucidation (Elucidação Estrutural Assistida por Computador). 47 Figura 3.2: Representação esquemática da redução de posto da matriz de dados (MD) de MATCH-5. 49 Lista de Figuras ii Oliveira, DM (2012) Figura 3.3: Espelho da planilha de entrada de dados e consulta de valores de δ de RMN de 13C de TTPC’s em um BD do programa MATCH-5 construído com dados da literatura. Versão 5 para planilha eletrônica (tipo Excel). 50 Figura 3.4: Cromatograma obtido por CGAR de 1 e padrões de HC (C31-C36). Coluna: SE-30, 30 m, 0,25 mm DI, 0,25 µm (capilar) de metilpolisiloxano; Temperaturas: rampa de 200 a 320 °C, razão de 5 °C/min, isotérmica por 1 min a 320 °C. Injetor a 280 °C e detector (FID) a 300 °C. 51 Figura 3.5: Espectro de absorção de 1 na região do IV (KBr). 52 Figura 3.6: Cromatograma de análise por CGAR de 2. Condições: Coluna SE-30, capilar, 30 m x 0,25 mm de diâmetro interno, filme de 0,25 nm de metilpolisiloxano, Alltech, USA. Temperaturas: coluna: Inicial a 200 °C, final até 320 °C por 1 min, a uma taxa de 5 °C/min. Detector e injetor operaram a 320 ºC. O índice de retenção (I) foi igual a 2689, calculado com base no cromatograma de uma série homóloga (C-22 a C-33) de HC (padrões). 53 Figura 3.7: Cromatograma de íons totais (TIC) obtido por CGAR-EM de 2. Condições: Coluna HP-1, capilar, 30 m x 0,25 mm de diâmetro interno, filme de 0,25 nm de metilpolisiloxano, Agilent, USA. Temperaturas: coluna: Inicial a 200 °C, final até 320 °C por 1 min, a uma taxa de 5 °C/min. Detector e injetor operaram a 280 °C. 54 Figura 3.8: EM associado ao pico em TR = 12,14 min do TIC de 2. 54 Figura 3.9: Fragmentograma do esqualeno com base no EM de 2. 55 Figura 3.10: Espectro de absorção de 2 obtido na região do infravermelho (filme de NaCl). 57 Figura 3.11: Espectro de RMN de 1H de 2 (CDCl3, 400 MHz). 57 Figura 3.12: Espectro de RMN de (a) 13C e (b) DEPT-135 de 2 (CDCl3, 100 MHz). 58 Figura 3.13: (A) Termograma DSC de uma amostra de 3 (1,06 mg), obtida em um aparelho Shimadzu DSC-50 (UFMG), em uma célula de alumínio e atmosfera de gás hélio (He, 50 mL/min), com varredura entre os valores de temperatura de 25 a 100 oC, mantido a 100 oC por 10 min e taxa de aquecimento de 20 oC/min; (B) Termograma DSC de uma amostra de 3 (reaquecimento), com varredura entre os valores de temperatura de -100 a 200 oC e taxa de aquecimento de 20 oC/min.. 60 Figura 3.14: Termograma DSC de uma amostra de 3 (1,00 mg), obtida em um aparelho Shimadzu DSC-50 (UFMG), utilizando uma célula de alumínio e atmosfera de gás hélio (He, 50 mL/min), com varredura entre os valores de temperatura de -110 a 200 oC e taxa de aquecimento de 20 oC/min. 60 Figura 3.15: Curvas TGA (linha contínua) e DTGA (linha pontilhada) de uma amostra de 3 (1,0 mg), obtida em um aparelho Shimadzu TGA-50H (UFMG), em uma célula de alumínio e atmosfera de ar (50 mL/min), com varredura entre os valores de temperatura de 0,00 a 800,00 oC e taxa de 61 Lista de Figuras iii Oliveira, DM (2012) aquecimento de 20 oC/min. Figura 3.16: Estruturas das formas cristalinas α e β do biopolímero natural 1,4- trans-poliisopreno. 61 Figuras 3.17: Curva de calibração obtida pela eluição de padrões de poliestireno (PS, à esquerda) e o cromatograma de 3, sobreposto à curva ajustada dos padrões de PS (à direita). Os cromatogramas GPC foram obtidos em um cromatográfo Shimadzu, mediante a injeção de uma amostra de 3, dissolvida em THF (20 µL). Coluna HRC-SIL 5 µm, 250 x 4,6 mm (Shimadzu), utilizando THF como fase móvel (fluxo de 0,5 mL min-1) e registro de dados em um detector de UV (λ 230 nm). 63 Figura 3.18: Proposta de rota auto-catalítica simplificada e o ciclo para representação do mecanismo de degradação oxidativa de 3, deduzidos com base nas análises espectrométricas e em dados da literatura para poliisoprenos (PI). 64 Figura 3.19: Cromatograma obtido por GPC do produto de degradação oxidativa de 3 (linha contínua). Curva de calibração (ajustada) de padrões de poliestireno, PS (linha e quadrados). Os cromatogramas GPC foram obtidos em um cromatográfo Shimadzu, mediante a injeção da amostra dissolvida em THF (20 µL), utilizando uma Coluna HRC-Sil 5 µm, 250 x 4,6 mm (Shimadzu), tendo THF como fase móvel (fluxo de 0,5 mL min-1) e registro de dados dotado de um detector de UV (λ 230 nm). 65 Figura 3.20: Espectros de absorção 3 na região do infravermelho (NaCl). (A): Início do processo de degradação. (B): Após degradação de 3 por auto- oxidação. 66 Figura 3.21: Espectro de RMN de 1H de 3 (CDCl3, 400 MHz). 67 Figura 3.22: Figura 3.22: Espectro de RMN de (a) 13C e (b) DPT-135 de 3 (CDCl3, 100 MHz). 67 Figura 3.23: Espectro de absorção de 4 na região do infravermelho (filme de NaCl). 70 Figura 3.24: Espectro de RMN de 1H de 4 (CDCl3, 400 MHz). 70 Figura 3.25: Espectro de RMN de 13C de 4 (CDCll3, 100 MHz). 71 Figura 3.26: Espectro de DEPT-135 de 4 (CDCl3, 100 MHz). 71 Figura 3.27: Estrutura da friedelina (5) com as indicações (setas) das principais correlações observadas no mapa de contornos NOESY (CDCl3 400 MHz, Figuras 3.37 e 3.38, p.81). 75 Figura 3.28: Espectro de absorção de 5 na região do IV (KBr). 76 Figura 3.29: Espectro de RMN de 1H de 5 (CDCl3, 400 MHz). 77 Figura 3.30: Espectro de RMN de (a) 13C e (b) DEPT-135 de 5 (CDCl3, 100 MHz). 77 Figura 3.31: Mapa de contornos HSQC de 5 (CDCl3, 400 MHz). 78 Figura 3.32: Mapa de contornos COSY de 5 (CDCl3, 400 MHz). 78 Lista de Figuras iv Oliveira, DM (2012) Figura 3.33: Expansão do mapa de contornos COSY de 5 (F1: δ 0,70-1,85 x F2: δ 0,95-1.85, CDCl3, 400 MHz). 79 Figura 3.34: Mapa de contornos HMBC de 5 (CDCl3, 400 MHz). 79 Figura 3.35: Expansão do mapa de contornos HMBC de 5 (F1: δ 5,0-65,0 x F2: δ 0,5- 2.35, CDCl3, 400 MHz). 80 Figura 3.36: Expansão do mapa de contornos HMBC de 5 (F1: δ 26,0-46,0 x F2: δ 0,70-1,65, CDCl3, 400 MHz). 80 Figura 3.37: Mapa de contornos NOESY de 5 (CDCl3, 400 MHz). 81 Figura 3.38: Expansão do mapa de contornos NOESY de 5 (F1 = δ 0,60-1,70 ppm e F2 = δ 0,70-1,26 ppm, CHCl3, 400 MHz). 81 Figura 3.39: Gráfico Rietveld de 5. Os dados observados estão representados por pontos (•) e o padrão calculado por uma linha sólida (-). A diferença entre os dados obsevados e calculados estão marcados embaixo (x); as barras verticais indicam as posições das reflexões de Bragg ( ). 83 Figura 3.40: Estruturas otimizadas de 5 por DFT-B3LYP/6-31G(d,p): (esquerda) confôrmero de baixa energia na forma cadeira-cadeira-cadeira-barco- barco (cccbb); (direita) confôrmero de alta energia na forma cadeira- cadeira-cadeira-cadeira-cadeira (ccccc). 85 Figura 3.41: Estrutura ORTEP3 (Burnett and Johnson, 1996) de 5 obtida por SDPD. Os átomos C são apresentados como elipsoides de 50% de probabilidade e os átomos de H como pequenas esferas de raios arbitrários. 86 Figura 3.42: Espectro de absorção da mistura de 5 e 6 na região do IV (KBr). 88 Figura 3.43: Espectros de RMN de (a) 13C e (b) DEPT-135 da mistura de 5 e 6 (CDCl3 e piridina-d5, 100 MHz). 88 Figura 3.44: Espectro de absorção de 6 na região do IV (KBr). 91 Figura 3.45: Espectro de RMN de 1H de 6 (CDCl3, 400 MHz). 91 Figura 3.46: Espectros RMN de (a) 13C e (b) DEPT-135 de 6 (CDCl3, 100 MHz). 92 Figura 3.47: Espectro de absorção de 7 na região do IV (KBr). 95 Figura 3.48: Espectro de RMN de 1H de 7 (CDCl3, 400 MHz). 95 Figura 3.49: Espectros de RMN de (a) 13C e (b) DEPT-135 de 7 (CDCl3, 100 MHz). 96 Figura 3.50: Espectro absorção de 8 na região do IV (KBr). 99 Figura 3.51: Espectro de RMN de 1H de 8 (CDCl3, 400 MHz). 100 Figura 3.52: Espectros de RMN de (a) 13C e (b) DEPT-135 de 8 (CDCl3, 100MHz). 101 Figura 3.53: Espectro de absorção de 9 na região do IV (KBr). 104 Figura 3.54: Espectro de RMN de 1H de 9 (CDCl3, 400 MHz). 105 Figura 3.55: Espectros de RMN (a) de 13C e (b) DEPT-135 de 9 (CDCl3, 100MHz). 106 Figura 3.56: Espectro de absorção de 10 e 11 na região do infravermelho (CsI). 109 Lista de Figuras v Oliveira, DM (2012) Figura 3.57: Espectro de RMN de 1H de 10 e 11 (CDCl3, 400 MHz). 109 Figura 3.58: Espectro de RMN de 13C de 10 e 11 (CDCl3, 100 MHz). 110 Figura 3.59: Espectro de RMN DEPT-135 de 10 e 11 (CDCl3, 100 MHz). 110 Figura 3.60: Espectro de absorção de 11 na região do IV (NaCl). 113 Figura 3.61: Espectro de RMN de 1H de 11 (CDCl3, 400 MHz). 114 Figura 3.62: Espectros de RMN de (a) 13C e de (b) DEPT-135 de 11 (CDCl3, 100MHz). 115 Figura 3.63: Espectro de absorção de 12 na região do infravermelho. 118 Figura 3.64: Espectro de RMN de 1H de 12 (CDCl3, 200 MHz). 118 Figura 3.65: Espectro de RMN de 13C de 12 (CDCl3, 50 MHz). 119 Figura 3.66: Espectro de RMN DEPT-135 de 12 (CDCl3, 50 MHz). 119 Figura 3.67: Espectro de absorção de 13 na região do IV (KBr). 122 Figura 3.68: Espectro de RMN de 1H de 13 (CDCl3, 400 MHz). 122 Figura 3.69: Espectro de RMN de 13C de 13 (CDCl3, 100MHz). 123 Figura 3.70: Espectro de RMN DEPT-135 (CDCl3, 100MHz). 123 Figura 3.71: Estruturas otimizadas por DFT de 14: (a) confôrmero cccbb de menor energia e (b) confôrmero ccccc de maior energia. Os átomos de carbono são representados em azul, os de oxigênio em vermelho e os de hidrogênio em branco. 126 Figura 3.72: Correlações entre os valores experimentais (τexp) dos ângulos torcionais endocíclicos (raios-X) para 3β-acetil-16β-O-p- bromobenzoila-pachysandiol-B e os calculados (τcalc) por DFT/B3LYP/6- 31(d,p) para o confôrmero cccbb de 14. 126 Figura 3.73: Análises de dispersão entre os dados de RMN experimentais de 14 (δ de 13C e δ de 1H ) e os valores obtidos por DFT-B3LYP/6-311++G(2d,p) de (a) δcalc.de 13C do confôrmero cccbb, (b) δcalc de 13C do confôrmero ccccc, (c) δcalc de 1H do confôrmero cccbb, (d) δcalc de 1H do confôrmero ccccc. 130 Figura 3.74 Seção expandida do mapa de contornos HMBC de 14 na região entre δ H 0,8-1,8 e δC 72-76 (CDCl3, 400 MHz). 132 Figura 3.75: Seção expandida do mapa de contornos HMBC de 14 na região entre δ de 1H 0,5-2,3 e δ de 13C 10-25 (CDCl3, 400 MHz). 132 Figura 3.76: Seção expandida do mapa de contornos HMBC de 14 na região entre δ de 1H 0,6-2,0 e δ de 13C 48-65 (CDCl3, 400 MHz). 133 Figura 3.77: Seção expandida do mapa de contornos HMBC de 14 na região entre δ de 1H 0,8-1,8 e δ de 13C 26-55 (CDCl3, 400 MHz). 133 Figura 3.78: Expansão do mapa de contornos NOESY na região entre δ de 1H 3,7- 4,05 e δ 0,95-1,90 (CDCl3, 400 MHz) de 14. 134 Figura 3.79: Expansão do mapa de contornos NOESY na região entre δ de 1H δ 0,93- 135 Lista de Figuras vi Oliveira, DM (2012) 3,00 e δ 1,63-1,90 (CDCl3, 400 MHz) de 14. Figura 3.80: Estrutura de 14 com as indicações das principais correlações de NOE (CDCl3, 400 MHz). 135 Figura 3.81: Correlações NOESY observadas entre os sinais de H-25 e H-26, H-28 e H-30, e entre H-29 e Hα−19 (CDCl3, 400 MHz) de 14. 136 Figura 3.82: Espectro de absorção de 14 na região do infravermelho (KBr). 138 Figura 3.83: Espectro de RMN de 1H de 14 (CDCl3, 400 MHz). 138 Figura 3.84: Espectro de RMN de 13C de 14: (CDCl3, 100 MHz). 139 Figura 3.85: Espectro de RMN DEPT-135 de 14 (CDCl3, 100 MHz). 139 Figura 3.86: Mapa de contornos HSQC de 14 (CDCl3, 400 MHz). 140 Figura 3.87: Expansão do mapa de contornos HMBC de 15a (CDCl3, 400 MHz): Correlação 3JC-4/H-24a (F2: δ 4,30-4,50 x F1:δ 47,0-49,5). 142 Figura 3.88: Espectro de absorção de 15 na região do infravermelho (KBr). 145 Figura 3.89: Espectro de RMN de 1H de 15 (CDCl3, 400 MHz). 145 Figura 3.90: Espectros de RMN de (a) 13C e (b) DEPT-135 de 15 (CDCl3, 100 MHz). 146 Figura 3.91: Espectro de RMN de 1H de 15a (CDCl3, 400 MHz). 146 Figura 3.92: Espectros de RMN de (a) 13C e (b) DEPT-135 de 15a (CDCl3, 100 MHz). 147 Figura 3.93: Espectro de absorção de 16 na região do infravermelho (KBr). 149 Figura 3.94: Espectro de RMN de 1H de 16 (CDCl3, 400 MHz). 150 Figura 3.95: Espectros de RMN de (a) 13C e de (b) DEPT-135 de 16 (CDCl3, 100 MHz). 151 Figura 3.96: Espectro de RMN de 1H de 17 (CDCl3, 400 MHz). 153 Figura 3.97: Espectro de RMN de (a) 13C e (b) DEPT-135 de 17 (CDCl3, 100 MHz). 153 Figura 3.98: Projeções de Harworth das estruturas dos monossacarídeos (18) identificados nas folhas de M. acantophylla por CCD, CGAR e CG-EM. 154 Figura 3.99: Placas CCD (a) eluída com CHCl3-MeOH-H2O-CH3COOH (6:4:1:1 v/v/v/v), revelada com anisaldeído sulfúrico. Aplicações: extrato SEMA não hidrolisado (1), fase aquosa resultante da hidrólise de SEMA (2) e padrões de: galactitol (3), D-glicose (4) e D-galactose (5); (b) eluída com clorofórmio-metanol-água (100:13,5:1 v/v/v), revelada com KMnO4 básico (EtOH, NaOH 0,1 mol.L-1). Aplicações: fase aquosa resultante da hidrólise de SEMA (S), e padrões de: glicose (G) e galactitol (D). 155 Figura 3.100: Cromatogramas obtidos por CGAR de (A) padrões de ramnose (S1, tr = 2,68 min), fucose (S2, tr = 2,73 min), ribose (S3, tr = 2,91 min), arabinose (S4, tr = 3,01 min), xilose (S5, tr = 3,36 min), manose (S6, tr = 5,56 min), galactose (S7, tr = 5,86) e glicose (S8, tr = 6,06 min), que foram derivatizados a alditóis-acetatos, (B) extrato SEMA hidrolisado, reduzido e acetilado, e, (C) extrato SEMA não hidrolisado, apenas reduzido e acetilado. As amostras foram analisadas (injeção de 2 µL) em uma coluna capilar BP10 (cianopropil fenil dimetil siloxano 14%, 30 156 Lista de Figuras vii Oliveira, DM (2012) m x 0,25 mm x 0,25 µm), divisão de fluxo de 1:80 (split), pressão de 15 psi (H2) e temperatura programada inicial de 200 oC, seguindo a 5 oC/min até a temperatura final de 250 oC em 10 minutos em um CG Varian CP-3800. Figura 3.101: Cromatograma de ions totais (TIC) obtido por CG-EM de SEMA hidrolisado, reduzido e acetilado e os respectivos EM de monossacarídeos identificados na forma de acetatos de alditóis. Condições: coluna capilar DB-5 (5% fenilmetilsilicone, 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm de d.i.), divisão de fluxo de 1:27, arraste por He(g) (189,2 kPa), temperaturas (T) de 120 oC a 7 oC/min até 280 oC em ≈23 minutos, mantida por 7 minutos, até 30 minutos. Injetor, T = 280 oC; interface, T = 250 oC, em aparelho Shimadzu, modelo GCMS QP-5000, dotado de detetor EM por impacto eletrônico (70 eV). 158 Figura 3.102: Cromatogramas obtido por CGAR de padrões de alditóis acetilados (B) das seguintes aldoses: ramnose (1, tr = 2,89 min), ribose (2, tr = 3,11 min), arabinose (3, tr = 3,22 min), xilose (4, tr = 3,57 min), manose (5, tr = 5,94 min), galactose (6, tr = 6,22) e glicose (7, tr = 6,41 min); e o cromatograma CGAR do extrato SEMA acetilado (A). As amostras foram analisadas (injeção de 2 µL) em uma coluna capilar BP10 (cianopropil fenil-dimetilsiloxano 14%, 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm), divisão de fluxo de 1/80, pressão de 15 psi (H2) e temperatura inicial de 200 oC, seguindo a 5 oC/min até a temperatura final de 250 oC em 10 minutos, utilizando um cromatógrafo CG Varian CP-3800. 160 Figura 3.103: Seção do mapa de contornos COSY de 19a (CDCl3, 200 MHz). 162 Figura 3.104: Espectro de absorção de 19 na região do infravermelho. 163 Figura 3.105: Espectro de absorção de 19a na região do infravermelho. 163 Figura 3.106: Espectro de RMN de 1H de 19 (CD3OD, 400 MHz). 164 Figura 3.107: Espectro de RMN de 1H de 19a (CDCl3, 200 MHz). 164 Figura 3.108: : Espectros de RMN de (a) 13C e (b) DEPT-135 de 19 (CD3OD, 100 MHz). 165 Figura 3.109: Espectro de RMN de 13C e de 19a (CDCl3, 50 MHz). 165 Figura 3.110: Espectro de RMN de DEPT-135 de 19a (CDCl3, 50 MHz). 166 Figura 3.111: Espectro EM de 19a. Obtido por CG-EM nas condições: coluna capilar DB-5 (5% fenilmetilsilicone, 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm de d.i.), divisão de fluxo de 1:27 (split), arraste por He(g) (189,2 kPa), temperaturas (T) de 120 oC a 7 oC/min até 280 oC em aproximadamente 23 min., mantida por 7 min., até 30 min.. Injetor, T = 280 oC; interface, T = 250 oC, em um CG-EM Shimadzu, modelo GCMS QP5000. Detetor IE, 70 eV. 166 Figura 3.112: Solução de SEMA (MeOH) em (a) pH 13 e em (b).pH 1,0 167 Figura 3.113: Cromatograma obtido por CLAE da fração solúvel em etanol (95%) dos extratos SEMA e FAMMA, com a fase móvel no seguinte gradiente (taxa de eluição de 1 mL min-1): iniciado com 10% de B; depois, com 10-30% de B em cinco minutos; em seguida, foi mantido em 30% de B por 15 minutos, depois com 30-50% de B em 5 minutos e, para 168 Lista de Figuras viii Oliveira, DM (2012) completar 30 minutos de análise, com 50-100% de B por 5 minutos. Onde A = ácido fórmico 0,5% em água (v/v) e B = ácido fórmico a 0,5% em acetonitrila:metanol (50:50 v/v). Foi utilizada uma coluna Shimadzu, C18 (ODS), 15 x 0,46 cm, partículas de 3 µm. Figura 3.114: Nomenclatura utilizada nos fragmentos de flavonoides glicosídicos. 169 Figura 3.115: Espectros de massas (EM-IES, offline, modo negativo) relacionados a constituintes flavonoides glicosídicos de SEMA. 171 Figura 3.116: Fotografia da cromatoplaca CCD em sílicagel 60G de 20, eluente: acetato de etila:metanol: água-ácido acético 0,5% (8:2:1); revelador: NP-PEG 4000 sob luz UV λ 366 nm, Rf = 0,25. 172 Figura 3.117: Espectro de absorção de 20 obtido por varredura na região do UV na cela do detector de fotodiodo, modelo SPD-M10A, acoplado à bomba LC-10AD, módulo de comunicação CBM 10A do equipamento para CLAE (Shimadzu). 173 Figura 3.118: Seção do mapa de contornos HSQC de 20 (CD3OD, 400 MHz) relativa aos hidrogênios e carbonos anoméricos (F2: δ de 1H 4,50-5,80 x F1: δ de 13C 99,5-104,0). 174 Figura 3.119: Espectro de absorção de 20 na região do infravermelho. 177 Figura 3.120: Espectro de RMN de 1H de 20 (CD3OD, 400 MHz). 178 Figura 3.121: Mapa de contornos HSQC de 20 (CD3OD, 400 MHz). 179 Figura 3.122: Seções do mapa de contornos HMBC de 20 (CD3OD, 400 MHz): (a) região entre δ de1H 1,00-8,00 e δ de13C 70–180; (b) região entre δ de1H 6,00-7,80 e δ de13C 90–165. 180 Figura 3.123: Fotografia eletrônica (2.4 Mpixels), sob luz UV (lâmpada λ 366 nm), da cromatoplaca CCD em sílicagel 60G de 21, utilizando o eluente acetato de etila-metanol-água (8:4:1 v/v/v) e revelador NP-PEG 4000, Rf = 0,43. 181 Figura 3.124: Espectro de absorção de 21 obtido por varredura na região do UV na cela do detector de fotodiodo, modelo SPD-M10A, acoplado à bomba LC-10AD e módulo de aquisição de dados CBM 10A do equipamento para CLAE (Shimadzu). 182 Figura 3.125: Seção do mapa de contornos HSQC de 21 (CD3OD, 400 MHz) relativa aos hidrogênios e carbonos anoméricos (F2: δ de 1H 4,5-5,90 x F1: δ de 13C 100,0-107,0). 184 Figura 3.126: Seção do Mapa de contornos COSY de 21 (CD3OD, 400 MHz) relativa às correlações entre os sinais dos hidrogênios anoméricos e dos hidrogênios vicinais (F2: δ de 1H 4,45-5,85 x F1: δ de 1H 3,20-4,20). 185 Figura 3.127: Região do mapa de contornos HMBC com as correlações atribuídas às ligações glicosídicas de 21: (a):[-β1-D-Gal(1→3)-O-quercetina]; (b): [- Ram(1α→2)Gal-]; (c): [Ram(1α→6)Gal-]; (d): [Xil(1β→3)Ram-]. 186 Figura 3.128: Ampliações (A-C) do mapa de contornos NOESY de 21 (CD3OD, 400 MHz) que mostram correlações interglicosídica conforme apresentada pelas linhas verdes tracejadas na estrutura (abaixo) racionalizada por 187 Lista de Figuras ix Oliveira, DM (2012) correlações NOE e otimizada por MMFF-94 Merck. Figura 3.129: Curvas características de absorvância em UV de 21 obtidas em soluções de (a) MeOH, MeOH + AlCl3, MeOH + AlCl3 + HCl(aq.) (b) MeOH, MeOH + NaOMe, e (c) MeOH, MeOH, MeOH + NaOAc, MeOH + NaOAc + H3BO3. Os dados espectrais foram registrados em um espectrômetro UV/Vis Beckman DU-600 (CPQRR, BH), ajustado para duas varreduras/amostra na faixa de comprimento de onda (λ) de 200-500 nm a 600 nm/min. 193 Figura 3.130: Espectro de absorção de 21 na região do infravermelho. 194 Figura 3.131: Espectro de RMN de 1H de 21 (CD3OD, 400 MHz). 194 Figura 3.132: Espectro de RMN de (a) 13C e (b) DEPT-135 de 21 (CD3OD, 100 MHz). 195 Figura 3.133: Mapa de contornos HSQC de 21 (CD3OD, 400 MHz). 196 Figura 3.134: Mapa de contornos COSY de 21 (CD3OD, 400 MHz). 197 Figura 3.135: Mapa de contornos HMBC de 21 (CD3OD, 400 MHz). 198 Figura 3.136: Mapa de contornos NOESY de 22 (CD3OD, 400 MHz). 199 Figura 3.137: Espectros EM-IES de 21 no modo negativo a partir do íon-radical molecular de 21 em m/z 888 (C38H48O24). 200 Figura 3.138: Espectros de massas EM-IES, de 21 obtido em modo positivo de detecção com a identificação e o isolamento (MS/MS) do íon precursor em m/z 911 [M +Na]+. 201 Figura 3.139: Fotografia da cromatoplaca CCD em sílicagel 60G de 22, eluente: acetato de etila:metanol: água-ácido acético 0,5% (8:2:1); revelador: NP-PEG 4000 sob luz UV λ 366 nm, Rf = 0,29. 202 Figura 3.140: Espectro de absorção de 22 obtido por varredura na região do UV na cela do detector com fotodiodo modelo SPD-M10A, acoplado à bomba LC-10AD e módulo de aquisição de dados CBM 10A do equipamento para CLAE (Shimadzu). 203 Figura 3.141: Seção do mapa de contornos HSQC de 22 (CD3OD, 400 MHz) relativa aos hidrogênios e carbonos anoméricos (F2: δ de 1H 4,5-5,70 x F1: δ de 13C 100,0-108,0). 204 Figura 3.142: Seção do Mapa de contornos COSY de 22 (CD3OD, 400 MHz) relativa às correlações entre os sinais dos hidrogênios anoméricos com os hidrogênios vicinais (F2: δ de 1H 4,50-5,50 x F1: δ de 1H 3,20-4,20). 204 Figura 3.143: Região do mapa de contornos HMBC apresentando as correlações atribuídas às ligações glicosídicas de 22: (a): -Ram(1→2)Gal-; (b): Ram(1→6)Gal-; (c): Xil(1→3)Ram-. As linhas com setas representam as correlações 3JH,C. 208 Figura 3.144: Ampliações (A-D) do mapa de contornos NOESY (CD3OD, 400 MHz), com as correlações que permitiram consistir a atribuição das ligações glicosídicas como mostrado na estrutura 3D de 22 abaixo. 209 Figura 3.145: Espectro de absorção de 22 na região do infravermelho. 211 Lista de Figuras x Oliveira, DM (2012) Figura 3.146: Espectro de RMN de 1H de 22 (CD3OD, 400 MHz). 212 Figura 3.147: Espectros de RMN de (a) 13C e (b) DEPT-135 de 22 (CD3OD, 100 MHz). 213 Figura 3.148: Mapa de contornos COSY (CD3OD, 400 MHz) de 22 e expansão da região entre δ 3,25 e 4,25 ppm (F2) x δ 3,25 e 4,25 ppm (F1). 214 Figura 3.149: Mapa de contornos HSQC de 22 (CD3OD, 400 MHz). 215 Figura 3.150: Mapa de contornos HMBC de 22 da região entre δ 80 e 170 ppm (F1) x δ 5,00 e 8,00 ppm (F2) (CD3OD, 400 MHz). 216 Figura 3.151: Mapa de contornos HMBC de 22 da região entre δ 67 e 107,5 ppm (F1) x δ 3,30 e 4,70 ppm (F2). (CD3OD, 400 MHz). 216 Figura 3.152: Mapa de contornos NOESY de 22 (CD3OD, 400 MHz) da região entre δ 3,20-4,20 ppm (F2) x δ 3,20-4,20 ppm (F1). 217 Figura 3.153: Mapa de contornos NOESY de 22 (CD3OD, 400 MHz) da região das metilas, entre δ 3,20-4,20 ppm (F2) x δ 0,85-1,25 ppm (F1). 217 Figura 3.154: Espectro de massas EM-IES de 22 obtido no modo negativo, com varredura de 100 a 1000 m/z. 218 Figura 3.155: Espectro de absorção de 23 obtido por varredura na região do UV na cela do detector com fotodiodo modelo SPD-M10A acoplado a uma bomba LC-10AD em um equipamento CLAE (Shimadzu). 219 Figura 3.156: Mapa de contornos HSQC de 23 (CD3OD, 400 MHz) - Região relativa aos sinais de carbonos e hidrogênios anoméricos. 222 Figura 3.157: Espectro de absorção de 23 na região do infravermelho. 226 Figura 3.158: Espectro de RMN de 1H de 23 (CD3OD, 400 MHz). 227 Figura 3.159: Mapa de contornos HSQC de 23 (CD3OD, 400 MHz). 227 Figura 3.160: Mapa de contornos COSY de 23 (CD3OD, 400 MHz). 228 Figura 3.161: Mapa de contornos HMBC de 23 (CD3OD, 400 MHz). 228 Figura 3.162: Espectros EM-IES de 23 obtidos no modo negativo. 229 Figura 3.163: Espectro EM2-IES obtido no modo positivo de 23 mostrando os fragmentos do íon quasi-molecular [M+Na]+ em m/z 925. 230 Capítulo 5 – Ensaios Biológicos Figura Título pp. Figura 5.1: Tempos de latência apresentados nas medições M1 (0 min), M2 (20 min) e M3 (60 min) durante teste de analgesia utilizando a solução aquosa do extrato FOMMA aplicado em cobaias (200 mg kg-1, v.o.). 247 Figura 5.2: Efeitos de captura de radicais livres de DPPH por 21 e 22 em metanol (controle: BHT). 249 Figura 5.3: Atividade inibidora de soluções dos extratos de folhas de Maytenus acanthophylla (DMSO, 20 µg.mL-1) sobre o crescimento (%) de três 254 Lista de Figuras xi Oliveira, DM (2012) linhagens de células tumorais humanas: MCF-7, TK10 e UACC-62 Figura 5.4: Atividade leishmanicida (%) de soluções de extratos de folhas de M. acanthophylla (DMSO, 20 µg.mL-1) sobre formas amastigotas (axênicas) do protozoário causador da leishmaniose. 257 Figura 5.5: Efeito dos glicosídeos 20 e 23 na proliferação das Células Mononucleares do Sangue Periférico humano (PBMC) estimulado com PHA. PBMC (2x105/poço) foram tratados com diferentes concentrações de 20 e 23 com PHA (5 µg mL-1) por 72h. Os dados são expressos como média ± erro padrão de sete experimentos independentes realizados em triplicata. *Estatisticamente diferente do controle (PHA, DMSO 0,01%), p<0,05. O controle de células sem estimulação está representado por CC. 261 Figura 5.6: Efeitos dos compostos 8, 9 e 19a sobre a síntese de ATP em cloroplastos de Spinacea oleracea L. 263 Lista de Tabelas xii Oliveira, DM (2012) ÍNDICE DE TABELAS Capítulo 1 - Introdução Tabela Título pp. Tabela 1.1: Plantas do gênero Maytenus utilizadas na etnomedicina brasileira 4 Capítulo 2 - Experimental Tabela Título pp. Tabela 2.1: Colunas de cromatografia líquida desenvolvidas no fracionamento de FHEMA 19 Tabela 2.2: Frações obtidas de C-1 20 Tabela 2.3: Agrupamentos e constituintes isolados das frações de C-1 de FHEMA 20 Tabela 2.4: Resumo das substâncias isoladas de FHEMA 24 Tabela 2.5: Colunas de CL desenvolvidas no fracionamento de SHEMA 26 Tabela 2.6: Frações coletadas de C-2, amostra A1 de SHEMA 27 Tabela 2.7: Agrupamentos e constituintes isolados das frações de C-3, amostra A2 29 Tabela 2.8: Agrupamentos e constituintes isolados das frações de C-4, amostra A3 de SHEMA 30 Tabela 2.9: Agrupamentos e constituintes isolados das Frações de C-5, amostra A4 de SHEMA 32 Tabela 2.10: Resumo das substâncias isoladas de SHEMA 32 Tabela 2.11: Colunas de CL desenvolvidas no fracionamento de FAEMA 33 Tabela 2.12: Agrupamentos e constituintes isolados das frações de C-6 35 Tabela 2.13: Resumo das substâncias obtidas de FAEMA 37 Tabela 2.14: Flavonoides identificados a partir das análises dos dados de IES/EM do extrato SEMA, modo negativo e varreduras na faixa de m/z 100-2000 Da 39 Tabela 2.15: Resumo das substâncias obtidas de SEMA 42 Capítulo 3 – Resultados e Discussão Tabela Título pp. Tabela 3.1: Dados do cromatograma obtido por CGAR de 1 e de padrões de n- alcanos 52 Tabela 3.2: Comparação entre os valores de δ de 13C e 1H de 2 (CDCl3, 400 MHz) e 56 Lista de Tabelas xiii Oliveira, DM (2012) os valores publicados para o esqualeno Tabela 3.3: Absorções na região do infravermelho de 3 na forma cristalina β (NaCl) 62 Tabela 3.4: Comparação dos valores de deslocamentos de RMN de 1H e de 13C de 3 (CDCl3, 400 MHz) com dados da literatura (CDCl3, 400 MHz) 63 Tabela 3.5: Comparação entre os valores de δ de 13C (CDCl3, 100 MHz) de 4 e os respectivos valores publicados para o octadecanol (CDCl3) 69 Tabela 3.6: Comparação entre os valores de δ de 1H de 4 (CDCl3, 400 MHz) e os respectivos valores publicados para o octadecanol (CDCl3) 69 Tabela 3.7: Proposta de reatribuição dos dados de RMN* e estereoquímica de 5 74 Tabela 3.8: Dados do pó constituído de microcristais de friedelina (5) 83 Tabela 3.9: Coordenadas atômicas fracionárias x, y, z da célula unitária (dimensões em Å) e os parâmetros de deslocamentos isotrópicos (Å2) 84 Tabela 3.10: Valores dos ângulos de torção endocíclicos (o) observados por SDPD e DFT calculados para friedelina 85 Tabela 3.11: Comparação e análise de dispersão entre os valores de δ de 13C de 6 (CDCl3, 100 MHz) e os respectivos valores publicados para o β- friedelinol (CDCl3, 100 MHz) 90 Tabela 3.12: Comparação e análise de dispersão entre os valores de δ de 13C de 7 (CDCl3, 100 MHz) com os respectivos valores publicados para o α- friedelinol (CDCl3, 100 MHz) 94 Tabela 3.13: Absorções na região do infravermelho e modos de vibração de 8 97 Tabela 3.14: Comparação e análise de dispersão entre os valores de δ de 13C de 8 (CHCl3,400 MHz) e os respectivos valores publicados para o lupeol (CHCl3,500 MHz) 98 Tabela 3.15: Absorções na região do infravermelho e modos de vibração de 9 102 Tabela 3.16: Comparação e análise de dispersão entre os dados de RMN de 9 (CDCl3, 400 MHz) com os respectivos valores publicados para o 3-O-acetato de lupeoíla (CDCl3, 400 MHz) 103 Tabela 3.17: Comparação e análise de dispersão entre os valores de δ de 13C de 10 e 11 (CDCl3, 100 MHz) com os respectivos valores publicados para os compostos 3β-esteariloxi-olean-12-eno e 3β-esteariloxi-urs-12-eno (CDCl3, 100 MHz) 108 Tabela 3.18: Absorções na região do infravermelho e modos de vibração de 11 111 Tabela 3.19: Comparação e análise de dispersão entre os valores de δ de 13C e 1H de 11 (CDCl3, 400 MHz) com os respectivos valores publicados para 3β-esteariloxi-urs-12-eno (CDCl3, 400 MHz) 112 Tabela 3.20: Comparação e análise de dispersão entre os valores de δ de 13C de 12 (CDCl3, 50 MHz) com os respectivos valores publicados para β-amirina (3β-hidroxi-olean-12-eno) (CDCl3, 50 MHz) 117 Lista de Tabelas xiv Oliveira, DM (2012) Tabela 3.21: Comparação e análise de dispersão entre os dados de RMN de 13 (CDCl3, 400 MHz) com os respectivos valores publicados para o canofilol (CDCl3, 400 MHz) 121 Tabela 3.22: Comparação entre os valores de δ de 13C de 14 e os valores calculados por B3LYP/6-311++G(2d,p) para as estruturas dos confôrmeros ccccc e ccccbb otimizadas por DFT 128 Tabela 3.23: Comparação entre os valores δ de 1H de 14 e os valores calculados por B3LYP/6-311++G(2d,p) para as estruturas dos confôrmeros ccccc e ccccbb otimizadas por DFT 129 Tabela 3.24: Atribuição dos dados de RMN de 14 137 Tabela 3.25: Comparação e análise de dispersão entre os valores de δ de 13C de 15 e 15a (CDCl3, 100 MHz) com os respectivos valores publicados para os compostos 3β,24-dihidroxifriedelano (piridina-d5, 100 MHz) e 3β,24- diacetoxifriedelano (CDCl3, 100 MHz) 143 Tabela 3.26: Comparação entre os valores de δ de 1H de 15 e 15a (CDCl3, 400 MHz) com os respectivos valores publicados para os compostos 3β,24- dihidroxifriedelano (piridina-d5, 400 MHz) e 3β,24-diacetoxifriedelano (CDCl3, 400 MHz) 144 Tabela 3.27: Comparação e análise de dispersão entre os valores de δ de 13C de 16 (CDCl3, 100 MHz) com os respectivos valores publicados para β- sitosterol (CDCl3, 100MHz) 149 Tabela 3.28: Comparação entre os valores de δ de 13C de 17 (CDCl3, 100 MHz) com os respectivos valores publicados para o ácido araquidônico (CDCl3, 100 MHz) 152 Tabela 3.29: Monossacarídeos livres (FS) e ligados (BS) identificados no extrato SEMA através da análise do cromatograma CGAR (Figura 3.100 (A), (B) e (C), p.156) 157 Tabela 3.30: Comparação entre os valores de δ de 13C observados de 19 (MeOH, 50 MHz) e 19a (CDCl3, 50 MHz) e os respectivos valores publicados para o galactitol (D20, 400 MHz) 25 e hexa-acetato de galactitol(CDCl3, 15 MHz) 161 Tabela 3.31: Atribuição dos valores de δ de 1H de 19 (MeOH, 200 MHz)e 19a (CDCl3, 200 MHz) e comparação com os dados da literatura para o galactitol (D2O, 400 MHz) 161 Tabela 3.32: Análise do cromatograma obtido por CLAE de SEMA (Figura 3.113) 168 Tabela 3.33: Flavonoides glicosídicos detectados no extrato SEMA por EM-IES no modo negativo (offline) 170 Tabela 3.34: Comparação entre dos valores de δ de 13C de 20 (CD3OD, 100 MHz) com os valores encontrados na literatura para a 3-O-{[α-L- ramnopiranosila(1→6)][ α-L-ramnopiranosila(1→2)]}-β-D-galactopira- nosídeo de quercetina (δ, CD3OD, 100 MHz) isolado de M. ilicifolia e M. aquifolium 175 Lista de Tabelas xv Oliveira, DM (2012) Tabela 3.35: Comparação entre os valores de δ de 1H de 20 (CD3OD, 400 MHz) com os valores encontrados na literatura para 3-O-{[α−L- ramnopiranosila(1→6)][α-L-ramnopiranosila(1→2)]}-β-D-galactopira- nosídeo de quercetina (δ, CD3OD, 400 MHz) isolado de M. ilicifolia e M. aquifolium 176 Tabela 3.36: Dados espectrais de 21 na região do UV 182 Tabela 3.37: Atribuição dos valores de δ de 13C de 21 (CD3OD, 100 MHz) e a comparação com valores disponíveis da literatura 189 Tabela 3.38: Atribuição dos valores de δ de 1H de 21 (CD3OD, 400 MHz) de 21 e a comparação com os valores encontrados na literatura 190 Tabela 3.39: Proposta de fragmentação para o tetraglicosídeo 21 e a atribuição dos íons observados nos EM-IES negativo (Figura 3.137, p.200), de acordo com a nomenclatura de Domon e Costello 191 Tabela 3.40: Fragmentograma proposto para o tetraglicosídeo 21 e a atribuição dos íons (aductos do sódio) observados nos EM-IES, modo positivo, do íon precursor em m/z 912 (Figura 3.138, p.201) 192 Tabela 3.41: Atribuição dos valores de δ de 13C de 22 (CD3OD, 100 MHz) e a comparação com os valores disponíveis na literatura (δ, CD3OD, 100 MHz) 38, 172 206 Tabela 3.42: Atribuição dos valores de δ de 1H (400 MHz) de 22 (CD3OD, 400 MHz) e comparação com os valores encontrados na literatura (CD3OD, 400 MHz) 207 Tabela 3.43: Fragmentação proposta para o tetraglicosídeo 22 e a atribuição dos íons observados no EM-IES, modo negativo 211 Tabela 3.44: Atribuição dos valores de δ de 13C de 23 (CD3OD, 100 MHz) e a comparação entre os valores encontrados na literatura (CD3OD, 100/125 MHz) 221 Tabela 3.45: Atribuição dos valores de δ de 1H de 23 (CD3OD, 400 MHz) e a comparação com os valores encontrados na literatura referentes à genina e cadeia glicosídica (CD3OD, 400/500 MHz) 223 Tabela 3.46: Fragmentação proposta para o tetraglicosídeo 23 e a atribuição dos íons observados nos EM-IES, modo negativo (Figura 3.162, p.229) 225 Tabela 3.47: Atribuição dos íons-fragmentos obtidos na detecção IES-EM de 23 no modo positivo (Figura 3.163, p.230) 225 Capítulo 5 – Ensaios Biológicos Figura Título pp. Tabela 5.1: Potencial analgésico de FOMMA (%)* 247 Tabela 5.2: Atividade antimicrobiana in vitro do extrato metanólico de folhas de M. acanthophylla, (FAMMA) frente a bactérias Gram-negativas e Gram- 251 Lista de Tabelas xvi Oliveira, DM (2012) positivas Tabela 5.3: Avaliação in vitro da atividade inibidora de soluções (DMSO, 20 µg.mL-1) de extratos de folhas de M. acanthophylla sobre o crescimento (%) das linhagens de células tumorais humanas MCF-7, TK10 e UACC-62 253 Tabela 5.4: Avaliação in vitro da atividade leshmanicida (M%) de soluções de extratos de folhas de M. acanthophylla (DMSO, 20 mg.mL-1), sobre formas amastigotas e axênicas do protozoário causador da leishmaniose 257 Tabela 5.5: Concentração Inibitória Mínima de extratos de folhas de M. acanthophylla (µg mL-1) contra espécies de Candida C. albicans, C. krusei e C. glabrata 259 Lista de Esquemas xvii Oliveira, DM (2012) ÍNDICE DE ESQUEMAS Capítulo 2 – Experimental Figura Título pp. Esquema 2.1: Preparação dos extratos de folhas de M. acanthophylla. 17 Esquema 2.2: Roteiro para obtenção de extrato rico em guta-percha de folhas de M. acanthophylla (GHEMA). 18 Esquema 2.3: Fracionamento do extrato FHEMA. 19 Esquema 2.4: Elaboração da goma extraída de folhas de M. acanthophylla (GHEMA). 25 Esquema 2.5: Fracionamento da amostra A1 de SHEMA. 26 Esquema 2.6: Fracionamento das amostras A2 e A3 de SHEMA. 29 Esquema 2.7: Fracionamento da amostra A4 de SHEMA. 31 Esquema 2.8: Fracionamento de FAEMA. 34 Esquema 2.9: Fracionamento do extrato SEMA. 38 Esquema 2.10: Fracionamento do extrato FAMMA. CLAE-PREP: Purificação utilizando coluna CLAE semi-preparativa (Shimadzu, Shim-pack ODS, 5 µm, 20 x 250 mm, fluxo 10 mL min-1, FM = [A + 20-30% de B], A = solução aquosa de TFA (0,1%, v/v); B = ACN-metanol (1:1 v/v) acidulada com TFA (0,1%, v/v). 43 Simbologia Oliveira, DM (2012) xviii ABREVIATURAS, ACRÔNIMOS, SIGLAS E SÍMBOLOS %T ou T(%) Porcentagem de transmitância υ Deformação axial (estiramento) ou frequência λ Comprimento de onda δ Deformação angular assimétrica ou simétrica no plano em espectrometria na região do infravermelho. Deslocamento químico em espectroscopia de ressonância magnética nuclear Acetona-d6 Acetona deuterada ACN Acetonitrila AcOEt Acetato de etila Ald-Ac Reações de derivatização de monossacarídeos a alditóis-acetatos para análise por CGAR ATP Adenosina trifosfato Ax Axial BD Banco de Dados BHI O caldo BHI (brain heart infusion) é um meio de cultura utilizado para cultivo de microrganismos. BHT Butil-hidróxi-tolueno CASE Computer-Aided Structure Elucidation CCD Cromatografia em camada delgada CCP Cromatografia em camada delgada preparativa CCF Cromatografia “Flash”em coluna - sílica gel-60 (230-400 Mesh) CCL ou CL Coluna de cromatografia líquida CGAR Cromatografia em fase gasosa de alta resolução CG-EM Sistema de cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas CI50 Concentração inibitória à 50% CL Cromatografia em fase líquida CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência CLAE-EM Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas COSY Correlelation Spectroscopy CPQRR Centro de Pesquisas René Rachou (Fiocruz) – Belo Horizonte, MG. d Dupleto DCM Diclorometano dd Dupleto duplo ddd Duplo dupleto duplo DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DFT Density functional theory (teoria funcional da densidade) DMSO Dimetilsulfóxido DQ Departamento de Química da UFMG dt Dupleto triplo EM Espectrometria de massas EM-IES Espectrometria de Massas com Ionização por Eletrospray (EM-IES) Simbologia Oliveira, DM (2012) xix eq Equatorial EtOH Etanol φ Diâmetro interno de uma coluna cromatográfica e de outros cilindros FID Flame Ionization Detector (detector de ionização de chama) FM Fase móvel GPC Cromatografia por permeação em gel ou por seleção por tamanho HC Hidrocarboneto HF Hartree–Fock (método) HD Desvio absoluto máximo (sigla mantida igual a do artigo publicado) HMBC Heteronuclear Multiple-Bond Correlation HMQC Heteronuclear Multiple-Quantum Correlation HSQC Heteronuclear Single-Quantum Correlation i.p Intraperitoneal ICEx Instituto de Ciências Exatas da UFMG IE Impacto eletrônico iNOS Enzima NO-sintase induzida IV Infravermelho J Constante de acoplamento escalar LAREMAR Laboratório de Ressonância Magnética Nuclear de Alta Resolução LB(+) Teste de Liebermann Burchard positivo Lit. Literatura LQPN Laboratório de Química de Produtos Naturais m Multipleto m/z Razão entre a massa e carga elétrica de um íon MATCH-5 Banco de dados de espectros de RMN de 13C de TTPC’s MCF-7 Células de tumor de mama humano MD Matriz de dados Me2CO Acetona MeOH Metanol MPLC Cromatografia líquida de média pressão NaOAc Acetato de sódio NaOMe NaOCH3, Metóxido de sódio NCI National Cancer Institute (Organismo governamental dos EUA). NEPLAM Núcleo de pesquisas de plantas medicinais – DQ/UFMG NMR-Covariance - Covariance nuclear magnetic resonance spectroscopy NP-PEG Natural Products-Polietilenoglicol (revelador para CCD) NUPRONAT Núcleo de Produtos Naturais da Univ. Est. do Sudoeste da Bahia OAc Grupo acetilóxi ODS Octadecilsilano p. Página PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cell PCA Análise por Componentes Principais (matemática) PES Superfícies de Energia Potencial P.F. Ponto de fusão POP Procedimento Operacional Padrão ppm Partes por milhão PS Poliestireno q Quarteto Simbologia Oliveira, DM (2012) xx QPN Química de Produtos Naturais recrist. Recristalização Rf Fator de retenção em cromatografia em camada delgada RMN Ressonância Magnética Nuclear RMSD Raiz do desvio médio quadrado RPM Rotações por minuto RPMI-1640 Meio de cultura para cultura de leucócitos humanos normais e neoplásicos, desenvolvido por Moore e colaboradores no Roswell Park Memorial Institute (EUA) s Simpleto σ Constante de blindagem magnética SDPD Structure Determination from Powder Diffraction (Sigla em inglês para Determinação Estrutural por Difração de Pó, técnica cristalográfica internacionalmente conhecida. sl Simpleto largo SG-CA Mistura de Sílica gel-carvão ativo (10:1) SQR Square root SRB Sulforodamina B t Tripleto Tg Temperatura de transição vítrea (polímeros) TK-10 Células tumorais renais humanas TMS Tetrametilsilano tR Tempo de retenção tt Tripleto triplo TTPC Triterpeno pentacíclico UACC-62 Células de melanoma humano UNICAMP Universidade Estadual de Campinas UV Ultravioleta UV-Vis Ultravioleta-visível v.o. Via oral Codificação dos extratos de folhas da planta FAEMA Extrato em acetato de etila de folhas de M. acanthophylla FAMMA Extrato hidroalcoólico de folhas de M. acanthophylla FHEMA Extrato hexânico de folhas de M. acanthophylla FHEQM Extrato hexânico (quente) de folhas de M. acanthophylla FOMMA Extrato Metanólico de folhas de M. acanthophylla GHEMA Sólido precipitado do extrato FHEQM SEMA Sólido precipitado de FOMMA SHEMA Sólido precipitado do extrato FHEMA Objetivo xxi Oliveira, DM (2012) OBJETIVO GERAL O OBJETIVO GERAL DESSE ESTUDO FOI DAR CONTINUIDADE À EXPLORAÇÃO CIENTÍFICA DA PLANTA Maytenus acanthophylla REISSEK, POR MEIO DA INVESTIGAÇÃO SISTEMÁTICA DE SUAS POTENCIALIDADES QUÍMICAS, FARMACOLÓGICAS E A CAPACIDADE DE FORNECER MATERIAIS RENOVÁVEIS. Objetivos específicos: Dar continuidade ao estudo fitoquímico de Maytenus acanthophylla Reissek, utilizando as partes aéreas, abordando o fracionamento, identificação e caracterização detalhada de constituintes químicos obtidos dos extratos em hexano, acetato de etila e metanol, para assim, obter o perfil e o potencial químico dessa planta. Realizar testes e ensaios biológicos, utilizando extratos e os constituintes isolados, visando avaliar o potencial farmacológico da planta. Obtenção e caracterização de polímero natural 1,4-trans-poliisopreno de M. acanthophylla. Investigar as propriedades e aplicações do polímero 1,4-trans-poliisopreno, tendo em vista a sua disponibilidade como um material plástico renovável em substituição a outros materiais derivados de combustíveis fósseis. Resumo xxii Oliveira, DM (2012) Resumo Esta tese versa sobre o estudo químico e farmacológico de folhas de Maytenus acanthophylla Reissek (Celastraceae), uma planta medicinal da Bahia (espinheira-santa). O objetivo geral consistiu na investigação sistemática das potencialidades químicas, farmacológicas e a capacidade de fornecer materiais renováveis dessa planta. O material de estudo foi coletado de espécimes encontrados na Região da Chapada Diamantina no Estado da Bahia. No presente trabalho foram transcritos os métodos, filosofias de trabalho e os resultados obtidos no estudo fitoquímico, bem como, os resultados de ensaios biológicos feitos com alguns compostos isolados e extratos. As estruturas dos compostos obtidos foram elucidadas por técnicas espectroscópicas (RMN 1D e 2D, EM-IES, CG-EM, IV, UV e difração de raios-X) com o suporte de banco de dados e programas computacionais de cálculos ab initio e modelagem molecular. O estudo fitoquímico permitiu a obtenção de trinta compostos químicos, sendo 21 puros e nove constituindo misturas. Nos extratos em metanol e metanol/água foram isolados três flavonoides inéditos, o 3-O-{[α-L-ramnopiranosil(1→6)]-O-[β-D-xilopiranosil(1→3)-O-α-L-ramnopiranosil- (1→2)]]-β-D-galactopiranosídeo de quercetina (21), 3-O-{[α-L-ramnopiranosil(1→6)]-O-[β-D- xilopiranosil(1→3)-O-α-L-ramnopiranosil(1→2)]}-β-D-galactopiranosídeo de canferol (22), 3- O-{[α-L-ramnopiranosil(1→6)]-O-[β-D-xilopiranosil(1→3)-O-α-L-ramnopiranosil-(1→2)]}-β-D- galactopiranosídeo de isoramnetina (23) e um flavonoide triglicosídico anteriormente isolado, o 3-O-{[α-L-ramnopiranosil(1→6)][α-L-ramnopiranosil-(1→2)]}-β-D-galactopiranosídeo de quercetina (20). Nos extratos em hexano e acetato de etila, os constituintes isolados constam de uma mistura de hidrocarbonetos (1), esqualeno (2), 1,4-trans-poliisopreno (guta-percha, 3), um álcool graxo (4); sete triterpenos pentacíclicos (TTPC) friedelanos: friedelina (5), 3β−friedelinol (6), 3α-friedelinol (7), 28-hidroxi-3-oxo-friedelano (canofilol, 13), 3β,16β-dihidroxifriedelano (pachysandiol B, 14), 3β,24-di-hidroxifriedelano (15) e 3β,24-diacetoxifriedelano (15a). Os compostos 14 e 15 foram isolados pela primeira vez na família Celastraceae. Foram também isolados dois TTPC’s lupanos: o 3β-lup-20(29)-en-3-ol (lupeol, 8) e o acetato de 3β-lup-20(29)- en-3-ila (9); bem como a mistura dos isômeros 3β-esteariloxi-olean-12-eno (10) e 3β- esteariloxi-urs-12-eno (11). O TTPC 11, a β-amirina (12), o β-sitosterol (16) e o ácido eicosanóico (17) também foram isolados puros nos extratos em hexano ou acetato de etila. Nos extratos em metanol/água foram detectadas por CG-EM as presenças de sete monossacarídeos (18) e o galactitol (19) foi isolado puro, o que permitiu a obtenção do derivado 1,2,3,4,5,6-hexa- acetato de galactitol (19a). O polímero 3 foi utilizado na formulação de um produto da classe dos antibióticos e antissépticos para uso odontológico, que gerou uma solicitação de registro de patente pela UFMG. Em testes biológicos, o extrato metanólico mostrou significativa atividade analgésica em camundongos, contudo, em ensaios microbianos e citotóxicos, os extratos das folhas não apresentaram ação tóxica ou inibidora contra células tumorais (MCF-7, TK10 e UACC-62), micro-organismos (bactérias e espécies de Candida sp.), ou sobre o protozoário da leishmaníase. Entretanto, em testes feitos com soluções de 19a sobre cloroplastos de Spinacea oleracea L. foi observada a inibição da síntese de ATP, constituindo um indicativo de que 19a pode servir de modelo para síntese de herbicidas. Os glicosídeos 21 e 22 apresentaram boas atividades em ensaios de captura de radicais livres de DPPH em solução, e 23 apresentou ação imunomoduladora em testes de proliferação de células mononucleares do sangue humano. À luz dos resultados obtidos, considerando a diversidade de constituintes químicos observados, foi possível constatar o grande potencial químico-farmacológico de Maytenus acanthophylla e reconhecer, por meio científico, a validade do uso de suas folhas na medicina popular. Resumo xxiii Oliveira, DM (2012) Abstract The aim of this work was to deal with the chemical and pharmacological studies Maytenus acanthophylla Reissek (Celastraceae) leaves, a medicinal plant of Bahia (holy thorn). The general objective was the systematic investigation of the plant`s chemical and pharmacological potential and the ability to provide renewable materials. The study material was collected from specimens found in the region of Chapada Diamantina in the state of Bahia. In this study we transcribed methods, philosophies of work and results obtained in the phytochemical study, as well as the results of biological tests made with some isolated compounds and extracts. The structures of these compounds were elucidated by spectroscopic techniques (NMR 1D and 2D, IES-EM, GC-EM, IV, UV and X-rays diffraction) with the support of database and computer programs for ab initio calculations and molecular modeling. The phytochemical study allowed the isolation of thirty chemical compounds, including 21 pure and nine constituting mixtures. Three new flavonoids were isolated in methanol and methanol/water extracts: 3-O-{[α-L- rhamnopyranosyl(1→6)]-O-[β-D-xylopyranosyl(1→3)-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)]}-β-D- quercetin galactopyranoside (21), 3-O-{[α-L-rhamnopyranosyl(1→6)]-O-[β-D-xylopyrano- syl(1→3)-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)]}-β-D-kaempferol galactopyranoside (22), 3-O-{[α-L- rhamnopyranosyl(1→6)]-O-[β-D-xylopyranosyl(1→3)-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)]}-β-D- isorhamnetin galactopyranoside (23); and one triglucoside flavonoid previously isolated: 3-O- {[α-L-rhamnopyranosyla(1→6)][α-L-rhamnopyranosyla(1→2)]}-β-D-quercetin galactopyra- noside (20). In the hexane and ethyl acetate extracts, the isolated constituents consist of a mixture of hydrocarbons (1), squalene (2), 1,4-trans-polyisoprene (gutta-percha,3), a fatty alcohol (4); seven pentacyclic triterpenes (TTPC) friedelan: friedelin (5), 3β−friedelinol (6), 3α-friedelinol (7), 28-hydroxy-3-oxo-friedelan (canophyllol, 13), 3β,16β- dihydroxy friedelan (pachysandiol B, 14), 3β,24-dihydroxyfriedelan (15) and 3β,24-diacetoxyfriedelan (15a). Compounds 14 and 15 were isolated for the first from the Celastraceae family. Two TTPC lupanes were also isolated: 3β-lup-20(29)-en-3-ol (lupeol, 8) and 3β-lup-20(29)-en-3-ila acetate (9); as well as the isomer mixture 3β-estearyloxy-olean-12-eno (10) and 3β-estearyloxy-urs-12-eno (11). TTPC 11 a β- amyrin (12), β- sitosterol (16) and eicosanoic acid (17) were also isolated pure in hexane or ethyl acetate extracts. By means of GC-MS seven monosaccharides (18) were detected and galactitol (19) was isolated pure in methanol/water extracts, which allowed to obtain the derivative 1,2,3,4,5,6-hexa-galactitol acetate (19a). The polymer 3 was used to formulate antibiotic and antiseptic products for use in dentistry, which generated a request for patent registration by UFMG. In biological tests, the methanol extract showed significant analgesic activity in mice; however, in microbial and cytotoxic tests the extracts of leaves showed no toxic or inhibitory action against tumor cells (MCF-7, TK10 and UACC-62), micro-organisms (bacteria and Candida species), or the protozoan leishmaniasis. However, in tests with solutions of 19a on chloroplasts from Spinacia oleracea L. we observed an inhibition of ATP synthesis which indicated that 19a can be a model for herbicides synthesis. In capture tests of DPPH free radicals in solution, glycosides 21 and 22 showed good activity and 23 showed immunomodulating effects in tests of proliferation of mononuclear cells from human blood. In light of the results, considering the diversity of the obtained compounds, it was possible to visualize the great chemical and pharmacological potential of Maytenus acanthophylla and to recognize, through scientific means, the validity of using its leaves in popular medicine. Capítulo 1 Introdução 1 Oliveira, DM (2012) NEPLAM – DQ-ICEx - UFMG 1 INTRODUÇÃO Oliveira, DM 2012 Capítulo 1 Introdução 2 Oliveira, DM (2012) QUÍMICA DE PRODUTOS NATURAIS: 50 ANOS DE PESQUISAS Na tentativa de esclarecer o porquê das plantas sintetizarem uma imensa e rica diversidade de metabólitos secundários compreendendo mais de 200.000 substâncias, Hartmann1 apresentou uma revisão bem estruturada sobre os avanços na área da pesquisa envolvendo o metabolismo secundário, ou melhor, o metabolismo especial das plantas. Hartmann, nesse artigo, nos conduz pelo caminho que culminou com uma importante mudança paradigmática ocorrida nos últimos 50 anos de intensa atividade de pesquisa científica envolvendo o estudo químico e fisiológico das plantas. Até 1980, os aspectos funcionais do metabolismo secundário das plantas foram amplamente ignorados por fitoquímicos e fisiologistas vegetais, pois eles achavam que os metabólitos secundários, aqueles que não eram utilizados pela planta no seu desenvolvimento individual, eram desnecessários, dejetos do metabolismo principal. A ideia de que existia uma função ecológica para o metabolismo especial das plantas apareceu ainda no século 19 com Stahl.2 Em 1959, o entomologista Fraenkel apud Hartmann, redescobriu o artigo de Stahl, e apresentou os resultados de experimentos sobre a proteção química exercida por plantas contra animais herbívoros, tais como, lesmas e caracóis (gastrópodes). Nesse artigo, Stahl concluiu que os compostos químicos secundários das plantas se formavam gradativamente, conforme a pressão seletiva de herbívoros sobre as mesmas. Após a republicação do artigo de Stahl, houve um interesse crescente pelo estudo do metabolismo especial das plantas até que, em 1971, Swain e Harbone apud Hartmann1, na Europa, organizaram o primeiro Simpósio da Phytochemical Society sobre o tema “Ecologia Fitoquímica” e, a partir desse evento, cresceram significativamente as pesquisas relacionadas a esta área. A Figura 1.1 ilustra os aspectos funcionais do metabolismo secundário das plantas em seu relacionamento ecológico natural. Figura 1.1: Funções ecológicas do metabolismo secundário de plantas, adaptada do artigo escrito por Hartmann.1 Capítulo 1 Introdução 3 Oliveira, DM (2012) No Brasil as pesquisas sobre o metabolismo de plantas e seus constituintes químicos teve como precursor o Professor Otto Gottlieb, cientista tcheco de nascimento, naturalizado brasileiro.3 Gottlieb figura como uma das mais influentes personalidades na Química Orgânica e na Química de Produtos Naturais no Brasil. A partir dos anos 60, esse cientista desenvolveu um intenso interesse na diversidade molecular da rica flora brasileira, e se tornou o pioneiro na introdução da Fitoquímica como uma das disciplinas mais importantes do contexto científico do Brasil. Por suas contribuições relevantes para o nosso conhecimento de ecogeografia, evolução e sistemática dos metabólitos secundários de plantas, foi agraciado com o prêmio Pergamon Phytochemistry Prize em 1992, além do que duas edições da revista Phytochemistry foram dedicadas a ele por ocasião do seu 80º aniversário no ano 2000. Um grande número de cientistas em atividade na área de Química dos Produtos Naturais no Brasil foi orientado, direta ou indiretamente, por ele. A influência de Gottlieb sobre a Ciência brasileira pode ser medida a partir da campanha realizada pela comunidade científica brasileira para promover sua indicação ao Prêmio Nobel em 1999.5 Após 50 anos de pesquisas científicas, a Química de Produtos Naturais (QPN) transformou-se em uma disciplina consistente e importante no cenário científico mundial, no qual o Brasil se acha inserido e satisfatoriamente representado. A QPN poderia estar em melhores condições caso não tivesse havido intervenções desastrosas do governo, na década de 70, a exemplo da extinção do antigo Instituto de Química Agrícola, IQA, fundado em 1918 no Rio de Janeiro, vinculado ao Ministério da Agricultura, Indústria e Comércio, órgão respeitado internacionalmente pela qualidade de suas pesquisas.6 Em entrevista à revista Ciência Hoje, publicada em outubro de 1988, Gottlieb comentou: “(...) Assistimos pasmos e indefesos, à evasão de nosso material vegetal para os EUA, Japão, Suíça e Alemanha.” e complementa, “Aqui (no Brasil) a Química de Produtos Naturais hoje é campo de treinamento de alunos de pós-graduação em busca de um título universitário”.6 Na verdade, raras as exceções, essas constatações são verdadeiras ainda hoje. Agora, encontramos-nos na eminência para uma nova mudança paradigmática que reformule o nosso modo de fazer Ciência e gerir o objeto de nossa atividade científica – os recursos naturais. Existe a necessidade de que essa mudança traga desenvolvimento sustentado, juntamente com a consolidação da Fitoquímica brasileira, não só para continuar a produzir conhecimento científico, mas sendo a um tempo aliada da preservação ambiental e do incentivo ao aparecimento de novos produtos químicos, farmacêuticos e tecnológicos. Capítulo 1 Introdução 4 Oliveira, DM (2012) A FAMÍLIA CELASTRACEAE A família botânica Celastraceae é composta de 98 gêneros e cerca de 1300 espécies de hábitos arbustivos e arbóreos.7 Família cosmopolita cujas espécies são distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais.8 No Brasil, foram relatados quatro gêneros da família Celastraceae: Maytenus Juss., Goupia Reissek, Austroplenckia Lund. e Fraunhofera Mart. e mais recentemente, o gênero Salacia (subfamília Hippocrateaceae).9 As plantas desses gêneros ocorrem de norte a sul do país, principalmente na faixa territorial próxima ao litoral, havendo espécies endêmicas e outras de ocorrência mais generalizada.10 O gênero Maytenus Molina emend Molina é um dos maiores da família Celastraceae, abrangendo 200 espécies. Esse gênero é predominantemente sulamericano e muitas de suas espécies são usadas na medicina popular da América do Sul na forma de infusões ou decocções, devido às suas atividades analgésica, anti-inflamatória e antiulcerogênica. No Brasil é encontrado o maior centro de diversidade específica do gênero10 e algumas dessas plantas, utilizadas na etnomedicina brasileira encontram-se relacionadas na Tabela 1.1. Diversas espécies de Maytenus já foram estudadas e tiveram suas atividades farmacológicas comprovadas.14 Tabela 1.1: Plantas do gênero Maytenus utilizadas na etnomedicina brasileira Espécie Nome Popular Parte Forma/uso Indicação/Ação ref M. acanthophylla Espinheira santa Folhas Decocção/oral Gastrite, úlcera. 13 Pau-de-jararaca Folhas Infusão/oral Digestivo, antisséptico, anti- inflamatória. 13 Folhas Decocção/banho Infecções urogenitais. 13 M. aquifolium Espinheira santa Folhas Decocção/oral Analgésica e Antiulcerogênica. 14 M. boaria Coração de bugre Folhas Chá/oral Febre. 15 M. ilicifolia Espinheira santa Folhas Decocção/oral Gastrite, úlcera. 16, 17 Espinhos-de-deus Folhas Infusão ou decocção/oral Reumatismo, febre, Distúrbios gastrointestinais. 18 Folhas Decocção/oral Digestivo e antiespasmódico. 19 Raiz Decocção/oral Contraceptivo. 20 Folhas Decocção/oral Anticâncerigeno. 21 Flores Decocção/oral Anti-inflamatório. 22 M. obtusifolia Carne-de-anta; Carrancudo; Bom- nome Folhas Decocção/oral Úlceras, inflamações. Câncer. 12 M. rigida Bom-homem, Pau-de-colher Casca do Caule Decocção/oral Anti-inflamatória, antiúlcera. Antidiarréica. 23 M. robusta Piriquiteira15 Folhas Decocção/oral Úlceras estomacais. 24 M. salicifolia Cafezinho Folhas Decocção/banho Pruridos e alergias cutâneas. 25 Folhas Decocção/oral Úlceras estomacais. 25 M. truncata Espinheira santa Folhas Decocção/oral Gastrite, úlceras. Anti-inflamatória. 26, 27 Capítulo 1 Introdução 5 Oliveira, DM (2012) Constituintes químicos do gênero Maytenus Estudos fitoquímicos disponíveis na literatura mostram que o metabolismo secundário de espécies do gênero Maytenus possui uma grande variedade de compostos, vários destes pertencentes à classe dos sesquiterpenos agarofurânicos8, bem como à classe dos triterpenos pentacíclicos (TTPC), principalmente os das séries dos friedelanos, lupanos, ursanos, oleananos e quinonametídeos.28-36 Desse gênero, também foram isolados taninos condensados37, flavonóides38-42 e alcaloides sesquiterpênicos.20,43-46 O conteúdo relativo de TTPC’s isolados em espécies Maytenus, nos últimos 20 anos, por pesquisadores do grupo de pesquisa do NEPLAM/UFMG foi de aproximadamente 40% de friedelanos, 23% de lupanos, 15% de ursanos, 11% de oleananos, 6% de quinonametídeos, 2% de taraxaranos e 2,1% de dímeros de TTPC. Os TTPC’s quinonametídeos isolados ocorreram exclusivamente nas raízes das plantas estudadas (Figura 1.2). Friedelanos, 40% Diméricos, 2% Taraxaranos, 2% Quinonametídeos, 6% Ursanos, 15% Lupanos, 23% Oleananos, 11% Figura 1.2: Quantidades relativas de TTPC’s isolados de Maytenus no NEPLAM/ICEx/UFMG. Fontes: Teses do NEPLAM/ICEx/UFMG (1990-2009) e site: zeus.qui.ufmg.br/~neplam/celastraceae.html. Diversos TTPC’s apresentaram importantes atividades biológicas, a exemplo, o ácido 22α-hidroxi-olean-12-en-3-oxo-29-óico (ácido triptotriterpenóico A, Figura 1.3, pág. 6), isolado de Maytenus macrocarpa, com forte atividade anti-HIV (EC50 de 1 μg/mL índice de seletividade de 35).47 Derivados do lupano, a exemplo do ácido betulínico (Figura 1.3, pág. 6), apresentaram atividades contra o vírus HIV, citotóxica contra diversas células tumorais48,49 e anti-malária.50 Alguns desses TTPC’s lupanos, dentre eles o composto rigidenol (11α- hidroxilup-20(29)-en-3-ona), também isolado da raiz de M. acanthophylla, apresentaram potente atividade anti-inflamatória, inibindo a produção de óxido nítrico e prostaglandina E2 em ratos.51 Dois TTPC’s oleananos, os ácidos oleanólico e ursólico (Figura 1.3, pág. 6), Capítulo 1 Introdução 6 Oliveira, DM (2012) apresentaram um número surpreendente de ações farmacológicas. Esses ácidos, e alguns de seus derivados semi-sintéticos, foram ativos contra cerca de 15 linhagens de células tumorais humanas. Os pesquisadores observaram, através da relação estrutura/atividade, que esses TTPC’s foram mais potentes quando apresentaram o esqueleto ursano associado a grupos formadores de ligações de hidrogênio nos carbonos C-3 e C-28.52 Os TTPC’s quinonametídeos isolados de Maytenus também mostraram uma variedade de atividades farmacológicas, tais como antimicrobiana, antioxidante, antimalárica e citotóxica.53,54 Por exemplo, o TTPC quinonóide pristimerina (3-hidroxi-2-oxo-24-nor-friedelan-1-,10,3,5,7- tetraen-20α-oato de metila), em baixas concentrações (CI50: 0,2–0,3 μmol.L-1), inibiu a ação da proteína NO-sintase induzida (iNOS), relacionada à produção de óxido nítrico em processos inflamatórios.55 Em estudo mais recente, a pristimerina apresentou citotoxidade frente às várias linhagens de células cancerosas e atividade antiploriferativa contra células tumorais humanas do tipo HL-60 (leucemia promielocítica).56 1 3 9 6 12 15 28 O 25 23 27 2119 30 COOH 29 OH 1 3 9 6 12 17 15 19 28 O OH OH 25 23 27 29 30 10 1 3 8 6 13 11 17 15 21 19 R 29R1 30 28 O OH O 25 23 27 Ácido triptotriterpenóico A (Oleanano) Ácido betulínico (Lupano) Ác. oleanólico R= H; R1 = CH3 Ác. ursólico R= CH3; R1 = H (ursanos) Figura 1.3: Estruturas químicas de alguns TTPC’s bioativos isolados de Maytenus sp. A partir de plantas do gênero Maytenus que ocorrem no Brasil, foram isolados vários compostos polifenólicos identificados como catequinas, proantocianidinas e alguns flavonóides glicosilados, que apresentam as geninas correspondentes ao canferol e à quercetina (Figura 1.4, p.7). De um modo geral, a literatura relata que todos esses flavonóides apresentaram propriedade antioxidante e outras, tais como anti-inflamatória, antibacteriana, antiviral, atividades antitumorais e contra lesões gástricas.57-59 Esses flavonóides conferem grande importância farmacológica às espécies desse gênero. A literatura apresenta os resultados de avaliações da atividade antiulcerogênica de partes aéreas das espécies brasileiras Maytenus, M. truncata, M. aquifolium, M. ilicifolia, M. obtusifolia, M. rigida e M. robusta, Capítulo 1 Introdução 7 Oliveira, DM (2012) em que, seus extratos aquosos ou hidroalcoólicos, ricos em flavonóides, exibem significativos efeitos de proteção antiúlcera ou cicatrizante em lesões da mucosa gástrica de animais de laboratório.12,14,24,26,40,60-63 Alguns desses estudos indicaram que os efeitos gastroprotetores das frações ricas em flavonóides das Maytenus envolvem a ativação de fatores de proteção e de redução da acidez da secreção gástrica.24,61,63 Os resultados desses estudos, sobre atividade antiúlcera, contribuem para a validação farmacológica e corroboram as indicações da etnomedicina dessas espécies. Flavonoide EspécieRef Flavonoide EspécieRef O OH OH OH OH HO M. aquifolium 59 M. imbricata 64,65 O OH HO OH O O-Gli(-Ram-Gli)-Ram M. salicifolia 25 Epicatequina 3-O-α-L-ramnopiranosil(1→6)-O-[α-L-glicopiranosil (1→3)-O-α- L-ramnopiranosil(1→2)]-O-β-D-glicopiranosídeo de canferol O OH OCH3 OH OH OH HO M. acanthophylla 29 M. aquifolium 59 M. obtusifolia 66 M. truncata 27 M. salicifolia 25 O OH HO OH O O-Gal(-Ram)-Ram-Gli R M. aquifolium 38,59 M. ilicifolia 38 M. truncata 67 4’-O-metilepigalocatequina 3-O-α-L-ramnopiranosil(1→6)-O-[β-D-glicopiranosil (1→3)-O-α- L-ramnopiranosil(1→2)]-O-β-D-galactopira-nosídeos de canferol (R=H) e de quercetina (R=OH) O O OCH3 OH OH O OH HO M. truncata 27 O OH HO OH O O-Gal(-Ram)-Ram R M. aquifolium 38 M. ilicifolia 38 3-O-acetil-4’-O-metilepigalocatequina 3-O-α-L-ramnopiranosil(1→6)-O-[L-ramnopiranosil (1→2)]-O-β- D-galactopiranosídeos de canferol (R=H) e de quercetina (R=OH) O O HO OH HO OH OH OH OH OH OCH3OH M. aquifolium 59 M. obtusifolia 66 M. truncata 27 M. salicifolia 25 O OH HO OH O O-Gal-Ram M. aquifolium 38 M. ilicifolia 38 Proantocianidina B 3-O-α-L-ramnopiranosil(1→2)-O-β-D-galactopiranosídeo de canferol O OH HO OH O O-Gal(-Ram)-Ram-Ar M. acanthophylla 68 M. aquifolium 38 M. ilicifolia 38 O OH OH HO O O O OH OH OH HO M. salicifolia 25 3-O-α-L-ramnopiranosil(1→6)-O-[α-L-arabinopira- nosil(1→3)-O- α-L-ramnopiranosil (1→2)]-O-b -D- galactopiranosideo de canferol 3-O-β-glicopiranosídeo de canferol Figura 1.4: Flavonoides isolados de espécies Maytenus (Brasil). Capítulo 1 Introdução 8 Oliveira, DM (2012) Maytenus acanthophylla Reissek M. acanthophylla (Figura 1.5) se apresenta como arbusto ou árvore de cerca de 3,0 m de altura. Os ramos novos são glabros e quadrangulares; as folhas são coriáceas de forma estreitamente elíptica ou oblongo-elíptica; limbo de 7,4 a 15,2 cm de comprimento e 2,3 a 4,2 cm de largura; margem com muitos espinhos, serrada. Inflorescência em fascículos com nodosidade.10 Carvalho-Okano relatou que M. acanthophylla ocorre na região do entorno e no interior da Chapada Diamantina na Bahia, e também no Norte de Minas Gerais.10 Na Bahia, M. acanthophylla não é uma planta domesticada, e a sua obtenção para uso na etnomedicina é baseada em extrativismo não comercial feito por comunidades rurais isoladas e vilarejos. Figura 1.5: Aspecto da morfologia externa dos ramos e frutos de M. acanthophylla (ilustração gentilmente cedida por Carvalho-Okano).10 Atualmente, os espécimes do gênero Maytenus estão distribuídos por pequenas reservas de vegetação nativa em fazendas do Município de Maracás (conhecida popularmente como “espinheira-santa”) e na área inserida no perímetro da reserva natural do Parque Nacional da Chapada Diamantina, onde pode ser encontrada com o nome popular de “pau-de-jararaca”.10 Na lista de plantas ameaçadas, M. acanthophylla foi considerada vulnerável à extinção devido Capítulo 1 Introdução 9 Oliveira, DM (2012) à baixa frequência na área de ocorrência da Bahia e considerada extinta do ecossistema vegetal do Estado de Minas Gerais.69 A infusão das folhas dessa planta é bastante utilizada na medicina popular no tratamento de úlceras, gastrites, tumores e como anti-inflamatório em “doenças de mulheres”.13 De modo semelhante, também ocorre na medicina tradicional do Sudeste e Sul no Brasil com as espécies M. aquifolium e M. ilicifolia. As espécies M. acanthophylla e M. truncata são também chamadas popularmente de “espinheira-santa” e têm similares aplicações na etnomedicina.29 A espécie M. acanthophylla é a espinheira-santa do Nordeste brasileiro, que apresenta uma boa semelhança à M. ilicifolia (Figura 1.6). Carvalho-Okano11 relatou que M. acanthophylla pode ser confundida com M. ilicifolia e que a distinção entre as duas espécies pode ser feita através dos frutos. Os de M. acanthophylla são tetrágonos e os de M. ilicifolia são orbiculares. (a) (b) (c) (d) (e) (f) Figura 1.6: Aspectos das folhas [(a) e (b)] e dos frutos (c) de M. acanthophylla. Aspectos das folhas [(d) e (e)] e dos frutos (f) de M. ilicifolia. Fotos (a) e (d): florabrasiliensis.cria.org.br (25/08/2009); (b), (c), e (e): próprias; (f): Fernanda Marques/Ciencia Hoje online (19/08/09). Classificação botânica Capítulo 1 Introdução 10 Oliveira, DM (2012) A classificação botânica da espécie Maytenus acanthophylla Reissek, mostrada na Figura 1.7 (abaixo), está de acordo com os sistemas taxonômicos de Cronquist (1988)70 e Takhtajan (1967).71 Figura 1.7: Classificação botânica de Maytenus acanthophylla Reissek segundo os sistemas de Cronquist e Takhtajan.70,71 O estudo fitoquímico de raízes de M. acanthophylla53, realizado previamente, revelou a presença de metabólitos, que normalmente ocorrem em plantas, como o composto β-sitosterol e o ácido graxo oléico; mostrou também constituintes comuns ao gênero Maytenus, como os TTPC’s das classes lupanos, oleananos, ursanos e quinonametídeos e também o isolamento do biopolímero 1,4-trans-poliisopreno (guta-percha) (Figura 1.8, p.11). O biopolímero guta-percha, encontrado em M. acanthophylla, também foi identificado em outras espécies Maytenus, que apresentam folhas coriáceas e ocorrem em regiões tipicamente tropicais ou semi-áridas, a exemplo de M. salicifolia Reissek25, M. phyllanthoides Benth (guttapercha-mayten ou Maytenus texana)72 e Maytenus truncata Reissek.27 Com relação às espécies brasileiras M. truncata e M. acanthophylla, foi observado neste trabalho Domínio Eukaryota Reino Plantae Filo Tracheophyta Subfilo Sub-reino Viridaeplantae Euphyllophytina Infrafilo (Plantas vasculares) (Plantas verdes) Magnoliopsida Radiatopses Classe (Dicotiledóneas) Subclasse Rosidae Superordem [Takhtajan] Celastranae Ordem Celastrales Família Celastralceae [Brown] (doce-amago) Gênero Maytenus [Molina] Epíteto específico acanthophylla [Reissek] Nome botânico Maytenus acanthophylla [Reissek] Capítulo 1 Introdução 11 Oliveira, DM (2012) que o grau de rigidez de suas folhas parece guardar alguma correlação com a ocorrência e a quantidade de guta-percha. 1 18 H OHO HH CH3 α β δ γ ε 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 20 22 23 24 27 28 29 25 26 21 H 19 18 H OH 17 16 15 1,4-transpoliisopreno ácido oléico β-sitosterol 3 4 O 1 6 1' 2' 6' OH OH O OH OH CH3 OH 4'-O-metil-(−)-epigalocatequina 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 16 17 18 22 21 2019 25 27 26 OH 30 29 O OH 23 26 O 20-hidroxi-20-epi-tingenona 1 2 3 4 5 6 OH OH OH OH OH OH galactitol 28 10 5 1 4 2 3 9 8 6 7 11 12 14 13 15 16 18 17 2324 25 26 27 19 22 21 H 2029 30 O OH rigidenol 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 16 17 18 22 212019 25 27 26 30 COOCH3 29 O OH 23 26 pristimerina 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 16 17 18 22 21 2019 25 27 26 30 H O OH 23 26 O tingenona 28 10 5 1 4 2 3 9 8 6 7 11 12 14 13 15 16 18 17 2324 25 26 27 19 22 21 H 2029 30 OH OH nepeticina 28 10 5 1 3 12 14 16 24 25 26 OH H 21 22 2019 30 27 23 29 olean-9(11):12-dien-3β-ol 28 10 5 1 5 3 9 12 14 16 19 24 25 26 OH H 21 22 20 19 30 27 29 23 ursa-9(11):12-dien-3β-ol Figura 1.8: Constituintes químicos isolados de raiz de M. acanthophylla Reissek.29 Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 12 NEPLAM – DQ-ICEx - UFMG 2 Parte Experimental Oliveira, DM 2012 Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 13 MATERIAIS E MÉTODOS Foi adotada como critério de pureza a visualização de uma única mancha em cromatoplaca obtida por cromatografia em camada delgada (CCD), utilizando eluentes com diferentes polaridades e pelo menos dois tipos de reveladores. Na preparação das cromatoplacas utilizou-se suspensão de sílica gel Merck 60 G em água [7 g para 15 mL (p/v)], formando camada de 0,25 mm de espessura, sobre suporte de vidro. Após secagem parcial a temperatura ambiente, as placas foram ativadas em estufa a 100 °C por 60 minutos. Como reveladores de cromatoplacas utilizaram-se luz ultravioleta, iodo e pulverização com solução de vanilina em álcool etílico (1:99) com ácido perclórico em água (3:97), misturadas na proporção de 1:1 v/v, seguida de aquecimento em estufa a 100 °C. As placas de cromatografia em camada preparativa (CCP) de sílica gel foram preparadas com 0,5 mm de espessura. Algumas colunas especiais foram empacotadas com uma mistura de sílica gel 60 e nitrato de prata na proporção de 1-2% p/p (sílica-NP). A mistura sílica-NP foi preparada conforme protocolo encontrado na literatura.73 Nos processos de cromatografia em coluna utilizando-se sílica gel Merck 60 (70-230 Mesh), foi adotada a proporção média de 1 g de extrato para 50 g de fase estacionária para as colunas de fracionamento do extrato. A proporção aproximada de 1 g de amostra até 100 g de fase estacionária foi utilizada na fase de purificação. A mesma proporção de 1/100 foi utilizada também em relação às colunas contendo Sephadex LH-20 Sigma e fluorisil Merck. Os solventes utilizados nos processos de cromatografia em coluna foram todos de grau analítico (P.A.) e previamente destilados quando necessário. Os extratos das folhas obtidos com metanol foram filtrados em colunas de Sephadex LH 20 (Amersham Biosciences) eluídas com etanol ou misturas desses solventes com água; analisadas por CCD, concentradas em centrífuga a vácuo (speed-vac). Na cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), as frações obtidas nas partições e processos de fracionamento foram analisadas em cromatógrafo Shimadzu (Princeton, NJ, USA), bomba LC10A, detector com fotodiodo SPD-M10A, CBM 10A, utilizando-se diferentes fases estacionárias, diversas misturas de solventes como eluente e diferentes comprimentos de onda (λ). Após a determinação das melhores condições de separação (fase estacionária, λ, tempo de análise e eluente), as amostras foram refracionadas no cromatógrafo Shimadzu, bomba LC 6AD, detector no UV SPD-10A em dois comprimentos de onda, λ, utilizando coluna semi-preparativa Shim-pack ODS (5 µm, 20 x 250 mm). As frações foram coletadas por pico e por volume, de Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 14 modo que cada pico foi recolhido separadamente. As frações obtidas foram analisadas por CCD e reagrupadas segundo os perfis cromatográficos. Os equipamentos utilizados no processo de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) são pertencentes ao LQPN, do CPQRR/Fio Cruz-BH. Pontos de fusão, obtidos em graus Celsius, foram determinados em aparelho Metler FP82 equipado com processador Metler FP800, pertencente ao DQ/ICEx da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Foi utilizado um espectrômetro de massas com ionização por eletrospray com quadrupolo e armadilha de íons, modelo LCQ Advantage, Thermo-Finnigan (San Jose, CA, USA) pertencente ao LQPN, do CPQRR/Fio Cruz-BH. Os espectros de massas foram obtidos nos modos positivo e negativo, na faixa de m/z 100-2000 Da. Os parâmetros utilizados foram: solução das amostras 500 µg/mL; temperatura do capilar 200º C; voltagem do capilar 10 V; corrente do spray 1 µA; voltagem do spray 4,5 kV no modo positivo e 3,0 kV no modo negativo; fluxo de nitrogênio de 20 L/h; energia de colisão 20-50%; fluxo da infusão 2,5 μL/min. Para a análise de CLAE-EM foi utilizado um cromatógrafo Shimadzu com detector UV- VIS e sistema eluente constituído de 30% ACN/H2O com 0,1% de ácido fórmico em 40 min. do LQPN, CPQRR/Fio Cruz-BH. O sistema foi acoplado ao espectrômetro de massas descrito acima, utilizando método desenvolvido no LQPN. Nesse método o espectro de massas foi registrado, sendo os picos com intensidade superior a 105 aprisionados na armadilha de íons e fragmentados para obtenção de espectros de MS/MS até no máximo MS5. As soluções das amostras foram preparadas a 5 mg/mL, injetando-se 20 µL. Foram obtidos espectros nos modos positivo e negativo. Para as análises na região de UV-visível, foi utilizado espectrofotômetro Beckman DU Série 600, pertencente ao LQPN do CPQRR/Fio Cruz-BH. Foram preparadas soluções dos flavonoides obtidos a 1% m/v em MeOH grau espectroscópico. Os reagentes para deslocamento foram preparados conforme proposto por Mabry e colaboradores (1970):74 ∗ NaOMe: 2,5 g de sódio metálico foram adicionados cautelosamente em 100 mL de MeOH. ∗ AlCl3: 5 g de AlCl3 anidro (amarelo-esverdeado) foram adicionados aos poucos a 100 mL de MeOH. Aguardou-se 24 h para utilização. Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 15 ∗ HCl: 50 mL de HCl concentrado foram adicionados lentamente a 100 mL de água destilada. ∗ NaOAc: foi utilizado o pó anidro. ∗ H3BO3: procedimento I – foi utilizado o pó anidro, procedimento II – utilizou-se 100 mL de MeOH espectroscópico seco saturado com H3BO3. As etapas das análises foram realizadas também conforme proposto por Mabry e colaboradores (1970):74 1. Ajustou-se a transmitância para 100% na presença exclusiva do solvente (MeOH); a absorvância da solução da amostra (flavonoide) foi ajustada para que o pico mais intenso entre λ250 e λ400 nm tenha uma densidade óptica entre 0,6 e 0,8. 2. O espectro de metanol foi obtido fazendo-se uma varredura de 200 a 400 nm com velocidade de 120 nm/min. 3. Adicionaram-se 3 gotas da solução de NaOMe à cubeta da amostra e imediatamente registrou-se o espectro. Depois de 5 minutos, um novo espectro foi obtido para verificar decomposição da amostra. Descartou-se o líquido da cubeta. 4. Foi colocada nova solução da amostra na cubeta e adicionadas 6 gotas da solução de AlCl3, obtendo-se imediatamente o espectro. 5. À cubeta da etapa 5 foram adicionadas 3 gotas da solução de HCl e se obteve o espectro. O conteúdo da cubeta foi descartado. 6. Adicionou-se o pó anidro de NaOAc, agitou-se até a formação de uma camada de 2 mm de pó na borda da cubeta preenchida com a solução da amostra. Os espectros foram obtidos após 2 e 10 min do preparo. 7. (a) Se não foi observada decomposição da amostra na etapa 7, a cubeta foi saturada com H3BO3, agitada, o espectro obtido e a solução descartada; (b) se foi observada decomposição na etapa 7, foi colocada nova solução da amostra na cubeta, adicionadas 5 gotas da solução de H3BO3 e pó de NaOAc até saturação. O espectro foi obtido imediatamente após a adição do acetato de sódio. Os espectros de absorção na região do infravermelho foram obtidos utilizando pastilhas de KBr [a 1 % (m/m)] ou em filme, quando necessário; em espectrômetro Shimadzu IR-408 do Departamento de Química, UFMG, ou em espectrômetro Perkin Elmer Spectrum one FTIR- Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 16 ATR da Faculdade de Farmácia da UFMG, por inserção direta da amostra, sem preparo de película ou pastilha de KBr. Os espectros de RMN de 1H e de 13C foram obtidos em espectrômetro Bruker AVANCE DRX-400 ou em Bruker AVANCE DPX-200, do Laboratório de Ressonância Magnética Nuclear de Alta Resolução (LAREMAR) do Departamento de Química, UFMG. Nos experimentos de RMN, foi utilizado como referencial interno o sinal do tetrametilsilano (TMS). Os solventes deuterados utilizados encontram-se indicados em cada caso. Os deslocamentos químicos (δ) são expressos em partes por milhão (ppm) e as constantes de acoplamento (J), em Hertz (Hz). As análises por cromatografia gasosa foram realizadas utilizando equipamento Varian modelo CP-3380 do Departamento de Química, UFMG. As análises dos ésteres triterpênicos por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas foram realizadas em aparelho Shimadzu, modelo CG-17A-CG-MS QP5050, equipado com coluna cromatográfica DB-5 de 30 m de comprimento e 0,25 mm de diâmetro interno e 0,5 µm de espessura do filme, pertencentes ao LQPN, do CPQRR/Fio Cruz-BH. As condições usadas foram temperatura de 220 °C no injetor e 240 °C no detector. A programação da temperatura de realização das análises foi de 60 °C a 290 °C, aquecimento de 3 °C por minuto durante 25 min. O fluxo do gás foi de 1,0 mL/min. A faixa de análise do espectrômetro de massas foi de 30 a 700 Da. Situações onde foram utilizadas condições diferentes encontram-se especificadas em cada caso. ESTUDO FITOQUÍMICO Partes aéreas de Maytenus acanthophylla, incluindo folhas, frutos e caule foram coletados a partir de dois exemplares da planta encontrados na zona rural da localidade de Pé de Serra, no município de Maracás, Bahia. Amostras do material coletado foram identificadas pela Profa. Dra Rita Maria Carvalho-Okano, do Departamento de Botânica da Universidade Federal de Viçosa (UFV) e pela Profa. Maria Cristina Teixeira, do Departamento de Botânica da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP). Uma exsicata foi depositada no herbário da UFV (VIC-27.182) e outra na UFOP (OUPR-15532). Após a coleta, as folhas foram separadas dos galhos e postas a secar juntamente com os frutos maduros em área ventilada, à temperatura ambiente. As folhas, depois de secas, foram moídas e renderam cerca de 4,0 kg. Os frutos secos foram separados das sementes e as cascas foram desprezadas. As sementes secas resultaram em 28,0 g. Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 17 Preparo dos extratos das folhas A partir de 2,8 kg de folhas moídas, foram preparados extratos por macerações com solventes orgânicos, obedecendo à seguinte ordem: hexano, acetato de etila, metanol e metanol- água (1:1). As extrações processadas à temperatura ambiente (t.a.), durante sete dias, em média, as quais produziram os seguintes extratos: em hexano, FHEMA e SHEMA; em acetato de etila, FAEMA; em metanol, FOMMA e SEMA, e em metanol-água (1:1), FAMMA (Esquema 2.1). Folhas moídas (2,8 kg) 1 - 1a. extração por maceração em hexano (t.a.) filtração a vácuo evaporação parcial do solvente (70%) fase líquida resíduo da 3a. extração (2,50 kg) 2 - filtração formação de fase sólida 1 - 2a. extração por maceração em acetato de etila (t.a.) 2 - filtração fase líquida evaporação do solvente FHEMA (39,0 g) fase sólida. evaporação do solventeresíduo da 2a. extração fase líquida FAEMA (41,0 g) resíduo da 1a. extração SHEMA (12,2 g) fase líquida FOMMA (55,0 g) 1 - 3a. extração por maceração em metanol (t.a.) 2 - filtração fase líquida evaporação do solvente 1 - 4a. extração por maceração em metanol-água (1:1) (t.a.) 2 - filtração resíduo da 4a. extração evaporação do solvente FAMMA (41,9 g) fase sólida SEMA (5,5 g) Esquema 2.1: Preparação dos extratos de folhas de M. acanthophylla. Extratos das sementes (HESMA) Uma parte equivalente a 10,0 g de sementes de M. acanthophylla foi submetida à extração por maceração com hexano (t.a.), durante uma semana. Após a remoção do solvente por evaporação, o extrato obtido (HESMA 5,5 g) se apresentou como um óleo verde-amarelado como o de oliva (Olea europaea L.) e aroma imitando o óleo de sementes de amendoim (Arachis hypogaea). Na parte inferior dessa fase oleosa, uma porção de um sólido branco aparecia como Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 18 precipitado. O conteúdo em óleo foi medido em, aproximadamente, 37% (v/v) da massa inicial de sementes. O extrato foi analisado preliminarmente por CGAR e apresentou uma composição predominante em ácidos graxos comestíveis, guardando boa semelhança ao óleo de oliva, principalmente em relação a presença dos ácidos esteárico, oléico, e linoléico (C-18, C-18:1 e C- 18:2). Este material oleaginoso foi reservado para estudo posterior. Preparo do extrato rico em guta-percha (GHEMA) Visando a obtenção de uma quantidade maior do biopolímero 1,4-trans-poliisopreno (guta- percha, isolado anteriormente nas raízes)29 para poder avaliar a distribuição de massa desse constituinte em M. acanthophylla, foi preparado o extrato GHEMA (11,4 g), rico em guta-percha. Esse extrato foi obtido pela extração sólido-líquido, sob-refluxo brando por 120 horas, utilizando um aparelho extrator de Soxhlet (Esquema 2.2). O extrato FHEQM foi reservado para estudo posterior. Folhas moídas (645,0 g) 1 - 1a. extração com hexano por aparelho de Soxhlet (120 h) 2 - filtração 1 - remoção parcial do solvente (~70%) fase líquida 2 - adição de metanol até coagular guta-percha fase líquida remoção do solvente FHEQM (23,1 g) fase sólida. GHEMA (11,4 g) resíduo (formação de fase sólida) 3 - filtração a vácuo Esquema 2.2: Roteiro para obtenção de extrato rico em guta-percha de folhas de M. acanthophylla (GHEMA). Fracionamento do extrato FHEMA O Esquema 2.3 sumaria as operações realizadas na elaboração fitoquímica do extrato hexânico das folhas de M. acanthophylla - FHEMA. No estudo fitoquímico do extrato FHEMA, foram elaboradas quatorze colunas cromatográficas, destas, oito resultaram em separações efetivas que levaram a isolamentos de constituintes químicos. A Tabela 2.1 (p. 20) mostra, sumariamente, o perfil das CCL utilizadas nos fracionamentos. Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 19 hexano-CHCl3 (3:7) FHEMA (20,5 g) HC ramificado (4a) álcool graxo (4b) n-alcanos (1) esqualeno (2) C-1, sílica gel 60 gradiente (gd1) G1 (F1-F2) G7 (F16) G6 (F15) G2 (F3-F4) G9 (F19-F20) G12 G11 (F22-F24) dcm-AcOEt (97:3) F25 F26 lupeol (8) 3β-esteariloxi-olean-12-eno (10) 3β-esteariloxi-urs-12-eno (11) sílica hex-AcOEt-iso- C3H7OH (95:5:0,5) C1-5 G8 (F17-F18) C1-4 sílica gradiente (gd4) friedelina (5) +β-friedelinol (6) hex-CHCl3-iso- C3H7OH (90:10:0,1) acetato de lupeoíla (9) hex-AcOEt-iso- C3H7OH (97:3:0,1) sílica C14-2 gd5 hex-CHCl3-iso- C3H7OH (80:20:0,5) hex-AcOEt-iso- C3H7OH (95:5:0,1) 3β-friedelinol (6) friedelina (5) sílica C14-1 hex-CHCl3-iso- C3H7OH (50:50:0,5) rec. rec. β-amirina (12) rec. hexano-AcOEt (9:1) sílica C1-2 gd2 sílica-N PC12-1 hex-CHCl3 (8:2) sílica-N PCCDP hex-CHCl3 (8:2) sílica/C1-3/gd3 água mãe 3β-esteariloxi-urs- 12-eno (11) hex-AcOEt-iso- C3H7OH (90:10:0,1) G10 (F21) friedelina (5) +β-friedelinol (6) 3β-friedelinol (6) rec. rec.1- Lav 2- Rec. Esquema 2.3: Fracionamento do extrato FHEMA. Tabela 2.1: Colunas de cromatografia líquida desenvolvidas no fracionamento de FHEMA CCL Tipo OD (cm) FE (massa, g) Sistema eluente (FM) Amostra (g) No. Frações (mL) C1 G 10 SG (512) Gradiente (gd1) 20,50 49 (200) C1-2 G 5 SG (180) Gradiente (gd2) 2,42 33 (50) C12-1 F 3 SG-NP (89) Isocrático (iso1) 0,55 38 (30) C1-3 G 3 SG (106) Gradiente (gd3) 0,54 139 (10) C1-4 G 3,5 SG (140) Gradiente (gd4) 2,01 117 (10) C14-1 F 1 SG (23) Isocrático (iso2) 0,11 128 (5) C14-2 G 3.5 SG (120) Gradiente (gd5) 0,95 120 (20) C1-5 G 3 SG (104) Gradiente (gd5) 0.88 53 (25) G: eluída por gravidade; F: média pressão ou flash; OD: diâmetro externo da coluna; FE: fase estacionária, SG: sílica gel 60; NP: nitrato de prata 1-2%; FM: fase móvel; As eluições por gradiente (gd) foram feitas com os seguintes solventes puros ou combinados: gd1: hexano (hex), clorofórmio, diclorometano (DCM), acetato de etila (AcOEt) e metanol; gd2: ciclo-hexano, acetato de etila e metanol; iso1: hexano:clorofórmio (8:2); gd3: hexano, diclorometano:isopropanol; gd4: hexano, clorofórmio e isopropanol; iso2: hexano:clorofórmio:isopropanol (90:10:0.1); gd5: hexano, acetato de etila, isopropanol. As proporções das misturas de solventes utilizadas nas eluições por gradiente foram indicadas na descrição do fracionamento por coluna cromatográfica. Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 20 Eluição da Coluna C-1 Parte do extrato bruto hexânico FHEMA (20,5 g), obtido das folhas de M. acanthophylla, após análises por CCD, foi aplicada em uma coluna de cromatografia líquida, CCL (φ = 10 cm) empacotada com 512 g de sílica gel 60 (C-1). Foram coletadas 49 frações de 200 mL cada. Os eluentes utilizados em C-1 foram hexano, clorofórmio, diclorometano, acetato de etila e metanol (gd1), em gradiente de polaridade (Tabela 2.2). Tabela 2.2: Frações obtidas de C-1 Sistema eluente Frações Hexano 100% F1 a F14 Hexano:CHCl3 [30:70] F15 a F25 DCM:acetato de etila [97:3] F26 a F32 Acetato de etila 100% puro F33 a F42 MeOH 100% puro F43 a F49 Agrupamento das frações de C-1 As frações coletadas em C-1 foram agrupadas segundo o perfil cromatográfico em CCD. Tabela 2.3: Agrupamentos e constituintes isolados das frações de C-1 de FHEMA Frações Grupo Massa (mg) Procedimentos Constituintes Identificação F1-F2 G1 700,0 Lav. com acetona (1) CGAR F3-F4 G2 161,0 Isolado puro (2) CG-EM, RMN F5-F7 G3 90,0 NE F8-F9 G4 950,0 NE ND F10-F14 G5 235,0 NE ND F15 G6 2420,0 C1-2, C12-1 e CCP C1-2 e C12-2 (11) (4a + 4b) RMN F16 G7 2870,0 Lav e rec com éter etílico (5 e 6) CCD, RMN C1-3 (10 + 11) RMN F17-F18 G8 2570,0 Lav e rec com éter etílico C1-4 e C14-2 C1-4 e C14-2 C1-4, C14-1 (5 + 6) (6) (5) (9) CCD CCD, RMN CCD, RMN RMN F19-F20 G9 100,0 Lav e rec com acetona (5 + 6) CCD F21 G10 160,0 Lav e rec com acetona (6) CCD F22-F24 G11 880,0 C1-5 (8) CCD, RMN F25-26 G12 302,0 Rec (acetona) (12) RMN F27-F49 G13- G18 5938,0 NE ND Lav: lavagem; Rec: recristalização; ND: não determinado; NE: não estudado; massa (mg). Mistura de n- alcanos (1); esqualeno (2); HC ramificado (4a); álcool graxo (4b); friedelina (5); β-friedelinol (6); lupeol (8); acetato de lupeoíla (9); 3β-alcanoiloxi-olean-12-eno (10); 3β-alcanoiloxi-urs-12-eno (11); β-amirina (12). Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 21 A Tabela 2.3, mostra os agrupamentos e os respectivos constituintes químicos isolados por grupo, bem como, o sumário das operações de fracionamento por CL e operações para purificação e isolamento dos referidos constituintes. Todos constituintes isolados, posteriormente, foram identificados por técnicas cromatográficas e espectrométricas. Não foram trabalhadas as frações que apresentaram o valor da razão entre a massa e o número de constituintes (complexidade avaliada por CCD) menor do que 5 mg/constituinte, ou quando as frações continham substâncias isoladas anteriormente em quantidades satisfatórias. Grupo G1 de C-1 (F1-F2, hexano puro) O material desse grupo (700 mg) foi dissolvido com hexano e, após precipitação com acetona, foi filtrado. O filtrado se apresentou como uma cera branca formada por escamas brilhantes (537,2 mg) que foi caracterizado por CGAR como uma mistura de n-alcanos (1), mediante a comparação com padrões de hidrocarbonetos isolados previamente da espécie Maytenus gonoclada.75 Grupo G2 de C-1 (F3-F4, hexano puro) Esse grupo apresentou um óleo amarelo esverdeado, bastante viscoso e solúvel em clorofórmio. Esse óleo, depois de analisado por CG-EM e RMN, foi identificado como sendo o triterpeno de cadeia aberta esqualeno (2; 161,0 mg). Grupo G6 de C-1 [(F15, hexano:clorofórmio (3:7)] O material desse grupo foi obtido como uma graxa amarelada (2,42 g), submetido a fracionamento cromatográfico por CCL (C1-2). As frações (F15-F18) (654,1 mg) coletadas de C1-2, quando eluídas com ciclo-hexano-acetato de etila (9:1), foram fracionadas em uma CCL tipo flash (C12-1), empacotada com sílica-AgNO3 2% (sílica-NP)73 e eluída com hexano:clorofórmio (8:2). As frações de F1 a F11 de C12-1 foram coletadas na forma de uma cera amarela (6,4 mg; P.F. ~50 oC), identificada por RMN como uma mistura de um HC ramificado (4a), tipo pristano, e um álcool graxo (4b). O grupo de frações de F12 a F33 (120 mg) de C12-1 foram purificadas por CCD preparativa, em duas placas (20 x 20 cm) revestidas por sílica gel 60G + NP e eluídas com hexano:clorofórmio (8:2). A fração de menor Rf (~ 0,55), após elaboração, apresentou um material graxo, macio e branco, identificado por métodos espectrométricos e por comparação com uma amostra autêntica isolada de M. salicifolia32 como o éster triterpeno-oleanano, 3β-esteariloxi-urs-12-eno (11; 9,3 mg). Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 22 Grupo G7 de C-1 [F16, hexano:clorofórmio (3:7)] Esse grupo apresentou um sólido (2,87 g) amarelo, que foi lavado com éter etílico e depois filtrado; um sólido branco recuperado na filtração foi identificado por CCD e análises espectrométricas (IV e RMN) como uma mistura (840,0 mg) de friedelina (5) e 3β-friedelinol (6). O respectivo sobrenadante da filtração de G7 (540,0 mg) foi fracionado por CCL (C1-3), empacotada com sílica gel 70-230 mesh (ASTM), utilizando gradiente de hexano:DCM:isopropanol. As frações 51 a 57, coletadas na eluíção correspondente a 90:10:0,1 do eluente, apresentaram um material pastoso com resultado positivo para o teste de Liebermann- Burchard. Esse material foi identificado como uma mistura (28 mg) de dois ésteres TTPC’s isômeros: 3β-esteariloxi-olean-12-eno (10) e 3β-esteariloxi-urs-12-eno (11). Grupo G8 de C-1 [F17-F18, hexano:clorofórmio (3:7)] O grupo G8 foi obtido como um material (2,52 g) amarelo e pastoso. Este material foi inicialmente lavado com acetato de etila e, após recristalização/filtração com acetona, foi obtido como um sólido cristalino (50,0 mg). A análise por CCD mostrou tratar-se de uma quantidade adicional da mistura de friedelina (5) e 3β-friedelinol (6). O sobrenadante recolhido da filtração anterior, após a eliminação do solvente, formou um sólido branco (2,01 g) que foi submetido a CCL (C1-4). O grupo de frações F44-F90, coletadas de C1-4 com hexano:clorofórmio:isopropanol (80:20:0,5), foi obtido como um material pastoso e amarelado que, ao ser recristalizado com acetona, revelou um sólido branco com teste positivo para TTPC. Este sólido (P.F. de 192,2-199,5 oC) foi elucidado como sendo o acetato de lupeoíla (9;, 558,5 mg). O grupo de frações F91-F100 de C1-4 (189,5 mg), obtido com hexano:clorofórmio:isopropanol (80:20:0,5), mostrou perfil em CCD similar ao do grupo F44- F90 de C1-4, entretanto, as várias tentativas de recristalização desse material não foram efetivas à sua purificação. Então, o sólido remanescente (109,0 mg) foi recolhido e aplicado a uma CCL tipo flash (C14-1) eluída com hexano:clorofórmio:isopropanol (90:10:0,1). As frações F31-F38, reunidas de C14-1, apresentaram um sólido branco, identificado como uma quantidade adicional de acetato de lupeoíla (9; 33,8 mg). O grupo de frações F101-F116 de C1-4, coletado com o sistema eluente hexano:clorofórmio:isopropanol (50:50:0,5) foi obtido como um sólido amarelo-claro (947,6 mg). Este sólido foi fracionado por CCL (C14-2). O grupo de frações F66-F71, coletado de C14- 2, com hexano:acetato de etila:isopropanol (97:3:0,1), após recristalização com acetato de etila, formou um sólido branco cristalino (P.F. de 237,4-243,6) com teste-positivo para TTPC. Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 23 Posteriormente, esse sólido foi identificado como sendo a friedelina (5; 18 mg). A partir do grupo de frações F82-F89 da coluna C14-2, coletado com hexano:acetato de etila:isopropanol (95:5:0,1), foi obtido um sólido branco (P.F. de 245,6-252,15 oC) depois de purificado por recristalização. Esse sólido foi caracterizado por CCD, usando uma amostra autêntica, como sendo β-friedelinol (6; 38,7 mg). Grupo G9 de C-1 [F19-F20, hexano:clorofórmio (3:7)] Esse grupo de C-1 apresentou um sólido branco que foi recristalizado com acetona. Essa operação levou à obtenção de um sólido branco cristalino (100 mg), identificado por CCD como uma quantidade adicional da mistura (70,5 mg) de friedelina (5) e friedelinol (6). Grupo G10 de C-1 [F21, hexano:clorofórmio (3:7)] Esse grupo foi obtido como um sólido branco (160,0 mg) que, após lavagem, seguida de recristalização com éter etílico e acetona, foi isolado como um sólido cristalino, identificado como sendo uma quantidade adicional de 3β-friedelinol (6; 116,8 mg). Grupo G11 de C-1 [F22-F24, hexano:clorofórmio (3:7)] Esse grupo de frações foi recuperado como um sólido branco-amarelado (880,0 mg) e foi submetido a fracionamento por CCL (C1-5). As frações F34-F37 de C1-5, coletadas com hexano:acetato de etila:isopropanol [95:5:0,5], depois de lavadas com éter de petróleo e recristalizadas com etanol, revelaram um sólido branco (P.F. de 182,4-187,1 oC) identificado como o TTPC lupeol (8; 87,8 mg). Grupo G12 de C1 [F25, hexano:CHCl3 (3:7) + F26, DCM:AcOEt (97:3)] O grupo G12 foi obtido como um material sólido (302,0 mg) branco com uma fina camada superficial amarelada. Esse material foi lavado com acetona resfriada e, em seguida, recristalizado com acetona, formando um sólido branco (P.F. 197,0-204,2 oC), que foi identificado posteriormente com sendo o TTPC oleanano β-amirina (12, 149,9 mg). Resumo do fracionamento de FHEMA A partir do extrato em hexano das folhas de M. acanthophylla, foram isolados e descritos, sete compostos puros, três compostos em misturas binárias e uma mistura de seis constituintes pertencentes a uma série homóloga de n-alcanos (Tabela 2.4). Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 24 Tabela 2.4: Resumo das substâncias isoladas de FHEMA Substância Massa (mg) Mistura de n-alcanos C-30 a C-35 (1) 537,2 Esqualeno (2) 161,0 Mistura de HC ramificado (4a) e álcool graxo (4b) 6,4 Mistura de friedelina (5) e 3β-friedelinol (6) 960,5 Friedelina (5) 18,0 3β-Friedelinol (6) 155,5 Lupeol (8) 87,8 Acetato de lupeoíla (9) 592,3 Mistura de 3β-esteariloxi-olean-12-eno (10) e 3β-esteariloxi-urs-12-eno (11) 28,0 3β-Esteariloloxi-urs-12-eno (11) 9,3 3β-Amirina (12) 149,9 Isolamento de 1,4-trans-poliisopreno de GHEMA O material obtido na preparação do extrato das folhas de M. acanthophylla (11,4 g) mediante uma extração sólido-líquido em aparelho de Soxhlet com hexano. A fração GHEMA foi dissolvida em 100 mL de clorofórmio e filtrada para eliminação de impurezas. Em seguida, ao sobrenadante recolhido foram adicionados cerca de 30 mL de metanol até a coagulação de uma goma (4,8 g), caracterizada como rica em 1,4-trans-poliisopreno (guta-percha), quando analisada por CCD com padrão. A solução de metanol:clorofórmio separada do material coagulado foi evaporada até a secura e forneceu um sólido branco, cristalino (4,24 g), identificado por CCD como uma quantidade adicional da mistura de friedelina (5) , 3β-friedelinol (6). O material da goma foi aplicado em uma coluna (φ = 5,0 cm), preenchida com 20 cm de sílica gel 70 mesh. A primeira eluição foi feita com 150 mL de metanol e, em seguida, com 300 mL de clorofórmio. A fração em clorofórmio forneceu um sólido branco-esverdeado como uma goma elástica (3,55 g), que foi lavado com acetona e confirmado por métodos espectrométricos como sendo o 1,4-trans- poliisopreno (3). Esse material foi armazenado em frasco de vidro no armário do laboratório e, após cerca de quatro semanas, uma grande parte havia sido degradada, apresentando um material amarelo com odor ácido. A pesquisa na literatura e a análise por IV mostraram que a degradação da guta-percha ocorreu devido à exposição desse material a impurezas, variações de temperatura e da luz ambiente. O fluxograma contido no Esquema 2.4 resume as operações descritas anteriormente na elaboração fitoquímica do sólido GHEMA para obtenção do biopolímero guta- percha. Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 25 1,4-trans-poliisopreno (3) Caracterização (PF, RMN de 1H e13C ) 1. Dissolução em cerca de 100 mL de CHCl3, seguida de filtração para eliminar impurezas. 2. Adição de MeOH até coagulação. 3. Decantação fase líquida Remoção do solvente Fase líquida 1- Filtração em coluna de sílica gel 70 eluída com MeOH e, em seguida, com CHCl3 2 - Lavagem com acetona GHEMA (11,4 g) Fase sólida Sólido elástico friedelina (5) + β-friedelinol (6) Sólido branco Análise por CCD Esquema 2.4: Elaboração da goma extraída de folhas de M. acanthophylla (GHEMA). Fracionamento do extrato SHEMA A análise por cromatografia gasosa, usando padrões, mostrou que o extrato SHEMA se tratava de uma fração de conteúdo enriquecido dos TTPC’s friedelina (5) e 3β-friedelinol (6). A análise do sólido SHEMA por CCD mostrou, além das manchas correspondentes aos TTPC’s 5 e 6, outras três ou quatro de menores Rf, referentes a outros constituintes, que são possivelmente TTPC’s ácidos ou di, tri-hidroxílicos. A composição química do sólido SHEMA incentivou a obtenção de maiores quantidades dos triterpenos friedelina e 3β-friedelinol. No NEPLAM, o estoque desses triterpenos, obtido a partir dos extratos em hexano de folhas de várias espécies de Maytenus estudadas, vem sendo utilizado para o suprimento de reagentes de partida em reações de síntese de derivados friedelânicos raros ou inéditos. No desenvolvimento do estudo do extrato SHEMA foram separadas quatro amostras desse material (18,5 g), as quais foram fracionadas em nove colunas cromatográficas empacotadas com sílica gel, que levaram a isolamentos de cinco (Tabela 2.10, p. 33) constituintes químicos puros de SHEMA. A Tabela 2.5 resume as principais características relativas às CCL’s e as condições experimentais utilizadas nos procedimentos cromatográficos. Na procura de um adsorvente para CCL que apresentasse maior eficiência na separação dos TTPC’s friedelina (5) e β-friedelinol (6), foram elaboradas CCL’s utilizando alumina neutra 60 (Merck, 70-230 mesh ASTM) como fase estacionária. Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 26 Tabela 2.5: Colunas de CL desenvolvidas no fracionamento de SHEMA Amostra SHEMA CCL Tipo OD (cm) FE (massa, g) Sistema eluente Carga (g) Frações (mL) A1 (9,1 g) C-2 G 5,5 SG (300) Isocrático (iso1) 9,06 54 (100) C2-1 F 1,0 SG (30) Isocrático (iso2) 0,16 20 (10) C2-2 F 1,0 SG (30) Isocrático (iso2) 0,16 20 (10) C2-3 F 2,0 SG (65) Isocrático (iso1) 0,30 18 (10) C2-4 F 0,8 SG-NP (25) Isocrático (iso1) 0,10 53 (5) A2 (4,4 g) C-3 G 3,0 SG (146) Isocrático (iso3) 4,10 129 (100) A3 (4,1 g) C-4 G 10,0 SG (130) Isocrático (iso4) 4,40 106 (100) C4-1 G 0,8 Al-N (5) Isocrático (iso5) 0,05 22 (5) A4 (0,9 g) C-5 G 3,0 SG (118) Isocrático (iso1) 0,85 73 (30) G: eluída por gravidade; F: média pressão ou flash; OD: diâmetro externo da coluna; FE: fase estacionária, SG: sílica gel 60; Al-N: alumina neutra; NP: nitrato de prata 1-2%; FM: fase móvel; iso1: clorofórmio puro; iso2: isopropanol (0,1%) em clorofórmio; iso3: hexano:clorofórmio (1:1); iso4: hexano:clorofórmio (1:2); iso5: hexano:clorofórmio (1:3). Fracionamento da amostra A1, coluna C-2 Uma amostra do sólido SHEMA, A1 (9,1 g) foi submetida a uma CCL (C-2) para fracionamento com eluição por clorofórmio. Foram coletadas 50 frações de 100 mL cada. O Esquema 2.5 resume os procedimentos desenvolvidos na elaboração do sólido SHEMA, amostra A1, fracionada a partir da CCL C-2. SHEMA A1 (9,1 g) C-2, sílica gel 60 isocrático F5-F15 F16-F18 F19-F28 clorofórmio Rec CHCl3- Metanol (9:1) friedelina (5) + β-friedelinol (6) β-friedelinol (6) Silica C2-2 Silica C2-1 CHCl3 friedelina (5) clorofórmio Oxidação: 1 - CH3COOH, Na2Cr2O7.2H2O, refluxo (80-90 oC) 2 - resfriamento (banho de gelo) 3 - adição de água e filtração a vácuo Sílica C2-3 mancha A Sílica CCDP CHCl3, F8-F16 mancha B α-friedelinol (7) β-friedelinol (6) F12-F26 Sílica-SN C2-4 F6 F52-F53F29-F43 α-friedelinol (7) β-friedelinol (6) canofilol (13) clorofórmio Esquema 2.5: Fracionamento da amostra A1 de SHEMA. Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 27 Agrupamento das frações de C-2, amostra A1 As frações de C-2 foram agrupadas de acordo com as semelhanças em CCD conforme mostra na Tabela 2.6 (p. 28). Tabela 2.6: Frações coletadas de C-2, amostra A1 de SHEMA Frações Grupo Massa (mg) Procedimento Constituinte Identificação F1 a F4 G1 189,0 NE ND F5 a F15 G2 5170,0 Estoque (5 + 6) CCD 640,0 Rec, estoque (6) CCD 320,0 CCL (C2-1 e C2-2) (5) CCD F16 a F18 G3 860,0 Estoque (6 + 7 + 13) CCD 300,0 CCL (C2-3), CCP (6) e (7) CCD, IV, RMN F19 a F28 G4 490,0 CCL (C2-4) (6), (7) e (13) CCD, IV, RMN F29 a F36 G5 144,0 NE ND F37 a F48 G6 63,0 NE ND F46 a F50 G7 46,0 NE ND NE: não estudado; CCL: fracionamento em coluna de cromatografia líquida; Lav: lavagem; Rec: recristalização; ND: não determinado; friedelina (5); β-friedelinol (6); α- friedelinol (7); 3-oxo-28-hidroxifriedelano, canofilol (13). Grupo G2 de C-2 (F5-F15, clorofórmio) O grupo G2 apresentou um sólido branco (6,13 g), inicialmente identificado por CCD como uma mistura de friedelina (5) e β-friedelinol (6). Parte do material de G3 (640 mg) foi recristalizado com a mistura clorofórmio:metanol (9:1) quente (50-60 oC), o filtrado, obtido sob resfriamento rápido em banho de gelo, foi identificado por CCD como sendo 6 (162,0 mg). Uma amostra (320 mg) do sólido do grupo G2 de C-2 foi dividida em partes iguais e aplicadas a duas CCL do tipo flash (C2-1 e C2-2), eluídas com uma solução de isopropanol (0,1% v/v) em clorofórmio, tendo sido coletadas 20 frações (10 mL cada) por CCL. Da fração F6 de C2-1 se isolou o TTPC 5 (20 mg) na forma pura (análise por CCD com padrões). Uma amostra de G2 (1,5 g), contendo a mistura dos TTPC’s 5 e 6, foi submetida a reação de oxidação com dicromato de sódio di-hidratado e ácido acético.76 O produto foi recolhido como um sólido branco (1,4 g) e, após recristalização com clorofórmio:metanol (9:1), foi obtido um sólido cristalino (1,0 g) formado por pequenas agulhas, que foi caracterizado (CGAR) como constituído por friedelina (5) com grau de pureza maior que 98%. Esse material foi preparado Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 28 visando, posteriormente, determinar a estrutura da friedelina por difração de raios-X de pó. Uma amostra do sólido 5 foi reduzida a um pó fino e preparada em um ZFSH (Amostrador de Background Zero), composto por SiC polido, posicionado em um ângulo de 3o para evitar ruídos de fundo sobre as leituras de difração. O material foi inicialmente suspenso em álcool isopropílico e homogeneamente distribuído ao longo do amostrador. A amostra, assim preparada, foi deixada a secar à temperatura ambiente sob rotação constante. Os dados de difração de raios- X do pó de 5 foram coletados por um difratômetro Siemens D5000 (UFMG) operando a 40 KV, 30 mA, utilizando um tubo de Cu Kα (λ = 1.54056 Å), monocromador de grafite e varredura na faixa angular 4-40o (2θ), com ajuste do ângulo de passo de 0,01o (2θ) e a constante de tempo de 15 s por passo. O amostrador contendo o pó de 5 foi submetido a uma rotação de 60 RPM para reduzir eventual tendência de orientação preferencial. Foram feitos três registros de varreduras, e a leitura final foi obtida por média. Grupo G3 de C-2 (F16-F18, clorofórmio) Esse grupo apresentou um sólido branco brilhante, caracterizado por CCD como uma mistura do TTPC 6 e outro não identificado de maior polaridade. Essa observação foi possível porque as cromatoplacas apresentavam duas manchas, próximas, uma da outra (∆Rf ~ 0,1), ambas apresentando a coloração violácea característica para TTPC, quando pulverizadas e reveladas com vanilina-ácido perclórico.77 Uma parte da amostra G3 (300 mg) foi fracionada, via CCL tipo flash (C2-3), em 18 frações eluídas com clorofórmio puro; as frações F8-F16 de C2-3 foram reunidas e apresentaram um sólido (85 mg) que foi purificado por CCP, eluída com clorofórmio. Foram coletadas duas frações nas cromatoplacas que resultaram em dois sólidos brancos identificados por CCD e técnicas espectrométricas (IV e RMN), como sendo o primeiro uma quantidade adicional do composto 6 (10,0 mg) e o segundo, o 3α-friedelinol (7; 6,0 mg). Grupo G4 de C-2 (F19-F28, clorofórmio) O material referente à reunião das frações F19-F28 de C-2 foi submetido à análise por CCL tipo flash (C2-4) com sílica-NP 1% como adsorvente e clorofórmio como eluente em 53 frações de 5,0 mL cada. As frações F12-F26 de C2-4 se apresentaram como um sólido branco, identificado (CCD, IV) como uma quantidade adicional de 6 (12 mg). Um sólido branco cristalino recuperado das frações F29-F43 de C2-4 foi identificado (RMN e IV) como uma quantidade adicional do TTPC 7 (52,0 mg). A reunião de frações F52-F53 de C2-4 foi isolada como um sólido branco, com teste-positivo para TTPC’s78, identificado por meio de análises espectrométricas (IV e RMN) como sendo o composto 3-oxo-28-hidrofriedelano, canofilol (13; 6,0 mg). Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 29 Fracionamento da amostra A2 de SHEMA, coluna C-3 Uma amostra do sólido SHEMA, A2 (4,1 g) foi desenvolvida em CCL (C-3) com eluição por hexano:clorofórmio (1:1). Foram coletadas 129 frações de 100 mL cada. O Esquema 2.6 resume os procedimentos desenvolvidos na elaboração do sólido SHEMA, amostra A2, fracionado a partir da CCL C-3. Agrupamento das frações de C-3, amostra A2 As frações de C-3 foram agrupadas de acordo com as semelhanças em CCD e são listadas na Tabela 2.7 abaixo. Tabela 2.7: Agrupamentos e constituintes isolados das frações de C-3, amostra A2 Frações Grupo Massa (mg) Procedimentos Constituintes Identificação F1 a F18 G1 11,0 Descartado NE F19 G2 45,0 Isolado puro (5) CCD, IV, RMN F20-F25 G3 3450,0 Estoque (5 + 6) CCD F26 a F36 G4 18,0 Estoque (6 + 7) CCD F37 a F121 G6 63,0 NE ND F122-F129 G7 12,0 NE ND CCL: fracionamento em coluna de cromatografia líquida; NE: não estudado; massa (mg). Friedelina (5); β-friedelinol (6); α-friedelinol (7); ND: não determinado. SHEMA A3 (4,4 g) C-3 sílica F19 F20-F25 clorofórmio:n-hexano (1:1) F26-F36 F6-F106 (50 mg) friedelina (5) α-friedelinol (7) β-friedelinol (6) + clorofórmio:n-hexano (2:1) C-4 sílica F2-F5 friedelina (5) C4-1 alumina neutra F13-F14 F15-F16 β-friedelinol (6) F17-F22 friedelina (5) β-friedelinol (6) friedelina (5) + friedelina (5) + β-friedelinol (6) SHEMA A2 (4,1 g) Esquema 2.6: Fracionamento das amostras A2 e A3 de SHEMA. Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 30 A fração F19 de C-3, isolada como uma substância pura, na forma de um sólido branco, com P.F. de 261,0-264,0 oC e teste-positivo para TTPC (Liebermann-Burchard), foi identificada por técnicas espectrométricas (IV e RMN) como sendo uma quantidade adicional do composto 5 (45,0 mg). As frações F20-F25 de C-3 foram coletadas como um sólido branco (3,45 g), identificado por CCD, utilizando amostras autênticas, como uma quantidade adicional da mistura dos constituintes 5 e 6. As frações F26-F36 foram reunidas como um sólido branco (18,0 mg) identificado por CCD com padrões, como uma mistura dos TTPC’s epiméricos 3β-friedelinol (6) e 3α-friedelinol (7). Fracionamento da amostra A3 de SHEMA, coluna C-4 A amostra A3 do sólido SHEMA (4,1 g) foi aplicada em uma CCL (C-4) eluída por clorofórmio:hexano, sendo coletadas 106 frações de 100 mL cada. O Esquema 2.6 (p. 30) resume os procedimentos realizados na elaboração do sólido SHEMA, amostra A3, fracionado a partir da CCL C-4. As frações de C-4, foram agrupadas de acordo com as semelhanças em CCD, são listadas na Tabela 2.8 abaixo. Tabela 2.8: Agrupamentos e constituintes isolados das frações de C-4, amostra A3 de SHEMA Frações Grupo Massa (mg) Procedimentos Constituintes Identificação F2 a F5 G1 50,0 Isolado puro (5) CCD F6-106 G2 3600,0 Estoque (5 + 6) CCD 50,0 CCL (C4-1) (5), (5 + 6) e (6) CCD CCL: fracionamento em coluna de cromatografia líquida; massa (mg). Friedelina (5); β- friedelinol (6). As frações F2-F5 de C-4, isoladas na forma de um sólido branco, apresentaram teste positivo para TTPC (Liebermann-Burchard). Esse sólido foi identificado, por CCD com padrões, como sendo uma quantidade adicional do TTPC 5 (50,0 mg). A reunião das frações F6-F106, levou a um sólido branco identificado (CCD) como mais uma porção adicional da mistura de 5 e 6. A dificuldade em resolver essa mistura por CCL, utilizando sílica gel em fase normal, motivou o teste com outro adsorvente. Então, uma amostra (50 mg) das frações F6-F106 de C-4 foi fracionada em uma CCL sob pressão (tipo flash, C4-1), empacotada com alumina neutra, eluída com hexano:clorofórmio (1:3) em 22 frações de 5 mL cada. As frações F13-F14 de C4-1 forneceram friedelina pura, 5 (3,8 mg) quando analisada por CCD e comparada com uma amostra autêntica. O grupo de frações F15-F16 de C4-1, após análise Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 31 por CCD com padrões, mostrou um sólido de composição similar à mistura de partida de 5 e 6 (15,0 mg). Segundo a análise por CCD com padrão, as frações F17-F22 de C4-1 apresentaram o TTPC 6 (20,8 mg) puro. Estudo fitoquímico da amostra A4 de SHEMA, coluna C-5 Uma amostra do sólido SHEMA (A4; 850 mg) foi fracionada em uma CCL (C-5), empacotada com sílica gel, com eluição por clorofórmio. Foram coletadas 73 frações de 30 mL cada. O Esquema 2.7, abaixo, resume os procedimentos desenvolvidos na elaboração da amostra A4. SHEMA A4 (850 mg) C-5 sílica F5 F6-F46 clorofórmio β-friedelinol (6) F47-F57 β-friedelinol (7) friedelina (5) + Lav c/ acetato de etila clorofórmio CCDP eluída 2x 3β,16β-di-hidroxifriedelano, pachysandiol B (14) F58-F73 Não estudado Esquema 2.7: Fracionamento da amostra A4 de SHEMA. Agrupamento das frações de C-5, amostra A4 As frações de C-5, listadas na Tabela 2.9, foram agrupadas de acordo com as semelhanças dos seus perfis em CCD. A fração F5 de C-5, isolada na forma de um sólido branco cristalino, que apresentou teste-positivo para TTPC (Liebermann-Burchard), foi identificado por CCD e comparado com uma amostra autêntica de friedelina, sendo caracterizado como uma quantidade adicional do TTPC 6 (45,0 mg). O grupo G3 (F6-F46) de C-5 foi identificado como uma quantidade adicional (424,0 mg) da mistura dos TTPC 5 e 6, quando comparado com padrões por CCD. O grupo G4 (F47-F57) de C-5 foi isolado como um sólido branco (10 mg), que foi submetido a uma CCP, constituída por uma cromatoplaca (20 x 20 cm) revestida de sílica gel G 60 (5 mm), eluída duas vezes com clorofórmio destilado. A fração coletada apresentou teste Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 32 positivo para triterpeno (Liebermann-Burchard). Após desorção da substância da sílica gel com clorofórmio:metanol (8:2), obteve-se um sólido branco identificado por técnicas espectrométricas (IV e RMN) como sendo o TTPC 3β,16β-di-hidroxifriedelano, pachysandiol B (14, 3,1 mg). A pesquisa bibliográfica mostrou que o TTPC 14 ainda não tinha sido isolado em plantas da família Celastraceae. Tabela 2.9: Agrupamentos e constituintes isolados das Frações de C-5, amostra A4 de SHEMA Frações Grupo Massa (mg) Procedimentos Constituintes Identificação F1 a F4 G1 2,0 NE ND F5 G2 45,0 Isolado puro (6) CCD F6 a F46 G3 424,0 Estoque (5 e 6) CCD F47 a F57 G4 10,0 CCP (14) IV, NMR, PF F58 a F73 G5 63,0 NE ND CCP: cromatografia em camada delgada preparativa; NE: não estudado; ND: Não determinado; friedelina (5); β-friedelinol (6); 3β,16β-di-hidroxifriedelano, pachysandiol B (14). Resumo do fracionamento de SHEMA A partir do sólido (SHEMA) retirado do extrato em hexano das folhas de M. acanthophylla, foram isolados e caracterizados cinco constituintes TTPC’s puros (5, 6, 7, 13 e 14). O composto 14 foi isolado pela primeira vez na família Celastraceae. Foi isolada também uma mistura dos epímeros 6 e 7, além de quantidades adicionais da mistura dos TTPC’s 5 e 6 (Tabela 2.10). Tabela 2.10: Resumo das substâncias isoladas de SHEMA Substância Massa (mg) Friedelina (5) 118,8 3β-Friedelinol (6) 249,8 3α-Friedelinol (7) 58,0 3-Oxo-28-hidroxifriedelano, canofilol (13) 6,0 Mistura de friedelina (5) e 3β-friedelinol (6) 8519,0 Mistura de 3β-friedelinol (6) e 3α-friedelinol (7) 18,0 3β,16β-di-hidroxifriedelano, pachysandiol B (14) 3,1 Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 33 Fracionamento do extrato FAEMA A análise do extrato FAEMA por CCD, utilizando revelação por irradiação de UV (254 e 366 nm) e luz visível, mostrou que esse extrato possuía uma alta concentração em pigmentos do tipo clorofila. Esses pigmentos foram detectados pela presença de manchas verdes, amarelas (luz visível) e em tons de vermelho (UV em 366 nm) relacionados à fluorescência das clorofilas.77 No desenvolvimento do estudo fitoquímico do extrato FAEMA (178 g) inicialmente foi feito o fracionamento em uma coluna filtrante de sílica gel 60, seguido por fracionamentos por CL com mais seis colunas cromatográficas, também empacotadas com sílica gel 60. Essas partições levaram à obtenção de cinco constituintes químicos de FAEMA puros, três misturas e um derivado resultante da reação de peracetilação em um forno de micro-ondas (Tabela 2.13, p. 38). A Tabela 2.11 resume as principais características relativas às CCL’s e as condições experimentais utilizadas nos procedimentos cromatográficos. Tabela 2.11: Colunas de CL desenvolvidas no fracionamento de FAEMA CCL Tipo OD (cm) FE (massa, g) Sistema eluente Carga (g) Frações (mL) C-6 G 12,0 SG (284) gradiente (gd6) 178,0 55 (150) C6-1 G 3,0 SG-CA (220) gradiente (gd6-1) 6,80 120 (10) C61-1 F 1,0 SG (22) Isocrático (iso61-1) 0,13 20 (5) C6-2 G 5,0 SG (400) gradiente (gd6-2) 32,3 120 (50) C62-1 G 1,0 SG-NP (35) gradiente (gd62-1) 0,17 81 (5) C62-2 G 2,0 SG-NP (50) gradiente (gd62-2) 0,30 90 (5) G: eluída por gravidade; F: média pressão ou flash; OD: diâmetro externo da coluna; FE: fase estacionária, SG: sílica gel 60; SG-CA: sílica gel 60 + carvão ativo; Al-N: alumina neutra; FM: fase móvel; gd6: clorofórmio, clorofórmio:acetato de etila (1:1), etanol, etanol:ácido acético (1%); gd6-1: clorofórmio, clorofórmio:hexano (1:1), clorofórmio, clorofórmio:acetato de etila (20%); iso61-1: hexano:clorofórmio (1:1); gd6-2: hexano:clorofórmio (2:8), clorofórmio, clorofórmio:acetato de etila [(9:1), (8:2) e, (1:1)], acetato de etila, acetato de etila:metanol (1:1) e metanol; gd62-1: hexano:clorofórmio [(6:4), (1:1), (4:6) e (2:8)], clorofórmio, clorofórmio:acetato de etila (9:1), (8:2), (1:1), acetato de etila; gd62-2: clorofórmio, clorofórmio:acetato de etila [(95:5), (8:2) e (1:1)], acetato de etila, acetato de etila:metanol (85:15). Na tentativa de se encontrar um adsorvente para CCL que apresentasse eficiência na remoção do conteúdo de pigmentos clorofílicos do extrato, foi preparada uma CCL (CC6-1) utilizando a mistura sílica-carvão ativo 10% (SG-CA) como fase estacionária. Entretanto, esse procedimento não levou a resultados satisfatórios devido à forte adsorção entre a fase estacionária e os componentes do extrato e à baixa resolução cromatográfica apresentada. O Esquema 2.8 Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 34 (p.35) resume os procedimentos realizados na elaboração do sólido FAEMA, fracionado a partir da CCL C-6. FAEMA (178,0 g) C-6, sílica gel 60 gradiente (gd6) Clorofórmio n-alcanos (1) C6-1 [sílica + carvão ativo (10%)] gd7 F11 friedelina (5) + β-friedelinol (6) F12 (6,8 g) F11-F19 F20 1,4-trans- poliisopreno (3) F21-F30 C62-1 sílica n-hexano-CHCl3 (1:1) F12-F14 F91-F94 ácido graxo C20 (17) lav. acetona F13-F16 (32,3 g) n-hexano n-hexano-CHCl3 (1:1) CHCl3-AcOEt (8:2) rec. acetona C6-2, sílica gel 60 (gd6-2) n-hexano- CHCl3 (2:8) F7-F9 1 - coagulação c/ MeOH 2 - filtração líquidosólido β-friedelinol (6) F12-F20 1 - precipitação c/ hexano 2 - filtração sólido β-friedelinol (6) + α-friedelinol (7) eliminação do solvente F21-F22 sólido β-friedelinol (6) CHCl3 F23 até F49 1 - precipitação c/ hexano 2 - filtração sobrenadantesólidos F23-F26 F27-F49 friedelina (5) + β-friedelinol (6) F27-F34 CHCl3-AcOEt (8:2) β-sitosterol (16) F59 F60-F74 F75-F77 C62-2 sílica CHCl3-AcOEt (9:1) (8:2) (1:1) CHCl3-AcOEt (1:1) F68-F70 3β,24-di-hidroxi- friedelano (15) 3β,25-diacetato de friedelanila (15a) F71-F73 acetilação em micro- ondas. Acetato de etila C61-1 sílica gel CHCl3-AcOEt (1:1) AcOEt:AcCOOH (99:1) F17-F55 (96,0 g) Não estudado (NE) Esquema 2.8: Fracionamento de FAEMA. Coluna C-6 O material do extrato FAEMA (178,0 g) foi submetido a uma CCL filtrante (C-6) com o fracionamento feito em gradiente de polaridade (gd6) com os seguintes eluentes: clorofórmio, clorofórmio:acetato de etila (1:1), acetato de etila, acetato de etila:ácido acético (99:1). Foram coletadas 55 frações de 100 mL cada e o perfil cromatográfico foi acompanhado por CCD mediante sistemas eluentes similares aos utilizados no fracionamento de C-6. Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 35 Agrupamento das frações de C-6 A Tabela 2.12 mostra os agrupamentos e os respectivos constituintes químicos isolados por grupo, bem como, o sumário das operações de fracionamento por CCL e operações aplicadas na purificação e isolamento dos referidos constituintes, tais como, (re)-dissoluções seletivas (lavagens), recristalizações, etc. Todos os constituintes isolados, posteriormente, foram identificados por técnicas cromatográficas e espectrométricas. Tabela 2.12: Agrupamentos e constituintes isolados das frações de C-6 Frações Grupo Massa (g) Procedimentos Constituintes Identificação F1 a F10 G1 12,9 NE ND ND F11 G2 1,8 Estoque (5 + 6) CCD F12 G3 6,8 CCL: C6-1 e C61-1 (1), (6) e (17) CCD, RMN F13 a F16 G4 32,3 CCL: C6-2, C62-1 e C62-2 (3), (5 + 6), (6) (6 + 7), (15), (15a) e (16) CCD, IV, RMN F17a F55 G5 96,0 NE ND ND NE: não estudado; CCL: fracionamento em coluna de cromatografia líquida; Lav: lavagem; Rec: recristalização; ND: não determinado; friedelina (5); β-friedelinol (6); α-friedelinol (7); 3β,24-di- hidroxifriedelano (15); β-sitosterol (16); 3β,24-diacetoxifriedelano; ácido icosanóico (17). Algumas frações de C-6 não foram estudadas (Tabela 2.12) quando o perfil cromatográfico (CCD) apresentou altas concentrações de pigmentos vegetais e a complexidade dessas frações (massa/número de constituintes) tornariam ou acarretariam em separações cromatográficas inviáveis. Grupo G2 de C-6 (F11, clorofórmio) O grupo G2 apresentou um sólido branco (1,12 g), identificado por CCD como uma quantidade adicional da mistura de friedelina (5) e β-friedelinol (6). Grupo G3 de C-6 (F12, clorofórmio:acetato de etila, 1:1) O grupo G3 foi obtido como um material heterogêneo, pastoso, esverdeado, contendo um sólido branco disperso. Esse material (6,8 g) foi submetido a uma coluna cromatográfica (C6-1) empacotada com sílica gel 60 e carvão ativo (10%). A eluição foi feita por gradiente (gd6-1) com os sistemas solventes hexano, hexano:clorofórmio (1:1), clorofórmio e clorofórmio:acetato de etila (8:2), tendo sido coletadas 120 frações de 10 mL cada. As frações F11-F19 de C6-1, eluídas com hexano, forneceram uma mistura de n-alcanos (138,0 mg, 1), identificada por CG como Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 36 similar a mistura de hidrocarbonetos anteriormente obtida no fracionamento do extrato em hexano (FHEMA). A fração F20 de C6-1, eluída com hexano:clorofórmio (1:1), forneceu um material que, após recristalização com acetona, resultou num sólido branco (3,8 mg), identificado por CCD como uma quantidade adicional de β-friedelinol (6). As frações F21-30 foram purificadas por CL tipo flash (C61-1) com sílica gel 60 (230-400 Mesh), eluída com hexano:clorofórmio (1:1). As frações F12-F14 de C61-1 produziram um sólido branco (17,3 mg) identificado por CCD e RMN como sendo uma quantidade adicional de 6. Retornando à coluna C6-1, as frações F91-F94 produziram uma cera amarelada (19,8 mg), identificada por RMN como sendo o ácido icosanóico (5,0 mg, 17), um ácido graxo C20. Grupo G4 de C-6 (F13-F16, clorofórmio:acetato de etila, 1:1) O material do grupo G4 de C-6 (32,3 g) foi submetido à análise cromatográfica em CCL (C6-2) utilizando-se 400 g de sílica gel 60 (70-230 mesh) como fase estacionária. Foram coletadas 119 frações de 50 mL. Os eluentes utilizados em C6-2 foram hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol. Esses solventes foram utilizados puros, ou em misturas de ordem crescente de polaridade (gd6-2). A solução formada a partir das frações F7-F9 de C6-2, que foram coletadas com o eluente hexano:clorofórmio (2:8), quando precipitada com metanol, forneceu um material elástico, que foi identificado por CCD frente a uma amostra autêntica, como sendo uma quantidade adicional (30,2 mg) do biopolímero 1,4-trans-poliisopreno (3). Após a remoção do solvente do sobrenadante resultante dessa filtração, foi recuperado um sólido branco identificado por CCD como uma quantidade adicional da mistura dos constituintes 5 e 6 (241,5 mg). As frações F12-F20 foram coletadas como um sólido branco que, após precipitação com hexano e filtração, foi identificado por CCD como outra quantidade adicional da mistura de 5 mais 6 (468,5 mg). O sólido branco recuperado das frações F21-F22 da coluna C6-2 foi identificado por CCD como sendo mais uma quantidade do constituinte 6 (22,1 mg). Todas as soluções das frações F23-F49 de C6-2 (particionadas com clorofórmio), após a adição de hexano, resultaram na precipitação de um sólido branco de aspecto cristalino. Após a coleta desses sólidos por filtração, ficou constatado por CCD que os sólidos oriundos das frações F23-F26 representam quantidades adicionais de 6 (~ 360,0 mg) e os sólidos obtidos a partir das frações F27-F49 continham quantidades adicionais da mistura dos epímeros 6 e 7 (132,6 mg). O agrupamento do material contido nos sobrenadantes das filtrações referentes às frações F27-F34 foi purificado por CL em sílica gel 60 (C62-1) com clorofórmio:acetato de etila (8:2), que levou à obtenção de um sólido branco (10,0 mg), reconhecido por CCD, frente a uma amostra autêntica, como sendo o esteróide β-sitosterol (16). As frações da coluna C6-2, eluídas com os sistemas Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 37 solventes clorofórmio:acetato de etila 9:1 (F59), 8:2 (F60-F74) e 1:1 (F75-F77), foram reunidas e o material total obtido (300 mg) foi fracionado em CL sílica-gel (C62-2). As frações F68-F70 de C6-2 eluídas com clorofórmio:acetato de etila (1:1) resultaram em um sólido (12,0 mg), que foi identificado por técnicas espectrométricas (IV e RMN) com sendo o TTPC diol 3β,24-di- hidroxifriedelano (15). As frações F71-F73, também fracionadas com clorofórmio:acetato de etila (1:1), apresentaram, segundo as análises por CCD, um conteúdo rico no composto 15, constituinte das frações F68-70. Posteriormente à elucidação estrutural de 15, procedeu-se a peracetilação do material de F71-F73 (5,0 mg). A peracetilação foi conduzida mediante a aplicação de irradiação na região de micro-ondas (seis ciclos de 5 minutos com 10% da potencia máxima de um aparelho de micro-ondas Panasonic de 900 Watts) sobre o conteúdo da mistura das frações F71-F73 com anidrido acético (1 mL) e acetato de potássio anidro (100 mg). Após a irradiação, a mistura reagente foi esfriada, neutralizada com bicarbonato de sódio aquoso a 10% (20 mL) e a suspensão aquosa formada foi submetida a uma extração com acetato de etila (3 x 5 mL). A fração em acetato de etila foi secada com sulfato de sódio anidro (3 g) e, após a eliminação do solvente, o sólido branco e pastoso obtido (3,9 mg) foi identificado por RMN como sendo o derivado peracetilado de 15, o TTPC 3β,24-diacetoxifriedelano (15a). Resumo do fracionamento de FAEMA A partir do extrato em acetato de etila das folhas de M. acanthophylla (FAEMA), as substâncias obtidas foram caracterizadas como uma mistura de hidrocarbonetos saturados (1), o 1,4-trans-poliisopreno (guta-percha) (3), três constituintes TTPC’s puros (6, 15, e 15a), bem como, quantidades adicionais das misturas de 5 com 6, e dos epímeros 6 e 7, um esteroide (16). Foi isolado também um ácido graxo saturado (17) (Tabela 2.13). Tabela 2.13: Resumo das substâncias obtidas de FAEMA Substância Massa (mg) Mistura de n-alcanos (1) 138,0 1,4-Trans-poliisopreno (3) 30,2 3β-Friedelinol (6) ~390 Mistura de friedelina (5) e 3β-friedelinol (6) 1830,0 Mistura de 3β-friedelinol (6) e 3α-friedelinol (7) 132,6 3β,24β-di-hidroxifriedelano (15) 12,0 3β,24β-diacetoxifriedelano (15a) 3,9 β-sitosterol (16) 10,0 ácido icosanóico (17) 5,0 Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 38 Estudo fitoquímico do extrato SEMA (Esquema 2.9) SEMA 1 - Suspensão de 1,0 g em 30 mL de metanol-água (9:1) 2 - Extração com 3x10 mL de CHCl3 Fase hidrometanólica (f-HM1) Fase clorofórmica (f-CL) Análise por CCD e RMN 1D Mistura dos TTPC's: friedelina (5) β-friedelinol (6) α-friedelinol (7) 1 - Ajuste p/ metanol-água (1:1) 2 - Extração com 3x15mL de n-butanol Fase em n-butanol (f-BU) 1 - Análise por CCD 2 -CLAE/EM Identificação de 3-O- glicosídios derivados do canferol, quercetina e isoramnetina. Fase hidrometanólica (f-HM2) Remoção do solvente Remoção do solvente sólido marrom-claro 1 - Recristalização com MeOH e água 2 - Análise IV Galactitol (19) Amostras de SEMA (2 % p/v MeOH) 1 - Hidrólise ácida (HCl 10%) por micro-ondas 2 - Partição com EtOAc Fase em EtOAc (f-Ac) Análise por CCD/UV 366 nm Identificação por CCD: Canferol e quercetina Fase hidrometanólica (f-HM3) Reações de derivatização de monossacarídeos a alditóis-acetatos e análise por CGAR (Ald-Ac) 1-Análise por CCD c/ padrões de monossacarídeos Sete monossacarídeos (18): ramnose, ribose, arabinose, xilose, manose, galactose e glucose Galactitol (19) + Amostra de SEMA (3,0 g) per-O-acetilação Hexa-acetato de galactitol (19a) 2-Ald-Ac/CGAR Sema hidrolisada Esquema 2.9: Fracionamento do extrato SEMA. Uma amostra de SEMA (1,0 g) foi suspensa em metanol-água (30,0 mL, 9:1 v/v) e fracionada com clorofórmio, formando as fases clorofórmica (f-CL) e hidrometanólica (f-HM1) (Esquema 2.9). A fração f-CL, depois de seca, apresentou ou sólido cristalino que foi analisado por CCD com padrões de TTPC, sendo identificada a presença de friedelina (5), β−friedelinol (6) e α-friedelinol (7) em mistura (12,0 mg). A fração aquosa f-HM1 teve ajustado o conteúdo metanol:água para (50/50 v/v) e foi submetida a uma nova extração com n-butanol (3 x 15 mL), formando as fases butanólica (f-Bu) e hidrometanólica (f-HM2). A fase f-HM2, após a remoção do solvente por evaporação, apresentou um material marrom-claro que, após ser recristalizado com metanol:água, apresentou um sólido branco (70,0 mg), que foi identificado por análise de absorção no IV como sendo o galactitol (19). A fração f-Bu de SEMA foi analisada em placas CCD, eluídas com acetato de etila:metanol:ácido acético em água (0,5%) [8:3:1] e reveladas com reagente NP-PEG4000 sob luz UV (lâmpada 366 nm). As placas CCD reveladas apresentaram manchas amarelas e amarelo-esverdeadas, atribuídas à presença de glicosídeos derivados de Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 39 quercetina e canferol, respectivamente.79 Amostras da fração f-Bu de SEMA (5 mg/mL) também foram submetidas a análises por CLAE com IES/EM acoplados. O equipamento CLAE-EM utilizado foi um cromatógrafo Shimadzu com detector UV-VIS e a fase móvel (50% v/v) de ACN/H2O com 0,5% de ácido fórmico, utilizando uma coluna C18 (ODS), 15 x 0,46 cm, partículas de 3 µm, em 40 min. A análise dos espectros EM-IES de SEMA juntamente com os dados da literatura, permitiram identificar dez glicosídeos derivados de quercetina e canferol como constituintes do extrato SEMA (Tabela 2.14). Tabela 2.14: Flavonoides identificados a partir das análises dos dados de IES/EM do extrato SEMA, modo negativo e varreduras na faixa de m/z 100-2000 Da Aglicona Identificação Ref. Miricetina Pentose-di-(ramnose)-ramnosídeo de miricetina PE Metilquercetina Pentose-ramnose-pentose-ramnosídeo de metilquercetina PE Quercetina di-(Ram)-pentose-hexosídeo de quercetina(21) 81 Quercetina di-(Ramnose)-hexosídeo de quercetina(20) 80, 81 Canferol di-(Ramnose)-pentose-hexosídeo de canferol(22) 80, 81 Canferol di-(Ramnose)-hexosídeo de canferol 81, 82 Isoramnetina Pentose-di-(ramno)-hexosídeo de isoramnetina(23) 81 Quercetina Hexose-hexosídeo de trimetil-quercetina PE Miricetina Pentose-ramnose-hexosídeo de miricetina PE Miricetina di-(Ramnose)-hexosídeo de miricetina 81, 82 (PE): Glicosídeos identificados no presente estudo mediante a comparação entre os valores característicos dos íons EM-IES disponíveis na literatura e os observados nos espectros EM-IES (modo varredura) de SEMA. (21, 22, 23) Glicosídeos inéditos (21, 22 e 23) que foram isolados por CLAE semi-preparativa e caracterizados com os dados de análises de dados RMN e EM-IES(1-3). Identificação dos monossacarídeos de SEMA por CGAR Os monossacarídeos livres e totais de SEMA foram analisados por CGAR, utilizando o método alditol-acetato. Na análise para detecção dos açúcares livres, o extrato SEMA foi utilizado sem ser hidrolisado e, na identificação dos açúcares totais, foi utilizado o seu produto de hidrólise ácida.74 As análises dos cromatogramas CGAR, obtidos por esse método, permitiram identificar um conjunto de sete monossacarídeos (L-ramnose, D-ribose, L-arabinose, D-xilose, D- manose, D-galactose e D-glicose, 18) e o poliol galactitol (19). A hidrólise da solução metanólica do extrato SEMA (500 µL a 2% p/v) foi feita em um tubo de ensaio, tendo sido o solvente previamente eliminado com fluxo ar quente. O extrato seco obtido foi então redissolvido com 300 µL de ácido clorídrico (10%) aquoso e o tubo, após ser hermeticamente fechado, foi levado ao forno de micro-ondas doméstico, com potência ajustada em cerca de 160 W (20%). Após a irradiação, o material foi esfriado e, em seguida, neutralizado com KOH(aquoso) a 10%. Os resíduos Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 40 de água/ácido resultantes da neutralização do extrato hidrolisado foram eliminados pela adição, seguida de evaporação, de duas porções consecutivas de 500 µL de metanol sob fluxo de N2(g),. Uma alíquota desse extrato SEMA hidrolisado foi particionada com acetato de etila/água e as fases obtidas foram submetidas a análises em placas CCD de sílica gel. As placas que receberam a fase orgânica (F-Ac) foram eluídas com clorofórmio:metanol:água (100:13,5:1 v/v/v). Após a eluição, as cromatoplacas foram reveladas com NP-PEG 400078 sob luz UV (λ 366 nm) apresentaram manchas amarelas e amarelo-esverdeadas, associadas à presença de flavonoides com esqueleto semelhante à quercetina e ao canferol, respectivamente. As placas CCD que receberam alíquotas da fração aquosa (f-HM3) foram eluídas com clorofórmio:metanol:água:ácido acético (6:4:1:1 v/v/v/v). Nessas placas, a revelação foi desenvolvida utilizando dois tipos de reveladores: anisaldeído sulfúrico78 e solução etanólica (70%) de permanganato de potássio em meio básico (pH~12). As placas com a fração f-HM3 apresentaram manchas identificadas como galactose, galactitol e glicose. O conteúdo remanescente do extrato SEMA hidrolisado (cerca de 1 mg) foi utilizado como reagente de partida nas reações de derivatizações, que são necessárias para desenvolver o método alditol- acetato (Ald-Ac), para a análise dos monossacarídeos totais por CGAR. Derivatização de monossacarídeos a acetatos de alditóis83 Redução dos açúcares com a formação de seus respectivos alditóis – em um tubo de plástico de microcentrífuga, tipo eppendorff de 1,5 mL, foram misturados 100-200 µL de uma suspensão aquosa (2%) de um padrão de monossacarídeo ou de SEMA (puro ou hidrolisado) com cerca de 10 mg de boroidreto de sódio, NaBH4(s). Essa mistura, em frasco aberto, foi posta a reagir por 30 minutos à temperatura ambiente. Após a reação foram adicionados 500 µL de ácido acético em metanol a 10% (v/v) para eliminar qualquer excesso de NaBH4 existente. Em seguida, essa solução solvente foi evaporada com um fluxo de ar quente (~70 oC). Esse último procedimento foi repetido por mais duas vezes para permitir a eliminação completa de resíduos de água e ácido. No processo de acetilação, o material, obtido na reação de redução descrita acima, depois de seco, foi mantido no eppendorff e recebeu 200 µL de anidrido acético. Essa mistura foi agitada rapidamente em um agitador tipo vortex e homogeneizada em um banho de ultra-som por 1 minuto. Logo depois, com o frasco bem fechado (reforçado com fita adesiva crepe), a mistura foi colocada para reagir em um forno de micro-ondas com potência a 30% (240 W) por cinco minutos. A solução obtida após a irradiação teve o solvente totalmente eliminado. Para a completa remoção de sobras de anidrido acético, o material seco obtido foi redissolvido em 500 Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 41 µL de tolueno, agitado em vortex, e novamente levado à secura por mais duas vezes consecutivas. Após a terceira e última operação de remoção de anidrido acético, o produto dessa reação foi particionado com água-acetato de etila (3 x 500 µL). A fração em acetato de etila foi evaporada até a secura para eliminar a água e o sólido obtido foi dissolvido em 200 µL de clorofórmio para, em seguida, ser injetado em um sistema para cromatografia a gás. Per-O-acetilação de SEMA A estratégia desta reação consistiu em realizar a per-O-acetilação dos carboidratos e polióis83 presentes no extrato SEMA e assim isolar o carboidrato mais abundante na forma de per-O-acetato. A acetilação se deu através da reação com anidrido acético, que atuou como reagente em excesso e solvente, mais acetato de sódio anidro, que agiu como um catalisador básico. A Figura 2.1 mostra o esquema da reação de per-O-acetilação de galactitol, o principal poliol encontrado livremente no extrato SEMA, conforme foi identificado por CGAR. O- O O OO ∆, 80 °C - OH OH OH OH OH OH 19 O O O O O O O O O O O O 19a Figura 2.1: Reação de per-O-acetilação do galactitol (19), componente principal de SEMA, a hexa-acetato de galactitol (19a). O procedimento seguido para promover a per-O-acetilação consistiu em adicionar uma parte do extrato SEMA (3,0 g) a um balão tritubulado (150 mL), contendo 60 mL de anidrido acético e 10 g de acetato de sódio anidro, montado com um condensador de refluxo (Figura 2.2). Essa mistura foi posta a reagir sob-refluxo (80 oC) e agitação magnética por 4 horas. Ao término da reação, a mistura foi posta a arrefecer em um banho de gelo e o meio, que se apresentava ácido (pH 4,8), foi então justado para pH 7,0 com adição de bicarbonato de sódio. Figura 2.2: Sistema de refluxo utilizado para conduzir a reação de per-O-acetilação do extrato SEMA. Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 42 Após a neutralização do excesso de anidrido, o produto da reação foi particionado em um funil de separação (250 mL) com acetato de etila (3x ~30 mL), e a fase orgânica obtida teve a umidade removida com uma porção (~30 g) de sulfato de sódio anidro. Em seguida, o acetato de etila foi eliminado, formando um material sólido marrom. Esse sólido foi recristalizado com acetato de etila:metanol (5:1 v/v) e o produto final da per-O-acetilação de SEMA, um sólido amorfo branco-acinzentado (400 mg), foi caracterizado através da análise dos dados de RMN de 1H e 13C como sendo o composto 1,2,3,4,5,6-hexa-O-acetil-D-galactitol (hexa-acetato de galactitol, 19a). Resumo do estudo fitoquímico de SEMA A partir do sólido separado do extrato em metanol das folhas de M. acanthophylla (SEMA), foram obtidos dois compostos puros, sendo um poliol e o seu derivado acetilado e uma mistura de três compostos triterpênicos, além da identificação de outros sete monossacarídeos e nove flavonóis glicosídicos (Tabela 2.15). Tabela 2.15: Resumo das substâncias obtidas de SEMA Substância Massa (mg) Mistura de friedelina (5), 3β-friedelinol (6) e 3α-friedelinol (7) 23,0 Mistura de monossacarídeos (18): (L-ramnose, D-ribose, L-arabinose, D-xilose, D- manose, D-galactose e D-glicose) Anal. Qual. Galactitol (19) 70,0 Hexa-acetato de galactitol (19a) 400 3-O-{[α-L-ramnopiranosil(1→6)][α-L-ramnopiranosil-(1→2)]}-β-D-galactopira- nosídeo de quercetina (20) 1,9 3-O-{[α-L-ramnopiranosil-(1→6)]-O-[β-D-xilopiranosil(1→3)-O-α-L-ramnopi- ranosil(1→2)]]-β-D-galactopiranosídeo de quercetina (21) 14,0 3-O-{[α-L-ramnopiranosil(1→6)]-O-[β-D-xilopiranosil(1→3)-O-α-L-ramnopi- ranosil(1→2)]}-β-D-galactopiranosídeo de canferol (22) 12,2 3-O-{[α-L-ramnopiranosil(1→6)]-O-[β-D-xilopiranosil(1→3)-O-α-L-ramnopi- ranosil-(1→2)]}-β-D-galactopiranosídeo de isoramnetina (23) 1,4 Anal. Qual.: análises qualitativas feitas por CCD e CGAR Estudo analítico de SEMA, FOMMA e FAMMA por CCD e CLAE A análise comparativa por CCD das frações dos extratos metanólicos (SEMA e FOMMA) e hidrometanólicos (FAMMA), solúveis em n-butanol (f-Bu) ou em etanol (95%) (f-EtOH), mostrou que essas frações, contendo flavonoides glicosídicos, apresentaram qualitativamente, o mesmo perfil cromatográfico. Assim, o fracionamento por CLAE foi realizado com o extrato que apresentou a maior massa da fração solúvel em n-butanol (f-Bu), o extrato FAMMA (f-Bu ≈ 41%). O extrato SEMA (f-Bu ≈ 23%) foi utilizado na prospecção preliminar por CCD, na identificação de glicosídeos flavônicos por CL-EM e identificação de açúcares por CGAR. O Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 43 extrato FOMMA (f-Bu ≈ 30%) foi reservado para testes biológicos. Os cromatograma obtidos com as frações f-Bu e f-EtOH para os extratos citados se apresentaram bastante similares. Análise por CLAE em escala semi-preparativa de FAMMA O cromatograma de f-EtOH (p.164) em escala analítica, usando detector UV com λ = 360 nm, apresentou picos significativos que indicaram as presenças de substancias relacionadas com flavonoides.74 O fracionamento por CLAE em escala semi-preparativa (injeções de 50,0 mg) foi então conduzido com uma parte do extrato FAMMA (4,0 g) solúvel em etanol por ter apresentado semelhança cromatogáfica com SEMA. A solução foi previamente filtrada em coluna de Sephadex LH-20 (Amersham Biosciences), utilizando três colunas (Büchi, 230 x 49 mm), em série, com eluição feita com etanol PA (95%, Vetec) utilizando uma bomba Shimadzu LC 8A (fluxo de 2,0 mL min-1). Foram coletadas 120 frações (50 mL) que, após redução do solvente em evaporador rotativo, foram agrupadas segundo os perfis cromatográficos apresentados nas cromatoplacas CCD de sílica gel, eluídas com acetato de etila:ácido:acético:ácido fórmico:água (100:11:11:26 v/v/v/v) e reveladas com reagente NP-PEG4000 sob luz UV (366 nm). Os agrupamentos de frações G7, G8, G9 e G10, que, nas análises por CCD, apresentaram manchas amarelas e amarelas esverdeadas, indicativas da presença de glicosídeos flavônicos, foram purificadas por CLAE em uma coluna semi-preparativa (Shimadzu, Shim-pack ODS, 5 µm, 20 x 250 mm, fluxo 10 mL min-1). As demais frações foram reservadas para estudo posterior. FAMMA (4,0 g) 1- Fracionamento: 3 colunas c/ Sephadex-LH20, eluidas c/: etanol 95%. 2 - Agrupamento das frações segundo perfil cromatográfico (CCD). G7 (F47-F55) (136,0 mg) G8 F56-F66 (182,0`mg) G9 F67-F75 (101,3 mg) G10 F76-F80 (32,3 g) Suspensão em etanol 95% Fração solúvel em EtOH CLAE-prep CLAE-prep CLAE-prep Glicosídeos 21 e 23 Glicosídeo 20Glicosídeo 22 Esquema 2.10: Fracionamento do extrato FAMMA. CLAE-PREP: Purificação utilizando coluna CLAE semi-preparativa (Shimadzu, Shim-pack ODS, 5 µm, 20 x 250 mm, fluxo 10 mL min-1, FM = [A + 20- 30% de B], A = solução aquosa de TFA (0,1%, v/v); B = ACN-metanol (1:1 v/v) acidulada com TFA (0,1%, v/v). Capítulo 2 Parte Experimental Oliveira, DM (2012) 44 O Esquema 2.10 (p.43) resume as operações realizadas no estudo cromatográfico do extrato hidrometanólico FAMMA. O material (100 mg) do grupo G7 foi purificada por CLAE semi- preparativa, utilizando a fase móvel constituída de uma mistura binária (A+B), sendo A (70%) = ácido trifluoroacético (TFA) a 0,1% em água deionizada e B (30%) = acetonitrila:metanol (50:50, v/v) contendo TFA a 0,1%. Esse experimento permitiu isolar um sólido (Tr = 27,0-28,6 min, 12,0 mg) na forma de um pó amorfo, amarelo, identificado por análise de dados de RMN (1D e 2D) e EM-IES, como sendo o glicosídeo inédito 3-O-{[α-L-ramnopiranosil(α→6)][α-L-xilopiranosil- (α→3)-O-α-L-ramnopiranosil(α→2)]}-β-D-galacto-piranosídeo de canferol (22). Parte do material (150 mg) do grupo G8, também purificada por CLAE preparativa, utilizando a fase móvel constituída de A(75%)+B(25%), permitiu isolar um sólido (Tr = 18,5-20,3 min, 14,0 mg) na forma de um pó amorfo, amarelo claro, identificado por análise de dados de UV, IV, RMN e EM-IES como sendo o glicosídeo 3-O-{[α-L-ramnopiranosil(1→6)]-O-[β-D-xilopiranosil(1→3)- O-α-L-ramnopiranosil(1→2)]]-β-D-galacto-piranosídeo de quercetina (21), um composto inédito. Com as mesmas condições cromatográficas aplicadas na purificação de 21, o grupo G8 forneceu o sólido (Tr = 20,4-23.9 min), um pó amarelo e amorfo, identificado na análise de dados espectrométricos (IV, RMN e EM-IES) como sendo 3-O-{[α-L-ramnopiranosil (1→6)][β-D- xilopiranosil(1→3)-α-L-ramnopiranosil(1→2)]}-β-D-galactopiranosídeo de isoramnetina (23), outro glicosídeo inédito. A purificação de G9 e G10, utilizando a fase móvel constituída de A(80%)+B(20%) forneceu um sólido (Tr = 28,7-29,6 min, 6,5 mg), na forma de um pó amorfo, amarelo claro, identificado por análise de dados de RMN (1D e 2D) como sendo o glicosídeo 3- O-{[α-L-ramnopiranosil(α→6)][α-L-ramnopiranosil(α→2)]}-β-D-galactopiranosídeo de quercetina (20), flavonoide isolado anteriormente de M. ilicifolia.38 O estudo das demais frações não levou à obtenção de substâncias puras. CÁLCULOS TEÓRICOS E ESTUDO POR DIFRATOMETRIA DE RAIOS-X Nas análises de difração de raios X, foi utilizado o difratômetro Siemens D5000, do DQ, UFMG, operado a 40 KV, 30 mA, com Cu Kα (λ = 1,54056 Å), com grafite monocromador e escaneado na faixa angular de 4-40° (2θ) com passo de 0,01° (2θ) e constante de tempo de 15 s/passo. A amostra foi submetida a rotação de 60 ciclos/min. Os cálculos teóricos com os confôrmeros ccccc e cccbb de 5 foram realizados utilizando o programa Gaussian 03.135 Na determinação estrutural de 5 e 14 foram utilizadas metodologias Hartree-Fock (HF)147 e DFT/B3LYP150-151 com aplicação dos conjuntos de bases 6-31G(d) e 6-31G(d,p), respectivamente.152-153 Na indexação dos dados de difração foi utilizado o programa DICVOL91. Capítulo 3 Metodologia da Determinação Estrutural 45 Oliveira, DM (2012) NEPLAM – DQ-ICEX - UFMG 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO Oliveira, DM 2012 Capítulo 3 Metodologia da Determinação Estrutural 46 Oliveira, DM (2012) Método Aplicado na Elucidação Estrutural dos Compostos Isolados A técnica de elucidação estrutural aplicada neste estudo foi baseada no método heurístico, que consistiu em encontrar, entre estruturas geradas hipoteticamente, uma que apresentasse características espectroscópicas e físico-químicas (obtidas por simulação) idênticas, ou muito próximas, das características que foram obtidas experimentalmente para um dado composto a ser elucidado. Basicamente, a técnica seguiu uma rotina (Figura 3.1, p.48), na direção de identificar fragmentos moleculares presentes nos compostos estudados, através da comparação entre os dados espectroscópicos e físico-químicos obtidos experimentalmente e os dados contidos na literatura especializada. As fontes de dados utilizadas foram disponibilizadas, principalmente, pelo sistema CAPES84, como a base de dados SciFinder (Chemical Abstrats). Foram consultadas, também, fontes de dados públicos na Web, como: SDBS-AIST85, NIST86, HMDB87, JST-BIRD (MassBank)88, NMRShiftDB89, e sites de grandes universidades, a exemplo da Biblioteca Digital da UNICAMP90. Como pode ser visto na Figura 3.1 (p.48), no início da rotina para se descobrir a correlação exata entre os dados espectroscópicos de uma substancia isolada durante o estudo fitoquímico e a sua estrutura química exata atribuída a esses dados, é necessário consultar informações de bancos de dados ou de publicações específicas para se verificar se essa substância é conhecida. A partir desse ponto, considerando que a substância isolada é inédita, a rotina das elucidações estruturais tem início com a identificação de um conjunto de fragmentos e subestruturas moleculares que mostrem correlações com os dados espectroscópicos (IV, RMN, UV, etc.) da substância isolada. A partir desses fragmentos e subestruturas são geradas as estruturas hipotéticas necessárias para simulações computacionais de otimização estrutural e dados de RMN, a fim de servir de apoio para resolver a estrutura real do composto isolado. No presente estudo as estruturas hipotéticas foram feitas utilizando programas computacionais que permitem o desenho de estruturas químicas tridimensionais e salvos em arquivos de modelagem tipo MDL (com extensão MOL), os quais são fornecidos gratuitamente pela internet (JMOL, ACD/ChemSketch, etc.). Seguindo com as estruturas hipotéticas desenhadas, procede-se a transferência destas para programas de modelagem molecular e depois para programas que simulam parâmetros de RMN. A maior parte das análises conformacionais foi feita com o uso do sistema de modelagem molecular da PERCH93 com o programa MMS-Molecular Modeling Software da PERCH NMR TOOLS, Versão 2007.2. Foram utilizados também os programas Gaussian Capítulo 3 Metodologia da Determinação Estrutural 47 Oliveira, DM (2012) V.03137 e SPARTAN 4.1.3155 nas otimizações de geometrias e simulação de parâmetros de RMN por meio de cálculos ab initio HF e DFT no estudo de elucidação estrutural e conformacional do composto 14 (p.120). Seguindo com o método de aproximação tentativa/erro, dito heurístico, a elucidação estrutural de um composto inédito foi feita pela comparação entre os dados simulados para cada estrutura hipotética e os dados experimentais. Essa etapa de comparação foi seguida por repetidas vezes, até que a correlação entre os dados calculados e experimentais apresentassem a melhor convergência possível e a enésima estrutura química testada permita a completa atribuição dos dados de RMN do composto isolado. O método de quantificação da proximidade de convergência foi feito mediante a avaliação dos índices de correlações de Pearson (R) e similaridade entre cossenos.91,92 Nos cálculos dessa quantificação são utilizados os dados de deslocamentos de RMN de 13C do composto isolado e simulados para a estrutura sob avaliação. Uma estrutura hipotética validada para representar um composto estudado deve apresentar o maior valor de similaridade entre cossenos (> 0,9800) ou o valor do quadrado do coeficiente de correlação (R2) deve maior que 0,9801. O método levou em consideração os erros, limitações e as aproximações intrínsecas aos programas utilizados para realizar as simulações.93, 94 Dados espectrais: RMN 1D, IV, UV, PF BD ou CASE de RMN Pesquisa Bibliográfica Identificar fragmentos estruturais Composto já isolado? Dados adicionais: EM, tR, [α]D, Informações botânicas, etc. Gerar estruturas hipotéticas SRelatório N Simular/comparar dados espectraisAnálise de RMN 2D Extrair informações de conectividade Propor estrutura final Sucesso? Relatório S N 8 1 2 3 4 5 6 7 9 10 Exp. x Simul. convergem? N S 11 12 Figura 3.1. Fluxograma simplificado dos passos seguidos na elucidação estrutural de compostos isolados no estudo fitoquímico de Maytenus acanthophylla. Notas: BD: banco de dados; CASE: Computer-Aided Structure Elucidation (Elucidação Estrutural Assistida por Computador). 95 Capítulo 3 Metodologia da Determinação Estrutural 48 Oliveira, DM (2012) MATCH-5 – Um banco de dados de espectros de RMN de 13C de TTPC’s Nesse estudo, devido à importância e à grande ocorrência de TTPC’s na planta estudada, foi desenvolvido um interesse especial na elucidação estrutural desses compostos. Na maioria das vezes, a determinação estrutural de um TTPC, sem o apoio de técnicas computacionais, pode demandar muito tempo e ainda assim, permitir a duplicação de esforços associados com a recaracterização de TTPC’s já isolados. Portanto, a etapa de eliminação de réplicas de TTPC’s e apoio no desenho de estruturas hipotéticas para essa classe de compostos foi obtida em consulta a um banco de dados (BD) específico concebido neste trabalho, o MATCH-5. O cerne desse aplicativo computacional consistiu em gerar uma matriz de dados (MD, 812x30) com valores de RMN de 13C de 812 espectros de RMN de TTPC’s. Os 30 valores de δ de 13C correspondentes aos sinais de carbono do esqueleto principal da molécula de um TTPC, constituíram um vetor-registro (1x30) de MD. Todos os dados dos TTPC’s juntos totalizaram 24.360 deslocamentos químicos, compilados de artigos de revisão bibliográfica,96, 97 relatórios, dissertações e teses produzidas no NEPLAM/UFMG. A versão principal do MATCH-5 utilizada neste estudo foi escrita para Matlab. A construção da matriz de dados operacional para consulta ao banco de dados foi feita a partir de um algoritmo matemático utilizando recursos de álgebra linear98, conforme as etapas abaixo: 1. Calcular os autovalores e correspondentes autovetores da matriz de dados bruta (MD). 2. Classificar os autovetores de MD pela magnitude de seus autovalores. 3. Escolher um novo posto para a matriz de dados operacional (M) por análise de componentes principais (redução de dimensionalidade). 4. Projetar os dados sobre esses autovetores. 5. Testar a posição de um vetor de dados desconhecido em M (consulta ao BD) e fornecer a resposta, que consiste no retorno dos correspondentes vetores de MD, que apresentam os maiores valores de similaridade (distância entre cossenos) em relação ao vetor de entrada. À MD de MATCH-5, foi aplicado um método algébrico com a consequente redução da dimensão da matriz de dados original, sem perda das informações contidas nos dados armazenados. Esse recurso algébrico consistiu na decomposição dos valores singulares (DVS). A DVS de MD (MD = USVT) levou à obtenção de uma nova matriz (M), aproximadamente igual a MD, porém, de posto (k) menor (Figura 3.2, p.50), Mk = Uk.(SkVk). Capítulo 3 Metodologia da Determinação Estrutural 49 Oliveira, DM (2012) A entrada de um vetor-registro de consulta ao BD, constituído por 30 registros de δ de 13C (Qq), não contido em MD, pôde ser computada como QqT Mk = QqT Uk(SkVk). Assim, foi possível calcular a posição desse vetor problema (Qq) em relação aos vetores de Mk, mediante cálculo dos cossenos dos ângulos formados entre os módulos dos vetores Qq e dos vetores de Mk (similaridade entre cossenos, Sc). A consulta termina com o retorno dos vetores-registros que apresentaram os cinco maiores valores de Sc (onde, 0≥Sc≤1). MD ~~ = Sk Uk Vk T Uk(SkVk) Figura 3.2. Representação esquemática da redução de posto da matriz de dados (MD) de MATCH-5. O posto ideal de Mk (k = 18) foi obtido pela análise por componentes principais (PCA), que reduziu significativamente (~40%) o espaço de armazenamento da matriz original (MD) e tornou mais dinâmica a consulta ao BD de MATCH-5 na versão para MATLAB. A operacionalização de MATCH-5 como um aplicativo para uso direto por outros estudantes e professores foi feita por meio de uma versão reduzida e otimizada para ser executada no Excel (Figura 3.3, p.51). A versão MATCH-5/Excel foi instalada em computadores no NEPLAM/UFMG e no NUPRONAT/UESB há mais de 24 meses e está sendo utilizado de maneira satisfatória na rotina de elucidação estrutural de TTPC’s. Esta iniciativa mostrou que um banco de dados, semelhante ao MATCH-5, pode ser feito e servir à consulta automatizada de qualquer outro parâmetro quantitativo obtido em experimentos de laboratório. Passos para a consulta de dados no MATCH-5/Excel: 1. Clicar no botão [Limpar entrada] para limpar a entrada de dados antiga. 2. Digitar os valores de entrada (valores de δ de 13C) nas células da coluna Entrada de Dados RMN da planilha Treinamento. (Podem ser consultados entre 1 e 30 valores simultaneamente). 3. Clicar no botão [Correlação] para que os valores de entrada sejam organizados em ordem crescente. 4. Clicar na no botão [Match TTPC] para consulta e 5. Ler a resposta à consulta na Tabela de Resultados que aparece logo abaixo da coluna de entrada. Essa tabela mostrará os números/nomes e as referências dos três TTPC’s Capítulo 3 Metodologia da Determinação Estrutural 50 Oliveira, DM (2012) contido no BD de MATCH-5, que apresentam os valores de δ de 13C mais próximos dos procurados. Na planilha Treinamento pode-se também consultar as estruturas dos TTPC’s de saída,5 consultando o artigo intitulado (clicar em Link =>) “13C NMR Spectra of Pentacyclic Triterpenoids-A Compilation and Some Salient Features (Mahato et al, 1994),96. A coluna No. (número), a primeira na Tabela de Resultados, apresenta o número da estrutura do composto conforme numeração no artigo. Figura 3.3: Espelho da planilha de entrada de dados e consulta de valores de δ de RMN de 13C de TTPC’s em um BD do programa MATCH-5 construído com dados da literatura. Versão 5 para planilha eletrônica (tipo Excel). Determinações estruturais dos compostos obtidos Utilizando a metodologia descrita acima, neste estudo, foram identificadas e elucidadas as estruturas de 30 compostos, entre constituintes químicos e derivados obtidos das folhas de M. acanthophylla, sendo 21 compostos puros (19 isolados e dois derivados) e nove na forma de misturas. Foi feita também, por métodos cromatográficos e espectroscopia de massas, a identificação de seis glicosídeos flavônicos que não puderam ser isolados. Capítulo 3 Determinação Estrutural de 1 Oliveira, DM (2012) 51 Mistura de Hidrocarbonetos (1) A mistura de hidrocarbonetos (1) foi obtida das frações F1-2, isoladas por CC (CC-1) do extrato hexânico FHEMA, na forma de escamas brancas brilhantes, com faixa de fusão entre 58,7-63,5 °C. O espectro de absorção de 1, na região do infravermelho (Figura 3.5, p.53), apresentou bandas que evidenciaram a natureza alifática do seu conteúdo, característica de hidrocarbonetos. Bandas de absorções intensas, devido a estiramento de ligações C-H de grupos metilas e metilenos (υ-CH), entre 2800-2950 cm-1. Duas bandas de absorção, sendo uma banda de intensidade média em 1378 cm-1 e outra de forte intensidade centrada em 1471 cm-1, foram atribuídas a deformações de ligações C-H (δ-CH). Uma banda intensa em 720 cm-1 foi associada à deformação de ligações C-H em fase de grupos metilênicos, onde o número desses grupos é maior que quatro unidades em uma única molécula99. A identificação foi possível pela comparação dos valores dos índices de retenção (I) calculados para a coluna SE-30, a partir dos tempos de retenção obtidos nos cromatogramas de F1-2 e os de uma série de hidrocarbonetos padrão (Figura 3.4), contendo principalmente os n-alcanos homólogos de cadeia entre C-31 a C-35. Figura 3.4: Cromatograma obtido por CGAR de 1 e padrões de HC (C31-C36). Coluna: SE-30, 30 m, 0,25 mm DI, 0,25 µm (capilar) de metilpolisiloxano; Temperaturas: rampa de 200 a 320 °C, razão de 5 °C/min, isotérmica por 1 min a 320 °C. Injetor a 280 °C e detector (FID) a 300 °C. CH3 CH3 1 n = 26 a 31 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 1 Oliveira, DM (2012) 52 A mistura de hidrocarbonetos (1) foi identificada, por CGAR, como uma série de n- alcanos de cadeia longa (C-31 a C35, os mais abundantes) (Tabela 3.1), onde a metade (50,4 %) da distribuição de massa total foi devida ao alcano linear C-33. Entretanto, o segundo componente mais abundante (38,7 %), possivelmente um HC ramificado, que apresentou o valor de índice de retenção (I = 3185) de um HC com o número de unidades metilênicas entre 31 e 32. Tabela 3.1: Dados do cromatograma obtido por CGAR de 1 e de padrões de n-alcanos Padrões n-alcanos F1-2 Pico Cn TR (min) IA Pico TR (min) I Área pico (%) C30 - - 1 14,25 3016 0,86 6 C31 15,46 3100 2 15,45 3100 2,84 C31(B) 3 16,53 3185 38,74 7 C32 16,69 3200 4 16,67 3196 3,66 9 C33 17,95 3300 5 17,99 3307 50,40 10 C34 19,04 3400 6 19,07 3400 2,77 11 C35 20,27 3500 7 20,22 3496 0,72 12 21,02 (A) Na identificação através do índice de retenção (I) foi utilizada a faixa de variação de 20 unidades (I± 20), calculada com base na separação entre dois picos (C-34 e C-35) do cromatograma da série homóloga de n-alcanos (padrões). (B): HC ramificado; I = índice de retenção em coluna cromatográfica (SE-30); Coluna: SE-30, Alltech (EUA), 30 m, 0,25 mm DI, 0,25 µm (capilar) de metilpolisiloxano; Temperaturas = rampa de 200 a 320 °C, razão de 5 °C/min, isotérmica por 1 min a 320 °C. Figura 3.5: Espectro de absorção de 1 na região do IV. 71 9. 07 72 9. 42 89 0. 0010 52 .0 7 13 78 .3 0 14 61 .8 2 14 71 .9 5 23 29 .7 5 28 46 .8 9 29 14 .5 5 29 54 .2 3 36 08 .8 3 37 29 .7 9 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 % Tr an sm itt an ce 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 Wavenumbers (cm-1) Capítulo 3 Determinação Estrutural de 2 Oliveira, DM (2012) 53 2,6,10,15,19,23-Hexametil-(6e,10e,14e,18e)-tetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaeno, esqualeno, (2) 25 23 3 4 519 7 8 915 11 12 13 14 10 1617 18 6 20 21 22 2 1 24 30 29 28 27 26 2 O constituinte 2 foi originado do fracionamento do extrato hexânico das folhas de Maytenus acanthophylla (FHEMA) e consistiu em um óleo de cor amarelo-esverdeada, viscoso, solúvel em clorofórmio. Em análise por CCD, 2, usando hexano como eluente, apresentou uma única mancha azul (RF em ~ 0,60) abaixo da mancha observada para os hidrocarbonetos C-30 a C-33. No cromatograma CGAR de 2 (Figura 3.6), o pico 2 (tR 11,69 min) foi atribuído a eluição do esqualeno, com base na comparação entre o valor do índice de retenção cromatográfico (I = 2689), calculado com os dados de tempo de retenção de uma série homóloga de HC’s padrões (C- 22 a C-33) isolados de plantas. O índice de retenção calculado foi comparado ao valor do índice de retenção publicado (I = 2663) para uma coluna HP-Ultra-1.100 similar à coluna SE-30 utilizada neste estudo. A confirmação do isolamento do esqualeno foi feita através das análises dos dados de EM, IR e RMN de 2. Figura 3.6: Cromatograma de análise por CGAR de 2. Condições: Coluna SE-30, capilar, 30 m x 0,25 mm de diâmetro interno, filme de 0,25 nm de metilpolisiloxano, Alltech, USA. Temperaturas: coluna: Inicial a 200 °C, final até 320 °C por 1 min, a uma taxa de 5 °C/min. Detector e injetor operaram a 320 ºC. O índice de retenção (I) foi igual a 2689, calculado com base no cromatograma de uma série homóloga (C- 22 a C-33) de HC (padrões). O cromatograma de íons totais (TIC, Figura 3.7), obtido através da análise CG-EM de 2, apresentou o pico em tR 12,14 min. A análise do EM associado a esse pico (Figura 3.8) mostrou que foram detectados íons fragmentos em m/z 69 (100%), m/z 81 (48%), 121(7%), 137(5%), Capítulo 3 Determinação Estrutural de 2 Oliveira, DM (2012) 54 273(0,1%); 341(0,25%) e 409 (traços). A consulta ao banco de dados da biblioteca de EM’s Wiley 138, residente na estação de trabalho do CG-EM, identificou o espectro de massas de 2 como sendo equivalente ao do esqualeno (p = 0,91). Os valores destes íons coincidiram com a literatura referente ao esqualeno101. Na Figura 3.9 (p.56) consta a proposta de fragmentação do esqualeno para os principais íons da EM-IE obtida de 2. Figura 3.7: Cromatograma de íons totais (TIC) obtido por CGAR-EM de 2. Condições: Coluna HP-1, capilar, 30 m x 0,25 mm de diâmetro interno, filme de 0,25 nm de metilpolisiloxano, Agilent, USA. Temperaturas: coluna: Inicial a 200 °C, final até 320 °C por 1 min, a uma taxa de 5 °C/min. Detector e injetor operaram a 280 °C. Figura 3.8: EM associado ao pico em TR = 12,14 min do TIC de 2. O espectro de absorção na região do infravermelho de 2 (Figura 3.10, p.57) apresentou bandas características de hidrocarbonetos de cadeia insaturada com ramificações. Uma banda intensa em 2700 a 2870 cm-1 foi atribuída a estiramentos de ligações C-H de grupos CH2 e CH3. As bandas fracas e conjugadas na região 1650-1680 foram atribuídas a alongamentos de ligações duplas carbono-carbono (C=C). A banda de absorção em 1450 cm-1 foi atribuída a deformações δ (C-H) próprias de alcanos e alcenos ramificados. Uma banda forte em 1380 cm-1 foi atribuída a deformações δ (C-H) de grupos metilas em cadeias laterais. A absorção em 830 cm-1 foi atribuída a deformações angulares fora do plano em ligações C-H de grupos -C=C-H. A banda em 3300 cm-1 foi atribuída a grupos hidroxilas, provavelmente surgidas devido à auto-oxidação do Capítulo 3 Determinação Estrutural de 2 Oliveira, DM (2012) 55 esqualeno,102 ou relacionadas a um possível teor de umidade adsorvida na janela de amostragem do espectrômetro de IR. + + + ++ +. H +. + C6H9 m/z 81,07 (48,0%) C5H9 m/z 69,07(100%) [C5H8][C4H8] C10H17 m/z 137,13 (5,0%) C9H13 m/z 121,10 (7,0%) [C11H20] [C10H16] C20H33 m/z 273.26 (0,10%) [C5H8] C25H41 m/z 341,32 (0,25%)C27H42 m/z 366,61 (traços) [C5H8] C30H49 [M-H] + m/z: 409,38 (traços) C30H50 [M] +. m/z 410,39 (Não detectado) [C3H8] Figura 3.9: Fragmentograma do esqualeno com base no EM de 2. Os espectros de RMN de 1H (Figura 3.11, p.57) e 13C (Figura 3.12, p.58) de 2 apresentaram sinais de hidrogênios (δ 5,08-5,15) e de carbonos (δ 124,30-135,12) em regiões características de compostos com ligações duplas e foram indicativos da natureza olefínica de 2. Os valores referentes às integrações dos sinais de hidrogênios olefínicos (δ 5,05-5,20, 6H) e metilênicos (δ 1,93-2,12, 20H) foram condizentes com a estrutura proposta para 2. O espectro de RMN de 13C Capítulo 3 Determinação Estrutural de 2 Oliveira, DM (2012) 56 apresentou 15 sinais (Tabela 3.2), os quais foram atribuídos, inicialmente, a quatro grupos CH3 na região de δ 16,01-25,69, quatro CH2 na região de δ 26,69 a 39,77, quatro CH entre δ 124,30 a 124,44 e três carbonos não hidrogenados situados entre δ 131,26 a 135,12. Essas atribuições indicavam tratar-se de um composto com estrutura isoprenóide C-15, tipo farneseno. Entretanto, a comparação entre os dados de RMN encontrados na literatura para o esqualeno (Tabela 3.2), bem como as análises feitas mediante a integração dos sinais de RMN de 1H e a EM mostrando a detecção dos íons em m/z 273, 341 e 409, contribuíram para a proposição de uma estrutura simétrica derivada de um grupo difarnesila (C-30), o esqualeno (2).101,103,104 25 23 3 4 519 7 8 915 11 12 13 14 10 1617 18 6 20 21 22 2 1 24 30 29 28 27 26 2 Tabela 3.2: Comparação entre os valores de δ de 13C e 1H de 2 (CDCl3, 400 MHz) e os valores publicados para o esqualeno101, 104 C δ 13C δ 1H 2 Lit101, 104 2 Lit101, 104 27 e 30 -CH3 16,01* 16,1 1,60 (s) 1,60 (s) 1,60 (s) 1,58 (s) 1,58 (s) 1,58 (s) 28 e 29 16,06* 16,1 24 e 26 17,68 17,8 1e 25 25,69 25,8 1,68 (s) 1,67 (s) 8 e 17 -CH2- 26,69 26,7 1,97 – 2,09 (m) 1,90 – 2,10 (m) 4 e 21 26,80 26,8 12 e 13 28,30 28,3 5 e 20 39,75* 39,8 9 e 16 39,77* 39,8 7 e 18 -CH= 124,30* 124,3 5,08 – 5,15 (m) 5,03 – 5,17 (m) 3 e 22 124,34* 124,4 11 e 14 124,44 124,5 2 e 23 =C= 131,26 131,3 10 e 15 134,91 135,0 6 e 19 135,12 135,2 (*) Atribuições intercambiáveis. Capítulo 3 Determinação Estrutural de 2 Oliveira, DM (2012) 57 T (% ) Número de onda (cm-1) 2850 1680 1650 3200 1715 1450 1380 830 Figura 3.10. Espectro de absorção de 2 obtido na região do infravermelho (filme de NaCl). 25 23 3 4 519 7 8 915 11 12 13 14 10 1617 18 6 20 21 22 2 1 24 30 29 28 27 26 2 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 5.25 5.20 5.15 5.10 5.05 5.00 2.20 2.10 2.00 1.90 1.80 1.70 1.60 1.50 Expansão C Expansão B B δ Expansão A δ δ δ Hidrogênios metilênicos H's metínicos olefínicos A C ppm Integral 0.98 - 0.81 5.4 1.34 - 1.09 33.0 1.64 - 1.53 25.9 1.70 - 1.64 9.7 2.12 - 1.93 20.3 5.20 - 5.05 6.0 6H Graxa 20H Hidrogênios metílicos Figura 3.11. Espectro de RMN de 1H de 2 (CDCl3, 400 MHz). Capítulo 3 Determinação Estrutural de 2 Oliveira, DM (2012) 58 25 23 3 4 519 7 8 915 11 12 13 14 10 1617 18 6 20 21 22 2 1 24 30 29 28 27 26 2 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 124.5 124.4 124.3 124.2 135 134 133 132 131 17.5 17.0 16.5 16.0 28 27 26 25 28.5 28.0 27.5 27.0 26.5 26.0 25.5 25.0 124.5 124.4 124.3 124.2 B Expansão C δ C-2/22 C-7/18 Expansão B D C-5/20 C-9/16 ExpansãoD Expansão A C δ δ δ δ δ δ A C-8/17 C-12/13 C-9/16 C-5/20 ED C-11/14 Expansão A C-10/15 C-6/19 C-2/23 (a) C-1/25 C-27/30 C-28/29 Expansão E (b) C-12/13 C-8/17C-4/21 C-24/26 C-4/21 C-24/26 C-11/14 C-7/18C-3/22 Figura 3.12: Espectro de (a) RMN de 13C e (b) DEPT-135 de 2 (CDCl3, 100 MHz). Capítulo 3 Determinação Estrutural de 3 59 Oliveira, DM (2012) 1,4-Trans-poliisopreno (guta-percha, 3) O constituinte 3 foi obtido de extratos hexânicos a quente (0,5 ± 0,05 %), por extração em aparelho Soxhlet (extratos GHEMA) a partir das folhas de Maytenus acanthophylla. Esse constituinte tinha a aparência uma goma branco-amarelada, semelhante ao que foi obtido anteriormente nas raízes dessa planta29. A análise por CCD, com padrão de guta-percha, confirmou o isolamento do biopolímero e, posteriormente, análises espectrométricas (IV e RMN 1D) confirmaram a estrutura do composto 1,4-trans-poliisopreno (3). O termograma de calorimetria exploratória diferencial (DSC) (Fig. 3.13A, p.61) de 3, obtido no primeiro aquecimento (primeira varredura), apresentou dois picos endotérmicos em 51,9 e 60,2 OC e o termograma DSC, obtido durante o reaquecimento da amostra (segunda varredura, Figura 3.13B, p.61), registrou um pico endotérmico em 41,2 oC. Esse comportamento térmico indicou que 3, de modo similar ao que ocorre com o 1,4-trans- poliisopreno (TPI), apresenta polimorfismo, sendo duas formas cristalinas α e β (Figura 3.16, p.62) e uma forma amorfa105. O polimorfismo de 3 ficou evidente mediante a análise do termograma DSC na primeira varredura, através do pico endotérmico em 51,9 °C, que foi atribuído à mudança da forma β para a forma α. Nesse mesmo termograma foi observado um segundo pico endotérmico em 60,2 °C, que foi atribuído à transição da fase α para a fase amorfa. O segundo termograma (Figura 3.13B, p.61) apresentou um pico em 41,2 °C atribuído a transição de fases de 3 da forma β  pura direto para a forma amorfa. Em resumo, comportamento térmico de 3 observado na preparação da amostra e análise por DSC pode ser simplificado como segue: Forma β forma α forma amorfa Forma amorfa (T > 60 °C) forma β Forma amorfa (T > 60 °C) forma α H CH3 n1 2 3 4 5 (α) (β) (δ) (ε) (γ) (3) Resfriamento temperatura ambiente Arrefecimento rápido gelo ou fluxo de N2 líquido ∆ (41,2 °C – 51,9 °C) ∆ (60,2 °C) Capítulo 3 Determinação Estrutural de 3 60 Oliveira, DM (2012) Os valores encontrados para as temperaturas de transição de fases do biopolímero 3 por DSC, bem como o caráter de reversibilidade entre as formas cristalinas e amorfas foram concordantes com os relatos encontrados na literatura para o TPI. 105,106 Figura 3.13: (A) Termograma DSC de uma amostra de 3 (1,06 mg), obtida em um aparelho Shimadzu DSC-50 (UFMG), em uma célula de alumínio e atmosfera de gás hélio (He, 50 mL/min), com varredura entre os valores de temperatura de 25 a 100 oC, mantido a 100 oC por 10 min e taxa de aquecimento de 20 oC/min; (B) Termograma DSC de uma amostra de 3 (reaquecimento), com varredura entre os valores de temperatura de -100 a 200 oC e taxa de aquecimento de 20 oC/min. A temperatura de transição vítrea (Tg) de 3 foi calculada em -69,5 oC (203,67 K), conforme a termograma DSC (Figura 3.14), obtida com o aquecimento da amostra previamente resfriada abaixo de -100 oC, através de nitrogênio líquido. Esse valor de Tg foi encontrado bastante próximo do valor publicado para a guta-percha e para o polímero sintético trans-poliisopreno (TPI)107. Figura 3.14: Termograma DSC de uma amostra de 3 (1,00 mg), obtida em um aparelho Shimadzu DSC-50 (UFMG), utilizando uma célula de alumínio e atmosfera de gás hélio (He, 50 mL/min), com varredura entre os valores de temperatura de -110 a 200 oC e taxa de aquecimento de 20 oC/min. 100 100.00 ||||| 80.00 |||| 60.00 ||| 40.00 ||| 20.00 || -2.00 -1.00 0.00 1.00 mW mg-1 T(oC) 60.17 51.94 (A) 200.00100.000.00-100.00 0.00 -1.00 41.19 mW mg-1 T(oC) (B) -100.0 -80.0 -60.0 0.00 -0.20 -0.40 -0.60 T (oC) DSC (mW) Onset -69.53 οC Endset -70.47 οC Mid point -69.49 οC Transition 0,004 mW Capítulo 3 Determinação Estrutural de 3 61 Oliveira, DM (2012) A curva termogravimétrica (TGA), obtida com o aquecimento de uma amostra de 3 (1,0 mg) sob fluxo de ar (50 mL/min) (Figura 3.15), mostrou que esse constituinte apresentou estabilidade térmica, sem significativa perda de material, até a temperatura de aproximadamente de 120 oC e entrou em processo de degradação rápida a partir de cerca de 260 oC. Figura 3.15: Curvas TGA (linha contínua) e DTGA (linha pontilhada) de uma amostra de 3 (1,0 mg), obtida em um aparelho Shimadzu TGA-50H (UFMG), em uma célula de alumínio e atmosfera de ar (50 mL/min), com varredura entre os valores de temperatura de 0,00 a 800,00 oC e taxa de aquecimento de 20 oC/min. Figura 3.16: Estruturas das formas cristalinas α e β do biopolímero natural 1,4-trans-poliisopreno. A taxa de perda de massa foi máxima em 407 oC e o material foi totalmente degradado quando a temperatura alcançou cerca de 600 oC. Na faixa de temperatura entre 130 a 255oC ocorreu a liberação de compostos voláteis, resultantes da despolimerização da cadeia de 3, possivelmente por cisões da cadeia polimérica, seguidas de reações radicalares, onde os mecanismos e rearranjos são análogos ou derivados dos que ocorrem na auto-degradação térmica de poliisoprenos (Figura 3.18, p.64), gerando, por exemplo, compostos como 4-metil- 4-vinil-butirolactona e metilvinilcetona.108, 109 0.00 200.00 400.00 600.00 800.00 T( oC) DTGA (---) mg/min TGA (__) (%) 0.00 0.20 0.40 0.60-100.00 0.00 100.00 200.00 H H H H forma α forma βn n Capítulo 3 Determinação Estrutural de 3 62 Oliveira, DM (2012) O espectro de absorção na região do infravermelho de 3 (Figura 3.20A, p.66) mostrou um conjunto de frequências de absorções característico de um hidrocarboneto acíclico poli- insaturado. As bandas de absorção centradas em 2980, 2900, 1665, 1450, 1385 cm-1 e em 880 e 800 cm-1 indicaram que o constituinte 3 foi isolado na forma cristalina β (Tabela 3.3). A ausência de bandas de absorção em 1580, 1540, 860 e 780 cm-1, reforçaram a proposição de que o composto 3 não se encontrava na forma α.110 Tabela 3.3: Absorções na região do infravermelho de 3 na forma cristalina β (NaCl) Nº de onda (cm -1) Intensidade Tipo de vibração 2980 Forte ν(=C−H) 2920 Forte νs(CH3) 2850 Forte νs(CH2) 1665 Fraca ν(C=C) 1450 Forte δ(CH2) 1385 Forte δs(CH3) 1215 Fraca δnp(=C−H) 1150 Fraca γ(CH2) 1110 Fraca ν(C−C) 880 Média δfp(=C−H) 800 Média ν(C−CH3) 750 Fraca γr(CH2) Abreviações: ν: estiramento; δ: dobramento ou deformação angular γ: torção ou oscilação; γr: rotação; as: assimétrico; s: simétrico; np: no plano; fp: fora do plano. Fonte: Espectro de 3 na região do infravermelho (Figura 3.20, p.67). No espectro de RMN de 1H (400 MHz, CDCl3, Figura 3.21, p.67), os sinais em δ 1,60 (sl, 3H) e 1,98 (m, 2H), 2,07 (m, 2H) foram atribuídos aos hidrogênios dos grupos metila (ε) e metilênicos (γ, δ), respectivamente. O pseudo tripleto (like a triplet) em δ 5,12 (pseudo t, J = 6,3 Hz, 1H) foi atribuído ao hidrogênio olefinico (β). Os valores normalizados das integrais desses sinais de RMN de 1H foram equivalentes ao número de hidrogênios esperados na estrutura monomérica de 3. As frequências dos sinais de RMN de 13C (100 MHz, CDCl3, Figura 3.22, p.67) foram observadas em δ 16,05 (C-5), 26,77 (C-4), 39,77 (C-1), 124,29 (C-3) H CH3 n1 2 3 4 5 (α) (β) (δ) (ε) (γ) (3) Capítulo 3 Determinação Estrutural de 3 63 Oliveira, DM (2012) 3 4 5 2 3 4 5 6 7 Lo g ( MM ) Tr (min) e em δ 134,96 (C-2). A Tabela 3.4 apresenta a comparação entre os dados de RMN obtidos experimentalmente e os encontrados na literatura.27 Tabela 3.4: Comparação dos valores de deslocamentos de RMN de 1H e de 13C de 3 (CDCl3, 400 MHz) com dados da literatura (CDCl3, 400 MHz) 101, 104 δ de 13C δ de 1H C 3 Lit27 3 Lit27 C-1(γ) 39,77 40,2 H-1a(γ) 1,98 (m) 2,04 (m) C-2(α) 134,96 135,4 H-1b(γ) 1,98 (m) 2,04 (m) C-3(β) 124,29 124,7 H-3(β) 5,12 (pseudo t, J = 6,3 Hz) 5,17 (m) C-4(δ) 26,77 27,2 H-4a(δ) 2,07 (m) 2,12 (m) H-4b(δ) 2,07 (m) 2,12 (m) C-5(ε) 16,05 16,5 H-5(ε) 1,60 (sl) 1,65 (s) A cromatografia GPC (Figura 3.17), desenvolvida com poliestirenos padrões de massas molares variadas, foi utilizada para determinar a massa molar de 3. A curva de eluição da Figura 3.17 (à direita) permitiu estimar os valores de massa molar ponderal media (MW) em 4,48 x 104 e massa molar média numérica (Mn) igual a 3,05 x 104 g mol-1 para esse biopolímero. Esses valores foram coerentes com valores de Mn e MW encontrados para guta- percha natural como a que foi extraída de folhas de Eucommia ulmoides (Eucommiaceae). 111 Figuras 3.17: Curva de calibração obtida pela eluição de padrões de poliestireno (PS, à esquerda) e o cromatograma de 3, sobreposto à curva ajustada dos padrões de PS (à direita). Os cromatogramas GPC foram obtidos em um cromatográfo Shimadzu, mediante a injeção de uma amostra de 3, dissolvida em THF (20 µL). Coluna HRC-SIL 5 µm, 250 x 4,6 mm (Shimadzu), utilizando THF como fase móvel (fluxo de 0,5 mL min-1) e registro de dados em um detector de UV (λ 230 nm). Parte do material de 3, após ser exposto à luz e temperatura ambiente por duas ou mais semanas, tornou-se uma pasta amolecida, amarela e de odor rançoso. Após análises por IV (Figura 3.20 B, p.66) e comparação com os dados da literatura, ficou constatado que todo Capítulo 3 Determinação Estrutural de 3 64 Oliveira, DM (2012) conteúdo de 3 havia sofrido uma degradação oxidativa. As duplas ligações alternadas e ramicações por grupos metilas de poliisoprenos (PI) favorecem a reação de degradação por oxidação. Entretanto, a degradação do PI pode ocorrer por fatores físicos, como defeitos provocado por choques e contusões, luz, calor, bem como por fatores químicos e ambientais, como oxigênio, ozônio do ar atmosférico, impurezas metálicas e também por fatores biológicos como a presença de enzimas e microrganismos.109,112,113 Nas condições em que o material original de 3 degradou, ficou evidente que pode ter ocorrido uma oxidação autocatalítica ou auto-oxidação. O mecanismo da auto-oxidação é radicalar e se inicia com a abstração de hidrogênios α-metilênicos para formar radicais alquila (R•). Na fase de propagação, os radicais alquila são peroxidados pelo ar e formam os radicais peroxilas (ROO•). Nessa etapa da fase de propagação, os radicais peroxilas abstraem hidrogênios e se transformam em hidroperóxidos (ROOH) que formam os radicais alcóxilas e, além de poderem formar mais radicais peroxila e hidroxila, desencadeiam a expansão da cadeia oxidativa e a multiplicação de espécies radicalares (Figura 3.18).102,108,113 Figura 3.18: Proposta de rota auto-catalítica simplificada e o ciclo para representação do mecanismo de degradação oxidativa de 3, deduzidos com base nas análises espectrométricas e em dados da literatura para poliisoprenos (PI).102,108,198,113 Na terceira e última etapa ocorre a terminação, quando acontecem reações de adição, despolimerização por clivagens-β, rearranjos e recombinações entre radicais. Nesse processo multi-etapas (RH → R• + O2 → ROO• → RO• → clivagens-β), podem ser formados compostos fixos e voláteis de diversas classes, tais como alcenos, alcoóis, éteres, aldeídos, cetonas e ácidos carboxílicos.114 Entretanto durante a auto-oxidação de PI, foi visto que os alcoóis e éteres são os principais produtos e o mecanismo de formação dos produtos envolve R H R H- R CR R CHR hν (λ 300-350 nm), ∆, defeitos, contusão, impurezas. O O OO R R OO C R R O O2x O O OO OO C R R H OOH OO OO R Rradical alquenila (R ) radical peroxila (ROO ) hidroperóxido (ROOH) Os radicais alcoxilas sofrem clivagens, rearranjos, reações radicalares e formam os produtos da auto-oxidação. Produtos: água, alcoóis, epóxidos, alcenos, cetonas, aldeídos, ésteres, ácidos carboxílicos. Poliisopreno (RH) R H Processos multietapas R + O OO OO R R radical alcoxila (RO )radical peroxila (ROO ) + ROOH/ -H2O ROO-H ROO + RH R ROO R + ROOH RH RO + ROO Clivagem-β H2O ROH, ROR1, RCOH, ROR2, R(C=O)R2 R + OH O2 RH Capítulo 3 Determinação Estrutural de 3 65 Oliveira, DM (2012) preferencialmente os radicais alcoxílas.113 As análises dos espectros no IV (Figura 3.20, p.66) e a cromatografia por GPC de 3 (Figura 3.19), antes e depois da degradação oxidativa, permitiram avaliar qualitativamente as principais mudanças que ocorreram na estrutura do polímero e concluir que os grupos funcionais identificados foram consistentes com os produtos da degradação oxidativa de PI’s. O espectro de absorção na região do infravermelho do material auto-oxidado de 3 (Figura 3.20B, p.66) apresentou um aspecto geral característico de uma mistura complexa de com múltiplos compostos orgânicos. Foi observada uma banda forte e larga centrada em 3380 cm-1, atribuída a grupos hidroxilas de alcoóis e ácidos. Foram observadas também bandas sobrepostas entre 1680-1800 cm-1, indicativas da presença de cetonas, ácidos carboxílicos e possivelmente de ésteres. As múltiplas bandas sobrepostas entre 1000 e 1300 cm-1, foram atribuídas a alcoóis (C-O) secundários e terciários, éteres (C-O-C), ésteres e epóxidos (C-O- C). As bandas em 2850, 2950 cm-1 e em 1430 e 1365 cm-1 foram atribuídas às deformações axiais das ligações C-H (CH2 e CH3) da porção alifática dos compostos de despolimerização, bem como, a observação de um ombro em 1660 cm-1 atribuído às deformações axiais das duplas ligações (-C=C-) em compostos olefínicos. Portanto, os valores observados de absorções no espectro no IV da mistura de compostos que resultou da degradação auto- oxidativa de 3 está de acordo com as absorções relatadas para compostos resultantes de processos de degradação oxidativa de poliisoprenos.102,109,112 O cromatograma GPC da mistura de compostos obtidos após a auto-oxidação fortuita de 3 (Figura 3.19) mostrou que houve uma redução profunda na massa molecular do composto original, após o processo de auto-oxidação. Figura 3.19: Cromatograma obtido por GPC do produto de degradação oxidativa de 3 (linha contínua). Curva de calibração (ajustada) de padrões de poliestireno, PS (linha e quadrados). Os cromatogramas GPC foram obtidos em um cromatógrafo Shimadzu, mediante a injeção da amostra dissolvida em THF (20 µL), utilizando uma Coluna HRC-Sil 5 µm, 250 x 4,6 mm (Shimadzu), tendo THF como fase móvel (fluxo de 0,5 mL min-1) e registro de dados dotado de um detector de UV (λ 230 nm). 3 4 5 6 6 4 2 Lo g ( M w ) (% ) 0 25 50 75 100 Tr (Min) 7 8 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 3 66 Oliveira, DM (2012) A curva de eluição GPC (Figura 3.19, p.66) permitiu estimar o valor de massa molar ponderal media (MW) em 239,6 g mol-1 e massa molar média numérica (Mn) igual a 122,6 g mol-1 para a mistura de compostos resultante da auto-oxidação de 3. Esses valores de massas molares encontrados indicam que houve um alto grau de despolimerização109 de (3) e que os compostos finais, obtidos após a degradação oxidativa de 3, provavelmente apresentam cadeias com comprimentos relativos situados entre C-5 e C-15. O processo de degradação oxidativa de TPI pode ser retardado por meio de aditivos, tais como óxidos metálicos redutores e substâncias antioxidantes. Cones odontológicos, preparados com guta-percha (15-22%), ZnO (37-84%), BaSO4 (0-31%) mais graxas (1-10%) ou resinas, são os materiais mais utilizados para obturação de canais em endodontia.115 Dados publicados mostram que a guta-percha de preenchimento de um canal dentário pode diferir para se degradar muito lentamente durante mais de 15 anos após a obturação27. A guta-percha vem sendo utilizada para fins odontológicos por mais de um século e, atualmente, existem poucos matérias sintéticos que podem substituí-la, a exemplo do material Resilon®116, com o mesmo índice para a relação entre custos e benefícios. Figura 3.20: Espectros de absorção 3 na região do infravermelho (NaCl). (A): Início do processo de degradação. (B): Após degradação de 3 por auto-oxidação. H nforma β H A produto de degradação Tr an sm itâ nc ia (% ) Número de onda (cm-1) 2850 2850 2920 2930 3380 1760 1780 1740 1710 1660 1450 1385 1240 1150 1060 1015 890 940 750 725 1665 1450 1385 1215 1150 1110 880 800 B 2980 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 3 67 Oliveira, DM (2012) Figura 3.21: Espectro de RMN de 1H de 3 (CDCl3, 400 MHz). Figura 3.22: Espectro de RMN de (a) 13C e (b) DEPT-135 de 3 (CDCl3, 100 MHz). H CH3 n1 2 3 4 5 (α) (β) (δ) (ε) (γ) (3) 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 5.14 5.12 5.10 5.08 2.02 2.00 1.98 1.96 1.942.12 2.10 2.08 2.06 2.04 2.02 H-1(γ) H−4(δ) H-3(β) δδδ δ H-1(γ)H−4(δ) H-1(ε) ppm Integral 1.02 - 0.85 0.4 1.64 - 1.54 3.0 2.02 - 1.93 2.0 2.12 - 2.03 2.1 2.64 - 2.61 0.4 5.21 - 5.05 1.0 1H 2H 3H 2H H-3(β) 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 δ δ C-2(α) C-5(ε) C-3(β) C-4(δ) (a) C-1(γ) (b) H CH3 n1 2 3 4 5 (α) (β) (δ) (ε) (γ) (3) Capítulo 3 Determinação Estrutural de 4 68 Oliveira, DM (2012) Álcool graxo (4) A fração F15 de C-1, que deu origem a 4 (6,4 mg),uma cera amarela, com ponto de fusão de cerca de 50 oC. O espectro de absorção na região do infravermelho de 4 (Figura 3.23, p.70) apresentou bandas características de uma mistura de hidrocarbonetos e de hidrocarbonetos hidroxilados, semelhantes a alcoóis graxos117. A banda larga e intensa na região de 3200-3700 cm-1 foi atribuída a estiramentos das ligações O-H de grupos hidroxilas. A banda de média intensidade entre 2870 e 2920 cm-1 (B) foi atribuída a estiramentos de ligações C-H de grupos CH3 e CH2, respectivamente. O aparecimento ombros de bandas de absorção com picos em 1470 e 1380 e em 1010-1200 cm-1 indicaram a possibilidade de ocorrência de bandas de absorção sobrepostas de uma mistura de constituintes com cadeia alifática e grupo hidroxila de álcool. A existência de uma cadeia longa de grupos CH2 ficou também evidenciada pela banda de absorção em 800 cm-1. No espectro de RMN de 13C (Figura 3.25, p.71) apresentou um conjunto de sinais mais intensos em δ 14,12; 22,72; 25,97; 29,32; 29,67; 29,71; 31,93; 33,04 e 62,40 que foi relacionado a um álcool graxo de alifático cuja cadeia carbônica é formada com mais de nove átomos de carbonos.118 Mostrou também um grupo de sinais bem menos intensos em δ 19,8; 24,5; 27,1; 28,0; 30,05; 31,84; 32,8; 34,4; 37,1; entre 37,4-37,5 e em 39,4 que foi atribuído a impurezas, possivelmente de um composto alifático ramificado.119,120 Nos espectro de RMN de 13C e DEPT-135 (Figuras 3.25 e 3.26, p.71), o sinal em δ 62,4 e o no espectro de RMN de 1H (Figura 3.24, p.71), o correspondente sinal de hidrogênio em δH 3,65 (t, J = 6,7 Hz) foi atribuído a um carbono metilênico de álcool primário (C-α). O sinal em δ 0,88 (m) foi atribuído ao grupo metílico terminal (ω) de um álcool graxo.99 O simpleto intenso e largo em δH 1,27 e os correspondentes sinais de carbono-13 na região de δ 29,32-29,71 foram atribuídos aos grupos metilênicos em cadeias alifáticas. Os deslocamentos químicos na faixa de δ 1,1 a 1,60 ppm, foram atribuídos a hidrogênios metínicos e metilênicos. A integração dos sinais de hidrogênios correspondeu a cerca de 80 hidrogênios, sendo 21 localizados na região OH α βn ω1 γ δ ω3 ω2 ω4 4 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 4 69 Oliveira, DM (2012) das metilas, o que sugeriu a presença de impureza constituída de um hidrocarboneto com cadeia alifática contendo grupos metilas em ramificações. A literatura apresenta relatos da identificação de hidrocarbonetos ramificados, tipo isoprenóides e alcoóis de cadeia longa em material graxo extraído de cutículas vegetais e em grãos, a exemplo de plantas úteis e comestíveis, a exemplo das frutíferas, Cucumis melo (melão), Lycopersicon esculentum (tomate) e Diospiro kaki (caqui).121-125 As Tabelas 3.5 e 3.6 apresentam a comparação entre os valores experimentais de RMN de 1H e RMN de 13C do álcool graxo de 4 os valores obtidos na literatura para o octadecanol.120 Tabela 3.5: Comparação entre os valores de δ de 13C (CDCl3, 100 MHz) de 4 e os respectivos valores publicados para o octadecanol (CDCl3) 120 Carb. (4) Octadecanol120 α 62,40 62,97 β 31,93 32,86 γ 25,97 25,85 δ 29,44 29,55 (CH2)n 29,67-29,71 29,78 ω 14,12 14,13 ω2 22,72 22,75 ω3 31,93 32,01 ω4 29,32 29,44 Tabela 3.6: Comparação entre os valores de δ de 1H de 4 (CDCl3, 400 MHz) e os respectivos valores publicados para o octadecanol (CDCl3) 120 δH Hid. 4b Octadecanol120 ω 0,88 (m) 0,88 (t, 7,0) α 3,65 (t, 6,7) 3,64 (t, 6,4) β 1,59 (m) 1,57 (m) CH2 1,27 1,26 H2 C n ω α OHβ γ δω2 ω3 ω4 H2 C n ω α OHβ γ δω2 ω3 ω4 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 4 70 Oliveira, DM (2012) Baseado nas análises espectrométricas apresentadas, pode-se sugerir que (4) se trata de um álcool graxo de cadeia longa do tipo CH3(CH2)nCH2OH, n>9, contendo impureza referente a um hidrocarboneto alifático ramificado. 2920 2870 3450 Bandas não consideradas 1470 1380 1090 970 800 Número de onda (cm-1) T (% ) Figura 3.23: Espectro de absorção de 4 na região do infravermelho (filme de NaCl). 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 A δ δ δ H-α metila de 4 OH Integrais δH (1) δH(2) H's 3,6847 3,6278 2.0 1,6289 1,5361 3.2 1,4623 1,0033 53.5 0,9344 0,7608 21.2 impureza A detalhe (CH2)n 3.70 3.65 3.60 3.55 3.50 2H 0.95 0.90 0.85 0.80 0.75 21H 1.60 1.55 2H H-β δ ou acoplamento virtual entre os H´s metilênicos e metílicos. Figura 3.24: Espectro de RMN de 1H de 4 (CDCl3, 400 MHz). OH α βn ω1 γ δ ω3 ω2 ω4 4 Hidrocarboreto ramificado (impureza)+ OH α βn ω1 γ δ ω3 ω2 ω4 4 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 4 71 Oliveira, DM (2012) Figura 3.25: Espectro de RMN de 13C de 4 (CDCl3, 100 MHz). 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 26 24 22 20 18 16 1433.0 32.5 32.0 31.5 31.0 30.5 30.0 29.5 29.0 B δ C-β C-ω2 C-ω1 C-α δ δ A C-ω1 Detalhe B C-γ C-ω2 C-β C-δC-ω3 C-ω4(CH2)n Detalhe A Figura 3.26: Espectro de DEPT-135 de 4 (CDCl3, 100 MHz). 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 33.0 32.5 32.0 31.5 31.0 30.5 30.0 29.5 C-γ C-ω C-α (CH2)n C-ω2 A Detalhe A C-δC-ω4 δ C-ω3C-β δ OH α βn ω1 γ δ ω3 ω2 ω4 4 Capítulo 3 Determinação estrutural de 5 Oliveira, DM (2012) 72 Revisão da elucidação estrutural de 5 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 O 27 26 25 30 H 5 A friedelina (5) foi obtida pura no fracionamento do extrato em hexano das folhas de Maytenus acanthophylla (Celastraceae). O material de 5 se apresentou na forma de um sólido branco cristalino que fundiu na faixa de temperatura de 259,7-262,1 °C (260-263,0 0C)126 e forneceu resultado positivo para TTPC mediante o teste de Liebermann-Burchard (LB+). A identidade de 5 foi confirmada através de CCD por comparação com amostra autêntica. O espectro de absorção de 5, no IV (Figura 3.28, p.76), de modo geral, mostrou bandas em, 2925, 2860, 1710, 1456, 1388, 1175, 987 cm-1, típicas de triterpenos pentacíclicos da classe dos friedelanos.31, 127-130 As bandas em 2860 cm-1 e em 2950 cm-1 foram atribuídas a estiramentos da ligação C-H (ν C-H) de grupos CH3 e CH2, bem como as bandas centradas em 1456 e 1388 cm-1 foram atribuídas a deformações (δ C-H) nesses grupos. Essas bandas evidenciaram a natureza alifática de 5. A banda em 1710 cm-1 foi atribuída a estiramentos da ligação C=O de cetona alifática e saturada.99 Os resultados do estudo conformacional do TTPC pachysandiol B (14, p.124) foram conclusivos para determinar a revisão da elucidação estrutural da friedelina (5) baseada em dados de RMN, considerando a possibilidade de esses dois TTPC’s friedelanos apresentarem estruturas com geometrias comparáveis. A análise do espectro de RMN de 1H de 5 (Figura 3.29, p.77) indicou, na região de valores de deslocamentos químicos dos hidrogênios alifáticos, a ocorrência de sete simpletos em δ 0,73, 0,87, 0,96, 1,00, 1,01, 1,05 e 1,18, atribuídos aos grupos metila. O sinal em 0,88 (d, 6,8 Hz, 3H) foi atribuído aos hidrogênios do grupo metila C-23 ligado em C-4. Foi observado também o sinal em δ 2,39 (ddd, 13,0, 5,0, 2,5 Hz, 1H), atribuído ao hidrogênio Hβ-2(equatorial), e o sinal em δ 2,31 (dd, 13,0, 7,0 Hz, 1H) atribuído ao hidrogênio Hα-2(axial), bem como um quarteto em δ 2,25 (q, 6,8 Hz, 1H), atribuído ao hidrogênio metínico ligado a C-4. As demais atribuições dos sinais de RMN de 1H de 5 Capítulo 3 Determinação estrutural de 5 Oliveira, DM (2012) 73 foram revistas por análise dos dados de RMN 2D (COSY, HSQC, HMBC e NOESY) e comparadas com os valores os valores da literatura (Tabela 3.7, p.74). 126,127 O espectro de RMN de 13C (Figura 3.30, p.77) apresentou um sinal em δ 213,22, típico de carbono sp2 ligado a oxigênio. A análise conjunta dos espectros DEPT-135 (Figura 3.30, p.77) e de RMN de 13C permitiu a identificação de oito sinais em δ 6,83, 14,67, 17,96, 18,67, 20,26, 31,79, 32,11 e 35,03 atribuídos aos carbonos dos grupos metila. Foram atribuídos também os sinais de onze carbonos metilênicos em δ 18,25, 22,29, 30,52, 32,44, 32,80, 35,36, 35,65, 36,03, 39,27, 41,31 e 41,54. Os seis sinais em δ 28,18, 30,01, 37,47, 38,32, 39,72 e 42,16 foram atribuídos a carbonos não hidrogenados e a atribuição de quatro grupos CH em δ 42,82, 53,13, 58,38 e 59,51. Foram encontradas correlações 1JH,C no mapa de contornos HSQC (Figura 3.31, p.78) que permitiram atribuir os sinais de RMN de 1H e 13C relativos a quatro grupos metínicos, onze metilênicos e oito metílicos de 5. O mapa de contornos COSY (Figura 3.32 e 3.33, p. 78-79) mostrou correlações associadas aos acoplamentos 3JH/H entre sinais de hidrogênios em δ 0,88 (d, 6,8 Hz)/2,25 (q, 6,8 Hz), δ 0,94 (m)/1,27 (m), δ 1,01 (s)/1,21 (m), δ 1,26 (m)/1,35 (m), δ 1,27 (m)/1,50 (m), δ 1,27 (m)/1,01 (s), 1,57 (dd, J = 5,0, 12,0 Hz)/1,21(m), δ 1,68 (dd, 5,0, 13,0 Hz)/2,31 (dd, 13,0, 7,0 Hz) e δ 1,97 (m)/2,39 (ddd, 2,5, 5,0, 13,0 Hz). Essas correlações foram atribuídas a acoplamentos entre os hidrogênios vicinais Hβ -23/Hα -4, Hα-22/Hβ-21, Hα-19/Hβ-30, Hα- 11/Hβ-12, Hα-6/Hβ-7, Hβ-21/Hβ-30, Hβ-18/Hα-19, Hβ-1/Hα-2 e Hα-1/Hβ-2, respectivamente. Os acoplamentos 2JH/H observados no mapa de contornos COSY (apresentados na Tabela 3.7, p.74) foram atribuídos às correlações entre os hidrogênios geminais dos grupos metilênicos de 5. Capítulo 3 Determinação estrutural de 5 Oliveira, DM (2012) 74 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 O 27 26 25 30 H 5 A B C D E Tabela 3.7: Proposta de reatribuição dos dados de RMN* e estereoquímica de 5 RMN de 1H, 13C, DEPT-135 e HSQC COSY HMBC NOESY C tipo δ de 13C δ de 1H [m, J (Hz)] C-5 42,16 Hα -1, Hα -4, Hβ -6, H- 23, H-24 C-9 37,47 H-25 C-13 39,72 H-26, H-27 C-14 38,32 H-26, H-27 C-17 30,01 H-28 C-20 28,18 H-29, H-30 O=C-3 213,22 Hα-1,H-2, Hα-4, H-23 HC-4 58,25 Hα-4: 2,25 (q, 6,8) Hβ-23 H- 23, H-24 Hα-10, Hβ-23 HC-8 53,13 Hα-8: 1,40 (m) Hβ-7 Hβ -6, Hα -10, Hα -11, H- 25, H-26 Hα-10, Hα-27 HC-10 59,51 Hα-10: 1,53 (m) Hα-1, Hβ-1 Hβ -1, Hα -4, Hβ-6, H- 8, H- 24, H-25 Hα-1, Hα-4, Hα-8 HC-18 42,82 Hβ-18: 1,57 (m) Hα-19, Hβ-28 Hβ-19, H-27, H-28 Hβ-21, Hβ-28, Hβ-30 H2C-1 22,30 Hα-1: 1,97 (m) Hβ-1: 1,68 (dd, 5,0, 13,0 ) Hβ-1, Hα-2, Hβ-2, Hα-10, Hα-1, Hα-2, Hα-10 Hβ-2, Hα-10 Hβ-1, Hα-2, Hβ-2, Hα-10, Hβ-11 Hα-1 H2C-2 41,54 Hα-2: 2,31 (dd, 7,0, 13,0) Hβ-2: 2,39 (ddd, 2,5, 5,0, 13,0) Hα-1, Hβ-1, Hβ-2 Hβ-1, Hα-2, Hα-4 Hα-1, Hβ-2 Hα-1, Hα-2 H2C-6 41,32 Hα-6: 1,26 (m) Hβ-6: 1,76 (m) Hβ-6, Hβ-7 Hα-6 H-24 Hα-4, Hβ-6, Hβ-23 Hβ-6, Hα-7, Hβ-7, Hβ-23, Hβ-25 H2C-7 18,25 Hα-7: 1,40 (m) Hβ-7: 1,50 (m) Hβ-7 Hα-6, Hα-7, Hα-8 Hβ-6, Hβ-7 Hβ-6, Hα-7, Hβ-24 H2C-11 35,65 a Hα-11: 1,26 (m) Hβ-11: 1,48 (m) Hβ-11, Hβ-12 Hα-11, H-25 Hα-8, Hβ-11, Hα-27 Hα−1, Hβ−11, Hβ-12, Hβ- 25 H2C-12 30,52 Hα-12: 1,18(m) Hβ-12: 1,35 (m) Hβ-12 Hα-12, Hα-11 H-27 Hα-27 Hβ-11, Hβ-25 H2C-15 32,44a Hα-15: 1,28 (m) Hβ-15: 1,50 (m) Hβ-15 Hα-15 Hβ-15, Hβ-16, Hα-22, Hα- 27 Hα-15, Hβ-28 H2C-16 36,03 Hα-16: 1,34 (m) Hβ-16: 1,56 (m) Hβ-16 Hα-16 H-28 H2C-19 35,36a Hα-19: 1,21 (m) Hβ-19: 1,38 (m) Hβ-19, Hβ-18, Hβ-30 Hα-19 Hβ-18, Hβ-29 Hβ-19, Hα-27, Hα-29 Hα-19, Hβ-28, Hα-29 H2C-21 32,78a Hα-21: 1,54 (m) Hβ-21: 1,27 (m) Hβ-21, Hβ-22 Hα-21, Hα-22, Hβ-30 H-22, H-29 Hβ-21, Hα-22, Hα-27 Hα-21, Hβ-18, Hα-22, Hβ- 28 H2C-22 39,27 Hα-22: 0,94 (m) Hβ-22: 1,50 (m) Hβ-21, Hβ-22 Hα-22, Hα-21 H-28 Hβ-22, Hα-21, Hβ-21, Hα- 27 Hα-22, Hβ-28 H3C-23 6,83 Hβ-23: 0,88 (d, J = 6,8 ) Hα-4 Hα-4, H-24 Hβ-1, Hα-4, Hα-6, Hβ-6, Hβ-24 H3C-24 14,67 Hβ-24: 0,73 (s) Hα-4, Hβ-6, Hα-10, H- 23 Hβ-7, Hβ-23, Hβ-25, Hβ-26 H3C-25 17,96 Hβ-25: 0,87 (s) Hβ-11, Hβ-12, Hβ-24, , Hβ-26 H3C-26 20,28 Hβ-26: 1,00 (s) Hβ-7, Hβ-25, Hβ-28 H3C-27 18,67 Hα-27: 1,05 (s) Hα-8, Hα-12, Hα-15, Hα- 16, Hα-19, Hα-22, Hβ-29 H3C-28 32,10 Hβ-28: 1,18 (s) Hβ-18 H-16 Hβ-15, Hβ-18, Hβ−19, Hβ- 21, Hβ-22, Hβ-26, Hβ-30 H3C-29 35,03 Hα-29: 0,95 (s) Hβ-21, H-30 Hα-19, Hβ-19, Hα-27 H3C-30 31,79 Hβ-30: 1,01(s) Hα-19, Hβ-21 H-29 Hβ-18, Hβ-21, Hβ-28 a sinais intercambiáveis. * 1H (CDCl3, 400 MHz) and 13C (CDCl3, 100 MHz), TMS usado como padrão interno. Capítulo 3 Determinação estrutural de 5 Oliveira, DM (2012) 75 O mapa de contornos HMBC (Figura 3.34-3.36, pág. 79-80) apresentou importantes correlações 2JH,C e 3JH,C, principalmente, as que foram observadas entre os sinais dos hidrogênios dos grupos metilas com os átomos de carbonos vicinais a esses grupos. O sinal de RMN de 13C em δ 213,22 (C-3) apresentou correlação com os sinais de hidrogênio de H-23 em δ 0,88 (d, J = 6,8 Hz) e também com ambos os de H-2 em δ 2,31 (dd, 7,0, 13,0 Hz) e 2,39 (ddd, 2,5, 5,0 e 13,0 Hz); bem como com o sinal de H-4, em 2,25 (q, 6,8 Hz). Os sinais em δ 58,25 (C-4) e δ 42,16 (C-5) apresentaram correlações com o sinal de H-23 e com um sinal em δ 0,73 (s), atribuído a H-24. O sinal em δ 53,13 (C-8) correlacionou com os sinais em δ 0,87 (s, H-25), e 1,00 (s, H-26). O sinal de C-10 (δ 59,51) também apresentou correlações com os sinais de H-24 e H-25; o sinal de C-18 (δ 42,82) mostrou correlação com os sinais de H-27 (1,05, s) e H-28 (1,18, s) e o sinal de C-20 (δ 28,18) apresentou correlação com os sinais em δ 0,95 (s) e 1,01 (s), atribuídos a H-29 e H-30, respectivamente. A análise completa do mapa de contornos HMBC confirmou as atribuições dos dados de RMN de 5, os quais são apresentados na Tabela 3.7 (p.74). Como se observa na Tabela 3.7, a reanálise dos dados de RMN de 5 permitiu a atribuição completa dos sinais, bem como corrigir as atribuições dos deslocamentos químicos de 13C e 1H relativos à C-29 e C-30, neste caso, apresentados trocados na literatura citada. O H H3C H3C CH3 H3C H3C CH3 CH3 CH3 H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H 1 3 5 8 10 12 14 16 18 21 23 24 25 27 28 29 30 Figura 3.27: Estrutura da friedelina (5) com as indicações (setas) das principais correlações observadas no mapa de contornos NOESY (CDCl3 400 MHz, Figuras 3.37 e 3.38, p.81). No mapa de contornos NOESY (Figuras 3.37 e 3.38, p.81) as correlações observadas entre os sinais de hidrogênios do grupo metila 23, na posição β-equatorial, em δ 0,88 (d, J = 6,8 Hz) e o sinal de Hβ-6 (1,76, dt, J = 2,5, 5,0 Hz), bem como, entre os sinais de Hα-1 (δ 1,97, tdd, 2,5, 7,0, 13,0Hz) e Hβ-11 (δ 1,48, m) permitiram estabelecer que os anéis A, B e C apresentam a conformação de cadeira-cadeira-cadeira, respectivamente (Tabela 3.7, p.74). As correlações NOE intercruzadas, observadas entre os sinais de Hα-15 (δ 1,28, m) e Hβ-16 Capítulo 3 Determinação estrutural de 5 Oliveira, DM (2012) 76 (δ 1,56, m) e entre os sinais de Hβ-15 (δ 1,50, m) e Hα-16 (δ 1,34, m), associadas à observação de que o sinal de Hα-16 e os de Hα-27 (δ 1,05, s) apresentaram correlações entre si, indicaram que o hidrogênio Hα-16 se localiza na parte inferior (curvatura) de um barco no anel D. No anel E, a conformação de barco foi atribuída mediante a observação das correlações entre os sinais dos dois hidrogênios metilênicos de H-19, em δ 1,21, (m, Hα-19) e δ 1,38, (m, Hβ-19), com os sinais metílicos em δ 0,95 (Hα -29), bem como a correlação entre os sinais de Hβ-18 (δ 1,57, dd, J = 5,0, 12,0 Hz) e Hβ-21 (δ 1,30, m). Através das correlações COSY, HMBC e NOESY citadas e as apresentadas na Tabela 3.7, p.74 e Figura 3.27, p.75, pode-se concluir que a friedelina, em solução de CDCl3 na temperatura ambiente, apresenta a conformação preferencial cadeira-cadeira-cadeira-barco-barco (cccbb) de modo semelhante ao pachysandiol-B (14).53 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 O 27 26 25 30 H 5 70 8. 05 76 1. 43 78 6. 67 88 4. 28 91 5. 48 10 03 .6 6 10 72 .2 6 11 09 .2 8 11 75 .8 0 12 03 .0 3 13 10 .7 8 13 88 .7 0 14 56 .5 1 15 20 .9 5 16 45 .0 0 17 01 .6 8 17 12 .6 3 23 35 .4 4 23 62 .6 6 28 59 .9 6 29 25 .3 4 30 83 .3 8 32 20 .8 2 32 64 .9 4 32 96 .3 4 33 34 .1 6 34 04 .0 2 34 92 .9 6 35 01 .8 7 35 30 .6 5 36 18 .8 7 37 55 .6 2 38 34 .1 9 38 87 .6 0 39 14 .6 7 39 62 .4 9 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 % Tr an sm itt an ce 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 Wavenumbers (cm-1) Figura 3.28: Espectro de absorção de 5 na região do IV. Capítulo 3 Determinação estrutural de 5 Oliveira, DM (2012) 77 2.40 2.20 2.00 1.80 1.60 1.40 1.20 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 2.45 2.40 2.35 2.30 2.25 2.20 1.20 1.10 1.00 0.90 0.80 0.70 2.26 2.24 2.22 Detalhe BH-4 δ δ sinais metínicos e metilênicos δ H-4 H-2αaxH-2βeq B A Detalhe A H-29H-30 H-26H-27H-28 H-25 H-24 Heq-22 H-23 δ 6.8 HZ 1H Figura 3.29: Espectro de RMN de 1H de 5 (CDCl3, 400 MHz). 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 42 40 38 36 34 32 30 28 23 22 21 20 19 18 17 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Detalhe A B δ C-3 A C-5 C-6 C-2 C-14 C-9 C-13 C-12 C-17 C-22 C-20 C-11 C-19C-16 C-30C-21 C-15 C-28 C-29 δ δ C-7C-1 C-25C-26 C-27 δ C-29 C-22C-2 C-12 C-18 C-18C-8 C-24 C-1 C-10 C-4 C-7 C-23 (a) 13c (b) DEPT-135 Figura 3.30: Espectro de RMN de (a) 13C e (b) DEPT-135 de 5 (CDCl3, 100 MHz). 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 O 27 26 25 30 H 5 Capítulo 3 Determinação estrutural de 5 Oliveira, DM (2012) 78 0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.11.21.31.41.51.61.71.81.92.02.12.22.32.42.5 f2 (ppm) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 f1 ( pp m ) 23 24 24 27 26 30 29 28 7αeq 7βax 1αeq 1βax 12βax 12αeq21α 21β 15α 15β 19α 11αax 11βeq 16α 16β 19β 22α 22β 6αax 6βeq 2βeq 2αax 8 10 4 Figura 3.31: Mapa de contornos HSQC de 5 (CDCl3, 400 MHz). 0.20.50.81.11.41.72.02.3 f2 (ppm) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 f1 ( pp m )6 α /7 β 22 α /22 β 22 α /21 β 18 β /19 α 16 α /16 β 19a /19 β 10 α /1 β 19 α /30 β 11 α /12 β 6 α /6 β 1 α /1 β 1 α /10 α 1 β /2 α 1 α /2 β 4α /23 β Figura 3.32: Mapa de contornos COSY de 5 (CDCl3, 400 MHz). 18β 25 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 O 27 26 25 30 H 5 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 O 27 26 25 30 H 5 Capítulo 3 Determinação estrutural de 5 Oliveira, DM (2012) 79 Figura 3.33: Expansão do mapa de contornos COSY de 5 (F1: 0,70-1,85 x F2: 0,95-1.85, CDCl3, 400 MHz). 0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5 f2 (ppm) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 f1 ( p p m ) H-2/C-3 H-1 /C-3 H-23/C-3 H-4/C-3 solvente Figura 3.34: Mapa de contornos HMBC de 5 (CDCl3, 400 MHz). 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 O 27 26 25 30 H 5 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 O 27 26 25 30 H 5 Capítulo 3 Determinação estrutural de 5 Oliveira, DM (2012) 80 Figura 3.35: Expansão do mapa de contornos HMBC de 5 (F1: δ 5,0-65,0 x F2: δ 0,50-2,35, CDCl3, 400 MHz). Figura 3.36: Expansão do mapa de contornos HMBC de 5 (F1: δ 26,0-46,0 x F2: δ 0,70-1,65, CDCl3, 400 MHz). 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 O 27 26 25 30 H 5 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 O 27 26 25 30 H 5 Capítulo 3 Determinação estrutural de 5 Oliveira, DM (2012) 81 0.70.91.11.31.51.71.92.12.32.5 f2 (ppm) 1.0 1.5 2.0 2.5 f1 ( pp m ) 2 β 2 β 4 α 4 α 2 α 2 α 1 α 1α 6 β 6 β 1 β 1 β 18 β 18 β 16 β 10 α 10 α 16 β 22 β 22 β 15 β 15 β 7 β 7 β 21 α 21 α 11 β 11 β 8 α 8 α 7 α 19 β 16 α 12 α 7 α 19 β 12 α 16 α 21 β 21 β 15 α 6 α 11 α 15 α6 α11 α 12 β 19 α 19 α12 β 22 α 29 α 24 β 25 β 23 β 26 β 30 β 27 α28 β 28 β 27 α 30 β 26 β 29 α 23 β 25 β 24 β 4/23 4/6 α 4/10 1 α /1 β 1 α /11 β 1 α /2 β 1 α /2 α 6 α /6 β 6 β /7 α 6 β /7 β 1 β− 6 β /24 1 β /25 6 β /23 Figura 3.37: Mapa de contornos NOESY de 5 (CDCl3, 400 MHz). 0.750.800.850.900.951.001.051.101.151.20 f2 (ppm) 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 f1 ( pp m ) 19 α 18 β 10 α 16 β 22 β 15 β 7 β 21 α 12 α 11 β 8 α7 α 19 β 12 β 16 α 21 β 15 α 6 α 11 α 19 α 12 α 22 α 29 α 24 β 25 β 23 β 26 β 30 β 27 α28 β 28 β 27 α 30 β 26 β 29 α 23 β 25 β 24 β 23/ 24 24/2524/26 25/26 19 α /2928/30 28/26 22 α /27 26/28 18/28 12 α /12 β 12 α /11 β 19 α /22 α 22 α 16 α /27 22 α /22 β 12 β /25 21 α /27 18/30 18/26 15 α /27 19 β /29 21 α /29 21 β /29 19 β /30 Figura 3.38: Expansão do mapa de contornos NOESY de 5 (F1 = δ 0,60-1,70 ppm x F2 = δ 0,70- 1,26 ppm, CHCl3, 400 MHz). 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 O 27 26 25 30 H 5 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 O 27 26 25 30 H 5 Capítulo 3 Difração de raios-X do pó de 5 82 Oliveira, DM (2012) Estudo conformacional de 5 por difração de raios X de pó Nesse estudo, a estrutura do TTPC friedelina, 5, isolada foi estudada com base na análise de dados de difração de raios-X de seu pó, a partir do sólido microcristalino (~1,2 g) obtido com grau de pureza maior que 98% (CGAR). O sólido 5 cristalizou no grupo espacial P21P21P21 ortorrômbico com a = 3,371 = b = 13,943, c = 28,456, α = β = γ = 90º, Z = 4, RWP = 0,1153%, RWP(w/obck) = 0,1426%, Rp = 0,0638%. A estrutura molecular e a estereoquímica relativa de 5 foram anteriormente estabelecidas por meio de técnicas de RMN126, 127 e rediscutidas nesta tese por meio de uma nova abordagem utilizando experimentos 2D atualizados (p.72). O preparo de monocristais dotados de tamanho, qualidade e estabilidade, suficientes, é uma limitação intrínseca do estudo por difração de raios-X. A dificuldade é ainda maior quando se tratam de amostras de produtos naturais, tais como TTPC’s isolados de plantas, devido à presença de impurezas e, além disso, essas substâncias são isoladas em pequenas quantidades.131 Por essas razões, neste trabalho, foi procurada a resolução da estrutura da friedelina a partir da difração de raios X de seu pó e de cálculos por Teoria do Funcional de Densidade (DFT),132 visando a otimização e aplicação dessa abordagem, a fim de poder estender a outros TTPC’s. Atualmente, a elucidação estrutural através da análise difratométrica de pó (SDPD) tem sido largamente utilizada com sucesso no âmbito de compostos inorgânicos e organometálicos e também, especificamente nos últimos anos, em diversos compostos orgânicos, especialmente fármacos. Além do mais, o procedimento SDPD para uma molécula orgânica é dependente de muitos fatores relacionados com a sua cristalinidade, pureza, tamanho, preferência conformacional, grupo espacial, polimorfismo e outras informações químicas adicionais131 e, portanto, se torna um desafio na área de fitoquímica. Os dados cristalográficos de um monocristal de friedelina foram anteriormente relatados na literatura133 e foram usados para validar os resultados deste trabalho. A estrutura de 5 foi otimizada por cálculos DFT/B3LYP/6-31G(d,p) e a indexação dos dados de difração do pó foi feita usando o programa DICVOL91,134 o que possibilitou identificar os picos experimentais, estabelecer o padrão deles e determinar o grupo espacial dos microcristais do pó. A Figura 3.39, p.83, mostra o gráfico representando o ajuste final obtido entre os padrões de difração observados e calculados. Os picos de difração, classificados e ajustados ao perfil Pseudo-Voight, foram submetidos aos refinamentos modificados de Pawley e Rietveld. Capítulo 3 Difração de raios-X do pó de 5 83 Oliveira, DM (2012) 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 -10000 -5000 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 Int en sid ad e Ânglo (2θ) Figura 3.39: Gráfico Rietveld de 5. Os dados observados estão representados por pontos (•) e o padrão calculado por uma linha sólida (-). A diferença entre os dados obsevados e calculados estão marcados embaixo (x); as barras verticais indicam as posições das reflexões de Bragg ( ). Tabela 3.8: Dados do pó constituído de microcristais de friedelina (5) Dados do cristal Fórmula química C30H50O Mr 426,70 Ajuste da célula unitária, grupo espacial Ortorrômbico, P21P21P21 Temperatura (K) 298(1) a, b, c (Å) 6.371, 13.943, c=28.456 α=β=γ 90 V Final (Å3) 2527,77 Z 4 Dx (Mg m -3) 1.121 Radiação, comprimento de onda (Å) Cu Kα1, 1.54056 O resumo dos dados referentes aos microcristais de 5 são mostrados na Tabela 3.8. Os parâmetros posicionais referentes a geometria da friedelina são apresentados na Tabela 3.9 (p.84). Os resultados dos cálculos por DFT mostraram que as formas dos cinco anéis de seis membros, nos dois confôrmeros desse triterpeno, se encontram nas formas cadeira-cadeira- cadeira-barco-barco (cccbb) e cadeira-cadeira-cadeira-cadeira-cadeira (ccccc), respectivamente, e em fase gasosa, apresentam valores de energia muito próximos, ∆Gtotalccccc- ∆Gtotalcccbb = 1,4 kJ mol-1 no nível teórico B3LYP/6-31G(d,p).132 Os valores dos ângulos de torção endocíclicos calculados por DFT apresentaram uma boa correlação (R2 = 0,999) com valores dos ângulos equivalentes da estrutura final do refinamento Rietveld. As estruturas otimizadas dos confôrmeros cccbb e ccccc estão apresentadas na Figura 3.40, p.85. O estudo realizado mostrou que o confôrmero cccbb é mais estável que confôrmero ccccc, sendo que a diferença de energia livre total entre eles foi de apenas -1,4 kJ mol-1 no nível de 10 5 1 4 2 3 8 7 9 6 13 14 12 11 17 16 18 15 21 22 2019 O 23 24 28 30 25 26 27 29 H H H 5 Capítulo 3 Difração de raios-X do pó de 5 84 Oliveira, DM (2012) teoria B3LYP/6-31G(d,p). A diferença de energia encontrada entre as duas estruturas é pequena e pode sofrer alterações dependendo da metodologia dos cálculos realizados. Por exemplo, o estudo utilizando diferentes intensidades de campo de força, realizado por Mo et al.(1989)133, indicou que essas espécies são praticamente degeneradas em fase gasosa. Segundo o relato desses autores, o confôrmero preferido pela molécula de 5, no estado cristalino, depende de forças intermoleculares relacionadas com o empacotamento, processos de solvatação e solubilidade. Outros cálculos utilizando funções de base maiores e diferentes funcionais de troca-correlação não foram realizados devido ao tamanho do sistema, o que demandaria um maior custo computacional. Tabela 3.9: Coordenadas atômicas fracionárias x, y, z da célula unitária (dimensões em Å) e os parâmetros de deslocamentos isotrópicos (Å2) Átomo x y z Uiso* O(1) 0,0859 0,2123 0,5126 0,05000 C(1) 0,2208 0,2771 0,4003 0,05000 C(2) 0,0671 0,2970 0,4401 0,05000 C(3) 0,0466 0,2104 0,4702 0,05000 C(4) -0,0091 0,1184 0,4457 0,05000 C(5) 0,1634 0,0964 0,4077 0,05000 C(6) 0,0918 0,0074 0,3786 0,05000 C(7) 0,2163 -0,0085 0,3340 0,05000 C(8) 0,2059 0,0801 0,3018 0,05000 C(9) 0,2956 0,1711 0,3266 0,05000 C(10) 0,1703 0,1840 0,3727 0,05000 C(11) 0,2699 0,2577 0,2949 0,05000 C(12) 0,3415 0,2417 0,2443 0,05000 C(13) 0,2294 0,1559 0,2202 0,05000 C(14) 0,2713 0,0637 0,2496 0,05000 C(15) 0,1375 -0,0195 0,2278 0,05000 C(16) 0,0992 -0,0124 0,1746 0,05000 C(17) 0,2528 0,0472 0,1441 0,05000 C(18) 0,3258 0,1421 0,1695 0,05000 C(19) 0,2881 0,2319 0,1392 0,05000 C(20) 0,3632 0,2236 0,0862 0,05000 C(21) 0,2804 0,1314 0,0645 0,05000 C(22) 0,1390 0,0723 0,0987 0,05000 C(23) 0,6093 0,2258 0,0862 0,05000 C(24) 0,2843 0,3121 0,0606 0,05000 C(25) 0,4410 -0,0177 0,1313 0,05000 C(26) 0,0008 0,1822 0,2172 0,05000 C(27) 0,5049 0,0328 0,2480 0,05000 C(28) 0,5415 0,1628 0,3377 0,05000 C(29) 0,3705 0,0751 0,4321 0,05000 C(30) -0,0579 0,0381 0,4813 0,05000 (*)Para o número reduzido de reflexões independentes obtidas (284), os deslocamentos foram fixados em 0,05000 Å2 (átomos de carbono e oxigênio) e 0,06000 Å2 (átomos de hidrogênio). Capítulo 3 Difração de raios-X do pó de 5 85 Oliveira, DM (2012) Figura 3.40: Estruturas otimizadas de 5 por DFT-B3LYP/6-31G(d,p): (esquerda) confôrmero de baixa energia na forma cadeira-cadeira-cadeira-barco-barco (cccbb); (direita) confôrmero de alta energia na forma cadeira-cadeira-cadeira-cadeira-cadeira (ccccc). Os átomos de carbono estão representados em púrpura, os de oxigênio em vermelho e os de hidrogênio em amarelo. Na Tabela 3.10 são apresentados os valores dos ângulos de torção endocíclicos dos anéis de 5, calculados (calc) por DFT e determinados por SDPD, onde se observa que esses valores mostraram boa concordância entre ambos, O maior desvio (rmsd) entre os valores dos ângulos de torção experimentais e os calculados (DFT) foi de 2,8o e desvio global de ± 1,5o. A correlação entre os valores experimentais e calculados foi significativa (R2 = 0,999), indicando que a geometria molecular do cristal de friedelina foi reproduzida em excelente concordância por cálculos DFT. Tabela 3.10: Valores dos ângulos de torção endocíclicos (o) determinados por SDPD e obtidos por DFT para friedelina Anel A Calc Obs εa Anel D Calc Obs εa C(1)-C(2)-C(3)-C(4) -50,8 -53,7 2,9 C(18)-C(13)-C(14)-C(15) -64,8 -67,8 3,0 C(2)-C(3)-C(4)-C(5) 57,1 58,5 1,4 C(13)-C(14)-C(15)-C(16) 27,3 30,5 3,2 C(3)-C(4)-C(5)-C(10) -59,8 -58,5 1,3 C(14)-C(15)-C(16)-C(17) 24,5 23,0 1,5 C(4)-C(5)-C(10)-C(1) 60,6 58,6 2,0 C(15)-C(16)-C(17)-C(18) -38,7 -39,0 0,3 C(2)-C(1)-C(10)-C(5) -56,0 -56,4 0,4 C(16)-C(17)-C(18)-C(13) 0,0 0,4 0,4 C(10)-C(1)-C(2)-C(3) 49,0 51,4 2,4 C(14)-C(13)-C(18)-C(17) 51,1 52,4 1,3 Anel B Anel E C(6)-C(5)-C(10)-C(9) -49,0 -51,8 2,9 C(17)-C(18)-C(19)-C(20) -46,5 -47,2 0,7 C(10)-C(5)-C(6)-C(7) 48,0 51,1 3,1 C(22)-C(17)-C(18)-C(19) -7,5 -7,1 0,4 C(5)-C(6)-C(7)-C(8) -56,9 -57,6 0,7 C(18)-C(17)-C(22)-C(21) 57,9 58,7 0,8 C(6)-C(7)-C(8)-C(9) 63,2 59,6 3,6 C(20)-C(21)-C(22)-C(17) -55,4 -57,0 1,6 C(7)-C(8)-C(9)-C(10) -60,2 -56,1 4,1 C(19)-C(20)-C(21)-C(22) 1,3 2,2 0,8 C(8)-C(9)-C(10)-C(5) 54,9 55,0 0,0 C(18)-C(19)-C(20)-C(21) 49,8 49,5 0,3 Anel C Anel r b C(8)-C(9)-C(11)-C(12) -48,6 -47,7 0,9 A 1,9 C(14)-C(8)-C(9)-C(10) 165,3 167,1 1,8 B 2,8 C(9)-C(8)-C(14)-C(13) -54,5 -51,4 3,1 C 1,6 C(12)-C(13)-C(14)-C(8) 55,2 54,1 1,1 D 2,0 C(11)-C(12)-C(13)-C(14) -58,4 -58,1 0,3 E 0,9 C(9)-C(11)-C(12)-C(13) 57,3 56,5 0,8 1,5 c (a) ε = |calc-obs|; (b) 2/12 1 )](/1[ i n inr εΣ == n = 6; (c) )(/1 1 i n i rn Σ = n = 5 Capítulo 3 Difração de raios-X do pó de 5 86 Oliveira, DM (2012) A estrutura resultante da aplicação do método de refinamento de Rietveld, mostrada na Figura 3.41 (p.86), foi racionalizada através dos dados de difração disponíveis na literatura.133 Os parâmetros atômicos finais da estrutura de 5-SDPD são mostrados Na Tabela 3.9 (p.84). É importante ressaltar que o sucesso desta análise de dados de difração de pó SDPD foi atribuído ao alto grau de pureza (>98%) do composto analisado. Figura 3.41: Estrutura ORTEP3 (Burnett and Johnson, 1996)138 de 5 obtida por SDPD. Os átomos de C são apresentados como elipsoides de 50% de probabilidade e os átomos de H como pequenas esferas de raios arbitrários. Concordante com a estrutura previamente conhecida de 5,133 a estrutura da friedelina encontrada pelo método descrito apresentou os anéis A, B e C adotando a forma de cadeira e o sistema cis-decalina, formado pelos anéis D e E, apresentaram a conformação barco-barco. A conformação barco-barco sugere repulsões menores entre os grupos metílicos ligados nesses dois anéis. A conformação encontrada para a friedelina também está coerente com a que foi relatada para o TTPC friedelano pachysandiol B (14). Os resultados obtidos nesse trabalho permitiram resolver a estrutura da friedelina, através de cálculos por DFT, bem como por análise dos dados obtidos por difração de raios X de pó. A técnica desenvolvida nesse estudo pode, alternativamente, ser utilizada quando a disponibilidade de amostras de TTPC’s, em quantidade e pureza exigidas, for suficiente e as condições experimentais não permitirem a aplicação do método clássico de difração de raios X utilizando monocristais. Capítulo 3 Determinação Estrutural da mistura de 5 e 6 Oliveira, DM (2012) 87 Mistura de friedelina (5) e 3β-friedelinol (6) A mistura dos constituintes 5 e 6 foi obtida em várias frações dos extratos em hexano e acetato de etila, bem como, de forma residual, no extrato em metanol das folhas. A mistura foi isolada na forma de um sólido branco cristalino, que fundiu na faixa de temperatura de 234,8 a 252,8 ºC. Uma amostra da mistura de 5 e 6 forneceu resultado positivo para o teste de Liebermann-Burchard e a composição da mistura foi identificada por CCD de sílica gel, junto com padrões autênticos de friedelina e 3β-friedelinol, utilizando CHCl3 como eluente e revelação utilizando uma solução hidroalcoólica ácida (H3PO4 1,5 %) de vanilina (1,5%).78 O espectro da mistura de 5 e 6, no IV (Figura 3.42, p.88), apresentou bandas centradas em 2840 e 2950 cm-1, devido a deformações axiais de ligações C-H de grupos metila e metileno (υ-CH), que evidenciaram a natureza alifática dos compostos. O espectro apresentou uma centrada em 1700 cm-1 e outra em 3400 cm-1, as quais são características de deformações axiais de carbonila de cetona e de hidroxila de álcool, respectivamente, em compostos alifáticos saturados.99 Além disso, o espectro apresentou bandas em 1440, 1380, 1360, 1170 e 980 cm-1, típicas de triterpenos pentacíclicos da série dos friedelano.127-129 No espectro de RMN de 13C (Figura 3.43, p.88), os sinais em δC 212,99 e δC 72,17, foram atribuídos aos carbonos oxigenados (C-3) da friedelina e do 3β-friedelinol, respectivamente. A confirmação desses dois sinais de carbono-13, bem como dos outros demais, foram feitas por comparação, com os dados da literatura.31, 96 O perfil espectroscópico permitiu propor a mistura de friedelina (5) e 3β-friedelinol (6) como os constituintes dessa mistura. As integrais dos sinais de RMN de 1H de H-18 (obtidos por transformação lorentz/gaussiana) de 5 (δ 1,18 (s)) e 6 (δ 1,17(s)) mostraram uma proporção de cerca de 3:7 na mistura, respectivamente. 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 O 27 26 25 30 H 5 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 OH 27 26 25 30 H 6 Capítulo 3 Determinação Estrutural da mistura de 5 e 6 Oliveira, DM (2012) 88 Figura 3.42: Espectro de absorção da mistura de 5 e 6 na região do IV (KBr). Figura 3.43: Espectros de RMN de (a) 13C e (b) DEPT-135 da mistura de 5 e 6 (CDCl3 e piridina-d5, 100 MHz). Número de onda (cm-1) T (% ) 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 O 27 26 25 30 H 5 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 OH 27 26 25 30 H 6 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 213.00 δ C-3 (3β-friedelinol) (a) C-3 (friedelina) 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 δ (b) δ Capítulo 3 Determinação Estrutural de 6 Oliveira, DM (2012) 89 3β-Friedelinol (6) 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 OH 27 26 25 30 H 6 O composto 6 foi obtido de várias frações de extratos em hexano (FHEMA e SHEMA). As frações F82-F89 da coluna C14-2 foram coletadas como um sólido branco cristalino, que fundiu na faixa de temperatura de 286,7-289,3 ºC (recrist. em acetona) (260,0- 262).25 Uma amostra desse sólido forneceu resultado de LB(+) para TTPC. A comparação do sólido 6 com uma amostra autêntica através de CCD confirmou a identidade desse sólido com o composto 3β−friedelinol. O espectro de 6 na região do infravermelho (Figura 3.44, p.91) apresentou bandas de absorção centradas em 2840 e 2966 cm-1, devido a deformações axiais de ligações C-H de grupos metilas e metilenos (ν-CH), as quais evidenciaram a natureza alifática de 6. Apresentou também uma banda em 3405 cm-1, vibração característica de deformação axial de grupos hidroxilas (δ-OH) de álcool em compostos alifáticos saturados. De modo geral, o perfil do espectro no IV, composto de bandas de absorção em 3622, 3474, 2942, 2866, 142, 1386, e 1362, 1176, 1008 e em 1000 cm-1, é típico de alcoóis de triterpenos pentacíclicos.31,127 A comparação entre os espectros no IV de 6 com o de uma amostra autêntica de 3β- friedelinol mostrou a mesma identidade espectrométrica para ambos.25 Através do espectro de RMN de 13C (Figura 3.46, p.92) e do espectro DEPT-135 (Figura 3.46, p.92) foram observados seis sinais de carbonos quaternários, cinco metínicos, onze metilênicos e oito metílicos, característicos de triterpeno pentacíclico da série friedelano. O espectro apresentou também sinal em δ 72,77; referente a carbono ligado a hidroxila (Tabela 3.11, p.90).96,128,129 O espectro de RMN de 1H (Figuras 3.45, p.91) mostrou um multipleto entre δ 3,76 a δ 3,71, que foi atribuído ao hidrogênio carbinólico (H-3). Na região de valores de Capítulo 3 Determinação Estrutural de 6 Oliveira, DM (2012) 90 deslocamentos químicos dos hidrogênios alifáticos foram observados sete simpletos atribuídos aos hidrogênios de grupos metila em δ 0,86 (H-25), 0,95 (H-29), 0,97 (H-24), 0,99 (H-26), 1,00 (H-30), 1,01 (H-27) e 1,17 (H-28) e um dupleto, observado no mapa de contornos COSY em δ 0,93 (d, ~7,0 Hz, H-23). As demais atribuições foram feitas mediante a comparação entre os valores de δ obtidos no espectro de RMN de 1H de 6 e na literatura.31,128 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 OH 27 26 25 30 H 6 Tabela 3.11: Comparação e análise de dispersão entre os valores de δ de 13C de 6 (CDCl3, 100 MHz) e os respectivos valores publicados para o β-friedelinol (CDCl3, 100 MHz)128 Carbono δ de 13C 6 Lit.128 1 15,81 16,05 2 36,10 36,56 3 72,77 72,76 4 49,20 49,19 5 37,85 38,38 6 41,75 41,74 7 17,56 17,56 8 53,22 53,21 9 37,12 37,12 10 61,38 61,39 11 35,36 35,56 12 30,65 30,65 13 39,70a 38,36 14 38,39a 39,69 15 32,35 32,34 16 35,58 35,56 17 30,04 30,03 18 42,85 42,84 19 35,21 35,35 20 28,19 28,84 21 32,84 32,34 22 39,30 39,29 23 11,62 11,62 24 16,40 16,40 25 18,26 18,25 26 20,13 20,12 27 18,65 18,65 28 32,10 32,09 29 35,03 35,03 30 31,80 31,80 a sinais intercambiáveis 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 δ d e 13 C d o β- fr ie de lin ol ( Li t.) δ de 13C de 6 y = 0.99905x + 0.08461 R2 = 0.99976 δ Capítulo 3 Determinação Estrutural de 6 Oliveira, DM (2012) 91 Djalma 3800 3600 3400 3200 3000 2800 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 Wavenumber (cm-1) 0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96 % 3622 3474 3006 2942 2866 1452 1386 1362 1176 1000 920 860 792 714 T (%) Figura 3.44: Espectro de absorção de 6 na região do IV (KBr). 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 OH 27 26 25 30 H 6 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 3.76 3.75 3.74 3.73 3.72 3.71 1.20 1.15 1.10 1.05 1.00 0.95 0.90 0.85 δ δ Sinal (ppm) Integral 0.88-0.84 3.0 0.92-0.88 2.5 0.94-0.92 1.7 0.95-0.94 4.2 0.97-0.96 3.6 1.03-0.98 10.9 1.15-1.05 0.3 1.19-1.15 2.6 1.35-1.19 12.1 1.59-1.36 22.3 1.78-1.70 1.0 1.94-1.87 0.8 3.76-3.71 1.0 1H Expansão A H-29 H-24 H-27 H-26 H-25 H-30 H-23 δ H-3 H-28 A Figura 3.45: Espectro de RMN de 1H de 6 (CDCl3, 400 MHz). Capítulo 3 Determinação Estrutural de 6 Oliveira, DM (2012) 92 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 OH 27 26 25 30 H 6 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 C-23C-26C-20 C-17 C-9 C-5 C-14 C-13C-18 C-4C-8C-10 δ C-3 A 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 (a) (b) C-12 C-23 C-24 C-7 C-1 C-26 C-27 C-25 C-18 C-22C-6 δ 43 42 41 40 39 38 37 36 35 34 33 32 31 Expansão A C-12 C-30C-28 C-15C-21 C-18 C-22 C-6 C-16C-11 C-29 C-19C-2 δ Figura 3.46: Espectros RMN de (a) 13C e (b) DEPT-135 de 6 (CDCl3, 100 MHz). Capítulo 3 Determinação Estrutural de 7 Oliveira, DM (2012) 93 3α-Friedelinol (7) 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 OH 27 26 25 30 H 7 O composto 3α-friedelinol (7), foi isolado do extrato SHEMA como um sólido branco cristalino, que apresentou temperatura de fusão na faixa de 295,9 a 300 ºC (298-300 ºC).31 Uma amostra de 7 forneceu resultado LB(+) positivo para TTPC (solução de coloração rósea) e apresentou comportamento cromatográfico (CCD) similar ao de uma amostra autêntica de 3α-friedelinol. O espectro de absorção de 7, na região do infravermelho (Figura 3.47, p.95), apresentou bandas centradas em 2868 e 2928 cm-1, devido a deformações axiais de ligações C-H de grupos metila e metileno (ν-CH), as quais evidenciaram a natureza alifática de 7. Bandas características de dimetilas geminadas foram observadas em 1360 e 1386 cm-1. Apresentou também bandas de absorções em 3230 e 3550 cm-1, as quais são características de deformações axiais de hidroxila (ν-OH) de álcool em compostos alifáticos. O conjunto de bandas em 3488, 3408, 2928, 2868, 1456, 1386, 1360, 1178, 1032 e 1002 cm-1, como um todo, é típico de TTPC’s hidroxilados.31,130 A comparação entre as bandas de absorção do espectro no IV de 7 com as de um espectro no IV de uma amostra autêntica de 3α- friedelinol31 apresentou a mesma identidade espectrométrica. O espectro de RMN de 1H (Figura 3.48, p.95) mostrou um sinal de dupleto triplo em δ 3,37 (dt, J = 5,0; 10,0 Hz) atribuído ao hidrogênio H-3. Na região característica de ressonância de hidrogênios alifáticos foram observados sete simpletos, atribuídos aos hidrogênios correspondentes aos grupos metila em δ 0,78 (H-24), 0,81 (H-25), 0,95 (H-29), 0,99 (H-26), 1,00 (H-27), 1,01(H-30), 1,17 (H-28) e um dupleto em δ 0,94 (d = 6,2 Hz, H- 23). Essas atribuições foram feitas mediante a comparação entre os valores de δ obtidos no espectro de RMN de 1H de 7 e os valores do 3α-friedelinol da literatura.31 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 7 Oliveira, DM (2012) 94 Através do espectro de RMN de 13C e do espectro DEPT-135 (Figuras 3.49 (a) e (b), p.96) foram observados seis sinais de carbonos quaternários, cinco metínicos, onze metilênicos e oito metílicos, característicos de triterpeno pentacíclico da série friedelano. Os espectros apresentaram também sinais em δ 71,42; referentes ao carbono (C-3) ligado a hidroxila (Tabela 3.12).96 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 OH 27 26 25 30 H 7 Tabela 3.12: Comparação e análise de dispersão entre os valores de δ de 13C de 7 (CDCl3, 100 MHz) com os respectivos valores publicados para o α-friedelinol (CDCl3, 100 MHz)31 Carbono δ de 13C 7 Lit.31 1 19,69 19,76 2 36,86 37,00 3 71,42 71,11 4 52,98 53,00 5 38,10 38,12 6 41,48 41,53 7 17,88 17,92 8 53,32 53,41 9 37,04 37,05 10 60,16 60,25 11 35,54 35,57 12 30,62 30,64 13 39,69a 38,31 14 38,30a 39,70 15 32,36 32,38 16 36,08 36,12 17 30,00 30,01 18 42,84 42,88 19 35,34 35,36 20 28,17 28,16 21 32,83 32,88 22 39,26 39,27 23 10,09 10,22 24 14,60 14,63 25 18,15 18,17 26 20,17 20,18 27 18,67 18,68 28 32,11 32,13 29 35,02 35,02 30 31,82 31,86 a Sinais intercambiáveis 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 δ d e 13 C d o α -f rie de lin ol ( Li t.) δ de 13C de 7 y = 0.9977x+0.10339 R2 = 0.99998 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 7 Oliveira, DM (2012) 95 Djalma 3800 3600 3400 3200 3000 2800 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 Wavenumber (cm-1) 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96 % 3488 3408 2998 2928 2884 1456 1386 1360 1178 1032 1002 922 862 T (%) Figura 3.47: Espectro de absorção de 7 na região do IV (KBr). 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 OH 27 26 25 30 H 7 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 1.20 1.15 1.10 1.05 1.00 0.95 0.90 0.85 0.80 0.75 3.40 3.35 3.30 Sinal (ppm) Integral 0.7885-0.7462 3.0 0.8276-0.7904 3.1 0.9047-0.8295 2.4 0.9647-0.9072 7.5 1.0309-0.9634 8.9 1.1459-1.0335 3.3 1.1856-1.149 3.3 1.6636-1.1875 25.7 1.8284-1.7097 1.5 1.9729-1.8271 0.7 2.0291-1.983 0.6 2.1516-2.0443 1.3 2.4035-2.2943 0.4 3.4181-3.3039 1.0 3.4901-3.4421 0.4 4.0356-3.6505 28.0 H-3 δ A Expansão AH-30 H-27 H-26 H-23 H-25 H-29 H-24 δ H-28 1H δ Figura 3.48: Espectro de RMN de 1H de 7 (CDCl3, 400 MHz). Capítulo 3 Determinação Estrutural de 7 Oliveira, DM (2012) 96 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 OH 27 26 25 30 H 7 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 40 39 38 37 (a) C-24C-18C-8 C-4 C-17 Expansão A C-20 C-23C-10 δ δ δ C-3 A 43 42 41 40 39 38 37 36 35 34 33 32 31 30 Expansão BC-18 C-28 C-30C-29 C-21C-22 C-11C-19 C-16 C-15 C-12C-2 C-18 C-6 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 (b) C-24 C-23C-25C-26 C-27 C-1 C-7 C-8 C-4C-10C-3 B C-9 C-13 C-5 C-2C-22 δ C-14 Figura 3.49: Espectros de RMN de (a) 13C e (b) DEPT-135 de 7 (CDCl3, 100 MHz). Capítulo 3 Determinação Estrutural de 8 97 Oliveira, DM (2012) 3β-Lup-20(29)-en-3-ol (lupeol, 8) 28 10 5 1 3 12 14 17 23 26 19 22 H 29 30 OH H a H b H 8 O constituinte 8 foi obtido do extrato hexânico (FHEMA) na forma de um sólido branco amorfo, que fundiu na faixa de temperatura de 213,8 a 216,7 ºC* (184,4-186,4 ºC)25. O sólido 8 apresentou resultado positivo para TTPC quando submetido ao teste químico de Liebermann-Burchard.78 A análise do espectro de 8, na região do IV (Figura 3.50, p.99) permitiu a identificação de um conjunto de bandas características de um triterpeno-álcool de esqueleto lupano. Na Tabela 3.13 são apresentadas as bandas, os modos de vibração e os respectivos fragmentos moleculares atribuídos. O conjunto de bandas observadas no espectro de IV em 3550, 3400, 3295, 2850, 2920, 1630 (fraca intensidade), 1470, 1455, 1440, 1380, 1360, 1140, 1110, 1040, 985 e em 880 cm-1, como um todo, foram caracterizadas como bandas do lupeol.64 A comparação do espectro no IV de 8 com o de uma amostra autêntica de lup-20(29)-en-3β-ol25 confirmou a identidade de ambos os espectros. Tabela 3.13: Absorções na região do infravermelho e modos de vibração de 8 Nº de onda, (cm-1) Grupo/fragmento molecular Modo de vibração 3550-3450 R-OH ν O-H 3400-3250 -CH2-COH-CH2- ν O-H 2920-2850 -CH2-; -CH3 ν C-H 1620-1640(*) RC=CH2 ν C=C 1470-1455 -CH2-; -CH3 δ C-H 1380-1360 gem-dimetila δ C-H 1190-1140 gem-dimetila ν C-H 1110 -CH2-OH ν C-OH 1040-1015 R-OH de álcois ν C-OH 880 RC=CH2 γ C=C-H (*) Esta banda nos TTPC lupanos, normalmente, é registrada nos espectros com baixa intensidade. * Na análise térmica da fração 5 por DSC foi observado um pico de fusão em 216,5 °C atribuído ao do lupeol. Capítulo 3 Determinação Estrutural de 8 98 Oliveira, DM (2012) O espectro de RMN de 1H de 8 (Figura 3.51, p.100) registrou um dupleto duplo em δ 3,19 (dd, J = 11,0 e 5,0 Hz), atribuído ao hidrogênio carbinólico (H-3) vizinho a um grupo metileno em um sistema ABX. Foi também observado um dupleto triplo em δ 2,38 (dt, J = 11,0 e 5,8 Hz), atribuído ao hidrogênio metínico Hax-19 em um sistema ABX2 com Hax-18, Heq-21 e Hax-21.99 Tabela 3.14: Comparação e análise de dispersão entre os valores de δ de 13C de 8 (CHCl3,400 MHz) e os respectivos valores publicados para o lupeol (CHCl3,500 MHz). 139 NC 8 Lupeol (Lit.)139 28 10 5 1 3 12 14 17 23 26 19 22 H 29 30 OH H a H b H 8 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 20 40 60 80 100 120 140 160 R2 = 1 δ de 13 C d e lu pe ol (l it. ) δ de 13C de 8 y = 1.00011x-0.0019 δ 13C δ 1H δ 13C δ 1H(*) 1 38,73 38,72 2 27,43 27,43 3 79,01 3,19 (dd, 11,0 e 5,0 Hz) 79,02 3,19 4 38,87 38,87 5 55,32 55,31 6 18,33 18,33 7 34,30 34,29 8 40,85 40,84 9 50,46 50,35 10 37,19 37,18 11 20,95 20,94 12 25,17 25,16 13 38,07 38,07 14 42,85 42,85 15 27,46 27,46 16 35,60 35,60 17 43,01 43,01 18 48,33 48,32 19 47,78 2,38 (dt, 11,0 e 5,8 Hz) 48,00 20 150,96 150,98 21 29,87 29,86 22 40,02 40,02 23 28,00 0,97 (s) 28,00 0,97 24 15,37 0,76 (s) 15,38 0,76 25 16,12 0,83 (dl, 0,5 Hz) 16,13 0,83 26 15,99 1,03 (s) 15,99 1,03 27 14,56 0,94 (dl, 0,8 Hz) 14,56 0,95 28 18,01 0,79 (s) 18,02 0,79 29 109,32 (a): 4,57(qd, 2,5 e 1,5 Hz) 109,32 4,56 (b): 4,69(m) 4,69 30 19,32 1,68 (m) 19,32 1,68 (*) Os valores dos acoplamentos escalares (J) e as multiplicidades não foram apresentados pela literatura. Os valores de δ de 13C de 8 (X) mostraram excelente correlação linear com os dados da literatura (Y = 1,00011X – 0,0019, R2 = 1,0000). O espectro de RMN de 1H de 8 registrou também um sinal em δ 4,57 (qd, J = 2,5 e 1,5 Hz) que foi atribuído ao hidrogênio (H-29a), em posição cis em relação aos hidrogênios do Capítulo 3 Determinação Estrutural de 8 99 Oliveira, DM (2012) grupo metila H-30 e um multpleto em δ 4,69 (m) atribuído a H-29b. O multipleto observado em 1,68 (m) foi atribuído aos hidrogênios H-30. A Tabela 3.14 (p.93) mostra a comparação entre alguns valores de δ de 1H de 8 com os correspondentes valores encontrados na literatura para o lupeol.139 Os espectros de RMN de 13C e DEPT-135 de 8 (Figuras 3.52 (a) e (b), p.101) apresentaram trinta sinais de carbono referentes a sete carbonos de grupos metilas, seis metinos, onze metilenos e seis sinais de carbonos não hidrogenados. Mostrou também dois sinais de carbonos de um grupo alquenilo em δ 159,96 (C-20), em δ 109,50 (C-29) e um sinal de carbono carbinólico em 79,01 (C-3). A comparação entre os valores δ de 13C de 8 com os do lupeol135 mostrou uma excelente correlação linear (R2 = 1,000). 28 10 5 1 3 12 14 17 23 26 19 22 H 29 30 OH H a H b H 8 Figura 3.50: Espectro absorção de 8 na região do IV (KBr). Alguns espectros no IV apresentaram, sistematicamente, bandas intensas em 1620-1630 e 1640- 1650 cm-1, as quais podem ser atribuídas produtos de limpeza e/ou solvente. Essas bandas possivelmente se sobrepuseram às bandas mais fracas, que ocorrem na mesma região do espectro de IV, relativas às ligações duplas no composto isolado (8). Número de onda (cm-1) T (% ) Capítulo 3 Determinação Estrutural de 8 100 Oliveira, DM (2012) 28 10 5 1 3 12 14 17 23 26 19 22 H 29 30 OH H a H b H 8 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0.84 0.83 0.820.95 1.00 0.95 0.90 0.85 0.80 0.75 4.70 4.69 4.68 4.67 4.58 4.57 4.56 4.55 2.422.402.382.362.34 3.22 3.20 3.18 3.16 1.69 1.69 1.68 1.68 1.67 δ δ δ H-3 H-19 H-3 H-29a H-29b H-30 δ A H-25 3H H-27 δ 3H H-26 H-27 H-23 Sinal (ppm) Integral 0.72-0.64 1.0 0.77-0.75 3.0 0.80-0.78 2.9 0.84-0.82 3.0 0.93-0.86 1.3 0.95-0.94 3.1 0.97-0.96 2.9 1.02-0.98 1.1 1.04-1.02 3.1 1.15-1.04 1.2 1.24-1.16 1.9 1.27-1.24 2.2 1.31-1.28 1.0 1.35-1.31 1.4 1.40-1.35 5.4 1.44-1.40 1.4 1.48-1.45 0.8 1.55-1.48 1.8 1.67-1.55 4.8 1.69-1.67 4.6 1.73-1.69 0.6 1.98-1.86 1.2 2.42-2.33 1.1 3.22-3.15 1.0 4.58-4.55 1.0 4.70-4.68 1.0 H-28H-25 H-24 δ δ Expansão A H-29b 1H H-29a 1H H-19 1H 1H δ H-30 3H Figura 3.51: Espectro de RMN de 1H de 8 (CDCl3, 400 MHz). Capítulo 3 Determinação Estrutural de 8 101 Oliveira, DM (2012) 28 10 5 1 3 12 14 17 23 26 19 22 H 29 30 OH H a H b H 8 50 48 46 44 42 40 38 36 34 32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 50 48 46 44 42 40 38 36 34 32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 110.0 108.0 C-27C-24C-25 C-26 C-6 C-28 C-30 C-11C-12 C-23 C-2 C-15 C-21 C-7C-16 C-10 C-13C-1C-4 C-22 C-19 C-17 C-14 C-8 C-18 C-9 13C C-29 A C-20 C-3 C-29 δ C-5 Expansão A δ 13C δ DEPT-135 DEPT-135 δ Figura 3.52: Espectros de RMN de (a) 13C e (b) DEPT-135 de 8 (CDCl3, 100MHz). (a) (b) Capítulo 3 Determinação Estrutural de 9 Oliveira, DM (2012) 102 Acetato de 3β-lup-20(29)-en-3-ila (9) O composto 9 foi isolado de frações do extrato hexânico (FHEMA) na forma de um sólido branco amorfo que, após recristalização com metanol, fundiu na faixa de temperatura de 198,4 a 199,6 ºC (172,0-174,9 oC)25 e forneceu resultado positivo para TTPC quando submetido ao teste químico de Liebermann-Burchard.78 Foi observado na literatura que o valor do ponto de fusão de um mesmo TTPC, isolado de plantas distintas, varia muito de um relato para outro. Isso provavelmente ocorre devido ao grau e à composição de impurezas que normalmente são isoladas juntamente com o TTPC no processo fitoquímico. Tabela 3.15: Absorções no infravermelho e modos de vibração de 9 Nº de onda, (cm-1) Grupo/fragmento molecular Modo de vibração 3070 RC=CH2 ν C-H 2920-2850 -CH2-; -CH3 ν C-H 1735 R-COOR1 ν C=O 1640 RC=CH2 ν C=C 1455 -CH2-; -CH3 δ C−H 1380-1370 Gem-dimetila δ C−H 1250 R-COOR1 ν Ο−C 1150 R-COOR1 ν C−O 880 RC=CH2 γ C=C−H A análise do espectro de 9 na região do infravermelho (Figura 3.53, p.104), permitiu a identificação de um conjunto de bandas características de um éster de triterpeno. As bandas em 1735 e 1250 cm-1 foram atribuídas a estiramentos de carbonila (C=O) e de ligação C-O de éster, respectivamente.99 A Tabela 3.15 mostra as bandas observadas e as atribuições de fragmentos moleculares. O conjunto de bandas observadas no espectro do IV em 3070, 2850, 2920, 1735, 1640, 1455, 1380, 1370, 1250, 1150, 1010, 1030, 980 e em 880 cm-1, como um todo, foram confirmadas como bandas características do TTPC 3-O-acetato de lupeoíla.25 Mediante a comparação entre os espectros no IV de uma amostra de 9 e de amostra autentica de 3-O-acetato de lupeoíla25 foi constatada a identidade entre ambos os espectros. 28 10 5 1 3 12 14 17 23 26 27 19 22 H 29 30 O H a H b H 1' 2' O 9 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 9 Oliveira, DM (2012) 103 Tabela 3.16: Comparação e análise de dispersão entre os dados de RMN de 9 (CDCl3, 400 MHz) com os respectivos valores publicados para o 3-O-acetato de lupeoíla (CDCl3, 400 MHz) 25 NC 9 Acetato de lupeol25 δ de13C δ de 1H δ de 13C δ de1H 1 38,42 38,39 1,63 ax, m; 0,98 eq, m 2 23,73 23,71 1,66, m 3 81,00 4,47 (m) 80,98 4,47, m 4 37,82 37,80 5 55,41 55,00 0,78, m 6 18,23 18,20 1,38 ax, m; 1,50 eq, m 7 34,25 34,21 1,39, m 8 40,88 40,85 9 50,38 50,34 1,28, m 10 37,11 37,08 11 20,97 20,94 1,39 ax, m; 1,20 eq, m 12 25,14 25,10 1,64 ax, m; 1,09 eq, m 13 38,08 38,04 1,62, m 14 42,85 42,83 15 27,46 27,43 1,65 ax, m; 0,99 eq, m 16 35,60 35,57 1,38 ax, m; 1,42 eq, m 17 43,02 43,00 18 48,32 48,29 1,36, m 19 48,03 2,37 (dt, 5,8 e 11,0) 48,01 2,36 (dt, 5,8 e 10,9) 20 150,97 150,97 21 29,87 29,83 1,91 ax, m, 1,33 eq, m 22 40,02 40,00 1,19 ax, m; 1,31 eq, m 23 27,96 0,85 (s) 27,95 0,84 (s) 24 16,19 0,84 (s) 16,18 0,83 (s) 25 16,51 0,86 (s) 16,49 0,85 (s) 26 16,00 1,03 (s) 15,97 1,03 (s) 27 14,52 0,94 (s) 14,50 0,93 (s) 28 18,02 0,79 (s) 18,00 0,78 (s) 29 109,36 a: 4,57 (m) b: 4,69 (m) 109,35 a: 4,57 (m) b: 4,68 (m) 30 19,31 1,68 (sl) 19,29 1,68 (s) 1’ 171,01 171,02 2’ 21,32 2,04 (s) 21,33 2,03 (s) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160170 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 δ d e 1 3 C do ac eta to de 3b -lu p-2 0(2 9)- en -3- ila (li t.) δ de 13C de 9 y = 1.0018x-0,03053 R2 = 1 28 10 5 1 3 12 14 17 23 26 27 19 22 H 29 30 O H a H b H 1' 2' O 9 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 9 Oliveira, DM (2012) 104 Os espectros de RMN de 1H, de 13C e DEPT-135 de 9 (Figuras 3.55 (a) e (b), p.106), registraram um conjunto de sinais em δ 4,57 (m, H-29a), δ 4,69 (m, H-29b), δ 109,36 (C-29), δ 150,97 (C-20), os quais foram atribuídos aos átomos de carbonos e hidrogênios do grupo isopropilideno do esqueleto do lupeol.135 Foram observados também sinais de carbono em δ 171,01 (C=O) e δ 21,32 (CH3), bem como o sinal de hidrogênio em δ 2,04 (Me-2’), atribuídos a um grupo acetila esterificado em C-3. O espectro de RMN de 1H (Figuras 3.54, p.105) também apresentou um sinal em δ 4,47 (m, H-3), atribuído ao hidrogênio carbinólico da molécula. As ressonâncias dos hidrogênios de sete grupos metilas de um esqueleto lupânico foram observadas em δ 0,79 (s, Me-28); 0,84 (s, Me-24); 0,85 (s, Me-23); 0,86 (s, Me-25); 0,94 (s, Me-27); 1,03 (s, Me-26) e 1,68 (sl, Me-30). Múltiplos sinais na região de δ 1,2 a 1,9 foram atribuídos a hidrogênios de grupos metilenos e metinos pertencentes à estrutura de um triterpeno pentacíclico lupânico.139 O espectro de RMN de 13C e DEPT-135 de 9 (Figuras 3.55 (a) e (b), p.106) apresentaram trinta e dois sinais de carbono-13, sendo oito metilas, seis metinos, onze metilenos e sete sinais de carbonos não hidrogenados. A comparação entre valores observados dos espectros de RMN de 13C de 9 e os valores relatados na literatura (Tabela 3.16, p.103) apresentaram coeficiente de correlação unitária (R = 1).25 Figura 3.53: Espectro de absorção de 9 na região do IV (KBr). Número de onda (cm-1) T (% ) 3070 28 10 5 1 3 12 14 17 23 26 27 19 22 H 29 30 O H a H b H 1' 2' O 9 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 9 Oliveira, DM (2012) 105 Figura 3.54:Espectro de RMN de 1H de 9 (CDCl3, 400 MHz). 28 10 5 1 3 12 14 17 23 26 27 19 22 H 29 30 O H a H b H 1' 2' O 9 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4 3.2 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 4.70 4.68 2.1 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 4.58 4.57 4.56 4.50 4.45 2.45 2.40 2.35 2.30 δ δ δ H-19 H-3 H-29b H-29a H-19H-3 δ H-29a H-29b Sinal (ppm) Integral 0.79-0.77 3.5 0.82-0.79 1.2 0.86-0.83 9.8 0.93-0.87 1.9 0.95-0.93 3.7 1.02-0.95 3.5 1.04-1.02 3.3 1.27-1.04 5.3 1.41-1.27 9.6 1.68-1.41 12.8 1.70-1.68 4.0 2.02-1.83 1.8 2.06-2.02 3.7 2.43-2.32 1.1 4.51-4.43 1.1 4.59-4.54 1.0 4.71-4.66 1.0 1H δ H-2' H-30 H-26 H-27 H-23 H-25 H-24 H-28 δ 1H 1H 1H Capítulo 3 Determinação Estrutural de 9 Oliveira, DM (2012) 106 Figura 3.55: Espectros de RMN (a) de 13C e (b) DEPT-135 de 9 (CDCl3, 100MHz). 28 10 5 1 3 12 14 17 23 26 27 19 22 H 29 30 O H a H b H 1' 2' O 9 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 50 48 46 44 42 40 38 36 34 32 30 28 26 24 22 20 18 16 110 105 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 40 38 36 34 32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 (a) C-5C-3 C-29C-20 δ δ A C-1' C-27 C-26C-25 C-28C-6 C-30 C-11C-2' C-2C-12 C-15C-23 C-21C-7 C-16 C-10 C-4C-13 C-1 C-22 C-8 C-14C-17C-18C-19 B Expansão A C-9 (b) C-7C-16C-1 C-24 C-5C-3 δ C-29 C-27 C-30 C-28C-2'C-23C-13 C-6C-11C-2C-12C-15C-21 Expansão B δ C-22 Capítulo 3 Determinação Estrutural da mistura de 10 e 11 107 Oliveira, DM (2012) Mistura de 3β-esteariloxi-olean-12-eno (10) e 3β-esteariloxi-urs-12-eno (11) 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 16 17 18 22 212019 29 28 26 27 25 O 2423 1'5' 8' 9' 15' 16' 17' O 18' R R1 30 H H (10) - R = H, R1 = CH3 (11) - R = CH3, R1 = H A fração (F16) que originou a mistura dos constituintes 10 e 11 foi isolada do extrato FHEMA como um material branco transparente, pastoso, com resultado positivo no teste para TTPC’s (Liebermann-Burchard).78 Subseqüentemente, esse material foi identificado como uma mistura dos compostos 3β-esteariloxi-olean-12-eno (10) e 3β-esteariloxi-urs-12-eno (11). O espectro na região do infravermelho da mistura (Figura 3.56, p.109) apresentou bandas em 2900 e 2850 cm-1, que são características de deformações axiais de C-H de grupos CH2 e CH3, respectivamente. A ausência de uma banda de forte intensidade na região de 3200-3700 cm-1 e a ocorrência de bandas em 1260 e 1734 cm-1, referentes às deformações axiais de C=O e C-O-C, respectivamente, indicaram a presença de éster alifático. As bandas em 1470 e 1380 cm-1 foram atribuídas à deformação angular de C-H de grupos metilas e gem- dimetilas, respectivamente.99 Os espectros de RMN de 13C (Figura 3.58, p.110) e DEPT-135 (Figura 3.59, p.110) apresentaram quatro sinais de carbonos olefinicos, típicos das ligações duplas endocíclicas (∆12) da β-amirina (δ de 13C 121,65 e 145,19) e da α-amirina (δ de 13C 124,33 e 139,62).96 Os correspondentes sinais de hidrogênios olefínicos em δ 5,13 (t, J=3,35 Hz, 1H) e 5,18 (t, J=3,40 Hz, 1H) foram detectados no espectro de RMN de 1H (Figura 3.57, p.109). No espectro de RMN de 13C o sinal em δ 173,66 e outro em δ 80,57, foram atribuídos a carbonos carbonílicos e a carbonos hidroxilados, respectivamente. O sinal de carbono mais intenso, em δ C 29,71, foi atribuído a carbonos metilênicos de cadeias alifáticas longas. As semelhanças entre os dados de RMN de 10 e 11 e os dados publicados por Vieira Filho128 e Miranda33 permitiram caracterizar como uma mistura constituída pelos ésteres 3β-esteariloxi-olean-12- eno (10) e 3β-esteariloxi-urs-12-eno (11). A Tabela 3.17 (p.108) apresenta as atribuições dos Capítulo 3 Determinação Estrutural da mistura de 10 e 11 108 Oliveira, DM (2012) dados experimentais de RMN de 13C para esses dois ésteres triterpênicos, e os gráficos de dispersão entre os valores de δ de 13C observados e os valores da literatura.33, 128 Os gráficos de dispersão apresentaram valores de correlação próximos da unidade (R2(10) ≈ R2(11) = 1), o que indicou que os dados de RMN de 13C de 10 e 11 e os respectivos valores apresentados na literatura apresentam identidade. 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 16 17 18 22 212019 29 28 26 27 25 O 2423 1'5' 8' 9' 15' 16' 17' O 18' R R1 30 H H (10) - R = H, R1 = CH3 (11) - R = CH3, R1 = H Tabela 3.17: Comparação e análise de dispersão entre os valores de δ de 13C de 10 e 11 (CDCl3, 100 MHz) com os respectivos valores publicados para os compostos 3β‐esteariloxi‐olean‐12‐eno e 3β‐esteariloxi‐urs‐12‐eno (CDCl3, 100 MHz)33, 128 δ de 13C 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 δ de13C de 10δ d e1 3 C d e 3β -e st ea ril ox i-o le an -1 2- en o (L it. ) (a) y = 0.99954x+0.0635 R2 = 0.99999 C 10 11 C 10 11 CL estearila 1 38,26 38,45 16 26,94 26,61 1' 173,66 2 23,37 23,64 17 32,48 33,74 2' 34,85 3 80,58 80,57 18 47,56 59,07 3' 25,17 4 37,75 37,75 19 46,79 39,62 4' 29,18 5 55,27 55,23 20 31,08 39,65 C 29,26 6 18,25 18,25 21 34,72 31,25 6' 29,36 7 32,60 32,87 22 37,15 41,54 7' 29,58 8 39,81 40,03 23 28,06 28,09 8' 29,67 9 47,64 47,64 24 16,77 16,81 9' 29,67 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 (b) y = 1.00027x+0.01632 R2 = 1 δ de 13 C de 3 β- es te ar ilo xi- ur s- 12 -e no (L it. ) δ de 13C de 11 10 36,85 36,80 25 15,54 15,72 10' 29,83 11 23,53 23,64 26 16,87 16,81 11' 29,70 12 121,65 124,33 27 25,95 23,24 12' 29,70 13 145,19 139,62 28 28,39 28,74 13' 29,70 14 41,72 42,08 29 33,33 17,49 14' 29,66 15 26,14 26,59 30 23,69 21,38 15' 29,47 16' 31,92 17' 22,69 18' 14,11 CL: cadeia lateral. Fonte: Espectros de RMN 13C/DEPT‐135 (p.110) No espectro de RMN de 1H (Figura 3.57, p.109), a integração dos sinais de hidrogênio na região entre δ 0,77 e 1,10, na qual predominam os sinais dos hidrogênios de grupos metilas, o valor relativo da integral foi de 69 H’s, enquanto que o valor da integral na região Capítulo 3 Determinação Estrutural da mistura de 10 e 11 109 Oliveira, DM (2012) entre 1,10 e 1,28, onde predominam os sinais dos hidrogênios metilênicos da cadeia lateral, foi de 66 H’s. Esses valores da integração dos sinais foram comparáveis ao número de hidrogênios metílicos e metilênicos das moléculas dos TTPC’s 3β-esteariloxi-olean-12-eno (10) e 3β-esteariloxi-urs-12-eno (11), isômeros de fórmula C48H84O2. As integrais dos respectivos sinais de H-12 de 10 e 11 mostraram que a mistura foi obtida na proporção aproximada de 0,4/1 entre o TTPC 10 e 11. 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 -10 0 10 20 30 40 50 60 1260 720 988 1175 1380 1470 1734 2850 T ( %) Número de onda (cm-1) 2900 3170 1660 Figura 3.56: Espectro absorção de 10 e 11 na região do infravermelho (CsI). 4.60 4.55 4.50 4.45 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 2.3 2.2 5.20 5.15 5.10 H-12 (10 e 11) δ H-3 (10 e 11) H-2' (10 e 11) δ H-12 (10) δ δ CH2 (cadeias laterais) de 10 e 11H-12 (11) H-2' (10 e 11) Integrais região (ppm) ΣH [0.74 .. 0.81] 8.1 [0.81 .. 0.85] 7.8 [0.85 .. 0.90] 20.4 [0.90 .. 0.95] 10.1 [0.95 .. 1.00] 9.3 [1.00 .. 1.04] 7.0 [1.04 .. 1.10] 6.5 [1.10 .. 1.20] 7.6 [1.22 .. 1.28] 58.0 [1.28 .. 1.40] 26.3 [1.40 .. 1.53] 10.2 [1.53 .. 1.72] 19.3 [1.72 .. 2.11] 9.5 [2.20 .. 2.39] 4.2 [4.41 .. 4.60] 1.9 [5.08 .. 5.16] 1.0 [5.16 .. 5.22] 0.4 H-3 (10 e 11) Figura 3.57: Espectro de RMN de 1H de 10 e 11 (CDCl3, 400 MHz). 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 16 17 18 22 212019 29 28 26 27 25 O 2423 1'5' 8' 9' 15' 16' 17' O 18' R R1 30 H H (10) - R = H, R1 = CH3 (11) - R = CH3, R1 = H Capítulo 3 Determinação Estrutural da mistura de 10 e 11 110 Oliveira, DM (2012) 42 40 38 36 34 32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 145 140 135 130 125 120 30.5 30.0 29.5 29.0 28.5 C- 7(1 0) C- 21 (11 ) C- 22 (11 ) C- 23 (11 ) C- 2(1 0) C- 15 (10 ) C- 22 (10 ) C- 1(1 0) Expansão A C- 14 (11 ) C- 14 (10 ) C- 2' C- 10 (11 ) C- 10 (10 ) C- 8(1 0)C -8( 11 ) C- 4(1 0 e 11 ) C- 20 (11 ) C- 19 (11 ) C-29(11) C- 17 (11 ) C- 17 (10 ) C- 20 (10 ) C- 28 (11 ) C- 27 (10 ) C- 30 (11 ) C- 30 (10 ) C- 27 (11 ) C- 24 (10 ) C- 23 (11 ) C- 25 (11 ) C- 25 (10 ) C-24 e C-26(11) C-26(10) C-16' Expansão B C-11', 12', 13' C-18' C-17' C- 3' B C δ C-3(10-11) C-5(10-11) C-18(10)C-18(11) δ δ C-13(11) C-13(10) C-12(11) C-12(10) C-9(10-11) A Expansão C δ C-10' C-8', 9', 14' C-4' C-5' C-6' C-15' C-7' Figura 3.58: Espectro de RMN de 13C de 10 e 11 (CDCl3, 100 MHz). 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 16 17 18 22 212019 29 28 26 27 25 O 2423 1'5' 8' 9' 15' 16' 17' O 18' R R1 30 H H (10) - R = H, R1 = CH3 (11) - R = CH3, R1 = H 47 46 45 44 43 42 41 40 39 38 37 36 35 34 33 32 31 30 29 28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 C- 21 (10 ) C- 22 (10 ) C- 1(1 0) C- 1(1 1) C-19(11) C-29(10) C- 2' C -7( 11 ) C- 7(1 0) C-20(11) C- 16 ' C- 19 (10 ) C- 21 (11 ) C- 22 (11 ) δ C-27(10) C-15' C-7' C-6' C-5' C-4' C -16 (10 ) C-28(11) C-27(11) C-30(10) C-30(11) C- 3' C-28(10) C- 17 ' C-23(11) C-23(10) C- 15 (10 ) C- 15 e C- 16 (11 ) C- 6(1 0 e 11 )C- 2(1 0) C- 11 (10 ) C- 2 e C- 11 (11 ) δ Figura 3.50: Espectro de RMN DEPT‐135 de 10 e 11 (CDCl3, 100 MHz). Capítulo 3 Determinação Estrutural de 11 Oliveira, DM (2012) 111 3β-esteariloxi-urs-12-eno (11) 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 16 17 18 22 21 20 19 29 28 26 27 25 O 2423 1'5' 8' 9' 15' 16' 17' O 18' H H 30 11 O constituinte 11 foi obtido do extrato hexânico (FHEMA) como uma graxa branca (4,3 mg), 11 forneceu resultado positivo para o teste de Liebermann-Burchard78 para TTPC (coloração rósea). O espectro de 11 na região do infravermelho (Figura 3.60, p.113) indicou que a amostra analisada se tratava de um éster triterpênico. A presença de uma banda em 1732 cm-1, acompanhada de outra na região entre 1248-1255 cm-1 (ν C-O) de baixa intensidade, evidenciaram que 11 se tratava de um TTPC éster derivado de ácido de cadeia longa. Visto que, os ésteres de triterpenos de grupos alcanoílas graxos apresentam as bandas de absorções relacionadas com a vibração da ligação C-O menos intensas do que as bandas correspondentes observadas nos acetatos.99 Tabela 3.18: Absorções na região do infravermelho e modos de vibração de 11 Nº de onda, ν (cm-1) Grupo/fragmento molecular Modo de vibração 2900-2840 −CH2−; −CH3 ν C-H 1732 R-COOR1 ν C=O 1470 −CH2-; −CH3 δ C-H 1380-1370 Dimetil geminal δ C-H 1255 R-COOR1 ν O−C 1175 R-COOCH2− δ H-C 995-970 −C=C-H γ C=C-H Fonte: Espectro no IV de 11 (p.) A Tabela 3.18 mostra as bandas e os modos de vibração com os respectivos fragmentos moleculares que foram atribuídos a 11. O espectro no IV de 11 apresentou bandas em 2840, 2900, 1732, 1460, 1380, 1370, 1255, 1175, 1100, 995 e 970 cm-1. Ao ser comparado com o espectro de uma amostra autêntica do éster 3β-alcanoiloxi-urs-12-eno, uma excelente concordância é observada, principalmente na região de impressão digital.25 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 11 Oliveira, DM (2012) 112 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 16 17 18 22 21 20 19 29 28 26 27 25 O 2423 1'5' 8' 9' 15' 16' 17' O 18' H H 30 11 Tabela 3.19: Comparação e análise de dispersão entre os valores de δ de 13C e 1H de 11 (CDCl3, 400 MHz) com os respectivos valores publicados para 3β-esteariloxi-urs-12-eno (CDCl3, 400 MHz)25, 33 C δ de 13C δ de 1H C δ de 13C δ de 1H 11 lit.25 11 lit.25 11 lit.25 11 lit.25 1 38,50 38,51 1,13 ax (m), 1,67 eq (m) 1’ 173,70 173,68 2 23,68 23,68 1,60 (m) 2’ 34,90 34,87 2,29 (t: 7,6) 2,29; dd: 7,4; 7,8 3 80,63 80,64 4,51 (m) 4,51, (dd, 10,2; 5,9) 3’ 25,20 25,20 1,63 (m) 1,64 (m) 4 37,79 37,77 4’ 29,20 29,20 1,25 (m) 1,25 (m) 5 55,32 55,32 0,87 (m) 5’ 29,28 29,28 1,25 (m) 1,25 (m) 6 18,29 18,29 1,41 eq (m) 1,52 ax (m) 6’ 29,38 29,38 1,25 (m) 1,25 (m) 7 32,92 32,92 1,33 eq (m) 1,55 ax (m) 7’ 29,61 29,60 1,25 (m) 1,25 (m) 8 40,09 40,09 29,66 - 29,72 29,66 - 29,72 1,25 (m) 1,25 (m) 9 47,69 47,69 1,55 (m) 10 36,85 36,85 11 23,41 23,41 1,91 (m) 11’ 12 124,38 124,38 5,13 (t, 3,5) 5,12 (t, 3,5) 12’ 13 139,67 139,67 14 42,13 42,13 15 26,65 26,65 0,96 eq (m) 1,83 ax, (m) 15’ 29,49 29,49 1,25 (m) 1,25 16 28,14 28,14 0,87 eq (m) 1,83 ax, (m) 16’ 31,95 31,95 1,25 (m) 1,25 17 33,78 33,78 17’ 22,71 22,70 1,25 (m) 1,25 18 59,13 59,13 1,31 (m) 18’ 14,12 14,12 0,88 (m) 0,87 19 39,69 39,65 0,93 (m) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 18 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 δ de 13 C d e 3β -e st ea ril ox i-u rs -1 2- en o (L it. ) δ de13C de 11 y = 0.99996x+0.00002 R2 = 1,0000 20 39,65 39,70 1,31 (m) 21 31,29 31,29 1,31 eq (m), 1,39 ax (m) 22 41,58 41,58 1,29 eq (m), 1,46 ax (m) 23 28,14 28,13 0,87 (s) 0,87 (s) 24 16,84 16,84 0,87 (s) 0,87 (s) 25 15,75 15,75 0,98 (s) 0,98 (s) 26 16,91 16,91 1,01 (s) 1,01 (s) 27 23,27 23,27 1,07 (s) 1,07 (s) 28 28,77 28,77 0,80 (m) 0,80 (s) 29 17,52 17,52 0,80 (m) 0,81 (d) 30 21,41 21,40 0,91 (d: 7,0) 0,90 (d) Fonte: Espectros de RMN 1D de 11 (p.109-110). Capítulo 3 Determinação Estrutural de 11 Oliveira, DM (2012) 113 Os espectros de RMN 1D (1H e 13C/DEPT-135) de 11, mostrados nas Figuras 3.62 (a) e (b), p.115), registraram sinais de deslocamentos químicos de 13C em δ 124,38, δ 139,67 e de 1H em δ 5,13 (t, J = 3,5 Hz), atribuídos aos carbonos e hidrogênios da ligação dupla de TTPC’s da classe dos ursanos.25, 96 Nesses espectros, também foram observados os sinais de carbono carbonílico em δ 173,70 (C=O), bem como o sinal de carbono carbinólico em δ 80,64 (-O-CH-) e o respectivo sinal do hidrogênio em δ 4,51 (m), que caracterizam um grupo éster.25 Multipletos observados na região de δ 1,2 a 1,9, indicaram a presença de hidrogênios metilênicos e metínicos pertencentes à estrutura de um triterpeno pentacíclico. O espectro de RMN de 13C de 11 (Figura 3.61, p.114) apresentou quarenta e cinco sinais de carbono, sendo identificados os sinais de carbono-13 de oito metilas, seis metínicos, vinte e três metilênicos e sete de carbonos não hidrogenados. A comparação entre os valores dos deslocamentos químicos do espectro de RMN de 13C de 11 com os valores relatados na literatura apresentou índice de correlação unitário (R2 =1) que permitiu concluir que 11 se tratava do composto 3β- esterariloxi-urs-12-eno, isolado anteriormente por Miranda e colaboradores (Tabela 3.19, p.112).25 T ( % ) Número de onda (cm-1) Figura 3.60: Espectro de absorção de 11 na região do IV (NaCl). 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 16 17 18 22 21 20 19 29 28 26 27 25 O 2423 1'5' 8' 9' 15' 16' 17' O 18' H H 30 11 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 11 Oliveira, DM (2012) 114 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 16 17 18 22 21 20 19 29 28 26 27 25 O 2423 1'5' 8' 9' 15' 16' 17' O 18' H H 30 11 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 4.54 4.52 4.50 4.485.14 5.12 2.32 2.30 2.28 2.26 1.08 1.06 1.04 1.02 1.00 0.98 0.96 0.94 0.92 0.90 0.88 0.86 0.84 0.82 0.80 H-3' δ δ δδ δ im pureza (H 2 O ) A H-3 1H H-12 1H H-2' 1H CH2 (cadeia lateral) H-28 H-23/H-24 H-18' H-29H-30H-25H-26 Expansão A H-27 Figura 3.61: Espectro de RMN de 1H de 11 (CDCl3, 400 MHz). Capítulo 3 Determinação Estrutural de 11 Oliveira, DM (2012) 115 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 16 17 18 22 21 20 19 29 28 26 27 25 O 2423 1'5' 8' 9' 15' 16' 17' O 18' H H 30 11 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 42 40 38 36 34 32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 29.8 29.6 29.4 29.2 40 38 36 34 32 30 28 26 24 22 20 18 δC δ C-1' C-13 C-12 C-3 C-18 C-5 C-9 C-11'-C-13' C-16 e C-23 Expansão A B δ δ C-14 C-22 C-8 C-19C-20 C-1C-4C-10 C-2' C-17 C-21 C-7 C-16' C-21 C-25 C-26 C-24 C-25 C-18' C-30 C-6C-2 C -1 1 C -2 7 C-17' C-3' C -1 5 C -2 8 A C-9'C-10' C-8' C-14' C-7' C-15' C-6' C-5' C-4' Expansão B C-30 C-27C-19C-20 C-22 C-1 C-2' C-7 C-16' C-28 C-16 e C-23 C-15 C-3' C-2 C-11 C-17' C-6 O sinal metílico de C-23 e o metilênico de C-16, em δC 28,13, coalesceram subtrativamente. Figura 3.62: Espectros de RMN de (a) 13C e de (b) DEPT-135 de 11 (CDCl3, 100MHz). δ (b) (a) Capítulo 3 Determinação Estrutural de 12 116 Oliveira, DM (2012) β-amirina, 3β-hidroxi-olean-12-eno (12) 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 16 17 18 22 212019 29 28 26 27 25 2423 H H 30 OH 12 O sólido branco 12 (28,0 mg) foi isolado do extrato FHEMA , apresentou de ponto de fusão entre 189,1-194,6 oC* (196,5-199,0 ºC)129 e teste positivo para TTPC’s (LB+).78 Subsequentemente, esse sólido foi identificado como sendo o composto 3β-hidroxi-olean-12-eno (β-amirina). No espectro na região do infravermelho de 12 (Figura 3.63, p.118), a banda na região entre 3200-3700 foi atribuída a deformações axiais de ligações O-H; as bandas em 2930 e 2850 cm-1, foram atribuídas a deformações axiais de C-H de grupos CH2 e CH3, respectivamente. As bandas em 1455 e 1375 cm-1 foram relacionadas à deformações angulares de C-H de grupos metilas e gem-dimetila, respectivamente.99 Os dados na região do infravermelho e o teste de LB sugeriram a presença de um álcool triterpênico. Nos espectros de RMN de 13C e DEPT-135, Figuras 3.65 e 3.66, p.119, respectivamente, os sinais de carbonos olefínicos em δ 121,72 (CH) e δ 145,19 (C) sugeriram a estrutura do TTPC da série oleanano ∆12, a β-amirina. O correspondente sinal de hidrogênio olefinico em δ 5,18 (t, 3,4 Hz, 1H) foi registrado no espectro de RMN de 1H (Figura 3.64, p.118). A boa correlação entre os dados obtidos e os dados publicados por Duarte,129 permitiram caracterizar 12 como a β-amirina (3β-hidroxi-olean-12-eno, 12). A Tabela 3.20 (p. 117) apresenta as atribuições dos dados de RMN de 13C de 12 e os gráficos de dispersão entre os valores de δ de 13C observados e os valores relatados para 12 (coeficiente de correlação R2(12) = 0,99986). * P.F. diferente da literatura porque a fração foi isolada com impureza de material graxo, como se pode observar nos espectros de RMN (p.113-114). Capítulo 3 Determinação Estrutural de 12 117 Oliveira, DM (2012) Tabela 3.20: Comparação e análise de dispersão entre os valores de δ de 13C de 12 (CDCl3, 50 MHz) com os respectivos valores publicados para β-amirina (3β-hidroxi-olean-12-eno) (CDCl3, 50 MHz)129 δ de 13C C 12 C β-amirina129 1 38,59 1 38,60 2 26,93 2 26,95 3 79,05 3 79,05 4 38,78 4 38,80 5 55,17 5 55,18 6 18,38 6 18,39 7 32,65 7 32,66 8 39,79 8 39,80 9 47,63 9 47,65 10 36,94 10 36,96 11 23,53 11 23,55 12 121,73 12 121,74 13 145,20 13 145,22 14 41,71 14 41,73 15 27,22 15 26,17 16 26,16 16 27,25 17 32,49 17 32,51 18 47,23 18 47,24 19 46,79 19 46,84 20 31,08 20 31,11 21 34,73 21 34,75 22 37,14 22 37,15 23 28,10 23 28,11 24 16,60 24 15,60 25 15,50 25 15,52 26 16,81 26 16,82 27 26,00 27 26,01 28 28,39 28 28,42 29 33,35 29 33,36 30 23,69 30 23,71 Fonte: Espectros de RMN 13C e DEPT-135 (Figuras 3.65 e 3.66, p.119) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 δ de 13 C d e β- am iri na δ de 13C de 12 y=1.00095x-0.05555 R2 = 0.99986 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 16 17 18 22 212019 29 28 26 27 25 2423 H H 30 OH 12 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 12 118 Oliveira, DM (2012) 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 16 17 18 22 212019 29 28 26 27 25 2423 H H 30 OH 12 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 70 80 90 100 33 50 81 5 99 8 11 00 11 85 13 7514 55 28 50 2930 16 34 Numero de onda (cm-1) Figura 3.63: Espectro de absorção de 12 na região do infravermelho. 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 5.20 5.15 3.3 3.2 3.1 δ δ H-12 H-3 H-12 H-3 δ 1H 1H Figura 3.64: Espectro de RMN de 1H de 12 (CDCl3, 200 MHz). Capítulo 3 Determinação Estrutural de 12 119 Oliveira, DM (2012) 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 16 17 18 22 212019 29 28 26 27 25 2423 H H 30 OH 12 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 32 31 30 29 28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 56 55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45 44 43 42 41 40 39 38 37 36 35 34 33 32 B δ δ C-13 C-3 C-12 δ A C-30C-20 C-16 C-27 C-26 C-25 C-24 C-23 C-15C-28 C-11 C-6C-2 Expansão A impurezas impurezas C-29C-22 C-21 C-19 C-18 C-14 C-10C-9 C-8 C-7 C-17 C-5 C-1 Expansão B C-4 Figura 3.65: Espectro de RMN de 13C de 12 (CDCl3, 50 MHz). 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 46 44 42 40 38 36 34 32 30 28 26 24 22 20 18 δ A Expansão A C-14 C-21 C-16C-15 C-11 C-7 C-6C-1 δ C-19 Figura 3.66: Espectro de RMN DEPT-135 de 12 (CDCl3, 50 MHz). Capítulo 3 Determinação Estrutural de 13 Oliveira, DM (2012) 120 28-Hidroxi-3-oxo-friedelano (canofilol, 13) 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 O 27 26 25 30 H OH 13 O material de 13 foi isolado do extrato SHEMA como um sólido branco e amorfo, apresentando temperatura de fusão de 271,6 a 275,9 ºC (272-275 ºC).128 Uma amostra de 13 forneceu resultado positivo para TTPC quando submetida ao teste químico de Liebermann- Burchard.78 A análise do espectro de 13, na região do infravermelho (Figura 3.67, p.122), permitiu a identificação de bandas características de um triterpeno pentacíclico duplamente funcionalizado, um TTPC ceto-álcool. Uma banda intensa, centrada em 3400 cm-1 foi atribuída a absorções próprias de estiramentos de ligação O-H de grupo hidroxila de álcool. A evidência da presença de grupo hidroxila de álcool primário foi observada no espectro pela ocorrência de banda em 1055 cm-1. Bandas intensas, em 2860 e 2930 cm-1, associadas às bandas em 1460 e 1390 cm-1, foram atribuídas a estiramentos e deformações, respectivamente, em ligações C-H de grupos metila e metileno. Uma banda de forte intensidade, em 1710 cm-1, foi correlacionada com a absorção característica de carbonila de cetonas cíclicas semelhante a que ocorre na friedelina (5). O conjunto de bandas observadas no espectro no IV em 3550, 3400, 3220, 2860, 2930, 1710, 1470, 1460, 1440, 1390, 1365, 1225, 1125 e em 1055 cm-1, foram caracterizadas como bandas do TTPC canofilol.27 A comparação entre as bandas do espectro no IV de 13 com as de um espectro no IV de uma amostra autêntica de 28-hidroxi-3-oxo friedelano (canofilol)128 mostrou a mesma identidade espectrométrica. O espectro de RMN de 1H de 13 (Figura 3.68, p.122) apresentou seis simpletos em δ 0,72, 0,87, 0,91, 0,98, 0,99, 1,13 e um multipleto em δ 0,88, atribuídos a sete sinais de hidrogênios de grupos metila. Apresentou também um sinal largo em δ 3,63 (sl), atribuído aos hidrogênios diastereotópicos do grupo -CH2-OH em C-28. A Tabela 3.21 (p.121) mostra a Capítulo 3 Determinação Estrutural de 13 Oliveira, DM (2012) 121 comparação entre os valores de δ de 13C observados para 13 e os valores relatados para o canofilol isolado por Vieira Filho.128 Tabela 3.21: Comparação e análise de dispersão entre os dados de RMN de 13 (CDCl3, 400 MHz) com os respectivos valores publicados para o canofilol (CDCl3, 400 MHz) 128 C 13 Literatura128 δ 13C δ 1H δ 13C δ 1H 1 22,27 22,27 1,65; 1,98 2 41,51 41,49 2,35 3 213,09 212,88 4 58,24 58,23 2,28 5 42,11 42,09 6 41,26 41,29 1,73 7 18,25 18,26 1,50 8 52,51 52,53 1,45 9 37,48 37,49 10 59,51 59,53 1,53 11 35,45 35,49 1,10 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 δ de 13 C 2 8- hi dr ox i-3 -o xo -fr ie de la no δ de 13C de 13 R2 = 1.0000 y = 0.99876 + 0.05267 12 30,11 30,13 1,39 13 39,38 39,41 14 38,17 38,19 15 31,27 31,44 1,43 16 29,14 29,17 1,93 17 35,18 35,25 18 39,47 39,49 1,38 19 34,51 34,58 1,05 20 28,16 28,13 21 31,41 31,50 1,45 22 33,39 33,41 1,42 23 6,82 0,88 (m) 6,80 0,87 d (6,8) 24 14,67 0,72 14,67 0,71 25 18,08 0,87 18,07 0,85 26 19,08 0,91 19,06 0,91 27 19,20 1,13 19,20 1,13 28 68,07 3,63 (sl, w/2 = 3,0 Hz) 67,82 3,65 29 32,84 0,98 32,87 0,97 30 34,26 0,99 34,29 0,99 O espectro de RMN de 13C (Figura 3.69, p.123) apresentou o sinal em δ 68,07, típico de carbono funcionalizado com grupo hidroxila em álcoois alifáticos primários.99 Observou- se também o sinal em δ 213,09 de carbono funcionalizado com grupo carbonila, sinal típico de C-3 na estrutura dos ceto-TTPC (cetonas biogenéticas).96 A análise conjunta dos espectros DEPT-135 (Figura 3.70, p.123) e de RMN de 13C permitiu a identificação de sete sinais de carbono em δ 6,82, 14,67, 18,08, 19,08, 19,20, 32,84 e 34,26, atribuídos a grupos metila; de onze sinais de grupos metilênicos em δ 18,25, 22,27, 29,14, 30,11, 31,26, 31,41, 33,38, 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 O 27 26 25 30 H OH 13 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 13 Oliveira, DM (2012) 122 34,51, 35,44, 41,26 e 41,51, e de seis sinais de carbonos não hidrogenados em δ 28,16; 35,18; 37,47; 38,17; 39,38 e 42,17. Foi possível também, a atribuição de mais quatro sinais de carbonos metínicos em δ 39,46, 52,50, 58,23 e 59,56. A Tabela 3.21 (p.121) mostra a comparação entre os sinais de δ de 13C observados de 13 e os valores relatados na literatura para o canofilol128 (coeficiente de correlação, R2 = 1). Número de onda (cm-1) T (% ) Figura 3.67: Espectro de absorção de 13 na região do IV (KBr). 3.8 3.6 3.4 3.2 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 1.15 1.10 1.05 1.00 0.95 0.90 0.85 0.80 0.75 0.70 3.65 3.64 3.63 3.62 3.61 2.4 2.3 2.2 H-4 H-4H-2 H-28 (−CH2−OH) δ hidrogênios α-carbonílicos (H-2) H-28 Expansão A 3H A H-27 H-29H-30 H-26 H-25 H-23 H-24 δ 6H 2H δ 3H δ Figura 3.68: Espectro de RMN de 1H de 13 (CDCl3, 400 MHz). 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 O 27 26 25 30 H OH 13 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 13 Oliveira, DM (2012) 123 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 42 40 38 36 34 32 30 28 26 24 22 20 18 16 C-28 C-10 C-8 C-4 C-3 δ C-23 C-24 A Expansão A δ C-5 C-2 C-6 C-18 C-13 C-14 C-9 C-11 C-17 C-19 C-30 C-22 C-29 C-21 C-15 C-12 C-16 C-20 C-1 C-27 C-26 C-7 C-25 Figura 3.69: Espectro de RMN de 13C de 13 (CDCl3, 100 MHz). 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 42 41 40 39 38 37 36 35 34 33 32 31 30 29 28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 C-23 C-24C-8C-10 C-4 C-28 δ A Expansão A C-7C-1 C-16 C-12C-21 C-15 C-22C-11 C-6 δ C-2 Figura 3.70: Espectro de RMN, DEPT-135 (CDCl3, 100 MHz). 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 O 27 26 25 30 H OH 13 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 14 124 Oliveira, DM (2012) 3β,16β-di-Hidroxifriedelano (pachysandiol B, 14). 10 5 1 4 2 3 9 8 6 7 11 12 14 13 15 16 18 17 19 20 22 21 23 28 29 24 OH OH 27 26 25 30 14 A completa atribuição dos deslocamentos químicos de 1H e 13C de pachysandiol-B (em solução de CDCl3) foi realizada com base em dados espectrais RMN 1D (1H, 13C e DEPT- 135) e 2D (HSQC, HMBC e NOESY). A análise conformacional da molécula de pachysandiol B foi baseada em dados de RMN e cálculos HF/6-31G(d) e DFT-B3LYP/6- 31G(d,p). Em apoio à interpretação dos dados experimentais de RMN foram calculados os deslocamentos químicos de 13C e 1H por DFT/6-311++G(2d,p). Combinando cálculos ab initio Hartree-Fock [HF/6-31G(d)] e Teoria Funcional de Densidade [DFT/B3LYP/6- 31G(d,p)] com dados dos espectros de RMN, foi possível estabelecer a predominância da conformação cadeira-cadeira-cadeira-barco-barco (cccbb) para o sistema pentacíclico de 14, formado por cinco anéis de seis átomos. Os resultados da elucidação estrutural e o estudo conformacional da molécula pachysandiol-B foram publicados na revista científica Structural Chemistry.140 A literatura apresenta vários estudos sobre a elucidação estrutural e conformacional de muitos compostos orgânicos complexos mediante a aplicação de técnicas de RMN combinadas com cálculos ab initio HF e DFT. Esses métodos permitem explorar as superfícies de energia potencial (PES) das moléculas e estimar os deslocamentos químicos úteis na interpretação de resultados experimentais. O TTPC 3β,16β-di-hidroxifriedelano (pachysandiol-B) aqui estudado foi isolado do extrato em hexano das folhas de Maytenus acanthophylla Reissek (Celastraceae). Esse composto foi isolado pela primeira vez de Pachysandra terminalis (Buxaceae) e os dados referentes ao espectro de RMN de 1H foram parcialmente atribuídos.141 Os TTPC’s da serie friedelano são comumente descritos por possuírem duas conformações preferenciais: um confôrmero na forma dobrada (F), no qual, todos os cinco anéis estão na conformação de cadeira (ccccc); e o confôrmero estirado (S), no Capítulo 3 Determinação Estrutural de 14 125 Oliveira, DM (2012) qual os anéis A, B e C estão em conformação de cadeira, e os anéis D and E estão na conformação de barco (cccbb, Figura 3.71, p. 126). De acordo com o modelo de Dreiding, a forma estirada (S) deveria predominar para pachysandiol-B, talvez como consequência do resultado da interação 1,3-diaxial da hidroxila 16β com a metila vicinal Hβ-26.142-145 Cálculos teóricos: Parâmetros e condições aplicadas As estruturas de partida dos confôrmeros cccbb e ccccc do pachysandiol-B foram montadas usando parâmetros geométricos experimentais do 3β-friedelinol136 e metil-3- oxofriedelan-20α-oato,137 respectivamente. As geometrias foram caracterizadas por meio da região de mínimo da curva PES, quando todos os modos vibracionais se tornaram reais, no nível de teoria B3LYP/6-31G(d,p). A diferença de energia entre os dois confôrmeros (∆Gtotal) foi calculada pela soma de duas partes: energia eletrônica mais energia de repulsão nuclear (∆Eele), bem como, a correção térmica para a energia livre de Gibbs (∆Gtherm). A contribuição térmica na fase gasosa foi avaliada usando formalismo canônico a 298 K.154 O cálculo de freqüências vibracionais harmônicas foi usado para estimar a correção da energia do ponto zero (ZPE) e a correção devido a população térmica dos níveis vibracionais. Os cálculos teóricos dos deslocamentos químicos de hidrogênio e carbono (δ de 1H e de 13C) foram desenvolvidos por DFT/B3LYP/6-311++G(2d,p), os valores de δ foram obtidos em relação aos correspondentes valores das constantes de blindagem de RMN, calculadas para permitir o ajuste em relação ao valor do TMS (σ de 1H 31,59 e σ de 13C 177,82). As correlações entre os ângulos de torção endocíclicos (τexp) dos anéis, obtidas previamente para o cristal de 3β- acetil-16β-O-p-bromobenzoilpachysandiol-B145 e os correspondentes valores calculados (τcalc) para estrutura otimizada por DFT do confôrmero cccbb, foram representadas no gráfico de dispersão τexp versus τcalc na Figura 3.72, p. 126. Otimizações geométricas e valores de δ de 1H e δ de 13C calculados As estruturas otimizadas dos confôrmeros cccbb e ccccc de pachysandiol-B são mostradas na Figura 3.71, p.126. As diferenças energéticas, ΔEele, entre os confôrmeros cccbb e ccccc foram de -9,41 e -8,6 kJ mol-1, nos níveis de teoria B3LYP/6-31G(d,p) e HF/6- 31G(d), respectivamente. Capítulo 3 Determinação Estrutural de 14 126 Oliveira, DM (2012) Figura 3.71: Estruturas otimizadas por DFT de 14: (a) confôrmero cccbb de menor energia e (b) confôrmero ccccc de maior energia. Os átomos de carbono são representados em azul, os de oxigênio em vermelho e os de hidrogênio em branco. No entanto, a investigação da conformação predominante no equilíbro a 298,15 K considerou a correção termal (∆Gtherm) para a energia livre Gibbs e, como resultado, o valor calculado (∆Gtotal) mostrou que o confôrmero cccbb era o mais estável em -15,48 kJ.mol-1 do que o confôrmero ccccc, no nível B3LYP/6-31G(d,p). O gráfico de dispersão τexp versus τcalc (Figura 3.72) indicou que os valores calculados dos ângulos endocíclicos torcionais para a estrutura DFT-otimizada do confôrmero cccbb de pachysandiol-B foram bastante concordantes (R2 = 0,9956) com os dados cristalográficos, confirmando que o cálculo, utilizando DFT/B3LYP/6-31G(d,p), consistiu em um método adequado para estudar a geometria das moléculas semelhantes às de esteroides e PCTT’s. -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 τ c alc (o ) τexp( o) R2 = 0,9956 Figura 3.72: Correlações entre os valores experimentais (τexp) dos ângulos torcionais endocíclicos (raios X) para 3β-acetil-16β-O-p-bromobenzoila-pachysandiol-B e os calculados (τcalc) por DFT/B3LYP/6-31(d,p) para o confôrmero cccbb de 14. Previsões teóricas de valores de deslocamentos químicos de RMN têm sido aplicadas em análises conformacionais de compostos orgânicos.143, 155-156 A estrutura e os arranjos Capítulo 3 Determinação Estrutural de 14 127 Oliveira, DM (2012) espaciais elucidados por dados espectrais de RMN mostraram que, em solução de CDCl3, à temperatura ambiente, as moléculas de pachysandiol-B preferencialmente adotam a conformação cccbb. Deste modo, ficou evidente que a elucidação estrutural, baseada em RMN e apoiada por cálculos ab initio, constituíram uma estratégia adequada para o estudo conformacional do pachysandiol-B, podendo ser aplicada para resolver a geometria e estereoquímica relativa de outros TTPC’s. As comparações entre os valores de deslocamentos químicos de 13C e 1H experimentais (δexp) e calculados por B3LYP/6-311++G(2d,p) (δcalc) de pachysandiol-B, são mostradas nas Tabelas 3.22 (p.128) e 3.23 (p.129). As análises por meio de gráficos de dispersão entre os valores de δexp de 13C e de 1H em função dos valores de δcalc para ambos os confôrmeros ccccc e cccbb podem ser vistas na Figura 3.73, p.130. A comparação entre os valores escalonados (δscaled) e os valores experimentais (δexp) mostrou que os menores desvios médios foram obtidos para o confôrmero cccbb. Os valores de δcalc para 13C e 1H para o confôrmero cccbb foram mais bem correlacionados (R2 = 0,9790 e 0,9668) com os valores de δexp do que os valores δcalc do confôrmero ccccc (R2 = 0,9533 e 0,8839), respectivamente. As comparações entre os deslocamentos químicos experimentais e os calculados de 13C e 1H nos anéis A-C, em ambos confôrmeros ccccc e cccbb, mostraram valores de correlações muito próximos. Os valores médios dos coeficientes foram de R2 = 0,9832 (δ 13C) e de R2 = 0,9524 (δ 1H). Entretanto, as correlações encontradas para os valores de deslocamentos químicos nos anéis D e E foram muito mais favoráveis no confôrmero cccbb [R2 (δ 13C) = 0,9605 e R2 (δ 1H) = 0,9837] do que no confôrmero ccccc [R2 (δ 13C) = 0,8936 e R2 (δ 1H) = 0,8085]. Os maiores desvios absolutos (HD) entre os valores experimentais e calculados (δexp e δcalc) foram encontrados para o confôrmero ccccc (HDδ13C = 8,88 e HDδ1H = 0,78) (Tabelas 3.22, p.128 e 3.23, p.129). O confôrmero cccbb apresentou, em média, desvios 42% menores (HDδ13C = 4,71 e HDδ1H = 0,53) do que o confôrmero ccccc. De um modo geral, os maiores desvios ocorreram em valores de deslocamentos químicos de carbonos β e γ-vicinais em relação aos dois grupos hidroxilas de 14 (C-1, C-2, C-4, C-13 e C- 14, C-15 e C-17) e nos átomos de carbono de grupos metila. Cabe ressaltar, que as previsões teóricas de RMN foram realizadas no vácuo a zero Kelvin, enquanto os experimentos de RMN foram executados em solução a 300 K. Capítulo 3 Determinação Estrutural de 14 128 Oliveira, DM (2012) 10 5 1 4 2 3 9 8 6 7 11 12 14 13 15 16 18 17 19 20 22 21 23 28 29 24 OH OH 27 26 25 30 14 Tabela 3.22: Comparação entre os valores de δ de 13C de 14 e os valores calculados por B3LYP/6- 311++G(2d,p) para as estruturas dos confôrmeros ccccc e ccccbb otimizadas por DFT δexp 13C δC (cccbb) δC (ccccc) C δexp δcalc δscaleda εcalcb δcalc δscaleda εcalcb 1 15,84 14,88 16,80 0,96 15,89 18,81 0,05 2 35,19 38,25 38,23 3,06 32,48 33,39 2,72 3 72,71 73,77 70,79 1,06 74,51 70,36 1,80 4 49,17 51,30 50,20 2,13 53,09 51,52 3,92 5 37,99 42,70 42,31 4,71 40,35 40,32 2,36 6 41,68 42,25 41,90 0,57 41,34 41,19 0,34 7 17,81 17,49 19,20 0,32 17,34 20,08 0,47 8 53,48 53,61 52,31 0,13 50,15 48,94 3,33 9 37,21 40,46 40,26 3,25 40,22 40,20 3,01 10 61,41 61,91 59,92 0,50 62,36 59,68 0,95 11 35,67 34,61 34,89 1,06 34,30 35,00 1,37 12 30,87 31,24 31,81 0,37 29,84 31,08 1,03 13 39,34 42,83 42,43 3,49 43,12 42,76 3,78 14 39,97 41,32 41,04 1,35 42,58 42,28 2,61 15 44,25 39,80 39,65 4,45 36,21 36,68 8,04 16 75,63 77,30 74,03 1,67 78,53 73,90 2,90 17 35,76 39,01 38,93 3,25 43,51 43,09 7,75 18 44,68 45,49 44,86 0,81 46,56 45,78 1,88 19 35,62 34,16 34,48 1,46 31,25 32,32 4,37 20 27,97 31,58 32,11 3,61 31,10 32,19 3,13 21 31,98 29,88 30,56 2,10 34,09 34,82 2,11 22 35,96 36,03 36,19 0,07 35,55 36,10 0,41 23 11,63 9,46 11,83 2,17 6,92 10,91 4,71 24 16,42 12,54 14,66 3,88 12,82 16,10 3,60 25 18,46 16,04 17,87 2,42 15,61 18,55 2,85 26 21,28 17,55 19,25 3,73 13,60 16,79 7,68 27 20,08 16,75 18,52 3,33 16,36 19,22 3,72 28 24,82 23,17 24,41 1,65 21,84 24,04 2,98 29 35,46 31,92 32,42 3,54 26,58 28,21 8,88 30 30,73 26,18 27,17 4,55 34,08 34,80 3,35 HD 4,71 c 8,88 c rms 2,21 d 3,30 d R2 0,9790 e 0,9533 e a δscaled valores obtidos por ajuste linear de δexp versus δcalc, b Εcalc = |δcalc - δexp|, c HD = Maior desvio absoluto, obtido entre os valores experimentais e calculado. d e Coeficiente de correlação de Pearson ao quadrado (R2) obtido por ajuste linear. ∑= n scalednrms 1 2 ]||)/1[( ε Capítulo 3 Determinação Estrutural de 14 129 Oliveira, DM (2012) Tabela 3.23: Comparação entre os valores δ de 1H de 14 e os valores calculados por B3LYP/6- 311++G(2d,p) para as estruturas dos confôrmeros ccccc e ccccbb otimizadas por DFT. δexp 1H δ 1H (cccbb) δ 1H (ccccc) H δexp δcalc δscaleda εcalcb δcalc δscaleda εcalcb 1β 1,56 1,45 1,70 0,11 1,39 1,65 0,17 1α 1,43 0,94 1,24 0,49 1,00 1,30 0,43 2β 1,90 1,37 1,63 0,53 1,86 2,08 0,04 2α 1,56 1,31 1,57 0,25 1,08 1,37 0,48 3α 3,74 3,55 3,62 0,19 3,52 3,60 0,22 4α 1,25 0,77 1,08 0,48 0,82 1,13 0,43 6β 1,75 1,82 2,04 0,07 1,48 1,74 0,27 6α 0,98 0,69 1,00 0,29 0,63 0,96 0,35 7α 1,38 1,14 1,42 0,24 1,12 1,41 0,26 7β 1,42 1,21 1,48 0,23 1,45 1,70 0,01 8α 1,29 1,06 1,34 0,23 0,86 1,17 0,43 10α 0,89 0,57 0,90 0,32 0,47 0,81 0,42 11α 1,17 0,78 1,09 0,39 0,78 1,09 0,39 11β 1,44 1,06 1,35 0,38 1,08 1,37 0,36 12β 1,35 1,24 1,51 0,10 1,14 1,43 0,20 12α 1,31 0,94 1,23 0,37 1,23 1,51 0,08 15β 1,21 1,15 1,43 0,08 1,66 1,89 0,43 15α 1,83 1,41 1,67 0,42 1,21 1,49 0,62 16α 4,00 4,02 4,05 0,02 3,47 3,55 0,53 18β 1,69 1,43 1,68 0,26 1,32 1,59 0,37 19α 1,35 1,02 1,31 0,33 1,31 1,58 0,04 19β 1,10 0,88 1,18 0,22 1,21 1,49 0,11 21α 1,38 0,97 1,27 0,41 0,90 1,20 0,48 21β 1,45 1,02 1,31 0,43 1,57 1,81 0,12 22α 1,48 1,10 1,39 0,38 1,39 1,65 0,09 22β 1,37 1,02 1,31 0,35 0,59 0,92 0,78 23β 0,94 0,74 1,05 0,20 0,59 0,93 0,35 24β 0,97 0,77 1,08 0,20 0,59 0,93 0,38 25β 0,87 0,58 0,91 0,29 0,53 0,87 0,34 26β 1,07 0,79 1,10 0,28 0,67 1,00 0,40 27α 0,96 0,79 1,10 0,17 0,71 1,03 0,25 28β 1,18 0,91 1,21 0,27 0,75 1,07 0,43 29α 0,96 0,65 0,97 0,31 0,69 1,01 0,27 30β 1,03 0,74 1,05 0,29 0,61 0,94 0,42 HD 0,53 c 0,78c rms 0,12 d 0,22d R2 0,9668 e 0,8839d a δscaled valores obtidos por ajuste linear de δexp versus δalc. b Ealc = |δcalc - δexp|. c HD = Maior desvio absoluto, obtido entre os valores experimentais e calculado. d e Coeficiente de correlação de Pearson ao quadrado (R2) obtido por ajuste linear. ∑= n scalednrms 1 2 ]||)/1[( ε 10 5 1 4 2 3 9 8 6 7 11 12 14 13 15 16 18 17 19 20 22 21 23 28 29 24 OH OH 27 26 25 30 14 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 14 130 Oliveira, DM (2012) 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80 (a) δ de 13 C c al c. d e 14 (c cc bb ) δ de 13C exp. de 14 y = 1.0681x-2.6344 R2 = 0.9790 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80 R2 = 0.9533 y = 1.0839x-3.5797 δ de 13 C c al c. d e 14 (c cc cc ) δ de 13C exp. de 14 (b) 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 (c) δ de 1 H c al c. d e 14 (c cc bb ) δ de 1H exp. de 14 y = 1.0574x-0.3588 R2 = 0.9668 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 δ de 1 H c al c. d e 14 (c cc cc ) δ de 1H exp. de 14 y = 0.9713x-0.2401 R2 = 0.8839 (d) Figura 3.73: Análises de dispersão entre os dados de RMN experimentais de 14 (δ de 13C e δ de 1H ) e os valores obtidos por DFT-B3LYP/6-311++G(2d,p) de (a) δcalc.de 13C do confôrmero cccbb, (b) δcalc de 13C do confôrmero ccccc, (c) δcalc de 1H do confôrmero cccbb, (d) δcalc de 1H do confôrmero ccccc. Análise dos espectros RMN 1D e 2D de 14 Os espectros de RMN de 13C (Figura 3.84, p. 139) e DEPT-135 (Figura 3.85, p. 139) permitiram a identificação dos deslocamentos químicos de 30 sinais de pachysandiol-B: 8 CH3, 10 CH2, 6 CH e 6 carbonos não-hidrogenados. No espectro de RMN de 1H (Figura 3.83, p. 138), o sinal em δ 3,74 (m), também observado no espectro de RMN de 1H de 3β- friedelinol31, e o sinal em δ 4,00 (t, J = 9,0 Hz), foram atribuídos a H-3 e H-16 respectivamente e indicaram a ocorrência de um friedelano-diol. O mapa de contornos HSQC (Figura 3.86, p. 140) permitiu obter a correlação entre 24 sinais de carbono e seus hidrogênios diretamente ligados (Tabela 3.24, p.137). Os seis carbonos não hidrogenados restantes foram atribuídos com o auxílio do mapa de contornos HMBC. O sinal do carbono hidroxilado (C-3), em δ 72,71, foi referido como ponto de partida para as atribuições dos demais deslocamentos químicos. As intensidades dos sinais relativos aos acoplamentos C-H ao longo de três ligações (3JC,H), registradas no mapa de contornos HMBC, guardaram estreita proporcionalidade com os valores teóricos de 3JC,H calculados pela expressão de Karplus a seguir: Capítulo 3 Determinação Estrutural de 14 131 Oliveira, DM (2012) 3JC,H = A + B cos ϕ + C cos 2ϕ Onde ϕ é o ângulo diedro, obtido da estrutura do TTPC elucidada por RMN e otimizada energeticamente por DFT, no nível B3LYP/6-31G(d,p) ou pelo método MMFF94- Merck.93 Os parâmetros A, B e C dependem da classe do composto e das condições experimentais.157 Valores médios para A, B e C foram estimados em 6,90, -0,75 e 5,68, respectivamente, a partir de valores de 3JC,H (Hz) observados experimentalmente no estudo dos TTPC’s friedelanos e friedo-oleananos 5, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 15 e 15a isolados de M. acanthophylla. Os valores calculados de 3JC,H para o confôrmero cccbb de 14 orientaram as atribuições das correlações do mapa de contornos HMBC e, juntamente com a análise do mapa de contornos NOESY foi possível propor a geometria e a estereoquímica relativa desse TTPC. O espectro de HMBC mostrou correlações entre os sinais em δ 72,71 (C-3) e os sinais em δ 0,94 (d, J = 7,33 Hz, H-23) e em δ 1,43 (m, Hα-1) (Figura 3.74, p.132). O sinal de C-23 (δ 11,63) correlacionou com o sinal em δ 1,25 (m) atribuído a Hα-4 (Figura 3.75, p. 132). O sinal do dupleto correspondente ao Hβ-23 apresentou correlação com os sinais de C-4 (δ 49,17) e C-5 (δ 37,99); o sinal de C-5 correlacionou com os sinais em δ 0,93-0,97 atribuídos a Hβ-23/24, e o sinal de Hβ-24 correlacionou com um sinal de carbono metínico em δ 61,41 (C-10), bem como com um sinal de carbono metilênico em δ 41,68 (C-6) (Figuras 3.76 e 3.77, p. 133). A correlação entre o sinal de C-10 com um simpleto em δ 0,87 (Hβ-25) também foi observada (Figura 3.76, p.133). O sinal de Hβ-25 mostrou acoplamento com o sinal de carbono não hidrogenado em δ 37,21 (C-9), com um sinal metínico em δ 53,48 (C-8) e com um sinal metilênico em δ 35,67 (C-11) (Figuras 3.76 e 3.77, p.133). Correlações do mapa de contornos HMBC foram observadas, também, entre os sinais de C-8 com um sinal de hidrogênio em δ 1,07 (Hβ-26), e esse último com os sinais em δ 44,25 (C-15), δ 39,34 (C-13) e δ 39,97 (C-14). Tanto o sinal C-13 quanto o de C-14 apresentaram correlações com o sinal de Hα-27 (δ 0,96), igualmente correlacionado com os sinais de C-12 (δ 30,87) e C-18 (δ 44,68), sendo que, esse último (C-18) mostrou acoplamento com os sinais em δ 1,45 (Ha-19), δ 1,18 (Hβ-28) e δ 1,48 (Hβ-22) (Figura 3.77, p.133). Capítulo 3 Determinação Estrutural de 14 132 Oliveira, DM (2012) Figura 3.74: Seção expandida do mapa de contornos HMBC de 14 na região entre δ H 0,8-1,8 e δC 72-76 (CDCl3, 400 MHz). 10 15 20 25 0.51.01.52.0 δ (ppm) C-23/Hα-4 C-1/Hα-10 C-7/Hα-8 C-26/Hα-8 C-26/Hβ-15C-26/Hα-15 C-27/Hβ-18 C-28/Hβ-18 C-28/Hβ-22 Figura 3.75: Seção expandida do mapa de contornos HMBC de 14 na região entre δ de 1H 0,5-2,3 e δ de 13C 10-25 (CDCl3, 400 MHz). 10 5 1 4 2 3 9 8 6 7 11 12 14 13 15 16 18 17 19 20 22 21 23 28 29 24 OH OH 27 26 25 30 14 10 5 1 4 2 3 9 8 6 7 11 12 14 13 15 16 18 17 19 20 22 21 23 28 29 24 OH OH 27 26 25 30 14 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 14 133 Oliveira, DM (2012) 0.60.81.01.21.41.61.82.0 50 55 60 65 δ (ppm) C-10/H-24 C-10/H-25 C-8/ Hα-15 C-8/H-25C-8/H-26 C-4/H-23 C-4/H-24 Figura 3.76: Seção expandida do mapa de contornos HMBC de 14 na região entre δ de 1H 0,6-2,0 e δ de 13C 48-65 (CDCl3, 400 MHz). 30 40 35 45 50 55 δ (ppm) 0.81.01.21.41.61.8 C-20/Hα-21 C-20/Hβ−22 C-20/H-29 C-20/H-29 C-30/ H-29 C-5/Hβ-7 C-5/Hα-6 C-9/Hα-11 C-9/ H-25C-9/ Hα-12 C-5/H-23C-13/ H-11β C-13/ H-12 C-14/Hα-7 C-14/ Hα-12C-14/H-18 C-30/Hα-21 C-21/ H-28 C-12/Hα-11 C-21/Hβ-19 C-12/ H-27 C-12/ H-25 C-21/H-29C-19/H-18 C-17/H-18 C-17/ Hα-15 C-11/ H-25C-2/Hα-1 C-17/H-28 C-17/Hβ-22 C-13/H-26 C-14/ H-26 C-13/H-27 C-14/H-27 C-29/H-30 C-6/H-24 C-2/H-10 C-13/H-8 C-18/Hβ-22 C-18/Hα-19 C-18/H-28 C-18/Hβ-19 C-15/H-26 C-18/H-27 C-4/H-23 C-4/H-24 C-8/Hα-15 C-8/Hβ-11 C-8/H-25 Figura 3.77: Seção expandida do mapa de contornos HMBC de 14 na região entre δ de 1H 0,8-1,8 e δ de 13C 26-55 (CDCl3, 400 MHz). 10 5 1 4 2 3 9 8 6 7 11 12 14 13 15 16 18 17 19 20 22 21 23 28 29 24 OH OH 27 26 25 30 14 10 5 1 4 2 3 9 8 6 7 11 12 14 13 15 16 18 17 19 20 22 21 23 28 29 24 OH OH 27 26 25 30 14 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 14 134 Oliveira, DM (2012) Os sinais de ressonância de H-15 em δ 1,21 (m) e δ 1,83 (m) correlacionaram com o sinal em 75,25 (C-16). Por meio das multiplicidades de H-15, foi possível deduzir a posição α-axial de H-16 e a ocorrência de um grupo hidroxila, em posição β, ligado em C-16 do anel D (Figura 3.74, p. 132). O sinal de C-20 (δ 27,97) foi correlacionado com os sinais de hidrogênio de um grupo gem-dimetila em δ 1,03 (H-30) e δ 0,96 (H-29), e esses sinais metílicos mostraram interação com os sinais de C-21 (δ 31,98) (Figura 3.77, p.133). Na comparação com os dados de RMN do epifriedelinol31, os valores de ressonância de 24 átomos de carbonos (C-1 a C-14, C-19 a 21, C-23 a C-25, C-26, C-27, C-29 e C-30) foram observados próximos dos seus homólogos no pachysandiol-B. No entanto, no pachysandiol- B, a presença de um grupo de hidroxila β-equatorial em C-16 desprotege os carbonos C-16 (∆δ = +39,73), C-15 (∆δ = +11,91), C-17 (∆δ = +5.74), C-18 (∆δ = +1,80), e blinda os carbonos C-22 (∆δ = -3,32), C-28 (∆δ = -7,30) nas posições α−, β−, γ−anti e γ−gauche, respectivamente.158, 159 Além disso, ocorreram deslocamentos significativos para maiores valores de δ nas ressonâncias dos hidrogênios Hα-16 (∆δ = +2,54), Hα-15 (∆δ = +0,30) e Hβ-22 (∆δ = +0,44). As correlações de NOE observadas entre os sinais em δ 1,75 (Hβ-6) e δ 1,56 (Hβ-1) e entre δ 1,75 (Hβ-6) e δ 1,90 (Hβ-2), suscitadas no mapa de contornos NOESY, foram importantes para estabelecer a completa atribuição dos deslocamentos químicos dos anéis A e B (Tabela 3.24, p.137). A correlação entre o sinal Hα-16 com o sinal de Hα-27 confirmou a hidroxila em C-16 na posição β-equatorial no anel D (Figuras 3.78, p.134 e 3.79, p.135). ppm (t2) 3.753.803.853.903.954.004.05 1.00 1.17 1.33 1.50 1.67 1.83 H-16/H-27 H-16/Hβ-15 H16/Hα-15 H-16/Hα-22 H-3/H-23 H-3/Hα-4 H-3/Hα-2 H-3/Hβ-2 ppm (t1) Figura 3.78: Expansão do mapa de contornos NOESY de 14 (F2: δ 3,70-4,05 x F1: δ 0,95-1,90; CDCl3, 400 MHz). 10 5 1 4 2 3 9 8 6 7 11 12 14 13 15 16 18 17 19 20 22 21 23 28 29 24 OH OH 27 26 25 30 14 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 14 135 Oliveira, DM (2012) ppm (t2) 1.001.171.331.501.671.83 1.625 1.650 1.675 1.700 1.725 1.750 1.775 1.800 1.825 1.850 1.875 1.900 ppm (t1) Hβ-6/Hβ-2 Hβ-6/Hβ-1 Hβ-6/Hβ-1 Hα-6/Hβ-6 H-18/H-30 H-18/Hβ-22 H-18/Hβ-12 H-18/Hα-15 H-18/Hβ-15 Hα-15/Hβ-15 Hα-15/Hα-22 Hα-15/H-18 Figura 3.79: Expansão do mapa de contornos NOESY de 14 (F1: δ 1,63-1,90 x F2: δ 0,93-3,00; CDCl3, 400 MHz). O mapa de contornos NOESY (Figuras 3.78, p. 134 e 3.79 e 3.81, p.136) mostra correlações entre o sinal de Hα-3 e os de Hβ-23 (δ 0,94), Hα-4 (δ 1,25), e Hα-2 (δ 1,56), e entre o sinal de Hα-16 com os sinais de Hα-19 (δ 1,35), Hα-22 (δ 1,48) e com ambos os sinais de H-15 (α e β) em δ 1,83 e δ 1,21, respectivamente (Figura 3.78, p.134). Foram observadas também, correlações NOE entre o sinal de Hβ-18 (δ 1,69) com os de Hβ-15 (δ 1,21), Hβ-30 (δ 1,03) e Hβ-26 (δ 1,07) (Figura 3.79). O mapa de contornos NOESY mostrou também que o sinal de H-29 (δ 0,96) estava correlacionado com os sinais em δ 1,35 (Hα-19) e δ 1,38 (Hβ-21), ao passo que o sinal de Hβ-28 (δ 1,18) correlacionou com os sinais Hβ-30 em δ 1,03 (Figura 3.81, p.136). 3 4 5 10 1 2 6 7 8 9 14 13 1211 15 16 17 18 19 22 21 20Me23 Me 24 Me 25 Me 26 Me 28 Me 30 Me 29 Me 27 OH H H H H H H H H H H H H H H H H H H OH H H H H H H H H Figura 3.80: Estrutura de 14 com as indicações das principais correlações de NOE (CDCl3, 400 MHz). Capítulo 3 Determinação Estrutural de 14 136 Oliveira, DM (2012) ppm (t2) 0.901.001.101.201.30 0.75 1.00 1.25 1.50 ppm (t1) H-29/Hα-19 H-29/Hα-21 H-28/H-30 H-26/H-25 H-28/Hβ-15 H-30/Hβ-21 H-28/Hβ-22 Figura 3.81: Correlações de NOE observadas entre os sinais de H-25 e H-26, H-28 e H-30, e entre H- 29 e Hα-19 (CDCl3, 400 MHz) de 14. À luz desses argumentos, foi possível sugerir as conformações em barco para os anéis D e E. Corroborando com as análises por RMN, os dados obtidos a partir da geometria da estrutura otimizada por DFT forneceu valores de ângulos diedros (ϕcalc) de 31,0º (ϕ1) e 143,5º (ϕ2) entre os átomos Hα16-C16-C15-Hα15 e Hα16-C16-C15-Hβ15, respectivamente. Esses valores de ϕcalc permitiram calcular os valores das constantes de acoplamento escalar (3JH-C-C- H) para o tripleto Hα-16, através da equação de Karplus, utilizando valores de A, B e C obtidos experimentalmente (p.131).157,160 Os valores calculados de Jϕ1 (8,9 Hz) e Jϕ2 (9,2 Hz) foram concordantes com os valores observados experimentalmente no espectro de RMN de 1H para o sinal de H-16 (4,0, t, Jϕ = Jϕ2 = 9 Hz). Os dados espectrais completos de RMN de pachysandiol-B estão listados na Tabela 3.24, p.137. Os deslocamentos químicos de 1H e 13C atribuídos para o constituinte pachysandiol-B (14) e o resultado das análises dos dados RMN indicam a estrutura do confôrmero cccbb (forma estirada S) como a estrutura preferida para este composto. Os cálculos teóricos mostraram que o confôrmero cccbb seria, pelo menos, 9 kJ/mol, mais estável do que o confôrmero ccccc, em boa concordância com os resultados experimentais. Além disso, os valores dos deslocamentos químicos calculados para o confôrmero cccbb apresentaram correlações significativas com os dados experimentais. Os espectros de RMN 2D permitiram mostrar que os anéis D e E estão na forma barco corroborando com as demais observações 10 5 1 4 2 3 9 8 6 7 11 12 14 13 15 16 18 17 19 20 22 21 23 28 29 24 OH OH 27 26 25 30 14 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 14 137 Oliveira, DM (2012) experimentais e teóricas. Os cálculos DFT e ab initio combinados com os dados experimentais de RMN mostraram-se valiosos e eficazes na elucidação estrutural de TTPC’s. Tabela 3.24: Atribuição dos dados de RMN de 14 13C/DEPT-135 1J(1H - 13C) - HSQC 2-3J(13C - 1H) HMBC 1H-1H NOESY C tipo δ de 13C δ de 1H C-5 37,99 Hα-6, Hα-7, Hβ-23, Hβ-24, Hα-1 C-9 37,21 Hα-11, Hα-12, Hβ-25 C-13 39,97a Hβ-26, Hα-27, Hβ-11, Hα-12, H β-15 C-14 39,34 a Hα-7, Hα-12, Hβ-26, Hα-27, Hβ-18 C-17 35,76 Hβ-15, Hβ-19, Hβ-22, Hβ-28, Hβ-18 C-20 27,97 Hα-21, Hβ-22, Hα-29, Hβ-30, Hβ-19 OHC-3 72,71 Hα-3: 3,74 (m) Hα-1, Hβ-23 Hα-1, Hβ-2, Hα-4, Hβ-23 OHC-16 75,63 Hα-16: 4,00 (t, J = 9,0 Hz) Hα-15, Hβ-15, Hβ-28 Hα-15, Hβ-15, Hα-22, Hα-27 HC-4 49,17 Hα-4: 1,25 (m) Hβ-23, Hβ-24 Hα-2, Hα-3, Hα-10, Hβ-23 HC-8 53,48 Hα-8: 1,29 (m) Hβ-11, Hα-15, Hβ-25, Hβ-26 Hα-11, Hα-15, Hα-27 HC-10 61,41 Hα-10: 0,89 (m) Hβ-24, Hβ-25 Hα-1, Hα-4, Hα-8 HC-18 44,68 Hβ-18: 1,69 (dd, J = 13,0, 5,0 Hz) Hα-19, Hβ-22, Hβ-27, Hβ-28 Hβ-15, Hβ-25, Hβ-26, Hβ-30 H2C-1 15,84 Hα-1: 1,43 (m) Hβ-1: 1,56 (m) Hα-10 Hα-10 Hβ-2, Hβ-25 H2C-2 35,19 Hα-2: 1,56 (m) Hβ-2: 1,90 (m) Hα-10, Hα-1 Hα-3, Hα-4, Hα-6, Hβ-2 Hα-2, Hα-3, Hβ-24 H2C-6 41,68 Hα-6: 0,98 (m) Hβ-6: 1,75 (td, 12,6, 3,0) Hβ-24 Hα-2, Hα-3 Hβ-7 H2C-7 17,81 Hα-7: 1,38 (m) Hβ-7: 1,42 (m) Hα-8 Hα-11 Hβ-6, Hβ-26 H2C-11 35,67 a Hα-11: 1,17 (dd, J = 13,5, 5,0 Hz) Hβ-11: 1,44 (m) Hβ-25, Hβ-12 Hα-8 H1α, H1β, Hβ-12 H2C-12 30,87 Hα-12: 1,31 (m) Hβ-12: 1,35 (m) Hα-27, Hα-11 Hβ-19, Hα-27 Hβ-11, Hβ-26 H2C-15 44,25 Hα-15: 1,83 (m) Hβ-15: 1,21 (m) Hβ-26 Hα-8, Hα-16, Hα-27 Hα-15, Hα−16, Hβ-18, Hβ-26, Hβ-28 H2C-19 35,62 a Hα-19: 1,35 (m) Hβ-19: 1,10 (m) Hβ-18, Hα-21, Hα-29, Hβ-30 Hα-27 Hα-12, Hβ-30 H2C-21 31,98 Hα-21: 1,38 (m) Hβ-21: 1,45 (m) Hβ-19, Hα-28, Hβ-29, Hβ-30 Hα-16 Hβ-28, Hβ-30 H2C-22 35,96 Hα-22: 1,48 (m) Hβ-22: 1,37 (m) Hβ-28 Hα-16, Hα-27 Hβ-18, Hβ-28 H3C-23 11,63 Hβ-23: 0,94 (d, J = 7,33 Hz) Hα-4 Hβ-1, Hα-3, Hα-4, Hβ-6 H3C-24 16,42 Hβ-24: 0,97 (s) Hα-4, Hα-10 Hβ-25 H3C-25 18,46 Hβ-25: 0,87 (s) Hα-8, Hα-11 Hβ-1, Hβ-24 H3C-26 21,28 Hβ-26: 1,07 (s) Hα-8, Hα-15, Hβ-15 Hβ-7, Hβ-12, Hβ-15, Hβ-18, Hβ-25 H3C-27 20,08 Hα-27: 0,96 (s) Hβ-18 Hα-8, Hα-16, Hα-19 H3C-28 24,82 Hβ-28: 1,18 (s) Hβ-18, Hα-22 Hβ-15, Hβ-21, Hβ-22, Hβ-26, Hβ-30 H3C-29 35,46 Hα-29: 0,96 (s) Hβ-29 Hα-19, Hα-21, Hβ-30 H3C-30 30,73 Hβ-30: 1,03(s) Hα-30 Hβ-18, Hβ-21, Hβ-28, Hβ-29 a sinais intercambiáveis * 1H (CDCl3, 400 MHz) e 13C (CDCl3, 100 MHz), TMS usado como padrão interno. 10 5 1 4 2 3 9 8 6 7 11 12 14 13 15 16 18 17 19 20 22 21 23 28 29 24 OH OH 27 26 25 30 14 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 14 138 Oliveira, DM (2012) Figura 3.82: Espectro de absorção de 14 na região do infravermelho (KBr). 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 4.0 3.9 3.8 3.7 1.15 1.10 1.05 1.00 0.95 0.90 0.85 1.9 1.8 1.7 1.55 1.50 1.45 1.40 1.35 1.30 1.25 1.20 4.05 4.00 3.95 3.76 3.74 3.72 δ B CD 1H1H Hα-3Hα-16 δ H-27 e 29 H2O graxa A (ppm) H's [0.86 - 0.88] 3.0 [0.88 - 0.89] 1.3 [0.89 - 0.90] 1.1 [0.91 - 0.92] 1.2 [0.92 - 0.95] 4.1 [0.95 - 0.98] 9.3 [1.01 - 1.04] 3.0 [1.05 - 1.08] 2.6 [1.08 - 1.09] 1.2 [1.09 - 1.16] 2.7 [1.16 - 1.18] 2.5 [1.19 - 1.24] 2.8 [1.24 - 1.27] 5.6 [1.27 - 1.29] 2.3 [1.29 - 1.33] 4.5 [1.33 - 1.36] 2.2 [1.36 - 1.42] 6.5 [1.43 - 1.47] 3.8 [1.48 - 1.53] 9.0 [1.53 - 1.60] 2.7 [1.61 - 1.72] 2.0 [1.72 - 1.79] 1.3 [1.80 - 1.80] 0.0 [1.80 - 1.84] 0.7 [1.84 - 1.85] 0.2 [1.85 - 1.91] 1.3 [3.69 - 3.79] 1.0 [3.96 - 4.04] 0.9 Expansão D Expansão B Hα-6Hα-11 H-19β H-28 H-30H-26 H-24 H-23 H-10 δ H-25 Expansão C Hα-15 Hβ-6Hβ-2 H-18 Expansão A graxa Hα-1 Hβ-1 Hβ-22Hα-22 Hβ-21 Hα-21 Hβ-11 Hα-7Hβ-7 Hα-2 Hβ-15 Hβ-12 Hα-12 H2O Hα-19 H-4 δ δ δ Hα-16 Expansão D δ Hα-3 Expansão D Figura 3.83: Espectro de RMN de 1H de 14 (CDCl3, 400 MHz). 10 5 1 4 2 3 9 8 6 7 11 12 14 13 15 16 18 17 19 20 22 21 23 28 29 24 OH OH 27 26 25 30 14 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 14 139 Oliveira, DM (2012) Figura 3.84: Espectro de RMN de 13C de 14: (CDCl3, 100 MHz). Figura 3.85: Espectro de RMN DEPT-135 de 14 (CDCl3, 100 MHz). 10 5 1 4 2 3 9 8 6 7 11 12 14 13 15 16 18 17 19 20 22 21 23 28 29 24 OH OH 27 26 25 30 14 10 5 1 4 2 3 9 8 6 7 11 12 14 13 15 16 18 17 19 20 22 21 23 28 29 24 OH OH 27 26 25 30 14 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 14 140 Oliveira, DM (2012) 44 ppm 1.01.52.02.53.03.54.0 10 20 30 40 50 60 70 ppm 16 3 impureza 10 4 8 1815α 15β 6α 6β 2β 2α 1α1β 7β 7α 11α 11β 12α 12β 19α 19β 21α 22α 21β graxa 22β 23 24 25 29 30 28 26 27 Figura 3.86: Mapa de contornos HSQC de 14 (CDCl3, 400 MHz). 10 5 1 4 2 3 9 8 6 7 11 12 14 13 15 16 18 17 19 20 22 21 23 28 29 24 OH OH 27 26 25 30 14 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 15 e 15a 141 Oliveira, DM (2012) 3β,24-di-Hidroxifriedelano (15) e 3β,24-di-acetoxifriedelano (15a) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 2930 O O R R R = H (15) R = COOH3 (15a) O composto 15, um sólido branco (12,0 mg) de ponto de fusão de 272,3-273,3 oC, foi obtido do fracionamento do extrato FAEMA. Uma parte deste sólido foi posteriormente acetilada e o derivado, um sólido branco pastoso (3,9 mg, 15a) foi utilizado na elucidação da estrutura de 15. O composto 3β,24-di-hidroxifriedelano é um triterpeno raro, isolado anteriormente de Eschweilera longipes (Lecythidaceae)161 e pela primeira vez em uma espécie da família Celastraceae. O espectro na região do IV (Figura 3.88, p.145) de 15 apresentou uma banda na região de 3420-3040 cm-1 e uma mais intensa em 1036 cm-1, que indicaram a presença de grupos hidroxilas. Além dessas, as absorções intensas em 1450, 1470, 2870 e 2940 cm-1 foram relacionadas a grupos CH2 e CH3 e sugeriram a ocorrência de um TTPC contendo mais de um grupo hidroxila na estrutura. Geralmente as absorções relacionadas aos estiramentos da ligação O-H que ocorrem entre 3200-3550 cm-1 são atribuídas a grupos hidroxílicos envolvidos em ligações de hidrogênio intermoleculares.117 Os espectros de RMN de 13C e DEPT-135 (Figura 3.90, p.146) de 15 permitiram atribuir os deslocamentos químicos de trinta e quatro sinais, sendo nove CH3, doze CH2, cinco CH, e oito C (carbonos não hidrogenados). O espectro de RMN de 1H de 15 (Figura 3.89, p.145) apresentou sinais típicos de um TTPC friedelano com seis simpletos de metilas ligadas a carbonos terciários, um dupleto de um grupo metila ligado a um carbono secundário (H-23) e um multipleto em δ 3,79 (m) atribuído ao hidrogênio carbinólico ligado a C-3. Nos espectros de RMN de 13C e de 1H de 15, o aparecimento das ressonâncias correspondentes ao de um grupo hidroximetilênico: δ de 13C em 63,3; δ de 1H em 3,64 (d, J = 12,5 Hz) e 3,97 (d, J = 12,5 Hz). Adicionalmente, considerando a ausência dos sinais correspondentes aos do grupo metila Me-24 (δ 14,6 e δ 0,78), como ocorre no β-friedelinol,31 foi sugerido que 15 se tratava de um TTPC friedelan-3β,24-diol. Capítulo 3 Determinação Estrutural de 15 e 15a 142 Oliveira, DM (2012) A análise do mapa de contornos HMBC de 15a (Figura 3.87, abaixo), através da correlação 3JC- 4/H-24a entre o sinal de carbono C-4 (δ 48,66) com o sinal de hidrogênio de H-24a (δ 4,44), confirmou a localização do segundo grupo oxigenado em C-24. As Tabelas 3.25 (p.143) e 3.26 (p.144) mostram os dados de RMN 13C e 1H obtidos a partir de experimentos 1D (1H, 13C, DEPT, Figuras 3.89 a 3.92, p.145-147), bem com os de 2D (HSQC, COSY, HMBC e NOESY) de 15 e do seu derivado acetilado (15a), respectivamente. A maioria dos valores de deslocamentos químicos observados para 15 e 15a teve uma boa correlação com os valores publicados, exceto para alguns valores de 15 em que esta análise encontrou inconsistências nos dados da literatura. 4.354.404.454.50 47.0 47.5 48.0 48.5 49.0 49.5 δC δH4.30 H-24a/C-4 Figura 3.87: Expansão do mapa de contornos HMBC de 15a (CDCl3, 400 MHz): Correlação 3JC-4/H-24a (F2: δ 4,30-4,50 x F1:δ 47,0-49,5). As discrepâncias entre os valores de deslocamentos químicos de 15 e os relatados por Costa,161 foram atribuídas, em parte, à utilização de solventes distintos nos experimentos de RMN e, principalmente, porque os valores relatados para C-3 e C-24 foram considerados inconsistentes. Geralmente, a acetilação de um grupo -COH provoca uma maior desblindagem do átomo de carbono sp3 ligado ao átomo de oxigênio (efeito α). Nos TTPC’s acetatos e derivados, os valores de δ de 13C e δ de 1H de átomos na posição α-oxi, normalmente são registrados em maiores valores de δ que nos alcoóis (∆δ de 13C = +2,5±1,40 ppm e ∆δ de 1H = +1,05±0,32 ppm).96,158 Os dados de RMN dos TTPC’s isolados neste estudo mostraram que átomos na posição α-oxi nos acetatos apresentam valores de δ de 13C entre +1,5-4,6 ppm e ∆δ de 1H entre 0,6-1,3 ppm mais elevados do que nos alcoóis correspondentes. Por exemplo, o constituintes lupânico 9 (acetato de lupeoíla) mostrou valores de ∆δ de 13C e de ∆δ de 1H de +2,0 e +1,28, respectivamente, em relação ao TTPC 8 (lupeol). O estearato de β-amirina (10) quando comparado à amirina (12), os valores de ∆δ de 13C e de ∆δ-de 1H foram de +1,5 e +1,28 ppm maiores no éster. Logo, comparando os valores de deslocamento químico das posições acetiladas de 15a com o álcool corespondente 15, verifica-se que o éster apresenta variações positivas.Essas variações nos valores de δ de 13C foram de +4,2 (C-3) e de +1,9 ppm (C-24) e em δ-de 1H foram de +1,20 (H-3), +0,80 (H-24a) e de +0,68 (H-24b), conforme mostra as Tabelas 3.25 e 3.26 (p.143-144). Com 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 2930 O O O O 15a Capítulo 3 Determinação Estrutural de 15 e 15a 143 Oliveira, DM (2012) base nos argumentos apresentados acima, podemos inferir que os deslocamentos químicos informados por Costa e colaboradores,161 principalmente para os sinais de carbono e hidrogênio do grupo carbinólico no TTPC 3β,24-dihidroxifriedelano, não estão condizentes com os valores normalmente observados. Tabela 3.25: Comparação e análise de dispersão entre os valores de δ de 13C de 15 e 15a (CDCl3, 100 MHz) com os respectivos valores publicados para os compostos 3β,24-dihidroxifriedelano (piridina-d5, 100 MHz) e 3β,24-diacetoxifriedelano (CDCl3, 100 MHz)161 15 15a NC δ 13C Lit.161 δ 13C Lit.161 1 16,71 17,1 16,35 16,3 2 38,77 40,3 32,11 32,1 3 70,11 74,7 74,27 74,3 4 49,60 49,1 48,66 48,5 5 41,50 41,4 40,73 40,6 6 35,99 36 36,02 35,8 7 18,85 19,3 17,72 17,6 8 53,40 53,8 53,24 53,1 9 37,03 36,8 37,04 36,9 10 61,64 61,6 61,21 61,1 11 35,80 36,5 35,81 35,7 12 30,67 31,4 30,69 30,6 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 0 10 20 30 40 50 60 70 80 δ d e 13 C 3β ,2 4- di- hid ro xif rie de lan o δ de 13C 15 R2 = 0.99399 13 38,38 37,6 38,37 38,3 14 39,57 39,9 39,66 39,5 15 32,07 32,5 32,29 32,0 16 35,92 35,6 35,94 35,9 17 29,91 30,7 30,03 29,9 18 42,81 43,6 42,81 42,7 19 35,24 35,6 35,36 35,2 20 28,07 28,8 28,18 29,1 21 32,76 32,7 32,79 32,9 22 39,17 39,0 39,28 39,2 23 11,95 14,8 13,89 13,7 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 R2 = 0.99997 δ d e 13 C de 3 β,2 4- dia ce to xif rie de lan o δ de 13C de 15a 24 63,33 65,8 65,20 65,1 25 17,58 18,4 18,38 18,3 26 18,56 18,9 18,65 18,6 27 19,87 20,8 20,15 20,1 28 31,99 33,6 32,11 32,0 29 34,90 35,6 35,05 35,0 30 31,74 32,7 31,78 31,7 31 - - 170,83 170,0 32 - - 21,24 21,2 33 - - 171,06 170,1 34 - - 21,21 21,2 Fonte: Espectros de RMN 13C e DEPT-135 (Figuras 3.89 e 3.92, p.145-147) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 2930 O O O O 15a 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 2930 OH OH 15 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 15 e 15a 144 Oliveira, DM (2012) Tabela 3.26: Comparação entre os valores de δ de 1H de 15 e 15a (CDCl3, 400 MHz) com os respectivos valores publicados para os compostos 3β,24-di-hidroxifriedelano (piridina-d5, 400 MHz) e 3β,24- diacetoxifriedelano (CDCl3, 400 MHz) 161 H 15 3,24-di-hidroxi- friedelano (lit.)161 15a 3,24-di-acetoxi- friedelano (lit.)161 Heq-3α 3,79 (m) 5,25 sl 4,99 (m) 4,94 d (2,4 Hz) Hax-4α 1,42 (m) NI 1,52 (m) 1,50 (m) Hax-8α 1,34 (m) NI 1,33 (m) 1,30 (sl) Hax-10α 1,06 (m) NI 1,09 (m) 1,10 (m) Hax-18β 1,56 (m) NI 1,54 (m) 1,60 (m) Hax-1β 2,34 dq (3x13,5 e 4,0 Hz) NI 1,47 (m) 1,45 (m) Heq-1α 1,46 (m) NI 1,40 (m) 1,45 (m) Hax-2β 1,65 (m) NI 1,96 (m) 1,90 (m) Heq-2α 0,88 (m) NI 1,59 (m) 1,55 (m) Hax-6α 1,35 (m) NI 1,35 (m) 1,50 (m) Heq-6β 2,04 (m) 2,3 d (14 Hz) 2,27 (m) 2,30 (sl) Hax-7β 1,45 (m) NI 1,44 (m) 1,40 (m) Heq-7α 1,38 (m) NI 1,32 (m) 1,40 Hax-11α 1,14 (m) NI 1,08 (m) 1,20(m) Heq-11β 1,48 (m) NI 1,54 (m) 1,50 (m) Hax-12β 1,30 (m) NI 1,32 (m) NI Heq-12α 1,42 (m) NI 1,40 (m) NI Hax-15β 1,26 (m) NI 1,31 (m) NI Heq-15α 1,42 (m) NI 1,49 (m) NI Hax-16α 1,59 (m) NI 1,42 (m) 1,4 Heq-16β 1,56 (m) NI 1,34 (m) 1,0 Hax-19α 1,37 (m) 2,0 dd (14,1 e 2,4 Hz) 1,38 (m) 2,30 d (13 Hz) Heq-19β 1,22 (m) NI 1,05 (m) 1,30 (m) Hax-21β 1,28 (m) NI 1,27 (m) 1,30 (m) Heq-21α 1,46 (m) NI 1,46 (m) NI Hax-22α 0,91 (m) NI 0,92 (m) 0,90 (d, 7 Hz) Heq-22β 1,51 (m) NI 1,48 (m) 1,40 (m) H-23 1,05 d (7,0 Hz) 1,09 d (7 Hz) 0,97 d (6,5 Hz) 0,92 d (7,0 Hz) H-24a 3,64 d (12,5 Hz) 4,61 d (14,0 Hz) 4,44 d (12,0 Hz) 4,40 d (13,0 Hz H-24b 3,97 d (12,5 Hz) 4,90 d (14,0 Hz) 4,65 d (12,0 Hz) 4,60 d (13,0 Hz) H-25 1,15 s 0,88 s 0,89 s 0,85 s H-26 1,02 s 1,04 s 1,00 s 0,96 s H-27 1,02 s 1,07 s 0,995 s 0,96 s H-28 1,18 s 1,18 s 1,17 s 1,13 s H-29 0,97 s 0,90 s 0,95 s 0,91 s H-30 1,03 s 1,00 s 0,990 s 0,96 s H-32 2,02 s 1,96 s H-34 2,04 s 2,00 s Lit.: literatura; Heq e Hax; hidrogênio equatorial e axial, respectivamente, NI: dado não informado. Fonte: Espectros de RMN de 1H (Figuras 3.89 e 3.91, p.145-146) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 2930 O O O O 15a 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 2930 OH OH 15 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 15 e 15a 145 Oliveira, DM (2012) 1380 Número de onda (cm-1) T (% ) 1470 3230 2940 2870 1450 1036 750 Figura 3.88: Espectro de absorção de 15 na região do infravermelho (KBr). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 2930 OH OH 15 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 4.0 3.8 3.6 1.20 1.15 1.10 1.05 1.00 0.95 3.80 3.79 3.78 3.77 2.40 2.35 2.30 Expansão A A δ -OH H-24a H-24b δ impureza do solvente H-3 Me-28 Me-25 Me-30 Me-26 Me-27 Me-29Me-23 δ H-3 δ1H ppm ppm Integ. 1.1622 1.1372 3.0 1.1938 1.1631 3.5 1.6204 1.5211 3.0 3.8088 3.7698 1.0 3.9925 3.9341 1.2 3.65 3.5881 1.0 2.4002 2.2711 1.0 2.0799 1.9909 1.1 1.6842 1.6195 1.4 1.5208 1.4356 5.2 1.437 1.3114 8.6 1.3139 1.1941 6.2 1.1361 1.0672 1.3 1.0661 1.0337 3.7 1.0343 0.9815 9.3 0.9808 0.9502 3.1 0.9513 0.8334 3.5 1H Hax-1β δ Figura 3.89: Espectro de RMN de 1H de 15 (CDCl3, 400 MHz). Capítulo 3 Determinação Estrutural de 15 e 15a 146 Oliveira, DM (2012) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 2930 OH OH 15 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 43 42 41 40 39 38 37 36 35 34 33 32 31 30 29 28 39 38 37 36 35 34 33 32 31 20 19 18 17 δ (a) A B Expansão B Expansão B C-27 C-25C-26 C-7 C-1 C-23C-4 C-8C-10C-3 δ C-24 (b) δ C-18 C-5 C-14 C-22 C-2 C-13 C-9 C-6 C-16 C-11 C-19 C-29 C-21 C-15 C-28 C-30 C-12 C-17 C-20 δ C-12C-15C-21 C-11 C-16C-6C-22 C-2 C-19 Expansão A C-7 C-1 Figura 3.90: Espectros de RMN de (a) 13C e (b) DEPT-135 de 15 (CDCl3, 100 MHz). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 2930 O O O O 15a 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 1.15 1.10 1.05 1.00 0.95 0.90 0.85 5.0 4.9 4.8 4.7 4.6 4.5 4.4 2.06 2.04 2.02 2.00 5.00 4.98 4.96 2.00 1.98 1.96 1.94 B A δ ppm Integ 0.906- 0.877 4.0 0.934- 0.910 1.4 0.956- 0.932 4.3 0.992- 0.957 7.4 1.000- 0.991 4.0 1.017- 1.000 3.4 1.153- 1.025 3.8 1.188- 1.152 4.1 1.227- 1.188 1.4 1.267- 1.239 3.7 1.340- 1.266 7.4 1.398- 1.342 3.7 1.510- 1.400 1.581- 1.510 7.1 1.693- 1.582 6.2 1.997- 1.925 1.5 2.052- 2.010 6.4 2.310- 2.238 1.2 4.458- 4.405 1.0 4.680- 4.622 1.1 5.006- 4.964 1.0 Expansão B H-28 H-29 H-25 H-30 H-29 H-23 δ H-27 Expansão A H-3 δ H-24 H-34 δ H-32 1H δ H-3 1H δ H-2β 10.0 H-34 H-32 Figura 3.91: Espectro de RMN de 1H de 15a (CDCl3, 400 MHz). Capítulo 3 Determinação Estrutural de 15 e 15a 147 Oliveira, DM (2012) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 2930 O O O O 15a 43 42 41 40 39 38 37 36 35 34 33 32 31 30 29 28 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 171.2 171.0 170.8 22 21 20 19 18 17 16 15 14 13 39 38 37 36 35 34 33 32 31 18.0 17.5 17.0 16.5 16.0 Expansão B C-34C-32C-20C-17 C-12 C-30 C-2/C-28C-15 C-21C-29C-19 C-6 C-11 C-16 C-9C-13 C-22 C-14C-5C-18 Expansão A C-31 C-33 δ δ δ δ BC-4 C-8 C-10 C-24 C-3 A (a) C-31 C-33 δ C-23C-1 C-7 C-25 C-26 C-27 (b) Expansão A Expansão A C-12 C-2 C-15C-21C-19C-11C-16C-6C-22 C-1C-7 A (DEPT) Figura 3.92: Espectros de RMN de (a) 13C e (b) DEPT-135 de 15a (CDCl3, 100 MHz). Capítulo 3 Determinação Estrutural de 16 148 Oliveira, DM (2012) 3β-Sitosterol (16) 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 1617 23 22 20 29 2724 25 21 28 H 26 18 H OH 19 16 O constituinte 16 foi obtido do fracionamento do extrato FAEMA por cromatografia líquida. O material isolado, um sólido branco (P.F. = 132,3-134,3 oC)*, sob teste de Liebermann-Burchard apresentou coloração azul que imediatamente esmaeceu a verde, sendo considerado um resultado positivo para esteroides.130 O espectro de absorção na região do infravermelho de 16 (Figura 3.93, p.150) apresentou características de composto alifático insaturado, através de bandas de absorção em 2960 cm-1, 2840 cm-1 (ν C-H), 1470 cm-1 e 1380 cm-1 (δ C-H). A banda de absorção em 3250- 3400 cm-1 (ν O-H) e em 1050 cm-1 (ν C-O) indicou a presença de hidroxila de álcool99. No espectro de RMN de 1H (Figura 3.94, p.150) o sinal em δ 5,35 (m, 1H) foi atribuído ao hidrogênio olefínico H-6 e o sinal em δ 3,52 (tt, J = 11,0 e 4,5 Hz, 1H) foi atribuído ao hidrogênio carbinólico H-3. Os seis sinais em δ 0,68 (s, 3H), 0,82 (d, J = 7,0 Hz, 3H), δ 0,84 (d, J = 7,0 Hz, 3H), δ 0,85 (m, 3H), δ 0,92 (d, J = 6,5 Hz, 3H) e em δ 1,01 (s, 3H) foram atribuídos aos hidrogênios metílicos e os sinais múltiplos com valores entre δ 0,89 e δ 2,31 foram atribuídos aos hidrogênios dos grupos CH2 e CH de 16. No espectro de RMN de 13C (Figura 3.95, p.151), os sinais em δ 121,73 e δ 140,78, foram atribuídos aos carbonos olefínicos C-5 e C-6 e o sinal em δ 71,83 foi atribuído ao carbono carbinólico C-3. Os valores de deslocamentos químicos de carbono e hidrogênio apresentados corroboram com a caracterização do constituinte 16 como sendo o β-sitosterol. Além disso, a comparação entre os valores de RMN de 13C de 16 e os encontrados da literatura (Tabela 3.27, p.149) apresentou uma excelente correlação (R2 = 0,99999). * A Sigma-Aldrich fornece β−sitosterol (pureza ≥ 95%) com temperatura de P.F. de 136-140 °C. Capítulo 3 Determinação Estrutural de 16 149 Oliveira, DM (2012) Tabela 3.27: Comparação e análise de dispersão entre os valores de δ de 13C de 16 (CDCl3, 100 MHz) com os respectivos valores publicados para β-sitosterol (CDCl3, 100MHz)75 C 16 Literatura75 1 37,28 37,28 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 0 20 40 60 80 100 120 140 160 y = 1.0019x-0.03762 δ de 13 C d e β- si to st er ol (L it. ) δ de 13C de 16 R2 = 0.99999 2 31,70 31,69 3 71,83 71,84 4 42,34 42,33 5 140,78 140,79 6 121,73 121,74 7 31,93 31,94 8 31,93 31,94 9 50,17 50,17 10 36,53 36,54 11 21,11 21,11 12 39,80 39,81 13 42,33 42,35 14 56,80 56,80 15 24,32 24,33 16 28,26 28,26 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 1617 23 22 20 29 2724 25 21 28 H 26 18 H OH 19 16 17 56,09 56,09 18 11,87 11,88 19 19,41 19,41 20 36,16 36,17 21 18,80 18,80 22 33,98 33,98 23 26,13 26,13 24 45,88 45,88 25 29,20 29,20 26 19,82 19,83 27 19,05 19,06 28 23,10 23,10 29 12,00 12,00 Fonte: Espectros de RMN de 13C /DEPT-135 (Figura 3.95, p.151). Estudos publicados mostraram que o fitosterol β-sitosterol desempenha um papel importante na redução da hipertrofia benigna de próstata em tratamento baseado em fitoterapia162 e na inibição da absorção de colesterol no intestino.163 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 16 150 Oliveira, DM (2012) Número de onda (cm-1) 1050 T (% ) Figura 3.93: Espectro de absorção de 16 na região do infravermelho (KBr). 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 5.38 5.36 5.34 5.32 3.60 3.55 3.50 3.45 1.05 1.00 0.95 0.90 0.85 0.80 0.75 0.70 0.65 δ δ H-6 A ppm Integ. ppm Integ. 5.3723-5.3292 1.0 1.2084-1.0182 8.8 3.5729-3.4722 1.1 1.0167-1.0021 3.3 2.3447-2.1833 2.3 1.0012-0.8719 7.7 1.9063-1.7806 3.5 0.8710-0.7876 10.2 1.7143-1.4196 11.9 0.7008-0.6606 3.1 1.4176-1.2069 7.9 1H 1H H-3 H-6 H-3 δ δ Expansão A Figura 3.94: Espectro de RMN de 1H de 16 (CDCl3, 400 MHz). 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 1617 23 22 20 29 2724 25 21 28 H 26 18 H OH 19 16 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 16 151 Oliveira, DM (2012) 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 40 38 36 34 32 30 28 26 24 22 20 18 12.1 12.0 11.9 11.8 42 40 38 36 34 32 30 28 26 24 22 20 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 (b) B Expansão B C-18/C-29 C-4/C-13 C-24 C-9 C-17 C-14 δ C-6 C-5 C-3 A(a) δ δ Expansão A C-21 C-27 C-19 C-26 C-11C-28C-15C-23C-16C-25 C-2 C-7/C-8 C-22 C-20C-10 C-1C-12 δ C-29 C-18 δ C-11C-28C-15C-23C-16 C-7 C-2C-22C-1C-12C-4 C-3C-6 Figura 3.95: Espectros de RMN de (a) 13C e de (b) DEPT-135 de 16 (CDCl3, 100 MHz). 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 1617 23 22 20 29 2724 25 21 28 H 26 18 H OH 19 16 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 17 152 Oliveira, DM (2012) Ácido graxo eicosanóico (17) 1 OH O 20α β ω 17 As frações que deram origem a 17 foram obtidas após fracionamento por cromatografia líquida do extrato em acetato de etila de folha de M. acanthophylla. A partir dessas frações foi isolado uma sólido ceroso e brilhante (5,0 mg) com ponto de fusão de 70 - 74 oC (76-78 oC).129 O espectro de RMN de 13C (Figura 3.97, p.153) apresentou um conjunto de sinais em δ 14, 23, 29, 29,6 e 32 (Tabela 3.28) são característicos de compostos que apresentam cadeia linear com número de átomos de carbono superior a nove.118 No espectro de RMN de 1H (Figura 3.96, p.153), o sinal em δ 0,88 (t, J = 7,0 Hz, 3H) foi atribuído aos hidrogênios do grupo metílico terminal. O simpleto muito intenso em δ 1,25 (m, 32H) e os correspondentes sinais de carbono-13 em torno de 29-30 ppm, incluindo o mais intenso em δ 29,72, foram atribuídos aos grupos metilênicos internos de uma longa cadeia alcânica de ácido graxo. Os hidrogênios metilênicos α e β-carboxílicos apresentaram os seus respectivos sinais em δ 2,37 (t, J = 7,5 Hz, 2H) e um quinteto em δ 1,64 (q, J = 7,5 Hz, 2H), respectivamente. A Tabela 3.28 apresenta a comparação entre os dados de RMN obtidos experimentalmente e os encontrados na literatura. O ácido eicosanóico (17) foi isolado anteriormente de Austroplenckia polpunea por Duarte.129 O ácido eicosanóico ou araquidônico, ocorre em pequenas quantidades em óleos vegetais como substâncias livres ou esterificadas, como por exemplo, no óleo de soja, amêndoas, amendoim e em outras plantas. 164-165 Tabela 3.28: Comparação entre os valores de δ de 13C de 17 (CDCl3, 100 MHz) com os respectivos valores publicados para o ácido araquidônico (CDCl3, 100 MHz) 85, 129 Posição 17 Lit.85 Posição 17 Lit.85 1 177,65 179,83 7 - 15 29,72 29,72 2 33,47 34,03 16 29,36 29,40 3 24,72 24,72 17 29,44 29,40 4 29,07 29,10 18 31,92 31,96 5 29,24 29,28 19 22,69 22,71 6 29,59 29,48 20 14,11 14,11 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 17 153 Oliveira, DM (2012) 2.40 2.35 2.30 1.70 1.65 1.60 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 δ δ H-2 H-3 H-2 H-3 δΗ CH2 α−cabonílico CH2 β-carbonílico CH2 internos ω-CH3 Sinal (ppm) Valor H's 0.91-0.83 3.0 3 0.95-0.94 0.2 0 1.02-0.98 0.5 0 1.30-1.15 27.5 28 1.33-1.30 1.8 2 1.40-1.33 1.7 2 1.68-1.59 2.3 2 2.40-2.30 1.7 2 7.28-7.23 3.8 1(OH) Total 40 H-20 Figura 3.96: Espectro de RMN de 1H de 17 (CDCl3, 400 MHz). 1 OH O 20α β ω 17 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 35.0 34.5 34.0 33.5 33.0 32.5 32.0 31.5 31.0 30.5 30.0 29.5 29.0 28.5 28.0 27.5 27.0 26.5 26.0 25.5 25.0 24.5 24.0 29.8 29.7 29.6 29.5 29.4 29.3 29.2 29.1 29.0 177.8 177.7 35.0 34.5 34.0 33.5 33.0 32.5 32.0 31.5 31.0 30.5 30.0 29.5 29.0 28.5 28.0 27.5 27.0 26.5 26.0 25.5 25.0 24.5 24.0 C-1 δ δ CH2 internos C-7 a C-15 C-2 C-18 C-3 C-1 ω-CH3 (C-20) C-19 C-18 C-3 (β-CH2) C-2 (α-CH2) δ A Expansão A δC C-6 C-5 C-17 C-16 C-4 DEPT-135 C-7 a C-15 δ Figura 3.97: Espectro de RMN de (a) 13C e (b) DEPT-135 de 17 (CDCl3, 100 MHz). (a) (b) Capítulo 3 Determinação Estrutural de 18 154 Oliveira, DM (2012) Mistura de monossacarídeos (18) O H HH OH H OH H OH OH OH β-D-Galactopiranose (galactose, S7) α-L-Arabinopiranose (arabinose, S4) β-D-Glicopiranose (glicose, S8) O H OHH H OH OH H H OH OH O H HH H OH OH H OH OH OH β-D-Manopiranose (manose, S6) O H OH H OH H OH H OH β-D-Ribofuranose (ribose, S3) O H HCH3 OH H H OH OH OH H α-L-Ramnopiranose (ramnose, S1) O H HH H OH OH H OH OH H β-D-Xilopiranose (xilose, S5) O H HH OH H OH H OH OH H Figura 3.98: Projeções de Harworth das estruturas dos monossacarídeos (18) identificados nas folhas de M. acantophylla por CCD, CGAR e CG-EM. Análise dos monossacarídeos do extrato SEMA por CCD Uma amostra (50 mg) do extrato SEMA foi hidrolisada com HCl (10%, 15 mL) em um forno de microondas comum, médio (cerca de 800 W) com potência de operação ajustada em 160 W (20% da potência máxima) por 5 minutos, em frasco fechado. Em seguida à hidrólise, foi feita uma extração por partição com acetato de etila. Foram desenvolvidas placas CCD de alumínio recobertas com sílicagel 60, carregadas com alíquotas de 20 µL das frações obtidas na fases orgânica e aquosa da partição e com amostras do extrato SEMA puro. As placas CCD carregadas com alíquotas da fração aquosa foram eluídas com clorofórmio-metanol- água-ácido acético (6:4:1:1 v/v/v/v), nessas placas, a revelação foi desenvolvida utilizando dois tipos de reveladores: anisaldeído sulfúrico e solução etanólica (70%) básica de permanganato de potássio. As placas da fração aquosa apresentaram manchas identificadas como galactose, dulcitol e glicose (Figuras 3.99 (a) e (b),p.155). As placas CCD carregadas com alíquotas da fração orgânica, foram eluídas com clorofórmio-metanol-água (87:12:1 v/v/v) e reveladas com NP-PEG 4000 sob luz UV (λ 366 nm). Nessas últimas foram detectadas duas manchas amarelo-esverdeadas e uma mancha amarela, que, com base na literatura, foram consideradas como indicativos da presença de flavonóis como quercetina (mancha amarela de menor Rf), canferol (mancha amarela-esverdeada e isoramnetina (segunda mancha amarela-esverdeada de maior Rf).77 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 18 155 Oliveira, DM (2012) Figura 3.99: Placas CCD (a) eluída com CHCl3-MeOH-H2O-CH3COOH (6:4:1:1 v/v/v/v), revelada com anisaldeído sulfúrico. Aplicações: extrato SEMA não hidrolisado (1), fase aquosa resultante da hidrólise de SEMA (2) e padrões de: galactitol (3), D-glicose (4) e D-galactose (5); (b) eluída com clorofórmio-metanol-água (100:13,5:1 v/v/v), revelada com KMnO4 básico (EtOH, NaOH 0,1 mol.L -1). Aplicações: fase aquosa resultante da hidrólise de SEMA (S), e padrões de: glicose (G) e galactitol (D). Identificação de monossacarídeos constituintes do extrato SEMA por CGAR e CG-EM O resultado da análise por CGAR do extrato SEMA hidrolisado (Tabela 3.29, p.157) permitiu identificar e avaliar a quantidade relativa de setes unidades monossacarídicas (Figura 3.98, p.154) constituintes desse extrato. Os padrões utilizados foram L-ramnose (S1), L- fucose (S2), D-ribose (S3), L-arabinose (S4), D-xilose (S5), D-manose (S6), D-galactose (S7) e D-glicose (S8), açúcares que normalmente são isolados de plantas, tais como S1, S3, S7 e S8, que constituem os flavonóis-3-O-glicosídeos de Maytenus.38-40,73 A técnica utilizada para análise de açúcares por CGAR, conhecida como alditóis- acetatos,166 para a derivatização das amostras, consistiu na redução dos açúcares livres do extrato e padrões com NaBH4, primeiro formando seus respectivos alditóis para, em seguida, submetê-los a reação de acetilação. As quantidades relativas, representadas pelas áreas dos picos cromatográficos (Ap), mostraram que o alditol galactitol (dulcitol) representava o constituinte majoritário do extrato SEMA, entretanto, a análise comparativa das áreas dos picos S7 nos cromatogramas CGAR (Tabela 3.29, p.157) indicou a ocorrência de β-D- galactose na forma ligada no extrato SEMA. Mediante as análises por CCD (Figura 3.99 (a) e (b)) e CGAR (Figuras 3.100 (A), (B) e (C), p.156) foi possível concluir que este carboidrato ocorre na forma livre como o galactitol (Figura 3.100 (C), p.156) e na forma ligada como a aldo-hexose cíclica β-D-galactopiranose (S7, Figura 3.98, p.154). (a) (b) Capítulo 3 Determinação Estrutural de 18 156 Oliveira, DM (2012) OH OH OH OH OH OH Galactitol isolado de SEMA 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.05 0.10 0.15 FI D (V olt s) Mix- 8 sugar S8 S7S6 S5S4S3 S2 FI D (V olt s) FI D (V olt s) S1 min (A) (C) S4 S6 S7 S8 SEMA red/acet (B) S5S3 S1 S4 SEMA acetilado S8 S7 S6 Figura 3.100: Cromatogramas obtidos por CGAR de (A) padrões de alditóis: ramnitol (S1, tr = 2,68 min), fucitol (S2, tr = 2,73 min), ribositol (S3, tr = 2,91 min), arabinitol (S4, tr = 3,01 min), xilitol (S5, tr = 3,36 min), manitol (S6, tr = 5,56 min), galactitol (S7, tr = 5,86) e glicitol (S8, tr = 6,06 min); (B) extrato SEMA hidrolisado, reduzido e acetilado, e, (C) extrato SEMA não hidrolisado, apenas reduzido e acetilado. As amostras foram analisadas (injeção de 2 µL) em uma coluna capilar BP10 (cianopropil fenil dimetil siloxano 14%, 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm), divisão de fluxo de 1:80 (split), pressão de 15 psi (H2) e temperatura programada inicial de 200 oC, seguindo a 5 oC/min até a temperatura final de 250 oC em 10 minutos em um CG Varian CP-3800. A análise dos cromatogramas obtidos por CGAR (Figura 3.100 e Tabela 3.29, p.157) mostrou que os monossacarídeos S4 e S8 foram detectados em ambas as formas, livre e ligada. Indicou também que S1, S3, S5 ocorrem exclusivamente na forma ligada, ou seja, ocorrem constituindo moléculas de glicosídeos, S6 ocorre apenas na forma livre e S2 não foi detectado no extrato. Os relatos da literatura mostram que o galactitol é um constituinte bastante comum nas plantas do gênero Maytenus25,29,27,64 e a maioria dos glicosídeos flavônicos isolados de plantas desse gênero apresentam unidades de galactose como o principal monossacarídeo constituinte de suas cadeias glicosídicas,38-40,74, 80-82 fato que está de acordo com a abundância relativa desse açúcar em SEMA, conforme os resultados apresentados neste estudo. Por outro lado, como foi observada, a disponibilidade desses sete monossacarídeos distintos (na forma ligada) nesse extrato (Figura 3.98, p.154) foi também um indicativo de que podem existir vários compostos flavonoides com cadeias formadas por mono, di, tri ou tetrassacarídeos nas folhas de M. acanthophylla. Capítulo 3 Determinação Estrutural de 18 157 Oliveira, DM (2012) Tabela 3.29: Monossacarídeos livres (FS) e ligados (BS) identificados no extrato SEMA através da análise do cromatograma CGAR (Figura 3.100 (A), (B) e (C), p.156) Pico Açúcar tr Ap (C) Ap (B) ∆Ap (B-C) No. Nome (min) FS (%) (%) total BS (%) S1 ramnose 2,69 0,00 1,65 1,65 S2 fucose ND ND ND ND S3 ribose 2,90 0,00 2,03 2,03 S4 arabinose 2,98 2,89 9,29 6,40 S5 xilose 3.40 0,0 1,12 1,12 S6 manose 5,50 1,65 <0,05 ND S7 galactose 5,90 *44,35 57,63 13,28 S8 glicose 6,01 1,04 6,48 5,44 ND: não detectado; tr: tempo de retenção médio entre os cromatogramas B e C; Ap(B): área do pico do cromatograma (B); (*): Nas folhas e raízes de M. acanthophylla foram isoladas quantidades significativas de galactitol (dulcitol). A técnica de derivatização utilizada na análise CGAR não faz distinção entre uma aldose/cetose e o seu poliol (alditol) correspondente após redução. A confirmação da identificação dos monossacarídeos por CG-EM utilizando padrões (S1 a S8), na forma de alditóis-acetatos e uma amostra de SEMA hidrolisada, reduzida e acetilada, foi feita mediante a análise dos tempos de retenção (TR) e da identidade/similaridade espectral (disponível na biblioteca do aparelho CG-EM utilizado). A análise do cromatograma de íons totais e espectros de massas obtidos (TIC, Figura 3.101, p.158), permitiram ratificar a identificação dos açúcares feitos por CGAR. Os picos dos açúcares S1, S6, S7 e S8 foram identificados em TR = 15,72, 21,83, 21,90 e 22,05 minutos. Os glicosídeos S3, S4 e S5 eluíram simultaneamente, onde os três respectivos picos se sobrepuseram na faixa de TR de 17,98 a 18,05 minutos, apresentando um único pico no TIC. A eluição simultânea de S3, S4 e S5 provavelmente ocorreu porque as estruturas dos correspondentes acetatos-alditois desses monossacarídeos são bastante semelhantes, apresentando tempos de retenção muito próximos e, portanto, indistinguíveis na análise por CG-EM nas condições utilizadas. Ca pí tu lo 3 D et er m in aç ão E st ru tu ra l d e 18 15 8 O liv ei ra , D M (2 01 2) T R (T IC ) = 2 2. 05 m in 30 50 70 90 11 0 13 0 15 0 17 0 19 0 21 0 23 0 25 0 27 0 29 0 31 0 33 0 35 0 37 0 39 0 41 0 05010 0 55 73 85 10 31 15 12 71 39 14 5 17 0 18 7 1 99 21 7 2 29 24 2 25 9 2 72 28 9 33 1 36 1 3 75 % m /z S8 : D -G lu c ito l, h e xa a c e ta to O O O O O O O O O O O O 20 50 80 11 0 14 0 17 0 20 0 23 0 26 0 29 0 32 0 35 0 38 0 41 0 44 0 47 0 05010 0 55 69 85 11 5 13 9 1 53 17 01 87 20 721 7 22 9 25 9 2 73 28 9 31 4 33 2 36 1 43 4 47 9 T R (T IC ) = 2 1. 90 m in % O O O O O O O O O O O O S7 : D -G a la c tit o l, h e xa a c e ta to m /z T R (T IC ) = 2 1. 83 m in 30 50 70 90 11 0 13 0 15 0 17 0 19 0 21 0 23 0 25 0 27 0 29 0 31 0 33 0 35 0 37 0 39 0 41 0 05010 0 55 73 85 10 31 15 12 71 39 1 45 17 0 18 7 1 99 21 7 2 29 24 2 25 9 2 72 28 9 36 1 3 75 m /z % O O O O O O O O O O O O S6 : D -M a n ito l, h e xa a c e ta to S3 , S 4 e S 5 : D -R ib ito l, L- a ra b in ito l e xi lit o l, p e n ta a a c e ta to O O O O O O O O O O 40 60 80 10 0 12 0 14 0 16 0 18 0 20 0 22 0 24 0 26 0 28 0 30 0 32 0 34 0 36 0 05010 0 61 73 818 5 981 03 11 5 1 27 14 5 15 8 17 5 18 7 20 0 21 7 28 9 % T R (T IC ) = 1 7, 99 a 1 8. 05 m in m /z T R (T IC ) = 1 5. 72 m in % 20 40 60 80 10 0 12 0 14 0 16 0 18 0 20 0 22 0 24 0 26 0 28 0 30 0 32 0 05010 0 55 73 83 8 7 11 5 12 8 14 2 15 7 17 0 18 4 21 3 23 0 27 3 S1 : L -R a m n o se , t e tr a a c e ta to O O O O O O O O O S 7 14. 28 14. 54 14. 80 15. 06 15. 32 15. 57 15. 83 16. 09 16. 35 16. 61 S 1 (m in ) 1 0 0 (% ) S 3, S 4 e S 5 6 .9 3 8 .7 3 1 1 .0 5 1 3 .3 8 1 5 .7 0 1 8 .0 2 2 0 .3 4 2 2 .6 7 2 4 .9 9 2 7 .3 2 2 9 .6 4 5 0 0 S 8 S 7 S 1 S 6 T IC T IC m /z 20 .5 20 .6 20 .8 21 .0 21 .2 21 .4 21 .6 21 .8 22 .0 22 .2 S 6 S 8 (m in ) (m in ) T IC Fi gu ra 3 .1 01 : Cr om at og ra m a de io ns t ot ai s (T IC ) ob tid o po r CG -E M d e SE M A h id ro lis ad o, r ed uz id o e ac et ila do e o s re sp ec tiv os E M d e m on os sa ca rí de os id en tif ic ad os n a fo rm a de a ce ta to s de a ld itó is . C on di çõ es : c ol un a ca pi la r D B- 5 (5 % fe ni lm et ils ili co ne , 3 0 m x 0 ,2 5 m m x 0 ,2 5 µm d e d. i.) , d iv is ão d e flu xo d e 1: 27 , a rr as te p or H e ( g) ( 18 9, 2 kP a) , t em pe ra tu ra s (T ) de 1 20 o C a 7 o C /m in a té 2 80 o C em ≈ 23 m in ut os , m an tid a po r 7 m in ut os , a té 3 0 m in ut os . I nj et or , T = 28 0 o C ; i nt er fa ce , T = 2 50 o C , e m a pa re lh o Sh im ad zu , m od el o G C- EM -Q P5 00 0, d ot ad o de d et et or E M p or im pa ct o el et rô ni co (7 0 eV ). Capítulo 3 Determinação Estrutural 19 e 19a 159 Oliveira, DM (2012) Galactitol (19) e hexa-acetato de galactitol (19a) 1 2 3 4 5 6 O O O O O O 1'' 1' O 4''4' O 3'' 3' O 6" 6' O 2' O 5'' 5' O 2'' 19a Galactitol (19) puro foi obtido, após recristalização com metanol-água (cerca de 8:2 v/v), a partir de uma amostra do extrato SEMA. Isolado como um sólido branco cristalino, com ponto de fusão de 185,8-188,1 °C (184,7-187,3 oC),25 apresentando solubilidade moderada em metanol quente e solúvel em água. As frações solúveis em água e em água- metanol (50/50 v/v) preparadas a partir dos extratos SEMA, FOMMA e FAMMA apresentaram uma alta concentração de 19, quando analisadas por CGAR, bem como por CCD (sílica gel), utilizando como eluente clorofórmio-metanol-água-ácido acético (6:4:1:1) e revelador preparado com KMnO4 (5%) dissolvido em solução 1,0 mol L-1 de KOH em etanol (95%). Uma amostra de 19, analisada por RMN de 1H e de 13C (Figuras 3.106, p.164 e 3.108, p.165), teve os dados comparados com os da literatura25 e se concluiu que a mesma se tratava do galactitol (dulcitol). O cromatograma CGAR do extrato SEMA (Figura 3.102, p.160), previamente acetilado, mostrou um pico atribuído ao galactitol acetilado, com área igual a 44,4 % da soma total relativa aos picos detectados. A peracetilação de outra alíquota do extrato SEMA (3,0 g), utilizando anidrido acético e acetato de sódio anidro, forneceu um sólido amorfo branco- acinzentado (400 mg), P.F. = 168,0-171,5 oC (168-169 oC), que foi identificado posteriormente, com base em análises de dados espectrais de IV, CG-EM e de RMN 1D (1H e 13C), por comparação com dados publicados, como sendo o 1,2,3,4,5,6-hexa-acetato de galactitol (19a).167 Ensaios biológicos feito com amostras de 19a, juntamente com os TTPC’s 8 e 9, para medir a capacidade de inibição da síntese de ATP em cloroplastos isolados de Spinacea oleracea L. (espinafre), revelaram que, na dose de 122,0 µmol L-1 (I50), 19a pode provocar a completa inibição dessa atividade. Esse resultado foi considerado relevante e estimulou o desenvolvimento de um estudo mais completo para testar a capacidade e a seletividade de 1 2 3 4 5 6 OH OH OH OH OH OH 19 Capítulo 3 Determinação Estrutural 19 e 19a 160 Oliveira, DM (2012) 8, 9 e 19a como inibidores de reações fotossintéticas em outras espécies vegetais, utilizando técnicas eletroanalíticas e fluorimetrias. Os resultados desse último estudo foram publicados no periódico Molecules sob o título The Triterpenes 3β-Lup-20(29)-en-3-ol and 3β-Lup-20(29)-en-3-yl Acetate and the Carbohydrate 1,2,3,4,5,6-Hexa-O-acetyl-dulcitolas Photosynthesis Light Reactions Inhibitors.168 3 4 5210 200 100 50 150 FID (mV ) 76 Padrões de alditois de acetatos: 1 - ramnitol 2 - ribositol 3 - arabinititol 4 - xilitol 5 - manitol 6 - galactitol (Tr = 6,22 min) 7 - glucitol 1 2 3 4 5 6 7 Min 3 4 5 Min 210 200 100 50 150 6 galactitol, hexa-acetato Tr = 6,24 min Área = 44,4% FID (mV ) 7 (A) (B) Figura 3.102: Cromatogramas obtido por CGAR de padrões de alditóis acetilados (B) das seguintes aldoses: ramnose (1, tr = 2,89 min), ribose (2, tr = 3,11 min), arabinose (3, tr = 3,22 min), xilose (4, tr = 3,57 min), manose (5, tr = 5,94 min), galactose (6, tr = 6,22) e glicose (7, tr = 6,41 min); e o cromatograma CGAR do extrato SEMA acetilado (A). As amostras foram analisadas (injeção de 2 µL) em uma coluna capilar BP10 (cianopropil fenil-dimetilsiloxano 14%, 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm), divisão de fluxo de 1/80, pressão de 15 psi (H2) e temperatura inicial de 200 oC, seguindo a 5 oC/min até a temperatura final de 250 oC em 10 minutos, utilizando um cromatógrafo CG Varian CP-3800. O espectro na região do IV de 19 (Figura 3.104, p.163) apresentou uma banda de absorção na faixa de 3200-3420 cm-1, atribuída a deformação axial de ligação O-H, e também bandas em 1102, 1077, 1046 e 1028 cm-1 correspondentes a deformações axiais de ligação C- O de álcool e polióis. A análise do espectro de absorção de 19a no IV (Figura 3.105, p.163) permitiu confirmar esse composto como um derivado acetilado de 19, através principalmente das bandas intensas em 1747 cm-1 (C=O), 1376 cm-1 (CH3-C=O), 1243-1227 cm-1, 1084 e em 1053 cm-1 (C-O), que são características de grupos ésteres como os dos acetatos alifáticos.99 A elucidação estrutural de meso-alditóis e de seus derivados acetilados é relativamente simples, como nos casos de 19 e 19a, porque os átomos de oxigênio de suas estruturas não ocupam posições a ponto de dobrar a molécula devido a efeitos estéricos de repulsão.167 Além disso, as estruturas de 19 e 19a, dotadas de um ponto de simetria (inversão, S2) situado entre os carbonos C-3 e C-4, apresentam espectros de RMN em que os correspondentes núcleos de Capítulo 3 Determinação Estrutural 19 e 19a 161 Oliveira, DM (2012) 13C e 1H simétricos possuem as mesmas frequências de ressonância. No espectro de RMN de 1H de 19 (Figura 3.106, p.164) foi observado um tripleto largo em δ 3,97 (t, J = 6,4 2H), atribuído aos hidrogênios H-2 e H-5. Os sinais relativos aos demais hidrogênios apareceram como dois multipletos justapostos entre δ 3,64-3,73 (6H), o sinal centrado em 3,67 (m) foi atribuído aos H’s metínicos H-3/H-4, e o sinal centrado em 3,69 (m) foi atribuído aos hidrogênios metilênicos H-1/H-6 (Tabela 3.31). O espectro de RMN de 13C de 19 (Figura 3.108, p.165) apresentou sinais em δ 63,18; 69,28 e em 70,10, atribuídos a C-1/C-6, C-3/C-4 e C-2/C-5, respectivamente25. No espectro de RMN de 13C e DEPT de 19a (Figuras 3.109 e 3.110, pp.165-166) os sinais detectados em δ 62,19, δ 67,45 e em δ 67,54 (Tabela 3.30) foram atribuídos a C-1/C-6, C-3/C-4 e C-2/C-5, respectivamente167. Tabela 3.30: Comparação entre os valores de δ de 13C observados de 19 (MeOH, 50 MHz) e 19a (CDCl3, 50 MHz) e os respectivos valores publicados para o galactitol (D20, 400 MHz) 25 e hexa-acetato de galactitol(CDCl3, 15 MHz) 167 C 19 Galactitol25 19a hexa-acetato de galactitol167 C-1/C-6 63,18 63,28 62,19 62,3 C-2/C-5 70,10 70,22 67,54 67,8 C-3/C-4 69,28 69,44 67,45 67,7 C-1’/C-6’(a) 170,46 NI C-3’/C-4’(a) 169,78 NI C-2’/C-5’(a) 170,30 NI C-1”/C-6” (b) 20,72 NI C-2’’/C-5’(b) 20,65 NI C-3”/C-4” (b) 20,58 NI (a), (b) Sinais intercambiáveis; NI: não informado. Fontes: Espectros de RMN 13C/DEPT-135 (Figuras 3.108-3.110, pp.165-166) e dados da literatura.25, 167 Tabela 3.31: Atribuição dos valores de δ de 1H de 19 (MeOH, 200 MHz)e 19a (CDCl3, 200 MHz) e comparação com os dados da literatura para o galactitol (D2O, 400 MHz) 25 H 19 Galactitol25 19a H-1a/H-6a 3,69 (m) 3,69 (d, 6,0 Hz) 4,28 (dd, J = 11,4, 4,4 Hz, 2H) H-1b/H-6b 3,69 (m) 3,69 (d, 6,0 Hz) 3,84 (dd, J = 11,4, 7,7 Hz, 2H) H-2/H-5 3,97 (t, J = 6,4 Hz, 2H) 3,97 (t, J = 6,6 Hz) 5,30 (m, 2H) H-3/H-4 3,67 (m) 3,68 (d, J = 2,0 Hz) 5,36 (m, 2H) H-1”/H-6” (*) 2,11 (s, 6H) H-2”/H-5” (*) 2,02 (s, 6H) H-3”/H-4” (*) 2,08 (s, 6H) (*) Sinais intercambiáveis; Fontes: Espectros de RMN de 1H (Figura 3.106-3.107, p.164) e dados da literatura literatura.25 1 2 3 4 5 6 OH OH OH OH OH OH 19 1 2 3 4 5 6 O O O O O O 1'' 1' O 4''4' O 3'' 3' O 6" 6' O 2' O 5'' 5' O 2'' 19a Capítulo 3 Determinação Estrutural 19 e 19a 162 Oliveira, DM (2012) O espectro de RMN de 1H de 19a (Figura 3.107, p.164), apresentou informações estruturais mais pormenorizadas do que o espectro de RMN de 1H de seu precursor não acetilado (19). A análise do espectro de RMN de 1H de 19a apresentou valores distinguíveis para as ressonâncias dos H’s metilênicos diastereotópicos (Ha e Hb) ligados em C-1/C-6, observadas como dois dupletos duplos em δ 4,28 (dd, J=11,4, 4,4 Hz, H-1a/H-6a) e em δ 3,84 (dd, J=11,4, 7,7 Hz, H-1b/H-6b). O multipleto em δ 5,30 (m, H-2/H-5) foi atribuído aos hidrogênios H-2/H-5 e outro sinal em δ 5,36 (m, 2H) foi atribuído aos hidrogênios H-3/H-4. Um dos três simpletos em δ 2,11 (s, 6H), δ 2,02 (s, 6H) e δ 2,08 (s, 6H) pode ser atribuído ao hidrogênios metílicos de H-1”/H-6” ou aos de H-2”/H-5”, ou então aos de H-3”/H-4”. As atribuições de RMN de 1H de 19a foram confirmadas no mapa de contornos COSY (Figura, 3.103), mediante a correlação do sinal de H-2 e H-5 (δ 5,36) com os sinais em δ 3,84 (H-1b/H-6b) e em δ 4,28 (H-1a/H-6a), e também através da correlação entre esses dois últimos sinais, atribuída aos acoplamentos geminais de H-1a com H-1b e de H-6a com H-6b. 2.002.503.003.504.004.505.00 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 ppm (f2) ppm (f1) H-2/H-1b H-5/H-6b H-2''/5''H-3''/4'' H-1''/6'' H-2/5 H-3/4 H-1a H-6a H-1b H-6b H-1a/H-1b H-6a/H-6b H-2/H-1a H-5/H-6a Figura 3.103: Seção do mapa de contornos COSY de 19a (CDCl3, 200 MHz). No espectro EM/EI de 19a (Figura 3.103, p.162) foi detectado em m/z 434 (C18H26O12) o íon-radical atribuído ao íon molecular [M]+• de 1,2,3,4,5,6-hexa-acetato de galactitol, confirmando a identidade química de 19a. 1 2 3 4 5 6 O O O O O O 1'' 1' O 4''4' O 3'' 3' O 6" 6' O 2' O 5'' 5' O 2'' 19a Capítulo 3 Determinação Estrutural 19 e 19a 163 Oliveira, DM (2012) 1 2 3 4 5 6 OH OH OH OH OH OH 19 Figura 3.104: Espectro de absorção de 19 na região do infravermelho. 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 10 20 30 40 50 60 70 1443 608 839 903 963 1053 10 84 1247 1227 1243 1376 1388 1747 2955 2969 T ( %) Número de onda (cm-1) 3459 Figura 3.105: Espectro de absorção de 19a na região do infravermelho. 3245 2934 1635 1357 1102 1077 1046 1028 926 861 90 92 96 98 100 3500 3000 2500 2000 1500 1000 SEMA_Djalma T (% ) 94 Número de onda cm-1 1 2 3 4 5 6 O O O O O O 1'' 1' O 4''4' O 3'' 3' O 6" 6' O 2' O 5'' 5' O 2'' 19a Capítulo 3 Determinação Estrutural 19 e 19a 164 Oliveira, DM (2012) 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 4.00 3.95 3.90 3.8 3.7 3.6 H-1/H-6 H-2 e H-5 δ δ H-3/H4 2H δ H-1/H-6H-2 e H-5 H-3/H4 6H Figura 3.106: Espectro de RMN de 1H de 19 (CD3OD, 400 MHz). 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 4.3 4.2 4.1 4.0 3.9 3.8 3.7 5.5 5.4 5.3 5.2 5.1 2.2 2.1 2.0 Expansão C C Expansão B B H-1a e H-6a δ H-1b e H-6b A ppm Integ. 2.2810-1.9604 18.2 4.0262-3.6721 2.0 4.4573-4.1802 2.0 5.5018-5.2235 4.0 2H 2H Expansão A δ 4H H-2 e H-5 H-3 e H-4 δ H-1'' a H-6'' δ 18H Figura 3.107: Espectro de RMN de 1H de 19a (CDCl3, 200 MHz). 1 2 3 4 5 6 OH OH OH OH OH OH 19 1 2 3 4 5 6 O O O O O O 1'' 1' O 4''4' O 3'' 3' O 6" 6' O 2' O 5'' 5' O 2'' 19a Capítulo 3 Determinação Estrutural 19 e 19a 165 Oliveira, DM (2012) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 (b) δ C-1 e C-6 C-2 e C-5 C-3 e C-4 C-1 e C-6 (a) δ C-1 e C-6 C-3 e C-4 Expansão A δ C-2 e C-5A B DEPT-135 Expansão B C-3 e C-4C-2 e C-5 Figura 3.108: Espectros de RMN de (a) 13C e (b) DEPT-135 de 19 (CD3OD, 100 MHz). 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 21.0 20.368.0 66.0 64.0 62.0 170.5 170.0 169.5 C B Expansão A C-1'' a C-6''C-2 e C-5 C-1' a C-6' δ A δ δ Expansão C Expansão B C-1 e C-6 C-3 e C-4 δ Figura 3.109: Espectro de RMN de 13C de 19a (CDCl3, 50 MHz). 1 2 3 4 5 6 OH OH OH OH OH OH 19 1 2 3 4 5 6 O O O O O O 1'' 1' O 4''4' O 3'' 3' O 6" 6' O 2' O 5'' 5' O 2'' 19a Capítulo 3 Determinação Estrutural 19 e 19a 166 Oliveira, DM (2012) 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 20.8 20.6 20.4 62.5 62.0 67.8 67.5 67.2 δ δ Expansão A C-2 a C-5 C-1 e C-6 δ δ A C-1 e C-6 C-1'' a C-6'' C-3 e C-4 C-2 e C-5 Figura 3.110: Espectro de RMN de DEPT-135 de 19a (CDCl3, 50 MHz). 50 80 110 140 170 200 230 260 290 320 350 380 410 440 470 0 50 100 55 69 85 115 127 139 170 187 207 217 229 259 272 289 314332 361 434 479 1 2 3 4 5 6 O O O O O O 1'' 1' O 4''4' O 3'' 3' O 6" 6' O 2' O 5'' 5' O 2'' 19a m/z % Figura 3.111: Espectro EM de 19a. Obtido por CG-EM nas condições: coluna capilar DB-5 (5% fenilmetilsilicone, 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm de d.i.), divisão de fluxo de 1:27 (split), arraste por He(g) (189,2 kPa), temperaturas (T) de 120 oC a 7 oC/min até 280 oC em ≈23 minutos, mantida por 7 minutos, até 30 minutos. Injetor, T = 280 oC; interface, T = 250 oC, em um CG-EM Shimadzu, modelo GCMS-QP5000. Detetor IE, 70 eV. 1 2 3 4 5 6 O O O O O O 1'' 1' O 4''4' O 3'' 3' O 6" 6' O 2' O 5'' 5' O 2'' 19a Capítulo 3 Análise preliminar do extrato SEMA 167 Oliveira, DM (2012) Identificação de Flavonoides Glicosídicos em SEMA por CLAE/EM-IES O extrato SEMA em metanol (5,5 g) foi obtido como uma goma marrom escura, lisa e quebradiça depois de seca, apresentando um aroma característico de doce de frutas; formou abundante espuma (>5 min) em água no teste de espuma a pH 1, entretanto, forneceu teste negativo para saponinas frente ao reagente de Komarovsky.77 Uma amostra do extrato SEMA dissolvida em água-metanol (50/50 v/v) apresentou coloração avermelhada (Figura 3.112) em presença de HCl(aq) 1 mol.L-1 e amarela em NaOH(aq) 0,1 mol.L-1. Uma parte dessa solução também formou um precipitado verde-escuro com cloreto férrico (FeCl3 em etanol, 10%). Essas reações indicaram a presença de compostos fenólicos, entre os quais provavelmente, flavonoides e proantocianidinas.79 A fração de SEMA solúvel em n-butanol (f-Bu) foi analisada em placas CCD, eluídas com acetato de etila-metanol-ácido acético em água (0,5%) [8:3:1 v/v] e reveladas com reagente NP-PEG4000 sob luz UV (lâmpada 366 nm). As placas CCD assim reveladas apresentaram manchas amarelas e amarelo-esverdeadas, atribuídas à presença de glicosídeos derivados de quercetina (manchas amarelas) e canferol (manchas amarelo-esverdeadas).77 Figura 3.112: Solução de SEMA (MeOH) em (a) pH 13 e em (b).pH 1,0 Análise por CLAE dos extratos SEMA O cromatograma obtido por CLAE da fração solúvel em etanol (95%) dos extratos FAMMA ou SEMA (f-EtOH) em escala analítica, apresentou dez picos significativos (picos 6-15) relacionados com flavonoides (Tabela 3.32, p.168) quando detectados a 360 nm (Figura 3.113, p.168). O perfil dos picos relacionados com flavonoides, detectados no cromatograma CLAE de f-EtOH (Figura 3.113, p.168), apresentou boa semelhança com o perfil dos picos correlatos detectados em análise por CLAE (UV, 360 nm) de amostras de extrato metanol:água (1:1 v/v) das folhas de M. ilicifolia e M. aquifolium relatado por Tiberti et al. (2007).80 Capítulo 3 Análise preliminar do extrato SEMA 168 Oliveira, DM (2012) 0 5 10 15 20 25 0 200 400 18 13 16158 12 Minutos 17 6 7 9 10 11 14 1 2 3 4 5 mAbs UV (λ 360 nm) Figura 3.113: Cromatograma obtido por CLAE da fração solúvel em etanol (95%) dos extratos SEMA e FAMMA, com a fase móvel no seguinte gradiente (taxa de eluição de 1 mL min-1): iniciado com 10% de B; depois, com 10-30% de B em cinco minutos; em seguida, foi mantido em 30% de B por 15 minutos, depois com 30-50% de B em 5 minutos e, para completar 30 minutos de análise, com 50- 100% de B por 5 minutos. Onde A = ácido fórmico 0,5% em água (v/v) e B = ácido fórmico a 0,5% em acetonitrila:metanol (50:50 v/v). Foi utilizada uma coluna Shimadzu, C18 (ODS), 15 x 0,46 cm, partículas de 3 µm. Tabela 3.32: Análise do cromatograma obtido por CLAE de SEMA (Figura 3.113) Pico Tr Área (mABS.min.102) A(%) Compostos isolados 1 3,29 1,08835 0,5 2 3,92 2,46509 1,1 3 7,81 4,02332 1,8 4 7,96 5,88303 2,6 5 9,62 10,2582 4,5 6 10,74 47,2972 20,6 (21) 7 11,05 15,7657 6,9 (20) 8 11,56 14,1041 6,1 9 12,58 63,6989 27,8 (22) 10 13,09 16,3229 7,1 11 13,64 14,5383 6,3 (23) 12 13,97 7,26915 3,2 13 14,36 7,99607 3,5 14 15,05 6,82991 3,0 15 16,07 5,93905 2,6 16 17,90 2,61069 1,1 17 19,05 1,34559 0,6 18 20,18 2,01707 0,9 Total 1,08835 100,0 No cromatograma obtido por CLAE de f-EtOH (Figura 3.113, p.168), os picos 6, 7, 9, e 11, detectados em Tr = 10,74 min, 11,05 min, 12,58 min e 13,64 min, respectivamente, foram atribuídos aos glicosídeos flavônicos que foram isolados 21, 20, 22 e 23 mediante operações concomitantes de fracionamento semipreparativo e purificação por Sephadex LH20 e CLAE, de uma amostra do extrato FAMMA (hidrometanólico) de composição similar ao de SEMA. Capítulo 3 Análise preliminar do extrato SEMA 169 Oliveira, DM (2012) Espectrometria de massas (EM-IES) Foram adquiridos espectros de massas (Figura 3.1115, p.171) com IES em espectrômetro de massa dotado de quadrupolo e armadilha de íons, modelo LCQ Advantage, Thermo-Finningan (USA) no laboratório LQPN do Centro de Pesquisas René Rachou. Os espectros de massa foram adquiridos usando a detecção de íons positivos e negativos e varreduras dentro da faixa de m/z 100-1000. A obtenção dos espectros EM/EM foi conduzida por aprisionamento e fragmentação dos íons de interesse por dissociação induzida via colisão (CID) utilizando partículas de gás He. Os fragmentos de massas de SEMA foram analisados com base na proposta de nomenclatura e fragmentação de glicosídeos utilizada por de Souza (2008)82 (Figura 3.114). Os fragmentos foram classificados nos tipos Yi e Bi, onde i indica a quantidade de monossacarídeos. Os íons Yi se referem aos fragmentos que contêm o núcleo da aglicona, assim, Y0 significa o fragmento correspondente a aglicona não ligada; Y1 representa o fragmento correspondente a aglicona ligada a uma unidade monossacarídica, e assim por diante. Os índices α e β indicam os fragmentos que se formaram tendo como referência a posição das clivagens ao longo da cadeia glicosídica. Os íons-fragmentos indicados com o índice α (alfa), tais como Y3α e Y2α, foram aqueles que perderam um resíduo neutro de xilose (Xil) e, em seguida, uma ramnopiranosila, respectivamente; os íons- fragmentos indicados por beta (Y3β e Y2β) foram os resultantes da saída sequencial de um grupo ramnopiranosil, seguido de um grupo xilipiranosil, respentivamente. Todos os EM-IES obtidos neste estudo foram executados e analisados conforme o método descrito acima. O O OHO OH O CH3 OH O OH CH3 OH OH OH O Y0 O OH OH OH O O OH Y3α Y3β Y2α B4 O OH OH OH Y2β B1 O O OH O OH O OH O CH3 OH O OH CH3 OH OH OH O OH OH B1β B3α B2α B2β B3β B1α B4 Figura 3.114: Nomenclatura utilizada nos fragmentos de flavonoides glicosídicos. 82 Capítulo 3 Análise preliminar do extrato SEMA 170 Oliveira, DM (2012) Tabela 3.33: Flavonoides glicosídicos detectados no extrato SEMA por EM-IES no modo negativo (offline) TR (min) [M−H]- ou [M]-• [Y0 − H] – ou Y0-• Y2- Y3α-/ Y3β- Identificação do composto Ref 1,35 887 318 609 739/755 Pent-ram-ram-ramnopiranosídeo de miricetina 81 1,44 871 314 579 739 Pent-ram-pent-ramnopiranosídeo de metil- quercetina 81 5,85 887 301 609 739/755 Ram-ram-pent-hexapiranosídeo de quercetinaa (21) PE 5,90 755 301ND 609 di-(Ram)- hexapiranosídeo de quercetinab (20) 80, 81, 87 6,16 871 285 593 739 Ram-ram-pent-hexapiranosídeo de canferolc (22) PE 6,31 739 285 593 di-(Ram)- hexapiranosídeo de canferol 80 6,37 901 316 624 769 Pent-ram-ram- hexapiranosídeo de isoramnetinad (23) PE 8,42 668 344 492* 620‡ Hex-hexapiranosídeo de trimetil-quercetina PE 17,99 757 317 625 Pent-ram-hexapiranosídeo de miricetina PE 19,27 771 317ND 639 Ram-Ram-hexapiranosídeo de miricetina 38, 81 * [M-Hex+CH3] -•; ‡ [M-48(H2O+2CH3)] -•; PE: Presente estudo; hex = hexose; pent = pentose; ram = ramnose; ND: íon esperado mas não observado. Os compostos a, b, c, d, foram posteriormente isolados e caracterizados por métodos espectroscópicos como sendo os glicosídeos 21, 20, 22 e 23, sendo 21, 22 e 23 inéditos. Amostras de f-Bu (5 mg/mL) foram submetidas a análises por CLAE com IES/EM acoplados. A análise dos espectros EM-IES de SEMA juntamente com os dados da literatura, e de repositórios públicos de espectros de massas disponibilizados na internet,85, 87, 169 permitiram identificar dez flavonoides glicosídicos derivados de quercetina, canferol, metil- quercetina, isoramnetina e miricetina entre os constituintes do extrato SEMA. A Tabela 3.33 (p.169) mostra os íons precursores [M]¯• e [M-H]¯ que foram atribuídos a flavonóides glicosídicos, registrados no modo de varredura, bem como os fragmentos desses íons produzidos com a primeira perda neutra de um resíduo glicosídico (Y2¯ ou Y3¯) e o fragmento correspondente à aglicona (Y0¯). Os íons fragmentos que ocorreram em m/z 284-286, 300- 302, 314-316, 316-318, são compostos derivados de canferol, quercetina, isoramnetina e miricetina. Essas quatro agliconas foram anteriormente identificadas por CLAE/EM-IES nas em folhas de M. ilicifolia.38, 80, 81 Entretanto, os fragmentos observados em m/z 342-344, gerados pelo precursor em m/z 668, indicaram que podem ocorrer flavonóis glicosídicos de M. acanthophylla com a aglicona do tipo trimetil-quercetina. Os íons em m/z em 668 [M] ¯• e 757 [M-H]¯ foram identificados e atribuídos a dois triglicosídeos flavônicos citados pela primeira vez neste estudo. Ca pí tu lo 3 A ná lis e pr el im in ar d o ex tr at o SE M A 17 1 O liv ei ra , D M (2 01 2) 10 70 13 0 19 0 25 0 31 0 37 0 43 0 49 0 55 0 61 0 67 0 73 0 79 0 85 0 91 0 97 0 8 7 1 05010 0 314 344 429 487 543 579 641 705 739 802 901 937 985 T R = 1 ,4 2 m in % 10 0 % 7 3 9 17 0 22 0 27 0 32 0 37 0 42 0 47 0 52 0 57 0 62 0 67 0 72 0 77 0 82 0 87 0 92 0 97 0 05010 0 197 284 320 378 441 467 507 589 657 704 753 784 809 846 872 901 926 979 T R = 6 ,3 1 m in m /z m /z 10 0 25 0 30 0 35 0 40 0 45 0 50 0 55 0 60 0 65 0 70 0 75 0 80 0 85 0 90 0 95 0 050 255 279 333 391 433 462 501 537 567 603 628 657 686 708 73975 5 769 798 825 871 887 973 984 T R = 5 ,9 0 m in m /z 50 40 14 0 24 0 34 0 44 0 54 0 64 0 74 0 84 0 94 0 10 40 11 40 12 40 13 40 14 40 0 113 189 239 325 469 517 623 669 727 770 806 90 2 939 1000 1059 1229 1307 1408 1467 % T R = 6 ,3 7 m in 7 7 1 T R = 1 9, 27 m in 27 0 32 0 37 0 42 0 47 0 52 0 57 0 62 0 67 0 72 0 77 0 82 0 87 0 92 0 97 0 0 5 0 1 0 0 271 293 353 430 479 510 533 557 586 619 653 703 805 846 870 909 980 m /z % 10 0% 0 10 80 15 0 22 0 29 0 36 0 43 0 50 0 57 0 64 0 71 0 78 0 85 0 92 0 218 293 336 411 467 496 526 573 651 693 739 795 872 963 T R = 1 ,3 5 m in 316 88 7 50 m /z m /z m /z m /z % 10 0 69 0 24 0 29 0 34 0 39 0 44 0 49 0 54 0 59 0 64 0 74 0 79 0 84 0 89 0 94 0 05 0 285 465 532 575 617 690 740 769 817 87 1 885 918 977 T R = 6 ,1 6 m in 50 1 0 1 2 0 2 3 0 3 4 0 4 5 0 5 6 0 6 7 0 7 8 0 8 9 0 301 349 502 585 684 739 8 8 7 940 T R = 5 ,8 5 m in 0% 10 0 % 4 0 10 0 16 0 22 0 28 0 34 0 40 0 46 0 52 0 58 0 64 0 70 0 76 0 82 0 88 0 94 0 0 5 0 10 0 317 364 397 461 542 575 627 663 7077 5 7 779 825 854 893 944 982 % m /z T R = 1 7, 99 m in % T R = 8 ,4 2 m in m /z 21 0 26 0 31 0 36 0 41 0 46 0 51 0 56 0 61 0 66 0 71 0 76 0 81 0 86 0 91 0 96 0 050 10 0 213 315 344 399 463 492 530 589 62066 8 724 775 828 867 911 957 991 Fi gu ra 3 .1 15 : E sp ec tr os d e m as sa s (E M -IE S, o ff lin e, m od o ne ga tiv o) r el ac io na do s a co ns tit ui nt es fl av on oi de s gl ic os íd ic os d o ex tr at o SE M A . (C on st itu in te 2 1) (C on st itu in te 2 0) (C on st itu in te 2 2) (C on st itu in te 2 3) Capítulo 3 Determinação Estrutural de 20 172 Oliveira, DM (2012) 3-O-{[α-L-ramnopiranosila(1→6)][α-L-ramnopiranosila(1→2)]}-β-D-galactopiranosídeo de quercetina (20). Ram-120 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH OH CH3 6''' OH Ram-2 Gal O composto inédito 20 foi isolado como um sólido amorfo (1,9 mg), amarelo, obtido do extrato em hidrometanólico das folhas de M. acanthophylla (FAMMA) por fracionamento em coluna de cromatografia líquida com Sephadex LH-20 e purificação em coluna de CLAE em fase reversa (C-18). Na tentativa de determinar o de ponto de fusão, uma amostra de 20 degradou antes de fundir. A análise de 20 por CCD revelada sob luz UV (366 nm), após revelar a cromatoplaca com o reagente NP/PEG-400, surgiu uma mancha amarelo-alaranjada brilhante, indicando a presença da genina do flavonóide 3,5,7,3’,4’-tetra-hidroxiflavona, quercetina (Figura 3.116).77 Esse resultado foi coerente com os relatos sobre a obtenção de flavonóides isolados de plantas do gênero Maytenus onde figuram compostos 3-O-glicosídeos da quercetina.38-39, 67 Figura 3.116: Fotografia da cromatoplaca CCD em sílicagel 60G de 20, eluente: acetato de etila:metanol: água-ácido acético 0,5% (8:2:1); revelador: NP-PEG 4000 sob luz UV λ 366 nm, Rf = 0,28. Capítulo 3 Determinação Estrutural de 20 173 Oliveira, DM (2012) O espectro de absorção no UV de 20 (Figura 3.117), obtido através do detector com arranjo de fotodiodo do cromatógrafo CLAE, utilizando a mistura A + B (23%) como fase móvel, sendo A = ácido trifluoroacético (TFA) a 0,1% em água deionizada e B = TFA a 0,1% em acetonitrila:metanol (50:50, v/v), mostrou duas bandas com picos de absorção máxima em λmax 355 e 256 nm, que indicaram a presença de um flavonoide do tipo flavanol.80, 170 Figura 3.117: Espectro de absorção de 20 obtido por varredura na região do UV na cela do detector de fotodiodo, modelo SPD-M10A, acoplado à bomba LC-10AD, módulo de comunicação CBM 10A do equipamento para CLAE (Shimadzu). O espectro de absorção na região do IV de 20 (Figura 3.119, p.177) apresentou uma banda na região de 3200-3550 cm-1 e outra intensa, com pico em 1050 cm-1, que indicaram a presença de grupos hidroxilas. O espectro apresentou também uma banda em 1658 cm-1 característica de grupo carbonílico quelado.39 Geralmente, as absorções relacionadas aos estiramentos da ligação O-H que ocorrem entre 3200-3550 cm-1 são atribuídas a grupos hidroxílicos envolvidos em ligações de hidrogênio intermoleculares.117 Essas absorções de 20 na região do infravermelho são condizentes com a estrutura dotada de grupos benzoíla e cinamoíla condensados como ocorre nos flavonóis. Com base nos dados cromatográficos, características espectrais na região do UV e IV, bem como os relatos sobre os flavonóides de Maytenus, foi possível propor o 3,5,7,3’,4’- pentahidroxiflavona (quercetina) como a aglicona de 20. Dados espectrais de RMN semelhantes aos de 20 foram relatados para o composto triglicosídeo isolado anteriormente de M. aquifolium, o flavonóide 3-O-{[α-L- ramnopiranosila(1→6)][α-L-ramnopiranosila(1→2)]}-β-D-galactopiranosídeo de quercetina.38 O espectro de RMN de 1H (Figura 3.120, p.178) compreendeu ressonâncias de hidrogênios aromáticos e glicosídicos e apresentou sinais de dois hidrogênios aromáticos meta-acoplados em δ 6,18 (d, J = 2,0 Hz, H-6) e em δ 6,37 (d, J = 2,1 Hz, H-8), que foram atribuídos a H-6 e H-8, respectivamente. Os sinais em δ 7,69 (d, J = 2,1 Hz, H-2’), 6,87 (d, J = 8,6 Hz, H-5’) e δ 7,57 Ram-120 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH OH CH3 6''' OH Ram-2 Gal Capítulo 3 Determinação Estrutural de 20 174 Oliveira, DM (2012) (dd, J = 8,5 e 2,1 Hz, H-6’), foram atribuídos a H-2’, H-5’ e H-6’, respectivamente. O espectro de RMN de 1H apresentou, também, sinais referentes às ressonâncias de três hidrogênios anoméricos em δ 5,66 (d, J = 7,8), δ 5,21 (d, J = 1,6) e 4,54 (d, J = 1,6 Hz, 1H). No mapa de contornos de HSQC de 20 (Figura 3.121, p.179), os sinais referentes às ressonâncias dos hidrogênios anoméricos foram associados aos sinais dos respectivos sinais de carbono em δ 100,79, δ 102,35 e δ 101,75 (Figura 3.118). No espectro de RMN de 1H, os dois dupletos em δ 0,95 e 1,18 (6,2) foram atribuídos aos hidrogênios metilas C-6 de duas ramnopiranosilas,74 os demais sinais de hidrogênios sacarídeos foram registrados na região entre δ 3,27-4,20. No mapa de contornos HMBC (Figura 3.122, p.180) foram detectadas importantes conectividades na estrutura de 20, como por exemplo, a correlação entre o sinal de hidrogênio em δ 3,95 (dd, J = 9,5, 7,5 Hz, H-2’’) e o sinal de C-1’’’ em δ 102,34. Através da comparação com os dados da literatura38 e a inspeção dos mapas de contornos HMBC, HSQC e COSY (não mostrado) foram identificados os valores das ressonâncias dos hidrogênios e carbonos pertencentes a três unidades de açúcar (Tabela 3.35, p.176). Ram-120 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH OH CH3 6''' OH Ram-2 Gal 4.54.6 4 7 4.7 4 8 4.8 4 9 4.9 5 0 5.0 5 1 5.1 5 2 5.2 5 3 5.3 5 4 5.4 5 5 5.5 5 6 5.6 5 7 5.7 5 8 5.8 f2 (ppm) 99.5 100.0 100.5 101.0 101.5 102.0 102.5 103.0 103.5 104.0 f 1 (p pm ) Gal H-1'' H-1''' Ram-1 Ram-2 H-1'''' Figura 3.118: Seção do mapa de contornos HSQC de 20 (CD3OD, 400 MHz) relativa aos hidrogênios e carbonos anoméricos (F2: δ de 1H 4,50-5,80 x F1: δ de 13C 99,5-104,0). Capítulo 3 Determinação Estrutural de 20 175 Oliveira, DM (2012) Ram-120 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH OH CH3 6''' OH Ram-2 Gal Tabela 3.34: Comparação entre dos valores de δ de 13C de 20 (CD3OD, 100 MHz) com os valores encontrados na literatura para a 3-O-{[α-L-ramnopiranosila(1→6)][ α-L-ramnopiranosila(α1→2)]}-β-D- galactopiranosídeo de quercetina (δ, CD3OD, 100 MHz) isolado de M. ilicifolia e M. aquifolium38 δ de 13C NC 20 lit38 NC 20 lit38 2 158,20 158,2 3-Gal 3 ND 134,3 1" 100,79 102,4 4 ND 179,0 2" 77,30 77,3 5 163,18 163,4 3" 75,42 75,1 6 99,37 99,7 4" 70,66 70,7 7 165,21 165,8 5" 75,00 75,5 8 94,47 94,4 6" 66,75 66,8 9 158,15 158,2 10 105,76 105,6 (2-1)Ram 1' 123,14 123,1 1’’’ 102,34 100,8 2' 117,12 115,9 2’’’ 72,23 72,1 3' 145,59 145,6 3’’’ 71,94 72,2 4' 149,64 149,4 4’’’ 73,76 73,9 5' 116,08 117,1 5’’’ 69,59 69,6 6' 122,72 122,8 6’’’ 17,06 17,8 (6-1)Ram 1”” 101,75 101,6 2”” 71,83 71,9 3”” 72,03 72,1 4”” 73,59 73,7 5”” 69,5 69,6 6”” 17,65 17,1 Valores de δ de 13Cde 20 foram obtidos nos mapas de contornos dos espectros HSQC (Figura 3.121, p.179) e HMBC (Figura 2.122, p.180). ND: Valor não detectado. Capítulo 3 Determinação Estrutural de 20 176 Oliveira, DM (2012) Ram-120 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH OH CH3 6''' OH Ram-2 Gal Tabela 3.35: Comparação entre os valores de δ de 1H de 20 (CD3OD, 400 MHz) com os valores encontrados na literatura para 3-O-{[α−L-ramnopiranosila(1→6)][α-L-ramnopiranosila(1→2)]}-β-D- galactopiranosídeo de quercetina (δ, CD3OD, 400 MHz) isolado de M. ilicifolia e M. aquifolium38 δ de 1H ( multiplicidade, J/Hz) H-n 20 Literatura38 H-6 6,18 (d, J = 2,0) 6,17 (d, J = 1,5) H-8 6,37 (d, J = 2,0) 6,35 (d, J = 1,5) H-2' 7,69 (d, J = 2,0) 7,72 (d, J = 1,5) H-5' 6,87 (d, J = 8,5) 6,90 (d, J = 8,5) H-6' 7,57 (dd, J = 8,5, 2,0) 7,61 (dd, J = 1,5, 8,5) 3-Gal H-1” 5,66 (d, J = 7,5) 5,63 (d, J = 7,5) H-2” 3,95 (dd, J = 9,5, 7,5) 3,94 (dd, J = 7,5; 9,7) H-3” 3,72 (dd, J = 9,5, 3,0) 3,75 (dd, J = 7,5, 3,6) H-4” 3,80 (m) 3,50 (dd, J = 3,5, 1,5) H-5” 3,66 (t, J = 6,0) 3,66 (ddd, J = 1,5, 5,0, 7,0) H-6a" 3,48 (m) 3,45 (dd, J = 12,0, 7,0) H-6b” 3,76 (m) 3,76 (dd, J = 12,0, 5,0) (2-1)Ram H-1’’’ 5,21 (d, J = 1,5) 5,27 (d, J = 1,5) H-2’’’ 3,99 (dd, J = 3,5, 1,5) 4,26 (dd, J = 3,0, 1,5) H-3’’’ 3,79 (m) 3,81 (dd, J = 9,5, 3,0) H-4’’’ 3,32(m) 3,34 (dd, J = 9,5, 1,5) H-5’’’ 4,04 (m) 4,15 (qd, J = 9,5, 6,0) H-6’’’ 0,95 (d, J = 6,0) 1,00 (d, J = 6,0) (6-1)Ram 1”” 4,54 (d, J = 1,5) 4,53 (d, J = 1,5) 2”” 3,57 (dd, J = 3,5, 1,5) 3,61 (dd, J = 3,5, 1,5) 3”” 3,51 (m) 3,54 (dd, J = 9,5, 3,5) 4”” 3,30 (m) 3,34 (t, J = 9,5) 5”” 3,53 (m) 3,58 (qd, J = 9,5, 6,0) 6”” 1,18 (d, J = 6,2) 1,22 (d, J = 6,6) Fonte: Espectro de RMN de 1H de 20 (Figura 3.120, p.178). As Tabelas 3.34 (p.175) e 3.35 (p.176) mostram os deslocamentos químicos de RMN de 13C e de 1H (CD3OD), obtidos a partir de experimentos de RMN de 1H e 2D (HSQC, HMBC e COSY) de 20. No espectro IES-EM do extrato SEMA, modo negativo, (Figura 3.115, p.171), o fragmento detectado em m/z 755 (100%) foi atribuído ao íon quasi-molecular [M-H]- de 20 (C33H40O20). Capítulo 3 Determinação Estrutural de 20 177 Oliveira, DM (2012) Com base nos deslocamentos químicos, multiplicidades dos sinais e valores das constantes de acoplamento, os resíduos monossacarídeos foram identificados como uma β-galactopiranosila (Gal) e duas α-ramnopiranosilas (Ram-1 e Ram-2).171-172 A atribuição da configuração “D” foi atribuída para Gal e a configuração “L” foi atribuída para Ram-1 e Ram-2, de acordo com as predominâncias dessas configurações em glicosídeos de origem vegetal.74 Os resultados obtidos nas análises dos dados espectrométricos de UV, IV, RMN, e a boa correlação desses com os dados encontrados na literatura,38 permitiram propor a estrutura do glicosídeo 3-O-{[α-L- ramnopiranosila(1→6)][α-L-ramnopiranosila(1→2)]}-β-D-galacto-piranosídeo de quercetina para o composto 20. Ram-120 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH OH CH3 6''' OH Ram-2 Gal 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 65 70 75 80 85 90 95 100 12 00 33 53 29 80 29 30 16 07 13 551 65 8 1050 T ( %) Comprimento de onda (cm-1) Figura 3.119: Espectro de absorção de 20 na região do infravermelho. Capítulo 3 Determinação Estrutural de 20 178 Oliveira, DM (2012) Ram-120 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH OH CH3 6''' OH Ram-2 Gal 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 5.5 5.0 4.5 4.1 4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 3.2 δ H -6 ''' Expansão B B δ Expansão A H -6 '''' H -6 H -8 H -5 ' H -6 ' H -2 ' A Sinal (ppm) Integral [0.991-0.922] 3.0 [1.206-1.156] 3.1 [3.292-3.229] 2.8 [3.357-3.325] 1.2 [3.559-3.448] 4.1 [3.602-3.555] 1.3 [3.686-3.623] 1.4 [3.761-3.685] 2.2 [3.816-3.760] 2.4 [3.825-3.785] 1.7 [3.975-3.919] 1.3 [4.005-3.980] 0.9 [4.068-4.013] 0.9 [4.554-4.538] 1.7 [5.219-5.197] 0.8 [5.688-5.630] 0.8 [6.197-6.169] 0.9 [6.382-6.358] 0.9 [6.895-6.855] 1.0 [7.585-7.545] 0.9 [7.704-7.673] 0.8 H -1 '''' δ 5''' 3''' 6b'' 2'''' 5'''' 3'''' 5'' 4'' H -1 ''' H -1 '' 3'' 2'' 6a''2''' 4''''4''' Figura 3.120: Espectro de RMN de 1H de 20 (CD3OD, 400 MHz). Capítulo 3 Determinação Estrutural de 20 179 Oliveira, DM (2012) Ram-120 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH OH CH3 6''' OH Ram-2 Gal 1.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.007.50 25 50 75 100 125 A 6''' 6'''' 3.253.503.754.00 67.5 70.0 72.5 75.0 77.5 6a''6b'' 5'''' 5''' 4'' 2'''' 3'''' 4''''4'''2''' 3''' 5'' 3'' 2'' 8 6 1'' 1''' 1'''' 2' 5' 6' solvente ppm (F2) ppm (F1) Expansão A Figura 3.121: Mapa de contornos HSQC de 20 (CD3OD, 400 MHz). Capítulo 3 Determinação Estrutural de 20 180 Oliveira, DM (2012) 1.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.007.508.00 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 C-2/H-8 C-9/H-8 C-5/H-6 C-6/H-8 C-8/H-6 C-10/H-6 C-1''/H-2'' C-1'''/H-2'''C-5'/H-6' C-6'/H-5'C-6'/H-2' C-3'/H-5' C-4'/H-2' C-5'''/H-1''' C-3'''/H-1''' C-3''''/H-1'''' C-5''''/H-1'''' C-5''''/H-6'''' C-4''''/H-6'''' C-4'''/H-6''' C-5'''/H-6''' C-3'''/H-4''' C-5''/H-6a'' C-5''/H-6b'' ppm (F1) C-4'/H-6' ppm (F2) 6.06.57.07.5 90.0 95.0 100.0 105.0 110.0 115.0 120.0 125.0 130.0 135.0 140.0 145.0 150.0 155.0 160.0 165.0 H-5'/C-6' H-5'/C-3' H-5'/C-2' H-2'/C-4' H-6'/C-4' H-6/C-5 H-8/C-2 H-8/C-9 H-2'/C-6' H-6/C-8 H-6/C-10 H-8/C-6 ppm (F1) ppm (F2) Figura 3.122: Seções do mapa de contornos HMBC de 20 (CD3OD, 400 MHz): (a) região entre δ de1H 1,00- 8,00 e δ de13C 70–180; (b) região entre δ de1H 6,00-7,80 e δ de 13C 90–165. (b) (a) Ram-120 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH OH CH3 6''' OH Ram-2 Gal Capítulo 3 Determinação estrutural de 21 181 Oliveira, DM (2012) 3-O-{[α-L-ramnopiranosil(1→6)]-O-[β-D-xilopiranosil(1→3)-O-α-L-ramnopiranosil(1→2)]}-β-D- galactopiranosídeo de quercetina (21) O composto inédito 21 foi isolado como um sólido amarelado e amorfo (14,0 mg), obtido do extrato em metanol-água (1/1) das folhas de M. acanthophylla (FAMMA). O ponto de fusão de 21 não foi obtido, pois a amostra degradou antes de fundir quando a temperatura atingiu cerca de 200 oC. Na análise de 21 por CCD sob luz UV (366 nm) e após revelação com o reagente NP/PEG-400, foi observado uma mancha amarelo-alaranjada brilhante, indicando a presença de um flavonol (Figura 3.123).77 Esse resultado foi coerente com os relatos sobre a obtenção de flavonoides isolados de plantas do gênero Maytenus onde figuram compostos 3-O- glicosídeos do flavonoide 3,5,7,3’,4’-tetra-hidroxiflavona, quercetina.38, 39, 67 Figura 3.123: Fotografia eletrônica (2.4 Mpixels), sob luz UV (lâmpada λ 366 nm), da cromatoplaca CCD em sílicagel 60G de 21, utilizando o eluente acetato de etila-metanol-água (8:4:1 v/v/v) e revelador NP-PEG 4000, Rf = 0,26. O espectro de absorção no UV de 21, registrado pelo detector com arranjo de fotodiodo do cromatógrafo CLAE, utilizando a mistura A + B (23%) como fase móvel, sendo A = ácido 21 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Xil Ram-1 Ram-2 Gal Capítulo 3 Determinação estrutural de 21 182 Oliveira, DM (2012) trifluoroacético (TFA) a 0,1% em água deionizada e B = TFA a 0,1% em acetonitrila:metanol (50:50, v/v), mostrou duas bandas com picos de absorção máxima em λmax 356 e 257 nm, que indicaram a presença de um flavonoide do tipo flavanol (Figura 3.124).80, 170 Figura 3.124: Espectro de absorção de 21 obtido por varredura na região do UV na cela do detector de fotodiodo, modelo SPD-M10A, acoplado à bomba LC-10AD e módulo de aquisição de dados CBM 10A do equipamento para CLAE (Shimadzu). A Tabela 3.36 mostra os valores de λmax (nm) contidos em espectros na região do UV de 21 (Figura 3.129, p.193), coletados utilizando um espectrofotômetro UV/Vis em solução de metanol e com os aditivos usuais na identificação sistemática de flavonoides.74 Tabela 3.36: Dados espectrais de 21 na região do UV Solução λmax, (nm) MeOH 258, 269 om, 356 NaOMe 261, 270 om, 396 AlCl3 273, 304 om, 360 om (Banda-Ib), 437 (Banda-Ia) AlCl3/HCl 268, 300 om, 362 (Banda-Ib), 394 (Banda-Ia) NaOAc 267, 360 om, 394 NaOAc/H3BO3 262, 372 Fonte: Espectros de UV de 21 (Figura 3.129, p.193); om: ombro. O forte deslocamento batocrômico da Banda I (40 nm), sem diminuição de intensidade na absorbância, ocorrido com a adição de base forte, metóxido de sódio (NaOMe), foi atribuído à presença de um grupo hidroxila fenólica livre em C-4’ (4’-OH) no anel B do núcleo de um flavonol; além disso, o espectro no UV de 21 em MeOH/NaOMe permaneceu estável por cerca de cinco minutos após o registro da varredura inicial, confirmando a ocorrência de substituintes em C-3. O deslocamento hipsocrômico (43 nm) observado na Banda Ia do espectro em AlCl3 após a adição de HCl evidenciou a presença de um sistema orto-di-hidroxi no anel B, e o deslocamento batocrômico (38 nm) remanescente na Banda-I após a adição de ácido, em relação ao espectro em MeOH, evidenciou a presença de um grupo 257 356 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 230 330 430 mAbs UV, λ (nm) 21 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Xil Ram-1 Ram-2 Gal Capítulo 3 Determinação estrutural de 21 183 Oliveira, DM (2012) -OH (C-5) quelante para Al3+ em posição peri à carbonila (C-4) no flavonoide. A base fraca acetato de sódio (NaOAc) ioniza somente grupos hidroxila ácidos em C-3, C-7 e C-4’ de 21, portanto, o efeito da adição de NaOAc sobre a absorção máxima da Banda-II (∆λ = +9 nm) sugeriu a existência de um grupo hidroxila livre em C-7. Em adição, foi observado que o espectro em NaOAc permaneceu estável após 5-10 minutos e o deslocamento batocrômico de 38 nm ocorrido na Banda-I, em relação ao espectro em MeOH, sustentaram as atribuições de substituição tipo (C(3)-O-R e de 4’-OH livre. A adição de ácido bórico na solução em NaOAc manteve um deslocamento batocrômico residual de +16 nm na Banda-I em relação ao espectro de 21 em MeOH, assim, como o H3BO3 é um agente quelante dos grupos orto-di- hidroxilas (exceto em C-5 e C-6), podemos sugerir a presença de 3’,4’-di-hidroxi em 21, o que confirma esse constituinte de M. acantophylla como um derivado 3-O-glicosídeo de um flavonol.74 O espectro de absorção na região do IV de 21 (Figura 3.130, p.194) apresentou uma banda na região entre 3200-3550 cm-1 e outra estreita, muito intensa, com pico em 1049 cm-1, que indicaram a presença de grupos hidroxilas. Observou-se também absorção em 1657 cm-1, característica de grupo carbonílico quelado, geralmente, as absorções relacionadas aos estiramentos da ligação O-H que ocorrem entre 3200-3550 cm-1 são atribuídas a grupos hidroxílicos envolvidos em ligações de hidrogênio intermoleculares. 99, 117 Assim, com base nos dados espectrais de UV e IV, a aglicona de 21 foi identificada como sendo a 3,5,7,3’,4’- penta-hidroxiflavona (quercetina). Os dados de RMN (Tabela 3.37, p.185) referentes aos grupos galctopiranosila e ramnopiranosila, bem como da aglicona de 21 (quercetina), poderam ser comparados aos valores correspondentes do glicosídeo, isolado de M. aquifolium, o flavonóide 3-O-{[α-L- ramnopiranosil(1→6)][β-L-glucopiranosil(1→3)-α-L-ramnopiranosil(1→2)]}-β-D- galactopira-nosideo de quercetina.40 Os dados de RMN referentes ao grupo xilopiranosila foram comparados como o tetraglicosídeo 3-O-{[β-D-xilopiranosil(1→3)-α-L- ramnopiranosil(1→6)][α-L-ramnopiranosil(1→2)]}-β-D-galactopiranosídeo de canferol isolado de Astragalus caprinus (Fabaceae).172 O espectro de RMN de 1H (Figura 3.131, p.194) apresentou sinais de dois hidrogênios aromáticos meta-acoplados em δ 6,19 (d, J = 2,0) e em δ 6,37 (d, J = 2,0), que foram atribuídos a H-6 e H-8, respectivamente. Os sinais em δ 7,71 (d, J = 2,0), 6,88 (d, J = 8,5) e δ 7,57 (dd, J = 8,5 e 2,0), foram atribuídos a H-2’, H-5’ e H- 6’, respectivamente. O espectro de RMN de 1H apresentou, também, sinais referentes às ressonâncias de quatro hidrogênios anoméricos em δ 5,62 (d, J = 7,8), δ 5,23 (d, J = 1,5), δ Capítulo 3 Determinação estrutural de 21 184 Oliveira, DM (2012) 4,54 (d, J = 1,5) e δ 4,52 (d, J = 7,5). Na seção do mapa de contornos HSQC de 21 (Figura 3.125, p.184), os sinais desses hidrogênios foram observados e apresentaram correlações com os seus respectivos sinais de carbonos em δ 101,35, 102,25, 101,96 e 106,66. Dois dupletos detectados em δ 0,97 (d, J = 6,0) e 1,18 (d, J = 6,0) foram atribuídos às metilas de dois grupos ramnopiranosilas (H-6’’’ e H-6’’’’).74 Os demais sinais de hidrogênios glicosídeos foram registrados na região de δ 3,27-4,19 do espectro. Figura 3.125: Seção do mapa de contornos HSQC de 21 (CD3OD, 400 MHz) relativa aos hidrogênios e carbonos anoméricos (F2: δ de 1H 4,5-5,90 x F1: δ de 13C 100,0-107,0). Através da comparação entre os dados da literatura e a análise dos espectros de RMN de 1H (Figura 3.131, p.194) e dos mapas de contornos COSY (Figura 3.134, p.197) e HMBC (Figura 3.135, p.198), tendo como ponto de partida os sinais dos hidrogênios anoméricos, foram atribuídas as ressonâncias de cada unidade de açúcar de 21. A observação da correlação 3JH-H, destacada na Figura 3.126, p.185, entre o sinal do hidrogênio em δ 5,62 (d, J = 7,8 Hz), atribuído ao hidrogênio anomérico H-1’’, com o sinal em δ 3,97 (dd, J = 9,5, 7,8 Hz, H-2’’), bem como o acoplamento de H-2’’ com o sinal em δ 3,74 (m, H-3’’) e de H-3’’ com o sinal em δ 3,81 (dl, J = 3,0 Hz, H-4’’), permitiram sugerir que H-1’’ e H-2’’ estavam em posição axial-axial em um anel de uma unidade β-D-galactopiranosila. Os dois sinais de hidrogênios metilênicos geminais em δ 3,26 (m, H-5a’’’’’) e 3,89 (dd, J = 11,5, 5,5 Hz, H-5b’’’’’), juntamente com mais outros quatro sinais em δ 4,52 (d, J = 7,5 Hz, H-1’’’’’), 3,29 (m, H- 2’’’’’), 3,35 (t, J = 9,0 Hz, H-3’’’’’) e em 3,52 (m, H-4’’’’’), foram atribuídos aos hidrogênios de um anel β-D-xilopiranosila, uma pentose que apresenta a estrutura semelhante ao resíduo de uma D-glicose que teve o grupo -CH2OH substituído por um hidrogênio em C-5 (Tabela 5.5 5.0 4.5 100 102 104 106 C-1"/H-1" Gal C-1'"'/H-1'"' Ram 2 C-1'"/H-1'" Ram 1 C-1''"'/H-1''"' Ram 2 ppm (F2) ppm (F1) 21 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Xil Ram-1 Ram-2 Gal Capítulo 3 Determinação estrutural de 21 185 Oliveira, DM (2012) 3.38, p.190). Os acoplamentos dos sinais dos hidrogênios anoméricos em δ 5,23 (d, J = 1,5 Hz, H-1’’’) e 4,54 (d, J = 1,5 Hz, H-1’’’’) com os seus respectivos hidrogênios vicinais em 4,19 (dd, J = 3,0, 1,5 Hz, H-2’’’) e 3,58 (dd, J = 3,5, 1,5 Hz, H-2’’’’), foram característicos dos hidrogênios H-1 e H-2 (equatoriais) que ocorrem nos anéis de grupos α-L-ramopiranosilas (Figura 3.126). Assim, foi possível determinar a configuração relativa das quatro unidades de açúcares através do valor das constantes de acoplamentos entre H-1 e H-2, levando em consideração que os valores de 3JH-H situados em torno de 1,5 Hz caracterizam a configuração α, enquanto que valores na faixa entre 7-9 Hz indicam a configuração β.170 Figura 3.126: Seção do Mapa de contornos COSY de 21 (CD3OD, 400 MHz) relativa às correlações entre os sinais dos hidrogênios anoméricos e dos hidrogênios vicinais (F2: δ de 1H 4,45-5,85 x F1: δ de 1H 3,20-4,20). As Tabelas 3.37 e 3.38 (p.185-186) mostram os dados completos de RMN de 13C e 1H (CD3OD, 400 MHz), obtidos a partir de experimentos 1D (1H, 13C, DEPT-135) e 2D (HSQC, COSY, HMBC e NOESY) de 21. Com base nos deslocamentos químicos, multiplicidades dos sinais e valores das constantes de acoplamento, foram identificados os resíduos monossacarídeos como sendo, um grupo β-galactopiranosila (Gal), dois α-ramnopiranosilas (Ram-1 e Ram-2) e um grupo β-xilopiranosila (Xil). A atribuição da configuração “D” foi feita para ambos resíduos de galactose e xilose, bem como, a configuração L foi atribuída para as duas unidades de ramnoses, essa atribuição levou em consideração a predominância dessas configurações em glicosídeos de origem vegetal.172 ppm (F2) 4.504.674.835.005.175.335.505.675.83 3.17 3.33 3.50 3.67 3.83 4.00 4.17 ppm (F1) H-1'' /H-2'' H-1''' /H-2''' H-1'''' /H-2'''' H-1''''' /H-2''''' 21 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Xil Ram-1 Ram-2 Gal Capítulo 3 Determinação estrutural de 21 186 Oliveira, DM (2012) As atribuições dos sinais de hidrogênios da cadeia glicosídica de 21, utilizando os espectros HMBC, COSY e RMN de 1H (Tabela 3.38, p.186), permitiram, mediante a análise do mapa de contornos HSQC(Figura 3.133, p.196), a atribuir as ressonâncias dos átomos carbonos aos quais esses hidrogenios estão ligados. A análise dos mapas de contornos HMBC e NOESY forneceram outras informações importantes relacionadas à ligação da aglicona à cadeia glicosídica, bem como as correlações que evidenciaram as pertinências das ligações interglicosídicas. O mapa de contornos HMBC (Figura 3.135, p.198) de 21 apresentou informações sobre as conexões entre as unidades monossacarídicas e entre a parte aglicona com a cadeia de carboidratos, via ligações glicosídicas. O sinal em δ 5,62 (d, J = 7,8) mostrou correlação com o sinal em δ 134,72 (C-3), permitindo estabelecer a conectividade entre C-1’’ (galactopiranosila) e C-3 (aglicona), sendo atribuída à ligação entre a quercetina e o grupo galactopiranosila ([–β-D-galactopiranosil-(1→3)-quercetina], Figura 3.127, correlação (a)). Através da observação da correlação entre o sinal de H-1’’’ em δ 5,23 (d, J = 1,5) com o sinal de carbono em δ 77,25 (C-2’’) foi possível atribuir a existência da ligação glicosídica entre um grupo ramnopiranosila com o grupo galactopiranosila (–[α-L-ramnopiranosil-(1→2)-D- galactopiranosil]-, Figura 3.127, correlação (b)). Figura 3.127: Região do mapa de contornos HMBC com as correlações atribuídas às ligações glicosídicas de 21: (a):[-β1-D-Gal(1→3)-O-quercetina]; (b): [-Ram(1α→2)Gal-]; (c): [Ram(1α→6)Gal-]; (d): [Xil(1β→3)Ram-]. 5.5 5.0 4.5 56 64 72 80 88 96 104 112 120 128 136 H-1''/C-3 H-1'''/C-2'' H-1'''''/C-3''' H-1''''/C-6'' (a) (b) (c) (d) δΗ δC 21 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Xil Ram-1 Ram-2 Gal Capítulo 3 Determinação estrutural de 21 187 Oliveira, DM (2012) A correlação entre o sinal de H-1’’’’ em δ 4,54 (d, J = 1,5) e o sinal de carbono em δ 67,18 (C-6’’) foi atribuída à ligação glicosídica entre um segundo grupo ramnopiranosila à galactopiranosila (–[α-L-ramnopiranosil-(1→6)-D-galactopiranosil]-, (Figura 3.127, correlação (c)) e, a correlação entre o sinal de H-1’’’’’ em δ 4,52 (d, J = 2,0) e o sinal de carbono em δ 82,59 (C-3’’’) foi atribuída à ligação glicosídica entre os grupos xilopiranosila e ramnopiranosila ([β-D-xilopiranosil-(1→3)-L-ramnopiranosil], (Figura 3.127, correlação (d), p.182). Os demais dados obtidos no mapa de contornos HMBC foram utilizados na elucidação das estruturas das unidades monossacarídeas juntamente com os mapa de contornos COSY e NOESY, ver Tabelas 3.37 e 3.38 (p.189 e 190). Figura 3.128: Ampliações (A-C) do mapa de contornos NOESY de 21 (CD3OD, 400 MHz) que mostram correlações interglicosídicas, conforme indicadas pelas linhas verdes tracejadas na estrutura obtida por correlações NOE e otimizada por MMFF-94 Merck (abaixo).93 Cores dos átomos: cinza (C), azul (H) e vermelho (O). H-1''/H-3'' H-1''/H-5'' ppm (F2) 5.5255.5505.5755.6005.6255.6505.675 3.55 3.60 3.65 3.70 3.75 3.80 3.85 3.90 3.95 4.00 ppm (F1) A ppm (F2) 5.2005.2255.2505.275 3.65 3.70 3.75 3.80 3.85 3.90 3.95 4.00 4.05 4.10 4.15 4.20 4.25 ppm (F1) 1'''/3'' 1'''/2'' 1'''/2''' B 5.175 H-1''''/H-6a'' 4.454.504.554.604.65 3.20 3.30 3.40 3.50 3.60 3.70 3.80 3.90 4.00 4.10 4.20 H-1''''/H-2'''' H-1''''/H-6b'' H-1'''''/H-3''' H-1'''''/H-2''' H-1'''''/H-3''''' H-1'''''/H-5a''''' C ppm (F2) ppm (F1) H-1'''' H-6a'' H-6b'' H-1'' H-2'' H-3'' H-1''' H-4'' H-6''' H-5''' H-3''' H-5''''' H-1''''' 21 H-6 H-2''''' H-3''''' H-6'''' Capítulo 3 Determinação estrutural de 21 188 Oliveira, DM (2012) O mapa de contornos NOESY de 21 (Figura 3.136, p.199) mostrou importantes correlações NOE que contribuíram na elucidação da estereoquímica da porção glicosídica da molécula de 21, principalmente as que envolveram hidrogênios anoméricos nas ligações interglicosídicas. As Figuras 3.128 (A), (B) e (C) (p.187) mostram as importantes correlações obtidas no mapa de contornos NOESY, que possibilitaram confirmar a presença de quatro ligações glicosídicas em 21. O sinal de hidrogênio anomérico em δ 5,62 (d, J = 7,8, H-1’’) apresentou correlações NOE com os sinais em δ 3,73 (H-3’’) e 3,66 (H-5’’), que permitiram confirmar as configurações 1,3-diaxial e 3,5-diaxial para os hidrogênios nas posições 1, 3 e 5 do resíduo galactopiranosila, respectivamente (Figura 3.128 (A), p.187). A ligação glicosídica [Ram-1(1→2)-O-Gal] foi confirmada mediante as correlações observadas entre o sinal do hidrogênio anomérico em δ 5,23 (d, J = 1,5, H-1’’’) e os hidrogênios H-2’’ e H-3’’ em δ 3,97 e δ 3,73, respectivamente (Figura 3.128 (B), p.187). A confirmação de atribuição da ligação glicosídica [Ram-2(1→6)-O-Gal]- foi feita através das correlações entre o sinal do hidrogênio anomérico em δ 4,54 (d, J = 1,5, H-1’’’’) do resíduo Ram-2 e os sinais dos hidrogênios H-6a’’ e H-6b’’da galactopiranosila (Gal) em δ 3,47 (m) e em δ 3,75 (m), respectivamente (Figura 3.128 (C), p.187). A ratificação da atribuição feita à ligação glicosídica [Xil(β1→3)Ram-1] se deu através da correlação entre o sinal do hidrogênio anomérico do resíduo da xilose (Xil) em δ 4,52 (H-1’’’’’) com o sinal em δ 3,94 (H-3’’’) do resíduo da raminose-1 (Ram-1) (Figura 3.128 (D), p.187). A pesquisa bibliográfica relacionada aos dados de RMN mostrou que 21 é um composto inédito. Souza e colaboradores81, 82 relataram a identificação e a cracterização por espectroscopia de massa de um composto similar a 21, um tetraglicosídeo de quercetina apartir de extratos de folhas de M. ilicifolia e M. aquifolium. Entretanto, o composto isolado de M. ilicifolia e M. aquifolium possuí a cadeia glicosídica diferente da cadeia de 21. No tetraglicosídio identificado por Souza, os dois grupos terminais da cadeia glicosídica foram α- L-ramnopiranosila e α-L-arabinopiranosila, enquanto que, na cadeia glicosídica de 21 os grupos terminais foram α-L-ramnopiranosila e β-D-xilopiranosila. Estruturalmente, a diferença entre os grupos arabinopiranosila e xilopiranosila está na posição relativa da hidroxila ligada em C-4, sendo portanto dois esteroisômeros ou epímeros. A comparação entre os dados de RMN de 13C e de 1H do resíduo de β-D-xilopiranosila de 21 com os correspondentes dados relativos ao resíduo de α-D-arabinopiranosila, presente no composto 3- O-{[α-L-ramnopiranosil(1→6)]-O-[α-L-arabinopiranosil(1→3)-O-α-L- ramnopiranosil(1→2)]}-β-D-galactopiranosídeo de canferol, também isolado de M. ilicifolia e Capítulo 3 Determinação estrutural de 21 189 Oliveira, DM (2012) M. aquifolium40, mostrou haver distinção significativa nos valores dos deslocamentos químicos, multiplicidades e constantes de acoplamento. Tabela 3.37: Atribuição dos valores de δ de 13C de 21 (CD3OD, 100 MHz) e a comparação com valores disponíveis da literatura.40, 172 C-n 21 Lit.40 HMBC C-n 21 Lit.40 HMBC Genina40 2 158,64 158,3 H-2’, H-6’ (2-1)Ram 3 134,72 134,5 H-1” 1’’’ 102,25 102,1 H-2’’ 4 179,42 179,3 2’’’ 72,13 72,0 H-1’’’ 5 163,24 163,0 H-6 3’’’ 82,59 82,7 H-1’’’, H-2’’’, H-4’’’, H-1’’’’’ 6 99,80 99,7 H-8 4’’’ 73,02 72,9 H-2’’’, H-3’’’, H-5’’’, H-6’’’ 7 165,71 165,6 H-6, H-8 5’’’ 69,69 69,5 H-1’’’, H-4’’’, H-6’’’ 8 94,66 94,6 H-6 6’’’ 17,52 17,6 H-4’’’ 9 158,44 158,5 H-8 10 106,00 105,8 H-6, H-8 (6-1)Ram 1' 123,36 123,2 H-2’, H-5’ 1”” 101,96 101,8 H-6a’’ 2' 117,49 117,4 H-6’ 2”” 72,16 72,1 H-3’’’’ 3' 145,90 145,8 H-2’, H-5’ 3”” 72,35 72,2 H-1’’’’, H-2’’’’, H-4’’’’ 4' 149,73 149,6 H-2’, H-5’, H-6’ 4”” 73,94 73,7 H-2’’’’, H-3’’’’, H-5’’’’, H- 5' 116,21 116,1 5”” 69,79 69,6 H-1’’’’, H-4’’’’, H-6’’’’ 6' 123,11 123,0 H-2’ 6”” 18,01 17,8 H-4’’’’ Cadeia glicosídica 3-Gal 21 Lit.38 HMBC (3-1)Xil Lit.172 1" 101,35 101,1 H-2’’ 1””’ 106,66 106,4 H-3’’’, H-2’’’’’,H-5a’’’’’ 2" 77,25 77,2 H-3’’, H-4’’, H-1’’’ 2””’ 75,42 75,2 H-3’’’’’, H-4’’’’’ 3" 75,74 75,7 H-2’’, H-4’’ 3””’ 77,71 77,5 H-4’’’’’, H-5a’’’’’, H-5b’’’’’ 4" 70,95 70,7 H-5’’ 4””’ 71,20 71,1 H-2’’’’’, H-3’’’’’, H-5a’’’’’ 5" 75,37 75,3 H-6a’’ 5””’ 67,07 66,9 H-1’’’’’ 6" 67,18 67,1 H-5’’, H-1’’’’ Fonte: Espectros de RMN de 13C e DEPT-135 (Figura 3.132, p.195). 21 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Xil Ram-1 Ram-2 Gal Capítulo 3 Determinação estrutural de 21 190 Oliveira, DM (2012) Tabela 3.38: Atribuição dos valores de δ de 1H de 21 (CD3OD, 400 MHz) de 21 e a comparação com os valores encontrados na literatura 40, 172 δ (multiplicidade, J, Hz) RMN 2D H-n 21 Literatura (genina)40 COSY NOESY H-6 6,19 (d, J = 2,0) 6,22 (d, J = 1,5) H-8 H-8 6,37 (d, J = 2,0) 6,41 (d, J = 1,5) H-6 H-2' 7,71 (d, J = 2,0) 7,75 (d, J = 1,5) H-5’, H-6’ H-5' 6,88 (d, J = 8,5) 6,94(d, J = 8,5) H-2’, H-6’ H-6’ H-6' 7,57 (dd, J = 8,5, 2,0) 7,61(dd, J = 1,5, 8,5) H-2’, H-5’ H-5’ 3-Gal Cadeia Glicosídica40 H-1” 5,62 (d, J = 7,8) 5,63 (d, J = 7,5) H-2’’ H-3”, H-5”, H-3’’’ H-2” 3,97 (dd, J = 9,5, 7,8) 3,94 (dd, J = 7,5; 9,7) H-1’’, H-3’’ H-1’’’ H-3” 3,74 (m) 3,75 (dd, J = 7,5, 3,6) H-2’’, H-4’’ H-1’’ H-4” 3,81 (dl, J = 3,0) 3,50 (dd, J = 3,5, 1,5) H-3’’, H-5’’ − H-5” 3,66 (tl, 6,5) 3,66 (ddd, J = 1,5, 5,0, 7,0) H-4’’, H-6a’’, H-6b’’ H-1’’, H-6a’’ H-6a" 3,47 (m) 3,45 (dd, J = 12,0, 7,0) H-5’’, H-6b’’ H-5’’, H-6b” H-6b” 3,75 (m) 3,76 (dd, J = 12,0, 5,0) H-5’’, H-6a’’ H-6a’’ (2-1)Ram H-1’’’ 5,23 (d, J = 1,5) 5,27 (d, J = 1,5) H-2’’’ H-2’’’, H-2’’ H-3’’, H-4’’’ H-2’’’ 4,19 (dd, J = 3,0, 1,5) 4,26 (dd, J = 3,0, 1,5) H-1’’’, H-3’’’ H-1’’’, H-3’’’ H-3’’’ 3,94 (dd, J = 9,5, 3,0) 3,81 (dd, J = 9,5, 3,0) H-2’’’ H-2’’’, H-1””’ H-4’’’ 3,52 (m) 3,34 (dd, J = 9,5, 1,5) H-3’’’ H-5’’’, H-6’’’ H-5’’’ 4,12 (m) 4,15 (qd, 9,5, 6,0) H-6’’’ H-3’’’, H-6’’’ H-6’’’ 0,97 (d, J = 6,0) 1,00 (d, J = 6,0) H-5’’’ H-3’’’, H-4’’’, H-5’’’ (6-1)Ram 1”” 4,54 (d, J = 1,5) 4,53 (d, J = 1,5) H-2’’’’ H-2””, H-6a/b’’ 2”” 3,58 (dd, J = 3,5, 1,5 3,61 (dd, J = 3,5, 1,5) H-1’’’’ H-1””, H-4”” 3”” 3,51 (m) 3,54 (dd, J = 9,5, 3,5) H-4’’’’ H-6”” 4”” 3,27 (m) 3,34 (t, 9,5) H-3’’’’, H-5’’’’ H-6”” 5”” 3,53 (m) 3,58 (qd, J = 9,5, 6,0) H-4’’’’, H-6’’’’ H-6”” 6”” 1,18 (d, J = 6,0) 1,22 (d, J = 6,6) H-5’’’’, H-4’’’’, H-5”” (3-1)Xil Literatura172 1””’ 4,52 (d, J = 7,5) 4,32 (d, J = 7,4) H-2’’’’’ H-3””’, H-4””’, H-5a””’, H-3’’’ 2””’ 3,29 (m)* 3,22 (dd, J = 7,4, 9,0) H-1’’’’’ H-5b””’ 3””’ 3,35 (t, 9,0) 3,30 (t, J = 8,6) H-2’’’’’, H-4’’’’’ H-1””’ 4””’ 3,52 (m) 3,48 (dd, J = 6,6, 2,8) H-3’’’’’, H-5b’’’’’ H-5b””’ 5a””’ 3,26 (m) 3,00 (t, J =12,2) H-5b’’’’’ H-1””’, H-5b””’ 5b””’ 3,89 (m) 3,77 (dd, J = 5,4, 12,2) H-4’’’’’, H-5a’’’’’ H-5a””’, 4’’’’’ dl: dupleto largo. (*) sinal sobreposto ao da impureza do solvente. Fonte: Espectros de RMN de 1H (Figura 3.131, p.194) e mapas de contorno COSY e NOESY (Figuras 3.134, p.197 e 3.136, p.199). 21 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Xil Ram-1 Ram-2 Gal Capítulo 3 Determinação estrutural de 21 191 Oliveira, DM (2012) Nos espectros de massas EM-IES de 21, modo negativo com varredura de m/z 100- 1000 (Figura 3.137, p.200), o sinal observado c m/z 888 (100%) foi atribuído ao íon-radical [M]−• (C38H48O24), que permitiu propor a massa de 21 em 888 Da. Foi observado no espectro EM2-IES que o íon molecular [M-H]¯ em m/z 887, obtido após ser aprisionado e bombardeado com hélio, produziu os fragmentos principais em m/z 755 e 741, os quais foram atribuídos aos íons-fragmentos Y3β− e Y3α−, respectivamente. As perdas ocorridas nessas fragmentações foram correspondentes à saída de um resíduo de pentose ([M-H-132]) e de uma ramnose ([M-H-146]), respectivamente. Com base nos dados de RMN, o resíduo de pentose foi atribuído a um grupo xilopiranosil. O íon em m/z 609 (Y2β- ou Y2α-) pode ter sido originado por duas vias distintas: (i) mediante a fragmentação do íon em m/z 741 com a saída de um xilopiranosil [Y3β−132]-, ou (ii) via o íon em m/z 741 com a saída de um ramnopiranosil [Y3α−146]-. Tabela 3.39: Proposta de fragmentação para o tetraglicosídeo 21 e a atribuição dos íons observados nos EM-IES negativo (Figura 3.137, p.200), de acordo com a nomenclatura de Domon e Costello81. EM-IES Atribuição m/z PN (Da) Íon PN 887 [M-H]− q-M 301 586 Yo − B4 463 424 Y1 − B1α + B2β 609 278 Y2α − B1α + B1β 609 278 Y2β − B2β + B1α 755 132 Y3α − B1β PN: perdas neutras, q-M: íon quasi-molecular A formação do íon Y1- (m/z 463), atribuído ao íon do mono-heterosídeo [aglicona-3-O- hexose]−, ocorreu via fragmentação do íon em 609 (Y2β- ou Y2α-), após a eliminação de um segundo grupo ramnopiranosil, o que, resumidamente, equivale ao fragmento [M −2 Ram– ara−H]-. Conseqüentemente, a formação do íon mais abundante, em m/z 301, atribuído a íon correspondente a aglicona (Y0-), resultou da fragmentação do íon em m/z 463 (Y1 -) via eliminação do último resíduo sacarídeo equivalente a uma hexose (galactopiranosila, segundo dados de RMN), ligado à molécula de quercetina. OH H O O OHO OH O CH3 OH O OH CH3 OH O O Y0 -./Y0 − O OH OH O O OH OH Y3α − Y3β − Y2α − = Y2β − B4 − Y1 − O OH OH OH Ram Xil Gal Ram Capítulo 3 Determinação estrutural de 21 192 Oliveira, DM (2012) Tabela 3.40: Fragmentograma proposto para o tetraglicosídeo 21 e a atribuição dos íons (aductos do sódio) observados nos EM-IES, modo positivo, do íon precursor em m/z 912 (Figura 3.138, p.201). EM-IES Atribuição m/z PN (Da) Íon PN 911/912 [M +Na]+ 609 302 [B4] + Y0 634 146/132 Y2α + Ram/Xil 634 132/146 Y2β + Xil/Ram 780 132 Y3α + Xil 766 146 Y3β + Ram EM-IES Atribuição m/z PN (Da) Íon PN 609 B4 + C. glic ND 132 B1α + Ara ND 146 B1β + Ram 331 132/146 B2α + Ara/Ram 301 146/162 B2β + Ram/ara 477 132 B3α + Ara 463 146 B3β + Ram PN: perdas neutras; ND: não detectado, a observação desses íons depende da energia de cone aplicada no método CID82. C. glic: íon- fragmento da cadeia glicosídica. A Tabela 3.39 (p.187) mostra as atribuições dos íons observados, a proposta de fragmentação e as perdas neutras calculadas para o espectro EM-IES2 no modo negativo. A diferença entre as massas dos íons [M-H]- e Y0-, igual a 586 Da, foi atribuída ao valor da massa da cadeia glicosídica de 21, que correspondeu à soma das massas molares de uma xilopiranila, duas ramnopiranilas e uma galactopiranila. A análise do espectro EM3-IES mostrou que o íon Y0- em m/z 301 foi o precursor dos íons-radicais em m/z 272 e em m/z 256. Esses íons foram atribuídos às perdas dos radicais neutros CHO (29 Da) e CHO2 (45 Da) pelo íon precursor. O padrão de fragmentação da aglicona foi coincidente com aquele apresentado nos dados de espectroscopia de massas relatados para glicosídeos da quercetina identificados O O OH O OH O CH3 OH O OH CH3 OH OH OH O Y0 + O OH OH OH OO OH Y3α + Y3β + Y2α + = Y2β + Na+ B4 + O OH OH OH Xil Ram Gal Ram O O OH O OH O OH O CH3 OH O OH CH3 OH OH OH O OH OH B1β + B3α + B2α + B2β + B3β + B1α + Na + B4 + Capítulo 3 Determinação estrutural de 21 193 Oliveira, DM (2012) em Maytenus aquifolium e M. ilicifolia80. Nos espectros EM-IES com detecção no modo positivo (Figura 3.138, p.201), adquirido pelo aprisionamento do íon precursor em m/z 912, foi possível observar íons dos tipos Yi+ e Bi+ como aductos do íon sódio (Na+). Os íons- fragmentos do tipo Bi+ detectados possibilitaram confirmar a constituição da cadeia glicosídica de 21. As perdas neutras calculadas em 132, 146, 146 e 162 Da, juntamente com os dados de RMN, confirmaram a seqüência das unidades sacarídeas como sendo Xil→Ram- 1→Gal→Ram-2. As Tabelas 3.39 e 3.40 (p.187-188) mostram as propostas de fragmentação da estrutura de 21, bem como a atribuição dos íons observados nos modos de detecção positivos e negativos, os espectros de massas correspondentes encontram-se no anexo (Figuras 3.137-3.138, pp.200-201). Os resultados obtidos nas análises dos dados espectrocópicos de UV, IV, RMN e EM-IES permitiram elucidar a estrutura do glicosídeo 21 como sendo a do composto inédito 3-O-{[α-L-ramnopiranosil(1→6)]-O-[β-D- xilopiranosil(1→3)-O-α-L-ramnopiranosil(1→2)]]-β-D-galactopiranosídeo de quercetina. Figura 3.129: Curvas características de absorvância em UV de 21 obtidas em soluções de (a) MeOH, MeOH + AlCl3, MeOH + AlCl3 + HCl(aq.) (b) MeOH, MeOH + NaOMe, e (c) MeOH, MeOH, MeOH + NaOAc, MeOH + NaOAc + H3BO3. Os dados espectrais foram registrados em um espectrômetro UV/Vis Beckman DU-600 (CPQRR, BH), ajustado para duas varreduras/amostra na faixa de comprimento de onda (λ) de 200-500 nm a 600 nm/min. 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 200 250 300 350 400 450 500 UV, λ (nm) Abs MeOH __________ MeOH+ AlCl3 − − − − MeOH+ AlCl3 + HCl ........... 356 258 273 437 268 362 394 0 0.4 0.8 1.2 1.6 200 250 300 350 400 450 500 UV, λ (nm) Abs MeOH __________ NaOMe- - - - 258 396 356 261 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 200 250 300 350 400 450 500 UV, λ (nm) Abs MeOH __________ MeOH + NaOAc − − − − MeOH + NaOAc + H3BO3 . . . . . . . 394 356 372 267 (a) (b) (c) Capítulo 3 Determinação estrutural de 21 194 Oliveira, DM (2012) 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 70 75 80 85 90 95 100 812 1357 1049 1657 2935 1605 29883360 T (% ) Número de onda (cm-1) Figura 3.130: Espectro de absorção de 21 na região do infravermelho. Figura 3.131: Espectro de RMN de 1H de 21 (CD3OD, 400 MHz). H-6' 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 4.2 4.1 4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 7.70 7.65 7.60 7.55 5'' H-6'''' H-6''' H-1'''' H-1''''' H-1'' H-1''' H-6H-8 H-5' H-6' H-2' metilas δ δ A 3''''' 3'' 6b''4'' 5b''''' 2'' Expansão B δ Sinal (ppm) Integral 7.7210-7.6907 0.9 7.5903-7.5424 1.0 6.8946-6.8554 1.0 6.3870-6.3567 1.0 6.2013-6.1755 1.0 5.6363-5.5914 1.0 5.2455-5.2069 1.1 4.5528-4.4973 2.4 4.2069-4.1721 1.0 4.1627-4.0705 1.1 3.9171-3.8583 1.1 4.0036-3.9196 2.2 3.8205-3.7864 1.1 3.7756-3.7100 2.2 3.6816-3.6355 1.1 3.5887-3.5603 1.1 3.5553-3.4423 5.5 3.3753-3.3229 1.3 3.2888-3.2301 2.5 1.2015-1.1561 3.2 0.9907-0.9446 3.1 2''' 5''' 3''' 2'''' 6a'' 5'''' 5a'''''4'''' H-2' E 6.88 H-5' δ Expansão D C D B 6.4 6.3 6.2 Expansão C H-8 H-6 δ Expansão E -OH C H D 2O D T M S 5.5 5.0 4.5 Expansão A δ H -1 ''' -OH H-1'''''H -1 ''' ' H-1'' 5.24 5.22 5.20 H-1''' δ 4''''' 3'''' 21 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Xil Ram-1 Ram-2 Gal Capítulo 3 Determinação estrutural de 21 195 Oliveira, DM (2012) Figura 3.132: Espectro de RMN de (a) 13C e (b) DEPT-135 de 21 (CD3OD, 100 MHz). 21 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Xil Ram-1 Ram-2 Gal 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 78 77 76 75 74 73 72 71 70 69 68 67 106 104 102 18.0 17.5 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 67.2 67.0 Expansão B δ C -3 ''' C -8 C -6C -5 ' C -2 ' C -6 ' C -1 ' C -3C -3 ' C -4 ' C -2 C -9 C -4C -7 metilas A C -5 δ Expansão C δ δ C -5 '''' ' C -6 '' C -5 '''C -5 '''' C -4 ''C -4 '''' ' C -2 ''' C -2 '''' C -3 '''' C -4 '''C -4 '''' C -2 '''' ' C -5 '' C -3 '' C -2 ''C -3 '''' ' Expansão A C -1 '' C -1 '''' C -1 ''' C -1 0 C -1 '''' ' δC C -6 '''' C -6 ''' C δ B DEPT-135 6'' 5''''' (b) (a) Capítulo 3 Determinação estrutural de 21 196 Oliveira, DM (2012) Figura 3.133: Mapa de contornos HSQC de 21 (CD3OD, 400 MHz). 21 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Xil Ram-1 Ram-2 Gal Capítulo 3 Determinação estrutural de 21 197 Oliveira, DM (2012) Figura 3.134: Mapa de contornos COSY de 21 (CD3OD, 400 MHz). F2 (ppm) 0.01.02.03.04.05.06.07.08.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 H-2'/H-6' H-2'/H-5' H-6'/H-5' H-8/H-6 A H-5'''/H-6''' H-5''''/H-6'''' H-1''''/H-2'''' H-1'''''/H-2''''' H-1''/H-2'' H-1'''/H-2''' F1 (ppm) 3.203.303.403.503.603.703.803.904.004.104.20 3.20 3.30 3.40 3.50 3.60 3.70 3.80 3.90 4.00 4.10 4.20 H-2'''/H-4''' H-2'''/H-3''' H-2'''/H-3''' H-3''/H-2'' H-5b'''''/H-5a''''' H-5b'''''/H-4''''' H-6b''/H-6a'' H-4''/H-6a'' H-5''/H-6a'' H-5''/H-3''H-3''/H-4'' H-4''/H-5'' H-6b''/H-5'' H-4''''/H-5'''' H-2''''/H-3'''' H-4''''/H-3'''' Expansão A Solvente B F1 (ppm) F2 (ppm) 3.55 3.50 3.45 3.40 3.35 3.30 3.25 3.15 3.20 3.25 3.30 3.35 3.40 3.45 3.50 3.55 H-4'''''/H-3''''' H-4''''/H-3'''' H-5''''/H-4'''' Expansão B F2 (ppm) F1 (ppm) 21 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Xil Ram-1 Ram-2 Gal Capítulo 3 Determinação estrutural de 21 198 Oliveira, DM (2012) Figura 3.135: Mapa de contornos HMBC de 21 (CD3OD, 400 MHz). 1.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.0 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 1.0 H-8/C-7 H-6/C-7 H-6/C-5 H-8/C-9 H-2'/C-2 H-6'/C-2 H-2'/C-4' H-6'/C-4' H-5'/C-4' H-2'/C-3' H-5'/C-3' H-1''/C-3 H-2'/C-1' H-5'/C-1' H-6'/C-2' H-3'''/C-1''''' H-2'''''/C-1''''' H-5a'''''/C-1''''' H-8/C-10 H-6/C-10 H-2'/C-6' H-2''/C-1'' H-6a''/C1'''' H-2''/C-1''' H-8/C-6 H-6/C-8 H-1'''/C-3''' H-1'''''/C-3''' H-2'''/C-3''' H-4'''/C-3''' H-1'''/C-2'' H-1'''/C-2''' H-1'''/C-5''' A ppm (F1) H-6''''/C-4'''' H-6''''/C-5'''' H-6'''/C-4''' H-6'''/C-5''' H-4'''/C-6''' H-4''''/C-6'''' ppm (F2) Expansão A 3.03.54.04.5 66.0 68.0 70.0 72.0 74.0 76.0 78.0 H-1'''''/C-5''''' H-1''''/C-5'''' H-1''''/C-3'''' H-2'''/C-4''' H-3'''/C-4''' H-5a''''' /C-3''''' H-3''/C-2''H-4''/C-2'' H-2''/C-3'' H-4''/C-3'' H-6a''/C-5'' H-2''''/C-4'''' H-3''''/C-4'''' H-5''''/C-4'''' H-3'''''/C-2''''' H-3'''''/C-4''''' H-2''''/C-3'''' H-4''''/ C-3'''' H-4''''/C-5''''H-4'''/C-5''' H-5''/C-6'' H-1''''/C-6'' H-5''/C-4'' H-5a''''' C-4''''' ppm (F1) H-4'''''/C-3''''' ppm (F2) 21 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Xil Ram-1 Ram-2 Gal Capítulo 3 Determinação estrutural de 21 199 Oliveira, DM (2012) Figura 3.136: Mapa de contornos NOESY de 22 (CD3OD, 400 MHz). H-1'''''/H-5a''''' 3.133.253.383.503.633.753.884.004.134.25 3.25 3.50 3.75 4.00 4.25 4.50 Expansão B Expansão A H-5b'''''/H-5a''''' 4.504.634.754.885.005.135.255.385.505.63 3.25 3.50 3.75 4.00 4.25 H-1''/H-5'' H-1''/H-3''' H-1'''/H-2''' H-1'''/H-5''' H-1'''/H-2'' H-1'''/H-3'' H-1''''/H-6a'' H-1''''/H-2'''' H-1''''/H-6b'' H-1'''''/H-3''' H-1'''''/H-2''' H-1'''''/H-3''''' H-6b'''''/H-6a''''' H-5'''/H-3''' H-3'''/H-2''' 1.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 1.08.0 COSY H-6'/H-5' A B H-6'''/H-5''' H-6'''/H-4''' H-6''''/H-4'''' H-6''''/H-5'''' CH4 F1 (ppm) F2 (ppm) F1 (ppm) F2 (ppm) F2 (ppm) F1 (ppm) 21 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Xil Ram-1 Ram-2 Gal Capítulo 3 Determinação estrutural de 21 200 Oliveira, DM (2012) Figura 3.137: Espectros EM-IES de 21 no modo negativo a partir do íon-radical molecular de 21 em m/z 888 (C38H48O24). 900850800750700650600550500450400350300 m/z 20 40 60 80 100 R e la tiv e I n te n si ty ( % ) 8 8 8 .8 7 7 8 .2 7 5 6 .8 6 7 6 .4 5 9 1 .7 5 4 8 .9 4 6 3 .6 4 1 0 .03 4 3 .6 3 0 1 .3 900850800750700650600550500450400350300 m/z 25 50 75 100 R e la tiv e I n te n si ty ( % ) 2 5 7 .4 2 7 2 .4 2 7 3 .3 2 7 8 .1 2 8 3 .0 3 0 1 .3 900850800750700650600550500450400350300 m/z 25 50 75 100 R e la tiv e I n te n si ty ( % ) 8 9 0 .3 8 8 9 .4 8 8 7 .6 8 8 6 .6 7 5 7 .9 7 5 6 .5 3 0 2 .3 3 0 1 .3 EM-IES EM3-IES [Y0 − CHO] −[Y0 − CO2] − [M]H2 [M-H]− [M-H]−-146 (Ram) Y3β − Y3α − -132 (Xil) Y2α − = Y2β − Y1 − -162 (Gal) Y0 − 6 0 9 .0 6 2 2 .6 7 4 1 .3 -146 (Ram) 8 8 7 .0 [M]H2 7 5 5 .2 EM2-IES % % % OH H O O OHO OH O CH3 OH O OH CH3 OH O O Y0 -./Y0 − O OH OH O O OH OH Y3α − Y3β − Y2α − = Y2β − B4 − Y1 − O OH OH OH Ram Xil Gal Ram Capítulo 3 Determinação estrutural de 21 201 Oliveira, DM (2012) Figura 3.138: Espectros de massas EM-IES, de 21 obtido em modo positivo de detecção com a identificação e o isolamento (MS/MS) do íon precursor em m/z 911 [M + Na] + . O O OH O OH O CH3 OH O OH CH3 OH OH OH O Y0 + O OH OH OH OO OH Y3α + Y3β + Y2α + = Y2β + Na+ B4 + O OH OH OH Xil Ram Gal Ram O O OH O OH O OHOH OH O CH3 OH O OH CH3 OH OH OH O B1β + B3α + B2α + B2β + B3β + B1α + Na + B4 + 200018001600140012001000800600400200 m/z 25 50 75 100 R e la tiv e I n te n si ty ( % ) 9 1 1 .4EM-IES 600550500450400350300250 m/z 25 50 75 100 R e la tiv e I n te n si ty ( % ) 6 1 0 .2 6 0 9 .4 5 9 1 .4 5 9 0 .7 5 1 8 .7 4 7 7 .3 4 6 3 .54 6 2 .8 4 5 9 .1 4 4 5 .0 3 9 4 .5 3 8 9 .4 3 8 5 .1 3 3 1 .8 3 3 1 .2 3 1 2 .8 3 0 1 .53 0 0 .8 2 4 2 .4 EM3-IES 950900850800750700650600550500450400350300 m/z 25 50 75 100 R e la tiv e I n te n si ty ( .. . 3 0 1 .0 3 3 1 .0 3 3 1 .6 3 7 3 .1 4 6 3 .1 4 7 7 .0 5 9 1 .2 6 0 8 .5 6 0 9 .3 6 1 0 .4 6 1 1 .6 6 1 6 .9 6 3 3 .9 6 3 5 .0 7 6 5 .6 7 8 0 .7 8 8 3 .1 8 8 6 .8 9 1 1 .0 9 1 2 .1 9 1 3 .7 EM2-IES [M+Na]+ [M+Na]+Y3β + Y3α +. Y2β + = Y2α + B4 + B3α +B3β +B2α +B2β + B4 + B3α + B3β + B2α + B2β + % % % Capítulo 3 Determinação Estrutural de 22 202 Oliveira, DM (2012) 3-O-{[α-L-ramnopiranosil(1→6)]-O-[β-D-xilopiranosil(1→3)-O-α-L-ramnopiranosil-(1→2)]}-β- D-galactopiranosídeo de canferol (22) 22 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Gal Ram-1 Ram-2 Xil O composto inédito 22 foi isolado como um sólido amarelo-claro amorfo (12,2 mg) e apresentou ponto de fusão indefinido (houve degradação da amostra quando a temperatura atingiu cerca de 203 oC). Esta substância foi obtida do extrato em metanol das folhas de M. acanthophylla (FAMMA). Na análise de 22 por CCD revelada sob luz UV (366 nm), após borrifar a cromatoplaca com o reagente NP/PEG-400, foi observado uma mancha verde- amarelada brilhante (Figura 3.139), indicando a presença da genina do flavonóide 3,5,7,4’-tetra- hidroxiflavona, o canferol.77 Esse resultado foi coerente com os relatos sobre a obtenção de flavonóides isolados de plantas do gênero Maytenus onde figuram compostos 3-O-glicosídeos do canferol.38, 39, 67 Figura 3.139: Fotografia da cromatoplaca CCD em sílicagel 60G de 22, eluente: acetato de etila:metanol: água-ácido acético 0,5% (8:2:1); revelador: NP-PEG 4000 sob luz UV λ 366 nm, Rf = 0,30. Capítulo 3 Determinação Estrutural de 22 203 Oliveira, DM (2012) O espectro de absorção no UV de 22 (diluído na fase móvel), obtido por meio de varredura feita utilizando o detector de UV do cromatógrafo CLAE, shimadzu LC-10, mostrou bandas com máximos em λmax 350 e 268 nm correspondentes às bandas I e II de flavonoide, respectivamente. Esse padrão de absorção no UV indicou a presença de um flavonol com substituição em C-3-OH (Figura 3.140).80, 170 Figura 3.140: Espectro de absorção de 22 obtido por varredura na região do UV na cela do detector com fotodiodo modelo SPD-M10A, acoplado à bomba LC-10AD e módulo de aquisição de dados CBM 10A do equipamento para CLAE (Shimadzu). O espectro de absorção na região do IV de 22 (Figura 3.145, p.211) apresentou uma banda de absorção na região de 3200-3550 cm-1 e outra estreita, porém intensa, com máximo em 1040 cm-1, que indicaram a presença de grupos hidroxilas. Observou-se, também, uma banda em 1656 cm-1 característica de grupo carbonila quelado.39 As absorções relacionadas aos estiramentos da ligação O-H foram observadas entre 3200-3550 cm-1 e foram atribuídas a hidroxílias envolvidos em ligações de hidrogênio intermoleculares.117 Essas absorções de 22 na região do infravermelho são condizentes com a estrutura de um flavonol. Com base nos dados cromatográficos, características espectrais na região do UV e IV, bem como os relatos sobre os flavonóides de Maytenus, foi possível propor o 3,5,7,4’-tetra-hidroxiflavona (canferol) como a aglicona de 22. O espectro de RMN de 1H (Figura 3.146, p.212) compreendeu principalmente ressonâncias de hidrogênios aromáticos e glicosídicos. Para os primeiros, o espectro mostrou sinais de dois hidrogênios aromáticos em δ 6,20 (d, J = 2,0 Hz, H-6) e em δ 6,39 (d, J = 2,0 Hz, H-8) e dois dupletos aparentes em δ 8,06 (d, J = 8,7 Hz, H-2’/H-6’) e δ 6,90 (d, J = 8,7 Hz, H-3’/H-5’). Observou-se também as ressonâncias de quatro hidrogênios glicosídicos anoméricos em δ 5,56 (d, J = 7,7 Hz), δ 5,23 (d, J = 1,50 Hz), δ 4,52 (m) e δ 4,53 (d, J = 7,3 Hz), no mapa de contornos HSQC (Figura 3.149, p.215) de 22, os sinais dos hidrogênios anoméricos foram associados aos sinais dos respectivos carbonos em δ 101,12, δ 102,28, δ 102,01 e δ 106,65 (Figura 3.141, p.204). 22 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Gal Ram-1 Ram-2 Xil Capítulo 3 Determinação Estrutural de 22 204 Oliveira, DM (2012) 106.0 107.0 108.0 Xil Ram-2 Ram-1 C-1''/H-1'' Gal ppm (F2) 4.50 5.00 5.50 101.0 102.0 103.0 104.0 105.0 ppm (F1) C-1'''/H-1''' C-1''''/H-1'''' C-1'''''/H-1''''' 100.0 Figura 3.141: Seção do mapa de contornos HSQC de 22 (CD3OD, 400 MHz) relativa aos hidrogênios e carbonos anoméricos (F2: δ de 1H 4,5-5,70 x F1: δ de 13C 100,0-108,0). No espectro de RMN de 1H dois dupletos em δ 0,99 (d, J = 6,0 Hz) e 1,17 (d, J = 6,0 Hz) indicaram a presença de dois grupos ramnopiranosilas,173 os demais sinais de hidrogênios sacarídeos foram registrados na região de δ 3,26-4,19 ppm. Os dados de RMN relatados para o 3- O-tetraglicosídeo de canferol isolado de M. ilicifolia e M. aquifolium38 (3-O-{[α-L- ramnopiranosil(1→6)][α-L-arabinopiranosil(1→3)-O-α-L-ramnopiranosil(1→2)]}-β-D-galacto- piranosídeo de canferol) serviram como base de comparação para os dados de RMN de 22 atribuídos à aglicona e para os grupos galactopiranosil e ramnopiranosil. Os dados de RMN referentes ao resíduo de xilopiranosila foram comparados aos que foram publicados para o 3-O- {[β-D-xilopiranosil(1→3)-α-L-ramnopiranosil(1→6)][α-L-ramnopiranosil(1→2)]}-β-D- galactopiranosídeo de canferol, um isômero constitucional de 22, isolado de Astragalus caprinus (Fabaceae).172 4.505.005.50 3.50 4.00 ppm F1 ppm F2 H-1'''/H-2'" H-1'''''/H-2''''' H-1''/H-2'' H-1''''/H-2'''' Figura 3.142: Seção do Mapa de contornos COSY de 22 (CD3OD, 400 MHz) relativa às correlações entre os sinais dos hidrogênios anoméricos com os hidrogênios vicinais (F2: δ de 1H 4,50-5,50 x F1: δ de 1H 3,20- 4,20). 22 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Gal Ram-1 Ram-2 Xil 22 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Gal Ram-1 Ram-2 Xil Capítulo 3 Determinação Estrutural de 22 205 Oliveira, DM (2012) Através da comparação entre os dados da literatura e a análise dos espectros de RMN de 1H (Figura 3.146, p.212) e dos mapas de contornos COSY (Figura 3.148, p.214) e HMBC (Figuras 3.150 e 3.151, p.216), iniciando a partir dos sinais dos hidrogênios anoméricos, foram atribuídas as ressonâncias de cada unidade de açúcar de 22. Na seção do mapa de contornos COSY (Figura 3.142, p.204), o sinal do hidrogênio anomérico da unidade galactopiranosila (H-1’’), em δ 5,56 (d, J = 7,7 Hz), mostrou intensa correlação com o sinal do hidrogênio vicinal H-2’’ em δ 3,94 (m, Hz), sendo atribuída a configuração 1,2-trans-diaxial entre esses hidrogênios. De modo semelhante, o sinal em δ 4,53 (m) foi atribuído ao hidrogênio anomérico H-1’’’’’ do resíduo xilopiranosila, acoplou com o hidrogênio vicinal (H-2’’’’’) em δ 3,29 (m) e ambos foram designados como hidrogênios axiais. Entretanto, os hidrogênios anoméricos atribuídos aos resíduos ramnopiranosilas, Ram-1 e Ram-2 em δ 5,23 (dl, J = 1,5 Hz, H-1’’’) e 4,52 (m, H-1’’’’), apresentaram fracas correlações 3JH-1,H-2 com os seus vizinhos, em δ 4,19 (dd, J = 3,0, 1,5 Hz, H- 2’’’) e 3,56 (dd, J =3,5, 1,5 Hz, H-1’’’’), respectivamente, indicando que esses hidrogênios dos grupos ramnopiranosilas são equatoriais. As Tabelas 3.41 e 3.42 (pp.206-207) mostram os dados completos de RMN de 13C e de 1H (CD3OD), obtidos a partir de experimentos 1D [RMN de 1H (Figura 3.146, p.212), RMN de 13C e DEPT-135 (Figura 3.147, p.213)], e 2D [HSQC (Figura 3.149, p.215), COSY(Figura 3.148, p.214), HMBC (Figuras 3.150 e 3.151, p.216) e NOESY(Figuras 3.152 a 3.153, pp.217-218)] de 22. Com base nos deslocamentos químicos, multiplicidades dos sinais e valores das constantes de acoplamento, os resíduos monossacarídeos foram identificados como β-galactopiranosila (Gal), α-ramnopiranosilas (Ram-1 e Ram-2) e β- xilopiranosila (Xil). A atribuição da configuração D foi atribuída para ambos Gal e Xil, bem como a configuração L foi atribuída para Ram-1 e Ram-2 de acordo com as predominâncias dessas configurações em glicosídeos de origem vegetal.172 Capítulo 3 Determinação Estrutural de 22 206 Oliveira, DM (2012) 22 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Gal Ram-1 Ram-2 Xil Tabela 3.41: Atribuição dos valores de δ de 13C de 22 (CD3OD, 100 MHz) e a comparação com os valores disponíveis na literatura (δ, CD3OD, 100 MHz) 38, 172 C-n 22 Lit38 HMBC C-n 22 Lit38 HMBC 2 158,90 158,5 H-2’, H-6’ (2-1)Ram-1 3 134,60 134,4 - 1’’’ 102,28 102,1 H-1’’, H-3’’’, H-5’’’ 4 179,51 179,7 - 2’’’ 72,12 72,0 H-1’’’ 5 163,23 163,1 - 3’’’ 82,55 82,7 H-1’’’, H-2’’’, H-4’’’, H- 6 99,83 101,0 H-8 4’’’ 73,04 72,9 H-2’’’, H-3’’’ 7 165,70 167,5 H-8 5’’’ 69,65 69,5 H-1’’’, H-6’’’ 8 94,74 95,5 H-6 6’’’ 17,62 17,6 H-4’’’ 9 158,49 158,5 H-8 (6-1)Ram-2 10 105,99 106,6 H-6, H-8 1”” 102,01 101,8 H-3’’’’ 1' 123,09 122,9 H-3’, H-5’ 2”” 72,16 72,0 H-1’’’’ 2' 132,28 132,2 H-6’ 3”” 72,36 72,2 H-6’’’’ 3' 116,25 116,2 H-5’ 4”” 74,00 73,9 H-6’’’’ 4' 161,37 161,0 H-2’,H-3’ H-5’, H-6’ 5”” 69,76 69,7 H-1’’’’, H-6’’’’ 5' 116,25 116,2 H-3’ 6”” 18,04 17,9 H-5’’’’ 6' 132,28 132,2 H-2’ 3-Gal (3-1)Xil (δ, Lit172) 1" 101,12 101,1 H-2’’ 1””’ 106,65 106,4 H-5’’’’’,H-3’’’ 2" 77,37 77,2 H-3’’, H-1’’’ 2””’ 75,42 75,2 H-3’’’’’ 3" 75,77 75,7 H-2’’ 3””’ 77,71 77,5 H-2’’’’’ 4" 70,8 70,7 H-2’’ 4””’ 71,20 71,1 H-2’’’’’, H-3’’’’’ 5" 75,41 75,3 H-2’’, H-6’’ 5””’ 67,07 66,9 H-1’’’’’ 6" 67,31 67,1 H-5’’ Fonte: Espectros de RMN de 13C e DEPT-135 (Figuras 3.147, p.213). Capítulo 3 Determinação Estrutural de 22 207 Oliveira, DM (2012) 22 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Gal Ram-1 Ram-2 Xil Tabela 3.42: Atribuição dos valores de δ de 1H (400 MHz) de 22 (CD3OD, 400 MHz) e comparação com os valores encontrados na literatura (CD3OD, 400 MHz) 38, 172 δ de 1H (multiplicidade, J, Hz) RMN 2D H-n 22 Literatura38 COSY NOESY H-6 6,20 (d, J =2,0) 6,18 (d, J =1,5) H-8 H-8 6,39 (d, J = 2,0) 6,35 (d, J = 1,5) H-6 H-2' 8,06 (d*, J = 8,7) 8,08 (d, J = 8,5) H-3’ H-3’ H-3' 6,90 (d*, J = 8,7) 6,92 (d, J = 8,5) H-2’ H-2’ H-5' 6,90 (d*, J = 8,7) 6,92 (d, J = 8,5) H-6’ H-6’ H-6' 8,06 (d*, J = 8,7) 8,08 (d, J = 8,5) H-3’ H-5’, H-2” 3-Gal H-1” 5,56 (d, J = 7,7) 5,57 (d, J = 7,5) H-2’’ H-3’’, H-5’’ H-2” 3,94 (m) 3,96 (dd, J = 7,5; 9,7) H-1’’, H-3’’ H-6’ H-3” 3,72 (m) 3,73 (dd, J = 7,5, 3,6) H-2’’ H-1’’’ H-4” 3,76 (dl, J = 3,0) 3,51 (dd, J = 3,5, 1,5) H-3’’ H-6a’’ H-5” 3,63 (tl, J = 6,0) 3,67 (ddd, J = 1,5, 5,0, 7,0) H-6a’’, H-6b’’ H-6’’'’ H-6a" 3,45 (dd, J = 10,0, 6,0) 3,45 (dd, J = 12,0, 7,0) H-5’’, H-6b’’ H-6b'’ H-6b” 3,72 (m) 3,76 (dd, J = 12,0, 5,0) H-6a’’ H-6a'’ (2-1)Ram-1 H-1’’’ 5,23 (m) 5,27 (d, J = 1,5) H-2’’’ H-2’’’,H-2’’, H-3’’ H-2’’’ 4,19 (dd, J = 3,0, 1,5) 4,26 (dd, J = 3,0, 1,5) H-1’’’, H-3’’’ H-3’’’ H-3’’’ 3,94 (m) 3,95 (dd, J = 9,5, 3,0) H-2’’’ H-1’’’, H-2’’’ H-4’’’ 3,51 (m) 3,58 (t, J = 9,5, 9,5) H-5’’’ H-6’’’ H-5’’’ 4,13 (m) 4,17 (qd, J = 9,5, 6,0) H-4’’’, H-6’’’ H-6’’’ H-6’’’ 0,99 (d, J = 6,0) 1,02 (d, J = 6,0) H-5’’’ H-4’’’, H-5’’’ (6-1)Ram-2 1”” 4,52 (m) 4,55 (d, J = 1,5) H-2’’’’ H-2’’’’, H-6a’’ 2”” 3,56 (dd, J =3,5, 1,5) 3,60 (dd, J = 3,5, 1,5) H-1’’’’ H-1’’’’ 3”” 3,53 (m) 3,55 (dd, J = 9,5, 3,5) H-6’’’’ 4”” 3,26 (t, J = 9,5), 3,31 (t, J = 9,5, 9,5) H-5’’’’ H-6’’’’ 5”” 3,52 (m) 3,57 (qd, J =9,5, 6,0) H-6’’’’ H-6’’’’ 6”” 1,17 (d, J = 6,2) 1,20 (d, J = 6,6) H-5’’’’ H-3’’’’, H-4””, H-5”” (3-1)Xil literatura172 1””’ 4,53 (d, J = 7,3) 4,32 (d, J = 7,4) H-2’’’’’ H-3’’’ 2””’ 3,29** (m) 3,22 (dd, J = 7,4, 9,0) H-1’’’’’ H-4’’’’’ 3””’ 3,35 (t, J = 9,0) 3,30 (t, J = 8,6) H-4’’’’’ H-1’’’’’ 4””’ 3,52 (m) 3,48 (m) H-3’’’’’, H-5b’’’’’ H-5b’’’’’ 5a””’ 3,27 (t, J = 11,5) 3,00 (t, J = 12,2) H-5b””’ 5b””’ 3,90 (m) 3,77 (dd 5,4, 12,2) H-4’’’’’, H-5a’’’’’ H-5a'’’’’, H-4’’’’’ (**) sinal sobreposto ao do solvente (metanol-d4). d*: dupleto aparente; dl: dupleto largo. Capítulo 3 Determinação Estrutural de 22 208 Oliveira, DM (2012) Informações estruturais relacionadas às ligações interglicosídicas e detalhes sobre a estereoquímica de 22 foram deduzidas pela análise dos dados obtidos nos experimentos HMBC178 (Figuras 3.150 e 3.151, p.216) e NOESY (Figuras 3.152 a 3.153, p.217). Na seção do mapa de contornos HMBC de 22 (Figura 3.143), o sinal em δ 5,23 (d, J = 1,5 Hz), atribuído a H-1’’’ (Ram-1) mostrou correlação com o sinal de carbono em δ 77,37 (C-2’’), essa correlação foi atribuída à ligação glicosídica -[-α−L-ramnopiranosil-(1→2)-galactopiranosil-]- (Figura 3.143, correlação (a)). A correlação entre o sinal de H-1’’’’ em δ 4,52 (m) e o sinal de carbono em δ 67,31 (C-6’’) foi atribuída à ligação glicosídica -[-α−L-ramnopiranosil-(1→6)-galactopiranosil-]- (Figura 3.143, correlação (b)) e, a correlação entre o sinal de H-1’’’’’ em δ 4,52 (m) e o sinal de carbono em δ 82,59 (C-3’’’) foi atribuída à ligação glicosídica [β−D-xilopiranosil-(1→3)- ramnopiranosil-]- (Figura 3.143, correlação (c)). Os demais dados obtidos no experimento HMBC, COSY e NOESY foram utilizados na elucidação das estruturas da aglicona e das unidades monossacarídeas, ver Tabelas 3.41 e 3.42 (p.206-207). 4.404.504.604.704.804.905.005.105.205.30 65.0 67.5 70.0 72.5 75.0 77.5 80.0 82.5 85.0 H-1'''''/C-3''' H-1'''/C-3''' H-1'''/C-2'' H-1'''/C-5''' H-1''''/C-6'' H-1''''/C-5'''' H-1''''/C-2'''' (b) (c) (a) F2 (ppm) F1 (ppm) Figura 3.143: Região do mapa de contornos HMBC apresentando as correlações atribuídas às ligações glicosídicas de 22: (a): -Ram(1→2)Gal-; (b): Ram(1→6)Gal-; (c): Xil(1→3)Ram-. As linhas com setas representam as correlações 3JH,C. O mapa de contornos NOESY de 22 (Figuras 3.152-3.153, p.217) mostrou importantes correlações para elucidação das unidades glicosídicas, principalmente as que envolveram 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' CHOH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6'' OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH CH 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' CH O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH 1''''' 1''' (c) (a) (b) Capítulo 3 Determinação Estrutural de 22 209 Oliveira, DM (2012) hidrogênios em posições 1,3-diaxiais nos anéis glicosídicos, como mostrado na Figura 3.144-A para o resíduo Gal. Foram também observadas correlações NOE entre os hidrogênios interglicosídicos, bem como entre a os sinais da genina (H-6’) e os resíduos de galactose (H-2’’). Essas correlações ajudaram na atribuição do sequenciamento das unidades monossacarídicas da cadeia glicosídica. 5.545.555.565.575.585.59 3.60 3.62 3.64 3.66 3.68 3.70 3.72 3.74 djalma/gracia - g77 H-1''/H-5'' H-1''/H-3'' ppm F1 ppm F2 A 8.008.058.10 3.85 3.90 3.95 4.00 4.05 4.10 4.15 4.20 ppm F1 ppm F2 H-2''/H-6' B H-1''''/H-6a'' 4.494.514.534.554.57 3.45 3.50 3.55 3.60 3.65 3.70 3.75 3.80 3.85 3.90 3.95 4.00 djalma/gracia - g77 ppm F1 ppm F2 H-1'''''/H-3''' C 5.20 5.21 5.22 5.23 5.24 5.25 ppm F2 3.70 3.80 3.90 4.00 4.10 4.20 ppm F1 H-1'''/H-2'' D H-1'''' H-6a'' H-6b'' H-1'' H-2'' H-3'' H-1''' H-4'' H-6''' H-5''' H-3''' H-5''''' H-1''''' 22 H-6 H-2''''' H-3''''' H-6'''' Figura 3.144: Ampliações (A-C) do mapa de contornos NOESY de 22 (CD3OD, 400 MHz) que mostram correlações interglicosídicas, conforme indicadas pelas linhas verdes tracejadas na estrutura obtida por correlações NOE e otimizada por MMFF-94 Merck (abaixo).93 Cores dos átomos: cinza (C), azul (H) e vermelho (O). Capítulo 3 Determinação Estrutural de 22 210 Oliveira, DM (2012) Foram observadas também correlações NOE entre o sinal anomérico da xilopiranose em δ 4,53 (d, J = 7,3 Hz, H-1’’’’) com o sinal em δ 3,94 (m, H-3’’’), permitindo identificar a ligação glicosídica Xil(1→3)Ram-1]- (Figura 3.144-C). O sinal anomérico de Ram-1 em δ 5,23 (d, J = 1,5 Hz, H-1’’’) acoplou com os sinais de H-2’’ da galactopiranose em δ 3,94 (m), indicando a existência da ligação –Ram-1(1→2)Gal- (Figura 3.144-D). A ligação glicosídica Ram- 2(1→6)Gal- foi detectada a partir da correlação entre o sinal do hidrogênio anomérico da Ram-2 [δ 4,52 (m), H-1’’’’] e o sinal de um dos hidrogênios metilênicos de Gal [δ 3,45 (dd, J = 10,0, 7,0 Hz), H-6a’’] (Figura 3.144-C). A ligação existente entre a aglicona e a cadeia glicosídica foi evidenciada pelas correlações entre um dupleto aparente referente aos hidrogênios aromáticos H- 6’ em δ 8,06 (d, J = 8,7 Hz) e os sinais dos hidrogênios H-2’’ em δ 3,94 (m) (Figura 3.144-B, p.209). No espectro de massas com ionização por electrospray (EM-IES) no modo negativo com varredura de 100-1000 Da (Figura 3.154, p.219 e Tabela 3.43, p.211), o íon observado em m/z 871 (100%) foi atribuído ao fragmento [M–H]− e permitiu propor a fórmula C38H48O23 (872 g mol-1) para 22. Os íons em m/z 725 e em m/z 739 foram atribuídos à fragmentação de [M-H]- após as perdas individuais de resíduos de um grupo raminopiranosila ([M-H-146]−, íon Y3β −) e perda de um pentopiranosila ([M-H-132]−, íon Y3α - ), respectivamente. Esse padrão de fragmentação indicou que esses resíduos se localizam nas porções terminais da cadeia glicosídica. O resíduo de pentose foi atribuído por RMN a um resíduo de xilose. E assim, podemos inferir que a formação do íon-radical em m/z 594 (íons Y2α −/Y2β −) é resultante de duas vias de fragmentação distintas que envolvem duas unidades ramnopiranosila. A primeira via levou a formação do íon Y2α − e foi deduzida considerando a fragmentação do íon precursor em m/z 739 (m/z 594: [M-H-Xil-Ram]−•), a segunda via levou ao íon Y2β − pelo precursor em m/z 725 (m/z 594: [M-H-Ram-Xil] −•). O íon- radical em m/z 286 foi atribuído ao fragmento formado pelo núcleo da aglicona (canferol) após a saída da cadeia glicosídica (Tabela 3.43, p.211). A observação do íon pseudo-molecular e as perdas de fragmentos neutros possibilitou calcular o valor da massa molar da parte glicosídica em 586 Da, um valor de massa molar que corresponde a uma cadeia glicosídica composta de duas unidades ramnopiranosila, uma hexopiranosila e uma xilopiranosila; o resíduo de hexose, com base nos dados de RMN, foi ratificado como correspondente a um grupo galactopiranosila, confirmando o composto 22 como um tetraglicosídeo do canferol. Capítulo 3 Determinação Estrutural de 22 211 Oliveira, DM (2012) Tabela 3.43: Fragmentação proposta para o tetraglicosídeo 22 e a atribuição dos íons observados no EM-IES, modo negativo m/z 286 m/z 739 m/z 725 m/z 594 3 O 6 O 2' 6' OH OH OH O 2" 1" O 6" O OH O OH 1''' O CH3 3"' OH O OH CH3 1"" OH OH OH O O 1''''' OH OH OH Atribuição m/z Fragmento PN (Da) 871 [(M +H)]− - 286 Y0 −• 586 594 Y2α −• 132, 146 594 Y2β −• 146/132 739 Y3α − 132 725 Y3β − 146 PN: perdas neutras Os resultados obtidos nas análises dos dados espectrométricos de UV, IV, RMN e EM-IES apresentados até aqui, permitem propor a estrutura do glicosídeo inédito 3-O-{[α-L- ramnopiranosil(1→6)][α-L-xilopiranosil(1→3)-O-α-L-ramnopiranosil(1→2)]}-β-D-galacto- piranosídeo de canferol para o constituinte 22 de M. acanthophylla. 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 805 12003350 1040 16 0516 56 T ( %) Número de onda (cm-1) djalma-g7-6 Figura 3.145: Espectro de absorção de 22 na região do infravermelho. 22 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Gal Ram-1 Ram-2 Xil Capítulo 3 Determinação Estrutural de 22 212 Oliveira, DM (2012) 22 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Gal Ram-1 Ram-2 Xil 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 5.4 5.2 5.0 4.8 4.6 8.2 8.0 7.8 7.6 7.4 7.2 7.0 6.8 6.6 6.4 6.2 4.2 4.1 4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 5.24 5.23 5.22 5.21 H-6''' B C H -1 '''' ' H-1'''' H-1''' H-1'' H-8 H-6 H-3'/5' H-6'''' DOH δ metilas H-2'/6' [1.02 0.94] 3.4 [1.20 1.13] 3.7 [3.20 3.10] 0.4 [3.40 3.22] 26.2 [3.58 3.40] 8.3 [3.65 3.59] 1.6 [3.82 3.66] 6.0 [4.01 3.83] 5.1 [4.21 4.05] 2.7 [4.31 4.25] 0.3 [4.56 4.49] 2.5 [5.28 5.19] 1.1 [5.59 5.52] 0.9 [6.24 6.15] 1.2 [6.42 6.35] 1.1 [6.94 6.84] 2.3 [8.14 7.97] 2.0 A H -C D 2O D H-1'''' H-1'''''H-1''' H-1'' Expansão A δ Anoméricos H-8 Expansão C δ H-6 H-3'/5'H-2'/6' 2''''' 4''''' 5'''' 4''' Impureza Expansão B δ 5''' 2''' 5b'''''3''' 2'' 4'' 3'' 6b'' 5'' 2'''' 6a'' 3'''' 3''''' 4'''' 5a''''' H-1''' δ Figura 3.146: Espectro de RMN de 1H de 22 (CD3OD, 400 MHz). Capítulo 3 Determinação Estrutural de 22 213 Oliveira, DM (2012) 22 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Gal Ram-1 Ram-2 Xil 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 67.5 67.0 δ E Expansão E C-5''''' C-6'' δ 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 107 106 105 104 103 102 101 18.0 17.8 17.6 82 80 78 76 74 72 70 68 66 166 164 162 160 158 Expansão D D C Expansão B Expansão A A C-3'''C-8 C-6 C-4 C-7 C-5 C-4' C-2 C-9 C-3 C-2'/C-6' C-1' C-3'/C-5' B δ C-6''' C-6'''' Expansão C C-1''''' C-10 C-1''' C-1'''' C-1'' ga la cto se Xi lo se ag lic on a R am 1 δ Ra m 2 Ra m 2 Ra m - 1 δ C-3''' C-3''''' C-2'' C-3'' C-2'''''/C-5'' C-4'''' C-4''' C-3'''' C-2''''C-2''' C-4''''' C-4'' C-5'''' C-5''' C-6''C-5'''' δ δ Figura 3.147: Espectros de RMN de (a) 13C e (b) DEPT-135 de 22 (CD3OD, 100 MHz). (b) (a) Capítulo 3 Determinação Estrutural de 22 214 Oliveira, DM (2012) 0.01.02.03.04.05.06.07.08.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 H-6/H-8H-2'/H-3' H-5'/H-6' H-1''/H-2'' H-1'''/H-2''' H-5'''/H-6''' H-5''''/H-6'''' H-1''''/H-2'''' H-1'''''/H-2''''' A ppm (F2) ppm (F1) 3.253.503.754.004.25 3.25 3.50 3.75 4.00 4.25 H-3''/H-4'' H-5''/H-6b'' H-5''/H-6a'' H-6a''/H-6b'' H-2''/H-3'' H-4'''/H-5''' H-4''''/H-5'''' H-5'''/H-4''' H-2'''/H-3''' H-3'''''/H-5b''''' H-5a'''''/H-5b''''' H-4'''''/H-5b''''' H-3'''/H-4''' δH δH H-3'''''/H-4''''' Expansão A Figura 3.148: Mapa de contornos COSY (CD3OD, 400 MHz) de 22 e expansão da região entre δ de 1H 3,25 e 4,25 ppm (F2) x δ de 1H 3,25 e 4,25 ppm (F1). 22 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Gal Ram-1 Ram-2 Xil Capítulo 3 Determinação Estrutural de 22 215 Oliveira, DM (2012) 22 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Gal Ram-1 Ram-2 Xil 1.02.03.04.05.06.07.08.0 0 25 50 75 100 125 0.0 ppm (F1) 6 8 3' e 5' 2' e 6' 1'' 1''' 1'''' 1''''' 3''' 3'''''2'' 2''''' 5'' 3'' 4'''' 4''' 3'''' 2'''' 4''''' 2''' 4''5''' 5'''' C-5'''''/H-5b''''' C-5'''''/H-5a''''' C-6''/H-6b'' C-6''/H-6a'' Solvente Impureza 6''' 6'''' 3.4503.5003.5503.600 71.00 71.50 72.00 72.50 73.00 73.50 74.00 4''''' 2'''' 4''' 3'''' H-6'''' H-6''' ppm(F2) ppm(F2) ppm (F2) Figura 3.149: Mapa de contornos HSQC de 22 (CD3OD, 400 MHz). Capítulo 3 Determinação Estrutural de 22 216 Oliveira, DM (2012) 5.005.506.006.507.007.508.00 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 H-6'/C-2' H-6'/C-2 H-2'/C-2 H-2'/C-4' H-3'/C-4' H-5'/C-4' H-3'/C-1' H-5'/C-1' H-3'/C-5' H-8/C-7 H-8/C-9 H-8/C-10 H-8/C-6 H-6/C-10 H-6/C-8 H-1'''/C-5''' H-1'''/C-2''' H-1'''/C-3''' 0.900.951.001.051.101.151.201.25 69.0 70.0 71.0 72.0 73.0 74.0 75.0 76.0 H-6''''/C-5'''' H-6'''/C-5''' H-6''''/C-4'''' H-6'''/C-5''' Região das metilas H-6'/C-4' ppm (F1) ppm (F2) Figura 3.150: Mapa de contornos HMBC de 22 da região entre δ de 13C 80 e 170 ppm (F1) x δ de 1H 5,00 e 8,00 ppm (F2) (CD3OD, 400 MHz). 3.303.403.503.603.703.803.904.004.104.204.304.404.504.604.70 67.5 70.0 72.5 75.0 77.5 80.0 82.5 85.0 87.5 90.0 92.5 95.0 97.5 100.0 102.5 105.0 107.5 H-1''''/C-6'' H-1'''''/C-5''''' H-1''''/C-5'''' H-1'''''/C-4''''' H-1''''/C-3'''' H-1'''''/C-3''' H-2'''/C-3''' H-2'''/C-4''' H-2''/C-1''' H-2''/C-10 H-2''/C-1'' H-2''/C-3'' H-3'''/C-4''' H-4''/C-2'' H-4''/C-5'' H-5''/C-6'' H-4'''/C-5''' H-4'''/C-3''' H-4'''''/C-3''''' H-2''''/C-3'''' H-6a''/C-1'''' H-6a''/C-4'''' H-6a''/C-5'' H-3'''''/C-4''''' H-3'''''/C-2''''' H-2'''''/C-3''''' H-5'''''/C-3''''' H-4''''/C-3'''' H-4'''''/C-5'''' H-3'''''/C-1''''' H-5'''''/C-1''''' ppm (F1) ppm (F2) Figura 3.151: Mapa de contornos HMBC de 22 da região entre δ 13C 67 e 107,5 ppm (F1) x δ 1H 3,30 e 4,70 ppm (F2). (CD3OD, 400 MHz). 22 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Gal Ram-1 Ram-2 Xil Capítulo 3 Determinação Estrutural de 22 217 Oliveira, DM (2012) 3.203.303.403.503.603.703.803.904.004.104.20ppm(F2) 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 4.0 4.1 4.2 djalma/gracia - g77 ppm (F1) H-5a'''''/H-5b''''' H-4'''''/H-5b''''' H-6a''/H-6b'' H-2'''/H-3''' H-3'''/H-5''' H-4''/H-6b'' H-2'''''/H-4''''' Figura 3.152: Mapa de contornos NOESY de 22 (CD3OD, 400 MHz) da região entre δ de 1H 3,20-4,20 ppm (F2) x δ 1H 3,20-4,20 ppm (F1). 3.203.303.403.503.603.703.803.904.004.104.20 0.85 0.90 0.95 1.00 1.05 1.10 1.15 1.20 djalma/gracia - g77 H-5'''/H-6''' H-4'''/H-6''' H-5''''/H-6'''' H-4''''/H-6'''' ppm(F2) ppm (F1) H-5''/H-6'''' Figura 3.153: Mapa de contornos NOESY de 22 (CD3OD, 400 MHz) da região das metilas, entre δ 1H 3,20-4,20 ppm (F2) x δ 1H 0,85-1,25 ppm (F1). 22 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Gal Ram-1 Ram-2 Xil Capítulo 3 Determinação Estrutural de 22 218 Oliveira, DM (2012) 22 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Gal Ram-1 Ram-2 Xil 1000950900850800750700650600550500450400350300 m/z 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96 R e la tiv e I n te n si ty ( % ) 9 7 4 .3 8 7 1 .2 8 4 5 .2 7 3 9 .2 6 8 6 .2 6 1 1 .3 5 6 0 .8 4 3 3 .33 4 3 .0 -ara 7 2 5 .3 Y3α − Y3β − 5 9 4 .2 -ram Y2α −. / Y2β −. Y0 −. 2 8 6 .1 - ram -ara [M - H]−. % Figura 3.154: Espectro de massas EM-IES de 22 obtido no modo negativo, com varredura de 100 a 1000 m/z. Capítulo 3 Determinação Estrutural de 23 219 Oliveira, DM (2012) Proposta de estrutura para (23) como 3-O-{[α-L-ramnopiranosil(1→6)]-O-[β-D- xilopiranosil(1→3)-O-α-L-ramnopiranosil-(1→2)]}-β-D-galactopiranosídeo de isoramnetina. 23 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH O 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH CH3 Xil Ram-1 Ram-2 Gal O composto inédito 23 foi isolado como um sólido amorfo (1,4 mg), amarelo, obtido do extrato FAMMA. Na análise de 23 por CCD revelada sob luz UV (366 nm), a cromatoplaca borrifada com reagente NP/PEG-400, apresentou uma mancha amerelo-esverdeada brilhante, indicando a presença de um flavonol com estrutura similar a da quercetina.77 Esse resultado foi coerente com os relatos sobre a obtenção de flavonoides isolados de plantas do gênero Maytenus onde figuram compostos derivados de flavonóis 3-O-glicosídeos.38, 39, 67 O espectro de absorção no UV de 23 mostrou duas bandas com picos de absorções máximos em λmax 359 e 259 nm que indicaram a presença de um flavonoide do tipo flavonol (Figura 3.155).80,170 0.00 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 220 270 320 370 λ (nm) 259 359 m A B s 420 Figura 3.155: Espectro de absorção de 23 obtido por varredura na região do UV na cela do detector com fotodiodo modelo SPD-M10A acoplado a uma bomba LC-10AD em um equipamento CLAE (Shimadzu). Capítulo 3 Determinação Estrutural de 23 220 Oliveira, DM (2012) O espectro de absorção na região do IV de 23 (Figura 3.157, p.226) apresentou uma banda larga na região de 3200-3550 cm-1 e outra mais estreita e intensa entre 1100-1000 cm-1, centrada em 1049 cm-1, que indicaram a presença de vários grupos hidroxilas. Observou-se também uma banda em 1657 cm-1 característica de grupo carbonila quelado39. Essas absorções de 23 na região do infravermelho são condizentes com a estrutura de um flavonol.117 A análise dos dados de RMN e de EM-IES revelou que a cadeia glicosídica de 23 tem a estrutura semelhante àquelas que foram encontradas nos constituintes 21 e 22. Os valores dos deslocamentos químicos referentes aos sinais de carbono hidrogenados de 23 foram detectados no mapa de contorno HSQC (Figura 3.159, p.227). No mapa de contornos HMBC (Figura 3.161, p.228) foi registrado uma única correlação entre o sinal de carbono em δ 148,29, que foi atribuído ao carbono não hidrogenado C-3’ e o sinal atribuído aos hidrogênios metoxílicos em 4,06 (s). Os valores dos δ de 13C obtidos apresentaram boa correlação com os valores correspondentes à aglicona do glicosídeo similar 3-O-β-D-apiofuranosil-(1→2)-[α-L-ramnopiranosil-(1→6)]-β-D- galactopiranosídeo de isoramnetina173 (Tabelas 3.44, p.221 e 3.45, p.223). Os deslocamentos químicos da cadeia glicosídica de 23 foram comparados com a do composto 3-O-[β-D- xilopiranosil(1→3)-O-α-L-ramnopiranosil(1→6)][α-L-ramnopiranosil-(1→2)]}-β-D-galactopira- nosídeo de canferol disponíveis na literatura.172 O espectro de RMN de 1H (Figura 3.158, p.227) apresentou sinais de dois hidrogênios aromáticos em δ 6,36 (sl, H-6) e em δ 6,58 (sl, H-8), bem como em δ 8,17 (sl, H-2’), δ 7,66 (m) e δ 7.06 (m, H-5’), sinais estes atribuídos aos hidrogênios de um flavonoide com esqueleto semelhante ao da quercetina. O sinal de hidrogênios de um grupo metoxila em δ 4,06 (s, OCH3) indicou que o composto 23 era portanto, um derivado da quercetina, a metilquercetina. A posição do grupo metoxila, localizada em C-3’, foi deduzida a partir da correlação observada no mapa de contornos HMBC (Figura 3.161, p.228). A ocorrência do grupo metoxila em C-3’ apresenta coerência biogenética de um produto natural e minimiza a possibilidade de uma reação de metilação acidental durante o processo fitoquímico, porque uma reação desse gênero, provavelmente envolveria os grupos hidroxilas com hidrogênios mais ácidos e lábeis. Posto que, uma reação de metilação feita considerando o glicosídeo 23 como nucleófilo, preferencialmente, ocorreria via substituição de hidrogênios hidroxílicos em C-4’ e C-7. As Tabelas 3.44 e 3.45 (p.221 e p.223) mostram a atribuição dos deslocamentos químicos de 23, na Tabela 3.45 também constam as principais correlações registradas nos mapas de contornos dos espectros COSY. O espectro de RMN de 1H apresentou dois dupletos em δ 0,92 (d, Capítulo 3 Determinação Estrutural de 23 221 Oliveira, DM (2012) J = 6,0 Hz) e 1,22 (d, J = 6,2 Hz) que foram atribuídos aos hidrogênios de dois grupos ramnopiranosilas (H-6’’’ e H-6’’’’).172 Mostrou também os sinais de dois hidrogênios anoméricos em δ 5,81 (d, J = 7,6 Hz, H-1’’) e δ 5,17 (sl, H-1’’’), no entanto, nesse espectro, não foram observados os sinais referentes aos hidrogênios H-1’’’’ e H-1’’’’’, esperados para ocorrem na região entre δ 4,5-4,7 ppm, provavelmente, devido a supressão do sinal de H-O da água. Todavia, as correlações referentes a esses sinais foram registradas em δ de 1H 4,56 (H-1’’’’) e 4,53 (H- 1’’’’’) nos mapas de contornos COSY(Figura 3.160, p.228) e HSQC (Figura 3.159, p.227). Possivelmente, o desaparecimento desses sinais do espectro tenha ocorrido concomitantemente à supressão do sinal de hidrogênios da água (δ em torno de 4,87), que normalmente ocorre como impureza do solvente CD3OD, durante a aquisição do espectro. 23 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH O 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH CH3 Xil Ram-1 Ram-2 Gal Tabela 3.44: Atribuição dos valores de δ de 13C de 23 (CD3OD, 100 MHz) e a comparação entre os valores encontrados na literatura (CD3OD, 100/125 MHz) 172-173 C-n 23 Lit.172-173 C-n 23 Lit 2 ND 158,9 (2-1)Ram 3 ND 135,5 1’’’ 102,07 102,25 4 ND 179,5 2’’’ 71,29 72,13 5 ND 163,0 3’’’ 82,71 82,59 6 99,85 99,8 4’’’ 72,00 73,02 7 ND 161,1 5’’’ 69,19 69,79 8 94,78 94,9 6’’’ 17,98 17,52 9 ND 158,5 10 ND 105,5 (6-1)Ram 1' ND 123,0 1”” 101,34 101,96 2' 114,53 114,6 2”” 71,73 72,16 3' 148,29* 148,4 3”” 71,90 72,35 4' ND 150,9 4”” 73,14 73,94 5' 116,18 116,0 5”” 69,48 69,79 6' 122,83 123,8 6”” 18,74 18,01 7’ (OCH3) 57,03 57,0 Cadeia glicosídica (Lit.)172 (3-1)Xil 3-Gal 23 Lit. 1””’ 106,64 106,66 1" 100,30 101,35 2””’ 75,04 75,42 2" 76,71 77,25 3””’ 77,23 77,71 3" 74,82 75,74 4””’ 70,68 71,20 4" 69,73 70,95 5””’ 66,80 67,07 5" 74,81 75,37 6" 66,55 67,18 Dados: Mapas de contornos HSQC e HMBC (*), Figuras 3.159, p.227 e 3.161, p. 228. Capítulo 3 Determinação Estrutural de 23 222 Oliveira, DM (2012) No mapa de contornos do HSQC, os quatro sinais de hidrogênios anoméricos mostraram correlação com os respectivos sinais de carbonos em δ 100,30 (C-1’’), δ 102,07 (C-1’’’), 101,34 (C-1’’’’) e 106,64 (C-1’’’’’) (Figura 3.156). Os demais sinais de hidrogênios sacarídeos foram registrados na região de δ 3,26-4,12 do espectro. 23 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH O 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH CH3 Xil Ram-1 Ram-2 Gal 4.504.755.005.255.505.75 100.0 101.0 102.0 103.0 104.0 105.0 106.0 107.0 C-1''/H-1'' (Gal) C-1'''/H-1''' (Ram-1) C-1''''/H-1'''' (Ram-2) C-1'''"'/H-1'''" (Xil) 108.0 4.006.00ppm (F2) Sinais suprimidos ppm (F1) Figura 3.156: Mapa de contornos HSQC de 23 (CD3OD, 400 MHz) - Região relativa aos sinais de carbonos e hidrogênios anoméricos. Capítulo 3 Determinação Estrutural de 23 223 Oliveira, DM (2012) 23 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH O 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH CH3 Xil Ram-1 Ram-2 Gal Tabela 3.45: Atribuição dos valores de δ de 1H de 23 (CD3OD, 400 MHz) e a comparação com os valores encontrados na literatura referentes à genina173 e cadeia glicosídica (CD3OD, 400/500 MHz) 172 δ de 1H (multiplicidade, J, Hz) 2D H-n 23 Literatura COSY Genina173 H-6 6,36 (sl) 6,22 (d, 1,5 ) H-8 H-8 6,58 (sl) 6,43 (d, 1, ) H-6 H-2' 8,17 (sl) 8,00 (d, 1,5 H-5', H-6' H-5' 7,06 (m) 6,93 (d, 7,5 ) H-2', H-6' H-6' 7,66 (m) 7,61 (dd, 7,5, 1,5 ) H-2', H-5' OCH3 4,06 (s) 4,00 (s) 3-Gal Cadeia Glicosídica172 H-1” 5,81 (d, 7,6) 5,57 (d, 7,8) H-2'' H-2” 3,97 (m) 3,93 (dd, 9,4, 7,8) H-1'' H-3” 3,83 (m) 3,71 (dd, 9,4, 3,0) H-4'' H-4” 3,81 (m) 3,76 (dd, 3,6 1,0) H-2'' H-5” 3,77 (m) 3,66 (m) H-6a'' H-6a" 3,49 (m) 3,50 (t, 12,2) H-4'' H-6b” 3,77 (m) 3,68 (m) H-6a'' (2-1)Ram H-1’’’ 5,17 (sl) 5,22 (d, 1,4) H-2''', H-2'' H-2’’’ 4,11 (m) 3,80 (dd, 3,3, 1,5) H-1''', H-3''' H-3’’’ 3,81 (m) 4,00 (m) H-1''', H-2''' H-4’’’ 3,51 (m) 3,35 (t, 9,8) H-3''', H-5''' H-5’’’ 4,04 (m) 4,07 (dd, 9,8, 6,2) H-4''' H-6’’’ 0,92 (d, 6,0) 0,99 (d, 6,3) H-5''' (6-1)Ram 1”” 4,56 (m) 4,54 (d, 2,0) 2”” 3,57 (m) 3,72 (m) 3”” 3,51 (m) 3,55 (dd, 9,4, 3,0) 4”” 3,27 (m)** 3,42 (t, 9,4) H-3'''' 5”” 3,55 (m) 3,55 (dd, 10,5, 6,7) H-1'''' 6”” 1,22 (d, 6,2) 1,16 (d, 6,7) H-5'''' (3-1)Xil 1””’ 4,53 (m) 4,32 (d, 7,3) H-2''''' 2””’ 3,29 (m)* 3,22 (m)* H-2''''', H-3''''' 3””’ 3,31 (m)* 3,30 (t, 8,6) H-4'''' 4””’ 3,48 (m) 3,48 (dd, 6,7, 2,7) H-5b''''' 5a””’ 3,28 (m) 3,00 (t, 12,2) H-5b''''' 5b””’ 3,92 (m) 3,77 (dd, 12,2, 5,4) H-4''''' (*) sinais sobrepostos ao do solvente no (metanol-d4) no espectro de RMN de 1H; sl: singleto largo; dl: dupleto largo; (**) sinal encoberto parcialmente pelo do solvente. Capítulo 3 Determinação Estrutural de 23 224 Oliveira, DM (2012) O espectro de massas EM-IES, obtido no modo negativo com varredura de 100-1500 Da (Figura 3.162, p.229), levou a identificação dos fragmentos em m/z 902 (100%) e em m/z 901, atribuídos a [M]-• e [M-H]-, respectivamente, sendo foi possível propor a massa de 902 Da para a molécula 23 (C39H50O24). No espectro EM2-IES, obtido com o aprisionamento e fragmentação do íon em m/z 902,foram identificados os íons-fragmentos em m/z 770 e 769 resultantes da saída de um resíduo de pentose ([M-132]-• e [M-H-132]-). Os íons em m/z 770 e 769 foram atribuídos aos fragmentos Y3α-• e Y3α-, respectivamente. Com base nos dados de RMN podemos afirmar que o resíduo de pentose perdido correspondeu a um grupo xilopiranosila. A fragmentação do íon em m/z 770 (EM3-IES), resultante da perda de uma unidade ramnopiranosila ([M-H-132-146]-), originou o íon-fragmento em m/z 623 (Y2β- ou Y2α-). O fragmento em m/z 476 foi atribuído ao íon-fragmento de um monoglicosídeo que se formou via o íon precursor em m/z 623 após a perda consecutiva de dois resíduos de ramnose [M-H-132-146-146]-. Então, a formação do íon mais abundante em m/z 315, atribuído a Y0- ([genina-H]-), ocorreu após a eliminação consecutiva dos resíduos de uma xilose, duas ramnoses e uma hexose (galactose, com base nos dados de RMN), o que também foi observado às cadeias glicosídicas dos constituintes 21 e 22. A diferença entre as massas do íon [M-H]- em m/z 901 e da aglicona em m/z 315 (Yo-) foi de 586 Da (B4), valor esse correspondente à massa molar da cadeia glicosídica de 23. A Tabela 3.46 (p.225) mostra as atribuições dos íons observados, a proposta de fragmentação e as perdas neutras calculadas para os espectros EM-IES no modo negativo (Figura 3.162, p.229). O espectro EM3-IES mostrou ainda que o íon em m/z 315, correspondente à molécula da aglicona desprotonada [Y0-H]-, atribuído como o íon precursor dos íons-fragmentos seguintes em m/z 300 e em m/z 272, que foram atribuídos às perdas dos radicais neutros CH3 (15 Da) e CO (28 Da). Foi observado que o padrão de fragmentação apresentado pela aglicona de 23 era coincidente com os dados de espectroscopia de massas relatados para os glicosídeos derivados da isoramnetina em Maytenus aquifolium e M. ilicifolia.80 À luz da análise dos dados espectroscópicos e cromatográficos disponíveis está se propondo um novo flavonoide com a estrutura do 3-O-{[α-L-ramnopiranosil(1→6)][β-D- xilopiranosil(1→3)-α-L-ramnopiranosil-(1→2)]}-β-D-galactopiranosídeo de isoramnetina para o composto 23. Ressaltamos que, para a confirmação inequívoca da estrutura acima proposta, os experimentos de RMN deverão ser repetidos para viabilizar a publicação em um periódico futuramente. Capítulo 3 Determinação Estrutural de 23 225 Oliveira, DM (2012) Tabela 3.46: Fragmentação proposta para o tetraglicosídeo 23 e a atribuição dos íons observados nos EM-IES, modo negativo (Figura 3.162, p.229) Perdas Atribuição m/z (Da) Íon PN 902 [M]-• 901 1 [M-H]- 769 132 Y3α -• Xil 623 132+146 Y2β − Xil+Ram 475 132+146 +146 +2 [Y1α-H2] − Xil+2Ram+H2 315 586 Yo − Xil+2Ram+Gal PN: perdas neutras em relação a [M-H]-, M: íon molecular. Tabela 3.47: Atribuição dos íons-fragmentos obtidos na detecção IES-EM de 23 no modo positivo (Figura 3.163, p.230) O OOH OH OH O O O OH O OH O CH3 OH O OH CH3 OH OH OH O O OH OH OH O CH3 Xil Gal Ram 1 Ram 2 B1β + B3α + B2α + B2β + B3β + B1α + Na + B4 + O OH OH OH O O OH O OH O CH3 OH O OH CH3 OH OH OH O [Y0− H] + /Y0 + EM-IES+ de 23 Atribuição m/z PN (Da) Íon 925 [M+Na]+ 779 146 Y3β + 647 146+132 Y2α +, Y2β+ 609 316 (aglicona) B4 + 477 316+132 B3α + 463 316+146 B3β + 331 316+132+146 B2β + 301 316+146+162 B2α + PN: perdas neutras em relação a [M+Na]+ , M: íon molecular. O O OHO OH O CH3 OH O OH CH3 OH OH OH O Y0 − O O- OH OH O O O CH3 Y3α − Y3β − Y2α − = Y2β − B4 − O OH OH OH Capítulo 3 Determinação Estrutural de 23 226 Oliveira, DM (2012) Uma fração contendo 23 foi submetida à EM com detecção no modo positivo e varredura entre 100-1000 Da. No EM-IES obtido no modo positivo foi observado o íon quasi-molecular ([M+Na]+) de 23 em m/z 925. A fragmentação desse íon quasi-molecular permitiu a detecção de íons Yi+ e Bi+ e foram atribuídas as perdas neutras que se relacionaram com resíduos de açúcar. A detecção dos íons-fragmentos Bi+ (i = 1-3) observados no EM2-IES (Figura 3.163, p.230), no modo positivo, forneceram informações sobre a cadeia glicosídica que confirmaram as atribuições feitas anteriormente para os EM-IES no modo negativo. O fragmento observado em m/z 609 (100%), obtido a partir do íon molecular, foi atribuído à cadeia glicosídica (B4+) após a saída do fragmento neutro equivalente à genina de 23. As fragmentações de B4+ geraram os íons em m/z 477 e 463, atribuídos a B3α+ e B3β+, na perda de um resíduo de xilose e outro de ramnose, respectivamente. Em seguida, as subsequentes fragmentações de B3α+ e B3β+ produziram os íons em m/z 331.(B2α+) e em m/z 301 (B2β+) após as perdas consecutivas da segunda ramnose e de uma galactose. A Tabela 3.47 (p.225) mostra as atribuições EM2-IES de 23 no modo positivo. A pesquisa bibliográfica com base nos dados de RMN mostrou que o composto 23 é um flavonoide glicosídico inédito. 23 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH O 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH CH3 Xil Ram-1 Ram-2 Gal 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 65 70 75 80 85 90 95 100 810 981 113 0135 6 160 5165 7298 8 293 5 T ( %) Número de onda (cm-1) 333 0 1049 Figura 3.157: Espectro de absorção de 23 na região do infravermelho. Capítulo 3 Determinação Estrutural de 23 227 Oliveira, DM (2012) 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4 3.2 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 8.4 8.2 8.0 7.8 7.6 7.4 7.2 7.0 6.8 6.6 6.4 6.2 6.0 5.8 5.6 5.4 5.2 5.0 4.8 4.6 4.4 7.7 7.7 7.6 1.3 1.2 1.0 0.9 5.81 So lve nteδ δ CB A δ Traços de DMSO-D6 δ O- CH 3 So lve nte δ H-6'''' H-6''' Sinal (ppm) Integral 4.035-3.998 1.1 4.095-4.036 2.5 4.146-4.096 0.8 5.203-5.140 1.1 5.831-5.778 1.1 6.397-6.298 0.9 6.624-6.546 0.7 7.109-7.044 1.3 7.679-7.636 1.2 8.185-8.159 1.1 δ δ H-6' H-5' H-8 H-6 H-1'' Expansão C Expansão A δ Região onde os sinais dos hidrogênios anoméricos H-1'''' e H-1''''' foram suprimidos juntamente com os da água H- 2' Expansão B Sinal (ppm) Integral 0.927-0.888 3.0 1.241-1.202 3.1 3.289-3.164 4.5 3.446-3.358 1.6 3.60-3.450 8.0 3.661-3.612 0.9 3.702-3.664 1.3 3.743-3.697 1.1 3.852-3.749 5.5 4.000-3.861 4.5 H-1''' H-6' H-6''''H-6''' H-1'' Figura 3.158: Espectro de RMN de 1H de 23 (CD3OD, 400 MHz). 6'''' (CH3) -O-CH3 6''' (CH3) 2'' (CH) 1'''' (CH) 1''''' (CH) 1''' (CH) 1'' (CH) 8 (CH) 6 (CH) 2' (CH) 5' (CH) 6' (CH) 1.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.007.508.00 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 A 6''(CH2) graxa solvente solvente Expansão A 6b'' 6a'' 3.504.00 67.5 70.0 72.5 75.0 77.5 80.0 82.5 3.203.303.403.603.703.804.10 3.90 ppm (F1) 5a''''' 5b''''' 5''''5''' 4'' 4''''' 2''' 2'''' 3'''' 4''''3'' 5'' 2'' 4''' 3''''' 3''' 2''''' ppm (F2) ppm (F2) ppm (F1) Figura 3.159: Mapa de contornos HSQC de 23 (CD3OD, 400 MHz). 23 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH O 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH CH3 Xil Ram-1 Ram-2 Gal Capítulo 3 Determinação Estrutural de 23 228 Oliveira, DM (2012) 6.6 6.5 6.4 6.3 6.25 6.50 Expansão A ppm (F1) ppm (F2) 4.00 3.75 3.50 3.25 3.25 3.50 3.75 4.00 4.25 1.02.03.04.05.06.07.08.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 H-6'/H-5' H-2'/H-6' H-6'/H-2'' H-1''/H-2'' H-1'''/H-2''' B H-6/H-8 δH A Expansão B H-5b'''''/H-5a''''' H-4'''''/H-5a''''' H-6b''/H-6a'' H-2'''/H-3''' H-1'''''/H-2''''' H-5'''/H-6''' H-5''''/H-6'''' H-2''/H-4'' H-3''''/H-4'''' H-3'''/H-4''' H-3'''''/H-5b''''' ppm (F1) ppm (F2) ppm (F1) ppm (F2) Figura 3.160: Mapa de contornos COSY de 23 (CD3OD, 400 MHz). ppm (F1) H-7'/C-3' 137.5 140.0 142.5 145.0 147.5 150.0 152.5 155.0 157.5 160.0 3.853.903.954.004.054.104.154.204.25ppm (F1) Figura 3.161: Mapa de contornos HMBC de 23 (CD3OD, 400 MHz). 23 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH O 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH CH3 Xil Ram-1 Ram-2 Gal Capítulo 3 Determinação Estrutural de 23 229 Oliveira, DM (2012) O O OHO OH O CH3 OH O OH CH3 OH OH OH O Y0 −/Y0 − O OH OH OH O O O CH3 Y3α − Y3β − Y2α − = Y2β − B4 − O OH OH OH . 90 2. 3 EM-IES 31 5. 0 35 6. 9 42 3. 9 63 6. 0 7 70 .1 -132 Re lat ive In te ns ity (% ) 100 0 0 100 90 2. 3 EM2-IES Re lat ive In te ns ity (% ) [M]−. Y0 − 3 1 5 .0 Y3α −. Y3α −-146 27 2. 6 29 9. 1 37 0. 0 42 4. 0 47 5. 9 50 2. 8 60 5. 3 62 3. 1 74 3. 3 77 0. 7 -(162 + 146 + 146) EM3-IES . Y2α − 13001100900700500300 m/z Re lat ive In te ns ity (% ) 100 0 [Y1α− H2] −. [M] [M] −. − Y3α − 90 1. 2 % % % Figura 3.162: Espectros EM-IES de 23 obtidos no modo negativo. Capítulo 3 Determinação Estrutural de 23 230 Oliveira, DM (2012) I Expansão I % O OOH OH OH O O O OH O OH O CH3 OH O OH CH3 OH OH OH O O OH OH OH O CH3 Xil Gal Ram 1 Ram 2 B1β + B3α + B2α + B2β + B3β + B1α + Na + B4 + O OH OH OH O O OH O OH O CH3 OH O OH CH3 OH OH OH O [Y0− H] + /Y0 + [M + Na]+ 300 390 480 570 660 750 840 930 0 50 100 3 3 1 3 8 9 4 6 3 609 6 4 8 7 1 7 7 7 9 8 2 7 925 % 300 330 360 390 420 450 480 0 1 2 301 331 359 389 413 464 477 485 771 791 811 831 851 871 891 911 931 0 5 10 779 795 815 827 869 890 909 925 % II Expansão II B2β + B2α + B3β + B4 + B3α + [M-ram+Na]+ [M-H2O+Na] + [M-ram-ara+Na]+ m/z m/z m/z Figura 3.163: Espectro EM2-IES obtido no modo positivo de 23 mostrando os fragmentos do íon quasi- molecular [M+Na]+ em m/z 925. Capítulo 4 Dados Físico-químicos 231 Oliveira, DM (2012) NEPLAM – DQ-ICEx - UFMG 4 DADOS FÍSICO-QUÍMICOS DOS COMPOSTOS Oliveira, DM 2012 Capítulo 4 Dados Físico-químicos 232 Oliveira, DM (2012) DADOS FÍSICO-QUÍMICOS DOS COMPOSTOS Mistura de Hidrocarbonetos (1) ⋅ Aspecto: Escamas brancas brilhantes ⋅ Ponto de fusão: 59-67 oC (hexano) ⋅ Solubilidade: Hexano e CHCl3 ⋅ Fórmula molecular: HC’s de C-30 a C-35 (maioria linear) ⋅ Massa molar: 422-492 g mol-1 (maioria) ⋅ IV (cm-1): 2750, 1450, 1360 e 710 ⋅ CGAR: Coluna SE-30, 30 m, 0,25 mm DI, 0,25 µm (capilar) de metilpolisiloxano; Temperaturas: rampa de 200 a 320 ºC, razão de 5 ºC/min, isotérmica por 1 min a 320 ºC. ⋅ TR, minutos (HC lineares): 14,25(C-30), 15,45(C-31), 16,67(C-32), 17,99(C-33), 19,07(C- 34), 20,22(C-35). Esqualeno (2) 25 23 3 4 519 7 8 915 11 12 13 14 10 1617 18 6 20 21 22 2 1 24 30 29 28 27 26 2 ⋅ Aspecto: Óleo de cor verde-amarelada ⋅ Solubilidade: Hexano, CHCl3, AcOEt ⋅ Fórmula molecular: C30H50 ⋅ Massa molar: 410 g mol-1 ⋅ IV (cm-1): 3300, 2760, 1425, 1365, 815 ⋅ CGAR: Coluna SE-30, capilar, 30 m x 0,25 mm de diâmetro interno, filme de 0,25 nm de metilpolisiloxano, Alltech, USA. Temperaturas: coluna: Inicial a 200 ºC, final até 320 ºC por 1 min, a uma taxa de 5 ºC/min. Detector e injetor operaram a 320 ºC. ⋅ TR, minutos: 11,69 ⋅ RMN de 1H (400 MHz; CDCl3): Tabela 3.2, p.65 ⋅ RMN de 13C (100 MHz; CDCl3): Tabela 3.2, p.65 ⋅ EM, m/z (%): 409 (traços), 341 (0,3), 273 (0,1), 137 (5), 121 (7), 81 (48), 69 (100%). CH3 CH3n n = 26 a 31 Capítulo 4 Dados Físico-químicos 233 Oliveira, DM (2012) 1,4-Trans-poliisopreno (3) H CH3 n1 2 3 4 5 (α) (β) (δ) (ε) (γ) (3) ⋅ Aspecto: Goma branco-amarelada ⋅ Endotérmicas de fusão (DSC): 41,3 (β), 51,9 (amorfa) e 60,2 °C (α) (CHCl3) ⋅ Solubilidade: CHCl3 ⋅ Transição vítrea (Tg) -69,5 °C (203,67 K) ⋅ Fórmula molecular: (C5H8)n ⋅ Massa molar média (Mn): 3,05 x 104 ⋅ Massa molar ponderal (MW): 4,48 x 104 ⋅ IV (cm-1): 2960, 2900, 2850, 1665, 1430, 1215, 1110, 1385, 880, 800 ⋅ RMN de 1H (400 MHz; CDCl3): Tabela 3.4, p.72 ⋅ RMN de 13C (100 MHz; CDCl3): Tabela 3.4, p.72 Álcool graxo (4) ⋅ Aspecto: Cera amarela ⋅ Solubilidade: Hexano e CHCl3 ⋅ Fórmulas moleculares estimadas: C19H40 e C18H38O ⋅ Massa molar: 268 e 270 g mol-1 ⋅ IV (cm-1): 3450, 2920, 2870, 1470, 1380, 1090, 970, 800 ⋅ RMN de 1H (400 MHz; CDCl3): Tabela 3.6, p.80 ⋅ RMN de 13C (100 MHz; CDCl3): Tabela 3.5, p.79 ⋅ ⋅ OH α βn ω1 γ δ ω3 ω2 ω4 4 Capítulo 4 Dados Físico-químicos 234 Oliveira, DM (2012) Friedelina (5) 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 O 27 26 25 30 H 5 ⋅ Aspecto: Sólido branco cristalino (forma de agulhas) ⋅ Ponto de fusão: 259,7-262,1 °C ⋅ Solubilidade: CHCl3 e DCM. ⋅ Fórmula molecular: C30H50O ⋅ Massa molar: 426 g mol-1 ⋅ IV (cm-1): 2925, 2860, 1710, 1456, 1388, 1360, 1175, 1004, 978, 884 ⋅ RMN de 1H (400 MHz; CDCl3): Figura 3.29, p.85 ⋅ RMN de 13C (100 MHz; CDCl3): Tabela 3.7, p.84 ⋅ EM, m/z (%): 69(100); 95(86); 123(70); 109(59); 179(21); 207(26); 218(21); 246(19); 273(15); 302(5); 412(4); 426(9). β-Friedelinol (6) 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 OH 27 26 25 30 H 6 ⋅ Aspecto: Sólido branco cristalino ⋅ Ponto de fusão: 286,7-289,3 ºC (recrist. em acetona) ⋅ Solubilidade: Levemente em CHCl3, AcOEt e tolueno ⋅ Fórmula molecular: C30H52O ⋅ Massa molar: 428 g mol-1 ⋅ IV (cm-1): 3622, 3474, 2942, 2866, 1452, 1386, e 1362, 1176 e 1000 ⋅ RMN de 1H (400 MHz; CDCl3): Tabela 3.11, p.96 ⋅ RMN de 13C (100 MHz; CDCl3): Tabela 3.11, p.96 ⋅ EM (IE) , m/z (%): 69(100); 95(59); 123(41); 107(21); 163(16); 207(12); 233(9); 218(14); 255(3); 273(10); 302(6); 411(3); 427(6). ⋅ Capítulo 4 Dados Físico-químicos 235 Oliveira, DM (2012) α-Friedelinol (7) 10 1 3 9 6 11 14 18 20 23 28 29 24 OH 27 26 25 30 H 7 ⋅ Aspecto: Sólido branco cristalino ⋅ Ponto de fusão: 295,9-300 ºC (clorofórmio) ⋅ Solubilidade: AcOEt e fracamente em CHCl3 ⋅ Fórmula molecular: C30H52O ⋅ Massa molar: 428 g mol-1 ⋅ IV (cm-1): 3488, 3400, 2920, 2850, 1470, 1458, 1440, 1387, 1365, 1180, 1035,1005, 820 (fraca). ⋅ RMN de 1H (400 MHz; CDCl3): Tabela 3.12, p.101 ⋅ RMN de 13C (100 MHz; CDCl3): Tabela 3.12, p.101 ⋅ EM (IE), m/z (%): 69(100); 109(10); 107(16); 149(16); 207(12); 218(14); 255(8); 302(6); 413(2); 409(2); 428(2) 3β-Lup-20(29)-en-3-ol (lupeol, 8) 28 10 5 1 3 12 14 17 23 26 19 22 H 29 30 OH H a H b H 8 ⋅ Aspecto: Sólido branco amorfo ⋅ Ponto de fusão: 213,8 - 216,7 ºC (recrist. c/ etanol) ⋅ Solubilidade: CHCl3 ⋅ Fórmula molecular: C30H50O ⋅ Massa molar: 426 g mol-1 ⋅ IV (cm-1): 3550, 3400, 3295, 2920, 2850, 1640 (fraca) 1470, 1455, 1440, 1380, 1360, 1140, 1110, 1040, 985, 880 ⋅ RMN de 1H (400 MHz; CDCl3): Tabela 3.14, p.107 ⋅ RMN de 13C (100 MHz; CDCl3): Tabela 3.14, p.107 ⋅ EM, m/z (%): 69(100); 55(72); 41(64); 135(52); 133(34); 197(28); 203(26); 218(26); 121(44); 189(40); 409(1); 408(1); 426(1) Capítulo 4 Dados Físico-químicos 236 Oliveira, DM (2012) Acetato de 3β-lup-20(29)-en-3-ila (9) 28 10 5 1 3 12 14 17 23 26 27 19 22 H 29 30 O H a H b H 1' 2' O 9 ⋅ Aspecto: Sólido branco amorfo ⋅ Ponto de fusão: 198,4 a 199,6 °C (clorofórmio-metanol) ⋅ Solubilidade: Hexano, CHCl3 ⋅ Fórmula molecular: C32H52O2 ⋅ Massa molar: 468 g mol-1 ⋅ IV (cm-1): 2920, 2850, 1735, 1640 (fraca), 1455, 1380, 1370, 1250, 1150, 1010, 1030, 980, 880 ⋅ RMN de 1H (400 MHz; CDCl3): Tabela 3.16, p.114 ⋅ RMN de 13C (100 MHz; CDCl3): Tabela 3.16, p.114 ⋅ EM, m/z (%): 73(100), 109(55), 133(34), 197(28), 203(23), 218(15), 191(44), 189(44), 409(1), 408(2), 426(4), 468(3) Mistura de 3β−esteariloxi-olean-12-eno (10) e 3β-esteariloxi-urs-12-eno (11) 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 16 17 18 22 212019 29 28 26 27 25 O 2423 1'5' 8' 9' 15' 16' 17' O 18' R R1 30 H H (10) - R = H, R1 = CH3 (11) - R = CH3, R1 = H ⋅ Aspecto: Graxa branca, pastosa ⋅ Solubilidade: CHCl3 ⋅ Fórmulas moleculares: C48H86O2 (10 ou 11) ⋅ Massas molares: 692 g mol-1 (10 ou 11) ⋅ IV (cm-1): 2900, 2840, 1732, 1470, 1380, 1255 (fraca), 1175, 1155 ⋅ RMN de 1H (400 MHz; CDCl3): Figura 3.49, p.120 ⋅ RMN de 13C (100 MHz; CDCl3): Tabela 3.17, p.118 ⋅ Capítulo 4 Dados Físico-químicos 237 Oliveira, DM (2012) 3β-Esteariloxi-urs-12-eno (11) 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 16 17 18 22 21 20 19 29 28 26 27 25 O 2423 1'5' 8' 9' 15' 16' 17' O 18' H H 30 11 ⋅ Aspecto: Graxa branca ⋅ Solubilidade: CHCl3 ⋅ Fórmula molecular: C48H86O2 ⋅ Massa molar: 692 g mol-1 ⋅ IV (cm-1): 2900, 2840, 1732, 1470, 1380, 1255 (fraca), 1175(fraca) ⋅ RMN de 1H (400 MHz; CDCl3): Tabela 3.19, p.124 ⋅ RMN de 13C (100 MHz; CDCl3): Tabela 3.19, p.124 3β-Hidroxi-olean-12-eno, β-amirina (12) 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 16 17 18 22 212019 29 28 26 27 25 2423 H H 30 OH 12 ⋅ Aspecto: Sólido branco ⋅ Ponto de fusão: 189,1-194,6 oC (acetona) ⋅ Solubilidade: CHCl3 ⋅ Fórmula molecular: C30H50O ⋅ Massa molar: 426 g mol-1 ⋅ IV (cm-1): 3440, 2930, 2850, 1455, 1380, 1100, 1000 ⋅ RMN de 1H (400 MHz; CDCl3): Figura 3.55, p.129 ⋅ RMN de 13C (100 MHz; CDCl3): Tabela 3.20, p.128 ⋅ EM (EI), m/z (%): 218 (100), 203 (40), 189 (21), 190 (19), 219 (17), ⋅ Capítulo 4 Dados Físico-químicos 238 Oliveira, DM (2012) 28-Hidroxi-3-oxo-friedelano (canofilol, 13) 10 5 1 4 2 3 8 7 9 6 13 14 12 11 17 16 18 15 21 22 2019 O 23 24 25 26 28 H 2930 27 H H OH 13 ⋅ Aspecto: Sólido branco e amorfo ⋅ Ponto de fusão: 271,6 a 275,9 oC (metanol) ⋅ Solubilidade: CHCl3 ⋅ Fórmula molecular: C30H50O2 ⋅ Massa molar: 442 g mol-1 ⋅ IV (cm-1): 3550, 3400, 3220, 2860, 2930, 1710, 1470, 1460, 1440, 1390, 1365, 1225, 1125, 1055 ⋅ RMN de 1H (400 MHz; CDCl3): Tabela 3.21, p.133 ⋅ RMN de 13C (100 MHz; CDCl3): Tabela 3.21, p.133 3β,16β-Di-hidroxifriedelano (pachysandiol B, 14). 10 5 1 4 2 3 9 8 6 7 11 12 14 13 15 16 18 17 19 20 22 21 23 28 29 24 OH OH 27 26 25 30 14 ⋅ Aspecto: Sólido branco e amorfo ⋅ Ponto de fusão: 258,3–261,3 oC (CHCl3/MeOH) ⋅ Solubilidade: CHCl3 ⋅ Fórmula molecular: C30H52O2 ⋅ Massa molar: 444 g mol-1 ⋅ IV (cm-1): 3435, 2924 2852, 1680 (fraca), 1459, 1386, 1090, 1030 ⋅ RMN de 1H (400 MHz; CDCl3): Tabela 3.24, p.148 ⋅ RMN de 13C (100 MHz; CDCl3): Tabela 3.24, p.148 ⋅ Capítulo 4 Dados Físico-químicos 239 Oliveira, DM (2012) 3β,24-Di-hidroxifriedelano (15) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 2930 OH OH 15 ⋅ Aspecto:: Sólido branco amorfo ⋅ Solubilidade: CHCl3 ⋅ Ponto de fusão: 272,3-273,3 oC ⋅ Fórmula molecular: C30H52O2 ⋅ Massa molar: 444 g mol-1 ⋅ IV (cm-1): 3230, 2940, 2870, 1470, 1450, 1380, 1036, 750 ⋅ RMN de 1H (400 MHz; CDCl3): Tabela 3.26, p.157 ⋅ RMN de 13C (100 MHz; CDCl3): Tabela 3.25, p.156 3β,24-Diacetoxifriedelano(15a) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 2930 O O O O 15a ⋅ Aspecto:: Graxa branca acinzentada ⋅ Solubilidade: hexano e CHCl3 ⋅ Fórmula molecular: C30H56O4 ⋅ Massa molar: 528 g mol-1 ⋅ IV (cm-1): Valores calculados: 2970, 1724, 1445, 1365, 1295, 1210, 1165, 1102, 920 ⋅ RMN de 1H (400 MHz; CDCl3): Tabela 3.26, p.157 ⋅ RMN de 13C (100 MHz; CDCl3): Tabela 3.25, p.156 ⋅ Capítulo 4 Dados Físico-químicos 240 Oliveira, DM (2012) 3β-Sitosterol (16) 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 1617 23 22 20 29 2724 25 21 28 H 26 18 H OH 19 16 ⋅ Aspecto: Sólido branco amorfo ⋅ Ponto de fusão: 132,3-134,3 oC (CHCl3) ⋅ Solubilidade: CHCl3 ⋅ Fórmula molecular: C29H48O ⋅ Massa molar: 412 g mol-1 ⋅ IV (cm-1): 3350, 2960,2840, 1470, 1380, 1050 ⋅ RMN de 1H (400 MHz; CDCl3): Figura 3.85, p.163 ⋅ RMN de 13C (100 MHz; CDCl3): Tabela 3.27, p.162 ⋅ EM, m/z (%): 55(100); 145(23); 133(23); 159(22); 135(21); 197(20); 312(15); 195(14); 143(11); 255(11); 134(5); 390(2); 309(2); 357(2); 399(1); 396 (1); 414(1). Ácido graxo eicosanóico (17) 1 10 OH O 20 17 ⋅ Aspecto: Sólido branco céreo ⋅ Ponto de fusão: 70 - 74 oC ⋅ Solubilidade: CHCl3 ⋅ Fórmula molecular: C20H40O2 ⋅ Massa molar: 312 g mol-1 ⋅ IV (cm-1): Valores calculados: 3060, 2940, 2870, 1690, 1460, 1420, 930 ⋅ RMN de 1H (400 MHz; CDCl3): Figura 3.88, p.167 ⋅ RMN de 13C (100 MHz; CDCl3): Tabela 3.28, p.166 ⋅ Capítulo 4 Dados Físico-químicos 241 Oliveira, DM (2012) Mistura de monossacarídeos (18) O H HH OH H OH H OH OH OH β-D-Galactopiranose (galactose, S7) α-L-Arabinopiranose (arabinose, S4) β-D-Glicopiranose (glicose, S8) O H OHH H OH OH H H OH OH O H HH H OH OH H OH OH OH β-D-Manopiranose (manose, S6) O H OH H OH H OH H OH β-D-Ribofuranose (ribose, S3) O H HCH3 OH H H OH OH OH H α-L-Ramnopiranose (ramnose, S1) O H HH H OH OH H OH OH H β-D-Xilopiranose (xilose, S5) O H HH OH H OH H OH OH H ⋅ Aspecto: Resina marrom-escura (extrato metanólico de folhas) ⋅ Solubilidade: Metanol-água (1:1), Moderadamente em EtOH ⋅ Fórmula molecular: C6H12O6 (Hexoses), C6H12O5 (ramnose), C6H10O5 (pentoses) ⋅ Massas moleculares: 180, 164 e 150 g mol-1, respectivamente (antes da derivatização). ⋅ CGAR dos acetatos de alditóis: Coluna capilar BP10 (cianopropil fenil dimetil siloxano 14%, 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm), divisão de fluxo de 1:80 (split), pressão de 15 psi (H2) e temperatura programada inicial de 200 oC, seguindo a 5 oC/min até a temperatura final de 250 oC em 10 minutos em um CG Varian CP-3800. ⋅ TR, (minutos): Ramnose (2,69), ribose (2,90), arabinose (2,98), xilose (3,40), manose (5,49), galactose (5,90) e glicose (6,01) ⋅ EM (IE), m/z (%): Acetatos de alditóis de hexoses: 115 (100), 139(60), 127(45), 187(45), 289(30), 259(14), 361(3), 375(3), 434(1); ramnose: 115 (100), 157 (55), 184 (25), 142 (25), 213 (5), 230 (4), 273 (3); pentoses: 115 (100), 103 (60), 85 (60), 145 (53), 127(45), 187 (32), 217(32), 289 (5). Galactitol (19) 1 2 3 4 5 6 OH OH OH OH OH OH 19 ⋅ Aspecto: Sólido branco cristalino ⋅ Ponto de fusão: 185,8-188,1 oC (metanol) ⋅ Solubilidade: Moderadamente em metanol e etanol. Solúvel em água. ⋅ Fórmula molecular: C6H14O6 ⋅ Massa molar: 182 gmol-1 ⋅ CGAR do acetato de alditol: Coluna capilar BP10 (cianopropil fenil dimetil siloxano 14%, 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm), divisão de fluxo de 1:80 (split), pressão de 12 psi (H2) e temperatura programada inicial de 200 oC, seguindo a 5 oC/min até a temperatura final de 250 oC em 10 minutos em um CG Varian CP-3800. (Tr = 6,2 minutos). ⋅ IV (cm-1): 3420-3200, 1102, 1077, 1046, 1028 ⋅ RMN de 1H (400 MHz; CDCl3): Tabela 3.31, p.175 ⋅ RMN de 13C (100 MHz; CDCl3): Tabela 3.30, p.175 Capítulo 4 Dados Físico-químicos 242 Oliveira, DM (2012) Hexa-acetato de galactitol (19a) 1 2 3 4 5 6 O O O O O O 1'' 1' O 4''4' O 3'' 3' O 6" 6' O 2' O 5'' 5' O 2'' 19a ⋅ Aspecto: Sólido branco acizentado ⋅ Ponto de fusão: 168,0-171,5 oC (AcOEt) ⋅ Solubilidade: CHCl3 ⋅ Fórmula molecular: C18H26O12 ⋅ Massa molar: 434 ⋅ CGAR: Condições: Idem 19 (Tr = 6,24 minutos) ⋅ IV (cm-1): 3459, 2969 e 2955 (fracas), 1747, 1376, 1247, 1227, 1084, 1053, 963, 608 ⋅ RMN de 1H (200 MHz; CDCl3): Tabela 3.31, p.175 ⋅ RMN de 13C (50 MHz; CDCl3): Tabela 3.30, p.175 ⋅ EM, m/z (%): 115 (100), 85 (46), 139(52), 127(42), 187(43), 145(33), 289(25), 259(16), 361(6), 371(5), 434(2). 3-O-{[α-L-ramnopiranosila(1→6)][α-L-ramnopiranosila(1→2)]}-β-D-galactopiranosídeo de quercetina (20) Ram-120 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH OH CH3 6''' OH Ram-2 Gal ⋅ Aspecto: Pó amorfo amarelado ⋅ Ponto de fusão: Degradou a partir de 190,4 °C ⋅ Solubilidade: Metanol ⋅ Fórmula molecular: C33H40O20 ⋅ Massa molar: 756 g mol-1 ⋅ UV (λmax, nm): 355 e 256 ⋅ IV (cm-1): 3353, 2980 e 2930 (fracas), 1658, 1607, 1355, 1200, 1050, 810 ⋅ RMN de 1H (400 MHz; CDCl3): Tabela 3.35, p.191 ⋅ RMN de 13C (100 MHz; CDCl3): Tabela 3.34, p.190 ⋅ IES-EM(1) negativo, m/z (%): 755 (91) [M-H]−, 756 (20) [M]−•, 609 (5) [M-H-146], 462 (3) [M-2H-146-146] (modo scan). Capítulo 4 Dados Físico-químicos 243 Oliveira, DM (2012) 3-O-{[α-L-ramnopiranosil(1→6)]-O-[β-D-xilopiranosil(1→3)-O-α-L-ramnopiranosil(1→2)]}-β-D- galactopiranosídeo de quercetina (21) 21 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Xil Ram-1 Ram-2 Gal ⋅ Aspecto: Pó amorfo amarelado ⋅ Ponto de fusão: Degradou a partir de 201,6 °C ⋅ Solubilidade: Metanol ⋅ Fórmula molecular: C38H48O24 ⋅ Massa molar: 888 g mol-1 ⋅ UV (λmax, nm): 356 e 257 ⋅ IV (cm-1): 3360, 2988 e 2935, 1657, 1605, 1357, 1049, 812 ⋅ RMN de 1H (400 MHz; CDCl3): Tabela 3.38, p.207 ⋅ RMN de 13C (100 MHz; CDCl3): Tabela 3.37, p.206 ⋅ IES-EM(2) negativo, m/z (%): 888 (100) [M]−•, 887 (40) [M-H]−, 755 (20) [M-H-132]−, 609 (3) [M-H-132-146]-, 463 (4) [M-H-132-146-146]-, 301 (100) [aglicona-H]- ⋅ IES-EM(2) positivo, m/z (%): 911 (5) [M+Na]+, 779 (0,3) [M-132+Na]+, 765 (1) [M- 146+Na]+, 633 (2) [M-132-146+Na]+, 609 (100) [M- 302+Na]+, 477 (6) [M-302-132+Na]+, 463 (9) [M-302- 146+Na]+, 331 (7) [M-302-132-146+Na]+, 301 (3) [M- 302-146-162+Na]+ 3-O-{[α-L-ramnopiranosil(1→6)]-O-[β-D-xilopiranosil(1→3)-O-α-L-ramnopiranosil-(1→2)]}-β-D- galactopiranosídeo de canferol (22) 22 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Gal Ram-1 Ram-2 Xil ⋅ Aspecto: Pó amorfo amarelado ⋅ Ponto de fusão: Degradou a partir de 195,4 °C ⋅ Solubilidade: Metanol ⋅ Fórmula molecular: C38H48O23 ⋅ Massa molar: 872 g mol-1 ⋅ UV (λmax, nm): 350 e 268 ⋅ IV (cm-1): 3360, 2985 e 2935, 1655, 1605, 1355, 1040, 806 ⋅ RMN de 1H (400 MHz; CDCl3): Tabela 3.42, p.226 ⋅ RMN de 13C (100 MHz; CDCl3): Tabela 3.41, p.225 ⋅ IES-EM(2) negativo, m/z (%): 871 (100) [M-H]-, 739 (21) [M-H-132]−, 725 (3) [M-H- 146]−, 594 (3) [M-132-146]-•, 286 (3) [aglicona]-• Capítulo 4 Dados Físico-químicos 244 Oliveira, DM (2012) 3-O-{[α-L-ramnopiranosil(1→6)]-O-[β-D-xilopiranosil(1→3)-O-α-L-ramnopiranosil-(1→2)]}-β-D- galactopiranosídeo de isoramnetina (23) 23 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH O 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH CH3 Xil Ram-1 Ram-2 Gal ⋅ Aspecto: Pó amorfo amarelado ⋅ Ponto de fusão: Degradou a partir de 192,7 °C ⋅ Solubilidade: Metanol ⋅ Fórmula molecular: C39H50O24 ⋅ Massa molar: 902 g mol-1 ⋅ UV (λmax, nm): 359 e 259 ⋅ IV (cm-1): 3330, 2988 e 2935, 1657, 1605, 1357, 1049, 981, 812 ⋅ RMN de 1H (400 MHz; CDCl3): Tabela 3.45, p.243 ⋅ RMN de 13C (100 MHz; CDCl3): Tabela 3.44, p.242 ⋅ IES-EM(2-3) negativo, m/z (%): 902 (77) [M]−•, 901 (48) [M-H]−, 769 (19) [M-H-132]−, 623 (3) [M-H-132-146]-, 476 (14) [M-H-132-146-146]-, 315 (100) [aglicona-H]- ⋅ IES-EM(2) positivo, m/z (%): 925 (18) [M+Na]+, 779 (1) [M-132+Na]+, 647 (1) [M- 132-146+Na]+, 609 (100) [M-316+Na]+, 477 (0,5) [M- 316-132+Na]+, 463 (0,2) [M-316-146+Na]+, 331 (1,8) [M-316-132-146+Na]+, 301 (0,4) [M-316-146-162+Na]+ Capítulo 5 Ensaios Biológicos 245 Oliveira, DM (2012) NEPLAM – DQ-ICEx - UFMG 5 Ensaios Biológicos Oliveira DM, 2012 Capítulo 5 Ensaios Biológicos 246 Oliveira, DM (2012) 1. ENSAIO DE AÇÃO ANALGÉSICA EM COBAIAS Os ensaios de atividade analgésica foram realizados no Laboratório de Fisiologia da Universidade Federal de Alfenas – UNIFAL, Alfenas, MG, Departamento de Ciências Biomédicas. Os trabalhos foram executados por Cláudia Quintino da Rocha e coordenados pelo Professor Alexandre Giusti-Paiva (UNIFAL). Para a realização dos ensaios de ação analgésica174 a solução aquosa do extrato metanólico FOMMA (200mg/kg), obtido de folhas de M. acanthophylla (Celastraceae), foi administrada por via oral (v.o.) em dois grupos de cobaias (n=6). A um grupo de controle foi administrado o fármaco morfina pela via peritonal (7,5mg/kg, i.p.). O extrato FOMMA foi caracterizado como rico em glicosídeos flavônicos, tais como: 3-O- {[α-L-ramnopiranosil(1→6)][β-D-xilopiranosil(1→3)-α-L-ramnopiranosil(1→2)]}-β-D-galacto- piranosídeo de quercetina (21) e 3-O-{[α-L-ramnopiranosil(1→6)][α-D-xilopiranosil(1→3)-α-L- ramnopiranosil(1→2)]}-β-D-galactopira-nosídeo de canferol (22) e 3-O-{[α-L- ramnopiranosil(1→6)]-O-[β-D-xilopiranosil(1→3)-O-α-L-ramnopiranosil(1→2)]}-β-D-galacto- piranosídeo de isoramnetina (23). 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH R 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Xil Ram-1 Ram-2 Gal R = OH (21) R = H (22) R = OCH3 (23) Gal = β-D-galactopiranosil, Ram = a-L-ramnopiranosil, e Xil = β-D-xilopiranosil. Foi instituído o tempo de 60 minutos, após o tratamento com volumes iguais de FOMMA aquoso ou de água destilada (controle negativo), para início dos testes na placa quente (tempo zero). O teste de placa quente consistiu em colocar as cobaias sobre uma placa de alumínio aquecida (55 ± 0,5 ºC) e observar a reação das cobaias ao calor. Para isso, foi medido, com um cronômetro digital, o tempo de latência (s) – o tempo gasto por cada animal para retirar uma pata traseira da placa e levá-la à boca. As medidas foram repetidas durante os períodos de zero, 20 e 60 minutos. Com o propósito de evitar danos às patas dos animais foi estabelecido um tempo de Capítulo 5 Ensaios Biológicos 247 Oliveira, DM (2012) corte de 20 segundos dentro dos períodos de testes. A morfina foi administrada 45 minutos antes do tempo zero. Resultados e discussão A solução aquosa do extrato FOMMA (200 mg kg-1) obtido das folhas de M. acanthophylla apresentou significativa atividade analgésica em camundongos (Figura 4.1). Os tempos médios de latência foram de 1,12, 2,30 e 4,28 segundos para as medições realizadas em 0, 20 e 60 minutos, respectivamente. O extrato FOMMA mostrou um potencial analgésico crescente durante as medições (Tabela 5.1), atingindo 21,4 % após 60 minutos do tratamento das cobaias, podendo alcançar melhores resultados em tempos maiores ou com doses mais concentradas. Os resultados indicam que os constituintes de FOMMA, principalmente os compostos antioxidantes como os flavonoides 21, 22 e 23, devem ser estudados mais detidamente, pela realização de outros ensaios, quanto as suas propriedades analgésicas. Tabela 5.1: Potencial analgésico de FOMMA (%)* Tratamento Dose (mg/kg) 0 min 21 min 60 min FOMMA(aq.) 200 5,6 11,5 21,4 Morfina 7,5 1,6 35,1 90,1 (*) p<0.01. Os valores comparados com o controle negativo (água destilada) M(0 min) M(20 min) M(40 min) M(60 min) 0 5 10 15 20 Te m po d e lat ên cia (s ) Medições FOMMA Morfina Figura 5.1: Tempos de latência apresentados nas medições M1 (0 min), M2 (20 min) e M3 (60 min) durante teste de analgesia utilizando a solução aquosa do extrato FOMMA aplicado em cobaias (200 mg kg-1, v.o.). Capítulo 5 Ensaios Biológicos 248 Oliveira, DM (2012) 2. CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DOS COMPOSTOS 21 e 22 As avaliações do potencial antioxidante dos constituintes de folhas de M. acanthophylla, foram realizadas mediante ensaios de captura de radicais livres em solução, utilizando um espectrofotômetro UV/VIS, HITACHI U-2010, pertencente ao Laboratório de Espectroscopia UV do Departamento de Química da UFMG. Foram testadas as soluções (metanol) dos seguintes constituintes isolados do extrato hidrometanólico (FAMMA) de folhas de M. acanthophylla: (21) 3-O-{[α-L-ramnopiranosil(1→6)][β-D-xilopiranosil(1→3)-α-L-ramnopiranosil(1→2)]}- β-D-galactopiranosídeo de quercetina. (22) 3-O-{[α-L-ramnopiranosil(1→6)][β-D-xilopiranosil(1→3)-α-L-ramnopiranosil- (1→2)]}-β-D-galactopiranosídeo de canferol. 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH R 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Xil Ram-1 Ram-2 Gal R = OH (21) R = H (22) Glicosídeos flavônicos isolados do extrato FAMMA de M. acanthophylla. Para estimar a atividade antioxidante dos constituintes 21 e 22, foram feitos ensaios espectrométricos para medir a capacidade de captura de radicais 2,2-difenil-1-picril-hidrazila DPPH (0,002%) quando postos a reagir com os flavonoides 21 e 22 diluídos em metanol (1, 10 e 100 µg/mL). O grau de descoloração da solução resultante da mistura de DPPH com uma determinada quantidade de amostra indica a eficiência na captura desses radicais dessa amostra. As descolorações foram avaliadas através do registro das absorbâncias das soluções de DPPH e das soluções das amostras 30 minutos depois da adição de DPPH. Foi feita também a leitura da absorbância do solvente utilizado (metanol). As medidas foram obtidas com o espectrofotômetro UV/VIS ajustado no comprimento de onda (λ) em 516 nm. Os valores de absorbância registrados foram relacionados com as concentrações das espécies reagentes e dos produtos, mediante a aplicação da lei de Lambert-Beer (A0 = −0,02383; A1=28,8)175. O percentual de inibição de radicais DPPH foi determinado pela comparação indireta entre a concentração destes nas solução de referência (controle positivo) e nas soluções das amostras, através da seguinte expressão: % Redução de DPPH = ]})(1{[100 0 030 r bx A AA − − 175-176 Capítulo 5 Ensaios Biológicos 249 Oliveira, DM (2012) Onde Ar0 foi o valor da absorbância de referência medida na solução de DPPH em metanol (13-15 µg/mL), Ax30 foi o valor da absorbância, lida 30 minutos após da mistura de 0,75 mL de solução da amostra (1, 10 ou 100 µg/mL) mais 1,5 mL da solução estoque de DPPH (20 µg/mL) e Ab0 foi o valor da absorbância do branco, constituído de solução metanólica da amostra pura nas três concentrações de ensaio. Para compor uma base de comparação, utilizando as mesmas condições de análises aplicadas às amostras de 21 e 22, foram avaliadas as capacidades de captura de DPPH por de soluções de butil-hidróxi-tolueno (BHT). Resultados e discussão Os resultados mostraram que os constituintes 21 e 22 em solução na concentração de 100 µg/mL apresentaram forte poder antioxidante, representado pela redução máxima de aproximadamente 64±2,8% e 94±1,2% de radicais livres (DPPH), respectivamente. Nessa concentração, o composto 21 foi mais eficaz na redução de radicais DPPH que o BHT (83±1,5%). Nas concentrações de 1 e 10 µg/mL, tanto 21 (35±1,1% e 52±1,2%) como 22 (36±1,1% e 37±2%) apresentam percentuais de redução de DPPH superiores aos do BHT (12±3,6% e 22±1,9%), respectivamente. OH BHT 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 10010 21 22 BHT Re du çã o de D PP H (% ) 1 Concentração (µg.mL-1) Figura 5.2: Efeitos de captura de radicais livres de DPPH por 21 e 22 em metanol (controle: BHT). 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH R 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH Xil Ram-1 Ram-2 Gal R = OH (21) R = H (22) Capítulo 5 Ensaios Biológicos 250 Oliveira, DM (2012) A atividade antioxidante apresentada pelos compostos 21 e 22 (Figura 5.2) foi atribuída à presença de grupos orto-dihidroxi, carbonila α,β-insaturada e grupos β-hidroxicetonas conjugados, os quais são responsáveis por propriedades quelantes que permitem a estabilização dos radicais livres e bloqueio dos processos oxidativos resultantes. A presença de dois grupos hidroxilas no anel B do flavonoide 21 pode justificar a sua melhor atividade antioxidante. Considerando os relatos recentes, os flavonoides antioxidantes também podem atuar no controle e inibição de expressões gênicas pró-inflamatórias in vitro e in vivo59. Os relatos científicos informam que as moléculas de flavonoides, em breve, servirão como base para o desenvolvimento de uma nova classe de agentes anti-inflamatórios177. A presença de flavonoides hidrossolúveis nas folhas da M. acanthophylla, apoiada nos relatos etnofarmacológicos29, efetivamente, permite concluir que a esses constituintes antioxidantes legitima o uso popular do infuso de suas folhas contra úlceras, gastrites e outros distúrbios gastrintestinais. Não obstante a constatação da eficiência farmacológica, atualmente, a demanda potencial por antioxidantes naturais para substituir os atuais sintéticos, representada principalmente pela indústria alimentícia, consiste num incentivo adicional ao isolamento, pesquisa e melhoramento das propriedades de compostos antioxidantes como os flavonoides de origem natural. 3. ENSAIOS BACTERIOLÓGICOS DO EXTRATO HIDROMETANÓLICO DE FOLHAS DE M. acanthophylla Ensaios bacteriológicos utilizando o extrato metanólico de folhas de M. acanthophylla, Celastraceae (FAMMA) realizados no Laboratório de Biotecnologia do Departamento de Química da UFMG, sob a supervisão da Professora. Dra. Jacqueline Aparecida Takahashi. As amostras foram avaliadas em duplicata, empregando-se o método de difusão em placa.178Nesse método, discos de papéis estéreis, de 6 mm de diâmetro, foram impregnados com 1000 µL de solução de 2 mg da amostra em 10 mL de solvente adequado (água, etanol ou DMSO), sendo cerca de 200 µg de amostra/disco. Os ensaios envolveram oito espécies bactérias, sendo: Citrobacter freundii, Proteus mirabilis, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei e Escherichia coli pertencentes aos tipos Gram-negativos, bem como Bacillus cereus, Listeria monocytogenes e Staphilococcus aureus pertencentes aos tipos Gram-positivos. No ensaio de controle foram utilizados discos impregnados com antibióticos ativos para os micro-organismos testados: cloranfenicol (30 µg/disco) e ampicilina (10 µg/disco). Capítulo 5 Ensaios Biológicos 251 Oliveira, DM (2012) Para estabelecer a atividade antibacteriana do extrato FAMMA, suspensões salinas com micro-organismos foram preparadas a partir da transferência de uma pequena quantidade de cada cultura bacteriana para um tubo contendo 2 mL de caldo nutritivo BHI (infusão de cérebro e coração). Um tubo, contendo uma espécie de bactéria dispersa no meio de manutenção, foi então incubado em estufa, a 37 oC, durante 18 horas e uma alíquota de 0,5 mL transferida para um outro tubo contendo 4,5 mL de solução salina (diluição de 1:10). Para os ensaios de atividade, as placas foram preparadas adicionando-se 10 mL do meio sólido e, após solidificação desse, 5 mL do meio semi-sólido contendo os respectivos inóculos de bactérias (0,2 mL da suspensão salina do micro-organismo). Os discos foram depositados nas placas de Petri sobre os meios de cultura, previamente inoculados com o micro-organismo, e deixou-se difundir por 4 horas à temperatura ambiente. As placas foram, então incubadas à temperatura de 37 oC, por 24 horas. O grau de resistência ou sensibilidade das bactérias frente às amostras testadas foi observado pela presença ou ausência de halos de inibição após 24 horas de incubação. A leitura dos halos de inibição foi feita medindo-se o diâmetro dos mesmos e os resultados expressos em centímetros. O cloranfenicol e a ampicilina foram utilizados como controle na concentração de 30 µg e 10 µg, por discos, respectivamente. Resultados e discussão No ensaio bacteriológico foi medido o grau de resistência ou sensibilidade das bactérias, frente às amostras de extrato FAMMA testadas, sendo observada a presença ou ausência de halos de inibição após 24 horas de incubação. A leitura do grau de inibição foi feita através da medida do diâmetro dos halos, comparativamente aos halos das substâncias controles, que resultaram em diâmetros médios de 2,66 cm para o cloranfenicol e 2,70 cm para a ampicilina. Tabela 5.2: Atividade antimicrobiana in vitro do extrato metanólico de folhas de M. acanthophylla, (FAMMA) frente a bactérias Gram-negativas e Gram-positivas Micro-organismo Resultado Citrobacter freundi (−) inativo Proteus mirabilis (−) inativo Salmonella typhimurium (−) inativo Shigella sonnei (−) inativo Escherichia coli (−) inativo Bacillus cereus (−) inativo Listeria monocytogenes (−) inativo Staphilococcus aureus (−) inativo Capítulo 5 Ensaios Biológicos 252 Oliveira, DM (2012) Os resultados obtidos (Tabela 5.2) indicaram a completa inatividade in vitro apresentada pelo extrato FAMMA frente às bactérias Citrobacter freundii, Proteus mirabilis, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei e Eschecichia coli pertencentes aos tipos Gram-negativos, e às bactérias Bacillus cereus, Listeria monocytogenes e staphilococcus aureus pertencentes aos tipos Gram-positivos. Como base de comparação foram utilizadas as inibições causadas pelos antibióticos clorafenicol (halos médios de 2,66 cm) ou ampicilina (halos médios de 2,70 cm) nos respectivos micro-organismos. 4. ENSAIO DE TOXICIDADE DE EXTRATOS PARA CÉLULAS TUMORAIS HUMANAS179 Os ensaios biológicos para monitoramento do fracionamento dos extratos de folhas de M. acanthophylla (FHEMA, FAEMA, FOMMA e SEMA) foram realizados pela equipe técnica do Laboratório de Química e Produtos Naturais - LQPN, do Instituto Renê Rachou (Belo Horizonte), coordenado pelo Dr. Carlos Zani. Para isso, as amostras testadas foram colocadas em placa de 96 poços, em quantidade suficiente para ensaio em triplicata e na concentração final de 20 µg/mL. Os técnicos do LQPN foram responsáveis pela diluição das amostras em solução de DMSO 1% em água e transferência do volume correto para a placa de ensaio, emitindo um laudo ao final do teste. Foram utilizadas quatro amostras de extratos de folhas de M. acanthophylla (FHEMA, FAEMA, FOMMA e SEMA), para o ensaio de toxicidade para células tumorais humanas. Linhagens de células tumorais UACC-62 (melanoma), TK-10 (tumor renal) e MCF-7 (tumor de mama) foram utilizadas para avaliação da proliferação celular; para a contagem colorimétrica foi utilizado o corante Sulfarrodamina B (SRB) na concentração de 0,4% em ácido acético aquoso a 1%. Os controles positivos utilizados foram etoposídeo (16 µg/mL) e colchicina (8 µg/mL). Para avaliar o efeito dos extratos de folhas de M. acanthophylla (FHEMA, FAEMA, FOMMA e SEMA) sobre a proliferação celular, foram utilizadas as linhagens de células tumorais UACC-62 (melanoma), TK-10 (tumor renal) e MCF-7 (tumor de mama). De acordo com dados do NCI (sigla em inglês do instituto nacional de pesquisas do câncer dos EUA), estas linhagens seriam capazes de detectar 95% dos extratos que contiverem substâncias antitumorais. O método utilizado para avaliação da atividade antineoplásica (AA) está registrado no Sistema da qualidade do LQPN-Fiocruz. Descrevendo de forma breve, o protocolo foi assim executado: As suspensões celulares foram diluídas de modo que em cada poço de uma placa de 96 poços fossem colocadas Capítulo 5 Ensaios Biológicos 253 Oliveira, DM (2012) 10.000 células das linhagens UACC-62 e MCF-7 e 15.000 células da linhagem TK-10. Os inóculos foram incubados por 24 h a 37 °C para estabilização. Em cada poço foi adicionada a solução do extrato de modo a se atingir a concentração final de 20 µg/mL. As células foram incubadas na presença dos extratos por 48 h em atmosfera de CO2 (5%) e 100% de umidade. A multiplicação destas células foi medida pelo método colorimétrico (λ515 nm) empregando a sulfarrodamina B (SRB). Resultados e discussão SRB é um corante que se liga aos aminoácidos básicos das proteínas das células e pode ser utilizado para quantificar a proliferação das células tumorais. Portanto, quanto menos células, menor será a concentração de espécies do tipo célula-corante ligado e menor será absorção medida180. Neste ensaio, resultados de 0 a 100% representam uma atividade denominada atividade citostática (AC). A atividade citostática é aquela exercida por frações que são capazes de inibir a proliferação das células presentes no inóculo inicial em relação ao controle sem droga. As frações que além de inibirem a proliferação celular ainda são capazes de matar as células presentes no inóculo inicial são denominadas citocidas, ou citotóxicas (AX), e apresentam valores de inibição de proliferação de 101 a 200%. Tabela 5.3: Avaliação in vitro da atividade inibidora de soluções (DMSO, 20 µg.mL-1) de extratos de folhas de M. acanthophylla sobre o crescimento (%) das linhagens de células tumorais humanas MCF-7, TK10 e UACC-62 Ensaio biológico FHEMA FAEMA FOMMA SEMA CCH ETP Toxicidade para células MCF-7 8,0 7,0 8,0 2,0 67 74 CV% 3 1 2 15 4 5 Toxicidade para células TK-10 24 15 6 6 87 90 CV% 7 4 1 9 7 13 Toxicidade para células UACC-62 10 8 10 22 77 80 CV% 2 7 5 12 10 16 Atividade3 AC. AC AC AC AC AC 1 – CCH: colchicina (8 µg.mL-1), substância controle de ação citostática (AC). 2 – ETP: etoposídeo (16 µg.mL-1), substância controle de ação citotóxica (AX) 3 - Resultados de 0 a 100% = AC; de 101 a 200% = AX. 4 - Linhagens de células: MCF-7 (tumor de mama); TK-10 (tumor renal); UACC-62 (melanoma) 5 - CV%: coeficiente de variação percentual. Capítulo 5 Ensaios Biológicos 254 Oliveira, DM (2012) As avaliações dos efeitos dos extratos de folhas de M. acanthophylla (FHEMA, FAEMA, FOMMA e SEMA) sobre a proliferação de células tumorais humanas UACC-62 (melanoma), TK-10 (tumor renal) e MCF-7 (tumor de mama), resultaram apenas em atividades citostáticas moderadas (AC ≤ 100%). Não houve qualquer resultado de inibição, provocado por extrato, que pudesse ser considerado como de atividade citotóxica (101 ≤ AX ≤ 200%), esses resultados estão condensados na Tabela 5.3 e na Figura 5.3. Os estudos fitoquímicos mostraram que os extratos testados são constituídos, basicamente, de substâncias do tipo de triterpenos pentacíclicos, carboidratos e flavonoides glicosilados. FH EM A FA EM A FO M M A SE M A CC H ET P DM SO 0 20 40 60 80 100 FH EM A FA EM A FO M M A SE M A CC H ET P DM SO 0 20 40 60 80 100 FH EM A FA EM A FO M M A SE M A CC H ET P DM SO 0 20 40 60 80 100 In ib iç ão ( % ) MCF-7 In ib iç ão ( % ) TK-10 In ib iç ão ( % ) UACC-62 Figura 5.3: Atividade inibidora de soluções dos extratos de folhas de Maytenus acanthophylla (DMSO, 20 µg.mL-1) sobre o crescimento (%) de três linhagens de células tumorais humanas: MCF-7, TK10 e UACC-62 Capítulo 5 Ensaios Biológicos 255 Oliveira, DM (2012) 5. ENSAIOS PARA AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE LEISHMANICIDA DOS EXTRATOS FHEMA, FAEMA, FOMMA E SEMA. Os ensaios biológicos para avaliação de atividade leishmanicida dos extratos de folhas de M. acanthophylla (FHEMA, FAEMA, FOMMA e SEMA) foram realizados pela equipe técnica do Laboratório de Química e Produtos Naturais LQPN, do Instituto Renê Rachou (Fiocruz, Belo Horizonte), coordenado pelo Dr. Carlos Zani. Inicialmente, as amostras testadas foram colocadas em placa de 96 poços, conforme procedimento seguido nos testes antitumorais (p. 251). Para a realização dos ensaios foi utilizado um protocolo adaptado no LQPN.181, 182 Formas promastigotas de L. amazonensis, retiradas de lesão de hamsters, foram cultivadas em meio de Schneider e estocadas em freezer a -70°C. Para transformação em formas amastigotas-axênicas, alíquotas do cultivo foram descongeladas e cultivadas em meio de Schneider, com pH 7,2 e temperatura de 26 °C por 7 dias. Após esse período, a cultura foi centrifugada e re-suspendida em um novo meio de Schneider (pH 6,0) e incubada a 32°C durante 9 dias. A câmara de Neubauer (CB) foi utilizada para determinação da concentração das formas amastigotas da suspensão. Deste modo, foram obtidas cerca de 90% dos parasitos na forma amastigota-axênica. Foram utilizadas quatro amostras dos extratos FHEMA, FAEMA, FOMMA e SEMA para os ensaios de atividade leishmanicida, desenvolvidos em triplicatas, sobre placas de microcultivo de 96 poços. Em cada poço-teste foram adicionados 90 µL de cultura na concentração de 1x108 parasitos mL-1 e 10 µL de soluções dos diferentes extratos, de forma que a concentração final do extrato no ensaio fosse 20 µg/mL. Os meios utilizados como controles foram: a) 100 µL de cultura na 1x108 parasitos mL-1; b) 90 µL de cultura e 10 µL de anfotericina B (AMB), marca Fungison® Bristol-Myers Squibb, na concentração de 0,2 µg mL-1; c) 100 µL de meio de cultivo; d) 90 µL de meio de cultivo mais 10 µL de extrato; para a contagem colorimétrica foi utilizado 10 µL de MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazolil)-2,5-difeniltetrazólio). No prosseguimento dos ensaios da atividade leishmanicida das amostras dos extratos, primeiramente foi preparada a suspensão de amastigotas-axênicas, em que a cultura em transformação foi retirada de estufa BOD (Biochemical Oxygen Demand) a 32 ºC, homogeneizada e transferida para tubo cônico de 50 mL esterilizado. O tubo foi centrifugado por 10 minutos a 1000 RPM e 27ºC. O sobrenadante foi desprezado e o sedimento suspendido em 10 mL de meio de Schneider (pH 6,0). Capítulo 5 Ensaios Biológicos 256 Oliveira, DM (2012) A determinação da concentração de amastigotas em CB foi feita em 10 µL da suspensão diluídos em 490 µL de tampão PBS (Phosphate-Buffered Saline). Com a lamínula colocada sobre a CB, foi adicionado por capilaridade um volume de aproximadamente 20 µL da diluição obtida e, em seguida, se fez a contagem das amastigotas no quadrante central da CB. Os amastigotas presentes foram contados e multiplicados pelo fator de diluição e por 104 (fator de correção da CB) para determinação da densidade de amastigotas (número amastigotas/mL) na cultura. A suspensão de amastigotas usada no ensaio tinha concentração do inóculo (CI) de 108 amastigotas/mL. Logo depois, se procedeu à homogeneização da suspensão de amastigotas em agitador tipo “vortex” e em seringa, e esta foi distribuída nas placas de teste. Aos poços de controle das placas foram adicionados 10 µL dos controles, AMB e DMSO e aos poços teste 10 µL das amostras (200 µg/mL em água Milli-Q contendo 1% de DMSO). As placas foram seladas com lamina de parafilme e incubadas em estufa BOD a 32 oC, por 72 h. Após este período, 10 µL de MTT a 5 mg/mL foram adicionados a cada poço. Decorridas 4 h de incubação, foram adicionadas 100 µL de SDS (dodecilssulfato de sódio) 10% em isopropanol para interrupção da reação colorimétrica do MTT. Após 30 min à temperatura ambiente foi feita a leitura em espectrofotômetro de ultravioleta em λ = 570 nm. Resultados e discussão O MTT é um corante que é reduzido enzimaticamente nas mitocôndrias dos parasitos vivos. A forma reduzida absorve a luz ultravioleta em 570 nm, permitindo a quantificação dos parasitos. A comparação da absorbância das frações com a absorbância do controle permite a expressão do percentual de morte dos parasitos181. Os resultados foram expressos como porcentagem de morte após 72 h de incubação. O cálculo da porcentagem de indivíduos mortos (M%) foi realizado com base na fórmula a seguir, onde: A é a média das densidades ópticas ou absorbâncias, ACn é a medida de controle e AEx representa o valor da absorbância do extrato e/ou fração testada. ] )( [100(%) Cn ExCn A AAM −= As avaliações dos efeitos dos extratos FHEMA, FAEMA, FOMMA e SEMA sobre a proliferação celular tiveram como resultados atividades de inibição menores do que 80% em todos os testes. Os resultados são apresentados na Tabela 5.4 no gráfico da Figura 5.4. Capítulo 5 Ensaios Biológicos 257 Oliveira, DM (2012) Tabela 5.4: Avaliação in vitro da atividade leishmanicida (M%) de soluções de extratos de folhas de M. acanthophylla (DMSO, 20 mg.mL-1), sobre formas amastigotas e axênicas do protozoário causador da leishmaniose Ensaio biológico FHEMA FAEMA FOMMA SEMA AMBI DMSOII Leishmanicida (Leishmania amazonensis) 21,5 17,8 17,6 17,9 57 16 CV% 1 1 1 4 3 5 AtividadeIII Inativo Inativo Inativo Inativo Inativo Inativo I AMB: Anfotericina B (0,2 mg.mL-1), substância controle no teste leishmanicida II DMSO: dimetilsulfóxido foi utilizado como controle negativo III São consideradas ativas as substâncias que promoverem inibições de crescimento superiores a 80%. Os testes para verificação de atividade leishmanicida contra formas amastigotas e axênicas do protozoário causador da leishmaniose, realizados com amostras de quatro extratos de folhas de M. acanthophylla apresentaram resultados negativos. FH EM A FA EM A FO MM A SE MA DM SO AM B 10 20 30 40 50 60 In ib iç ão ( % ) Extratos Figura 5.4: Atividade leishmanicida (%) de soluções de extratos de folhas de M. acanthophylla (DMSO, 20 µg.mL-1) sobre formas amastigotas (axênicas) do protozoário causador da leishmaniose. Capítulo 5 Ensaios Biológicos 258 Oliveira, DM (2012) 6. ENSAIO PARA ATIVIDADE FUNGICIDA DOS EXTRATOS FHEMA, FAEMA, FOMMA E SEMA O ensaio para atividade fungicida183 dos extratos de folhas de M. acanthophylla (FHEMA, FAEMA, FOMMA e SEMA) foi realizado no Laboratório de Micologia do Departamento de Microbiologia/ICB da Universidade Federal de Minas Gerais, sob a supervisão de Dra. Suzana Johann. As amostras foram avaliadas em oito concentrações. Nos ensaios para atividade fungicida foram envolvidas três espécies de micro-organismos (fungos), sendo: Candida albicans, Candida krusei e Candida glabrata. Foram utilizados como controles o meio RPMI, um meio de cultura usado no crescimento de células e tecidos, desenvolvido no Roswell Park Memorial Institute-RPMI (EUA), e anfotericina B. Para estabelecer a atividade fungicida dos extratos, inicialmente, foi aplicado o método de microdiluição para a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM), em que as substâncias foram testadas em oito concentrações que variaram de 1000 a 7,8 µg mL-1. De cada diluição, alíquotas de 100 µL foram distribuídas em microplacas. Como controle de crescimento e de esterilidade foi usado somente o RPMI, sem adição dos extratos e solvente. Como controle de toxicicidade do solvente foi usado o meio de cultura RPMI, juntamente com o solvente. Como controles positivos foram usados o RPMI adicionado de anfotericina B. As concentrações do antifúngico de referência usadas variaram, desta forma, de 0,12 a 62,0 µg mL-1. Após a montagem das placas, cada orifício teste e controle de crescimento receberam 100 µL do inóculo microbiano. As placas foram incubadas e lidas após 48 horas para as amostras de Candida spp.183, 184 As CIM’s foram consideradas como a menor concentração do produto natural, ou antifúngico, que inibiu totalmente o crescimento do micro-organismo, em relação ao RPMI, após a incubação. Os resultados foram expressos em µg mL-1. Resultados e discussão No ensaio para estabelecer a atividade fungicida dos extratos de folhas de M. acanthophylla (Celastracea) (FHEMA, FAEMA, FOMMA e SEMA) foi medido o grau de resistência ou sensibilidade da Candida spp, frente às amostras testadas, mediante a determinação da CIM. Os resultados da atividade antifúngica para os extratos estão descritos na Tabela 5.5. Apenas o extrato FOMMA apresentou CIM de 250 µg mL-1 contra o fungo C. krusei, um valor pouco Capítulo 5 Ensaios Biológicos 259 Oliveira, DM (2012) expressivo para se considerar esse extrato como fungicida, quando se compara o valor de CIM da anfotericina (controle) que foi 500 vezes superior. Tabela 5.5: Concentração Inibitória Mínima de extratos de folhas de M. acanthophylla (µg mL-1) contra espécies de Candida C. albicans, C. krusei e C. glabrata Extratos C. albicans C. krusei C. glabrata FHEMA >500 >500 >500 FAEMA >500 >500 500 FOMMA >500 250 >500 SEMA >500 >500 >500 Anfotericina B 1,0 0,5 1,0 (P<0,05); o valor >500 indica que na concentração de 500 µg mL-1 não ocorreu inibição do crescimento da Candida spp., ou seja o extrato não foi ativo. Os valores das CIM obtidos do teste para atividades fungicida mostraram que as amostras dos extratos de folhas de M. acanthophylla (Celastracea) (FHEMA, FAEMA, FOMMA e SEMA) foram inativas frente às três espécies de Candida testadas, quando comparados aos valores registrados para o controle positivo (anfotericina B). 7. ENSAIO DA PROLIFERAÇÃO DAS CÉLULAS MONONUCLEARES DO SANGUE PERIFÉRICO HUMANO (PBMC) 23 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH O 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH CH3 Xil Ram-1 Ram-2 Gal O ensaio da proliferação das células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) para avaliação do potencial citotóxico e imunomodulador185 dos glicosídeos 3-O-{[α-L- ramnopiranosil(1→6)][α-L-ramnopiranosil(1→2)]}-β-D-galactopiranosídeo de quercetina (20) e 3-O-{[α-L-ramnopiranosil(1→6)][β-D-xilopiranosil(1→3)-α-L-ramnopiranosil (1→2)]}-β-D- galactopiranosídeo de isoramnetina (23), compostos obtidos do extrato metanólico das folhas de M. acanthophylla (Celastraceae) [FOMMA], foi realizado no Laboratório do Depto de Fisiologia e Biofísica ICB/UFMG, sob a supervisão da professora Dra. Elaine Maria de Souza Fagundes. As culturas das PBMC foram preparadas com base no protocolo descrito por Gazzinelli.186 As Ram-120 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH OH CH3 6''' OH Ram-2 Gal Capítulo 5 Ensaios Biológicos 260 Oliveira, DM (2012) amostras foram avaliadas em diferentes concentrações, que variaram de 100 a 0,0001 µg mL-1. Brevemente, as PBMC foram obtidas de voluntários saudáveis, adultos de ambos os sexos, por centrifugação do sangue venoso heparinizado sobre um recipiente de centrifugação em gradiente de densidade Ficoll/Hypaque. As células mononucleares foram coletadas da interfase após a separação de Ficoll e lavadas três vezes em RPMI-1640. As suspensões celulares foram ajustadas para concentração de 2,0x106 mL-1 células e plaqueadas em matrizes de 96 poços (200.000 celulas por poço). Todas as culturas foram preparadas em meio RPMI-1640, suplementadas com 5% (v/v) esterilizada de soros AB e 2 µmol L-1 de L-glutamina e solução antibiótica/antimicótica contendo 1000 UI mL-1 de penicilina. Alíquotas de 1000 mg mL-1 de estreptomicina e 25 mg mL- 1 de fungisona foram adicionadas ao controle de contaminação por fungos e bactérias (meio completo). Para estimulação dos linfócitos foi utilizada a fitohemaglutinina (PHA) a 2,5 µg mL-1. Células cultivadas em DMSO (0,01%) e estimuladas com PHA foram utilizadas como controle, bem como PBMC não estimuladas (CC). A viabilidade e a proliferação das células foram determinadas pelo ensaio de MTT187. Esse ensaio, resumidamente consistiu na incubação por 72 horas de PBMC com diferentes concentrações de 20 e 23 (100 até 0,0001 µg mL-1) estimulados com 2,5µg mL-1 de fitohaemaglutinina (PHA, ou fitohemaglutinina), 20 µL de solução MTT (5 mg mL-1, filtrado em RPMI por meio de filtro com poro de 0,2 µm) foram adicionadas às placas e incubadas a 37 ºC por 4h. O sobrenadante foi cuidadosamente removido, e 200µL de HCl 0,04 mol.L-1 em isopropanol foi adicionado para dissolver os cristais formados. A absorbância foi medida em λ = 590 nm, com um leitor de microplacas VersaMax (Tunable Microplate Reader, Molecular Device, EUA). Os dados tiveram tratamento idêntico ao dispensado para as células cancerosas. Resultados e discussão Este ensaio foi conduzido para estabelecer a influência dos glicosídeos 20 e 23 sobre a proliferação de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) estimuladas com PHA, bem como o potencial citotóxico desta substância. Para avaliação da proliferação/viabilidade celular foi utilizado o ensaio de MTT. Conforme demonstrado na Figura 5.5, os glicosídeos 20 e 23 em concentrações de 100 a 0,001 µg mL-1 reduziram significativamente a proliferação PBMC estimuladas (proliferação <70%), em relação as cultura controle (DMSO). O glicosídeo 20 apresenta um efeito do tipo hormese, apresentando uma curva dose- resposta do tipo bifásica. Neste tipo de efeito, alguns xenobióticos (drogas, toxinas etc) têm Capítulo 5 Ensaios Biológicos 261 Oliveira, DM (2012) efeitos opostos em concentrações altas ou baixas. Esse efeito pode ser observado em concentrações de 0,01 µg mL-1 e 0,0001 µg mL-1, onde não se observa o efeito inibitório significativo sobre a proliferação de células mononucleares, induzida por PHA, quando comparado ao controle PHA e ao composto 23. Entretanto nessa mesma concentração (0,0001 µg mL-1) 23 mostrou um efeito inibitório significativo (redução > 30% das PBMC) na proliferação celular, demonstrando forte potencial imunomodulador na proliferação de linfócitos ativados. É importante enfatizar que, em nenhuma das concentrações testadas, foram observados efeitos citotóxicos, uma vez que os dois glicosídeos não apresentaram inibição da viabilidade/proliferação celular que fossem menores que o controle de células (CC) mantido nas mesmas condições. 23 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH O 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH O CH3 6''' 1''''' O 5''''' 4''''' 3''''' 2''''' OH OH OH CH3 Xil Ram-1 Ram-2 Gal Figura 5.5: Efeito dos glicosídeos 20 e 23 na proliferação das Células Mononucleares do Sangue Periférico humano (PBMC) estimulado com PHA. PBMC (2x105/poço) foram tratados com diferentes concentrações de 20 e 23 com PHA (5 µg mL-1) por 72h. Os dados são expressos como média ± erro padrão de sete experimentos independentes realizados em triplicata. *Estatisticamente diferente do controle (PHA, DMSO 0,01%), p<0,05. O controle de células sem estimulação está representado por CC. Glicosídeo 20 10 0 10 1 0, 1 0, 01 0, 00 1 0, 00 01 P H A C C 0 50 100 150 Glicosídeo 23 µg mL-1 pr ol ife ra çã o vs c on tr ol e (% ) * * * * * * * * * * * * 10 0 10 1 0, 1 0, 00 1 0, 00 01 P H A C C 0, 01 0 50 100 150 µg mL-1 Ram-120 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' CH3 6'''' 1''''OH OH OH O O 4´´ 3´´ 2'' 1'' O 5´´ 6´´ OH OH O O 3 4 10 2 O 1 9 5 8 6 1´ O 7 2´ 6´ OH 4´ 3´ 5´OH OH 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' O OH OH OH CH3 6''' OH Ram-2 Gal Capítulo 5 Ensaios Biológicos 262 Oliveira, DM (2012) Estes resultados demonstram que 20 e 23 apresentaram potencial imunomodulador, suprimindo a proliferação celular. Contudo, os dois glicosídeos não desenvolveram citotoxicidade, uma vez que nas diferentes concentrações não houve redução da proliferação/viabilidade quando comparadas as culturas de PBMC sem estímulo (CC). 8. ENSAIOS DE INIBIÇÃO DE SÍNTESE DE ATP188 Estudo realizado sob a coordenação do Dr. Blas Lotina-Hennsen, professor da Universidad Nacional Autonoma de México, Mexico (Departamento de Bioquímica - Facultad de Química, UNAM). Os ensaios foram realizados a partir de soluções em DMSO dos seguintes compostos obtidos das folhas de M. acanthophylla: lupeol (8), 3β-acetato de lupeolila (9) e o derivado peracetilado do dulcitol, o peracetildulcitol (19a), nas concentrações de 50 100, 200 e 300 µmol L-1. 28 10 5 1 3 12 14 17 23 26 19 22 H 29 30 OH (8) 1 2 3 7 10 12 15 19 20 22 23 28 CH3 30 29 H H H H O C 1' CH3 2' O H H-29a H H-29b (9) 1 6 O O O O O O Me-1' 1' O 4' O 3' O Me-6' 6' O 2' O 5' O (19a) Os cloroplastos foram isolados de folhas de espinafre (Spinacea oleracea L.) adquiridas no supermercado. Para extração dos cloroplastos as folhas livres da nervura central e das extremidades basal e apical (25 g) foram trituradas em liquidificador e submetidas à extração com 100 mL do seguinte meio: sacarose (400 µmol L-1), MgCl2 (5 µmol L-1), KCl (10 µmol L-1) e o sal de potássio do N-[tris(hidroximetil)metil]glicina (K+[tricina]¯, 30 µmol L-1) em pH 8,0 (1 mol L-1 KOH). O meio foi homogeneizado e filtrado com quatro camadas de gaze. O filtrado foi centrifugado e o sobrenadante descartado, o sólido resultante contendo os cloroplastos foi dissolvido em 1 mL de um meio constituído por: sorbitol (100 µmol L-1), KCl (10 µmol L-1), MgCl2.6H2O (5 µmol L-1) e K+[tricina]¯ (1 µmol L-1) em pH 8,0 (1 mol L-1 KOH). Para determinar a concentração da clorofila, foram pipetados 50 mL da solução de cloroplastos para um tubo de centrífuga contendo 3 mL de acetona. A amostra foi mantida no escuro por cinco minutos e depois submetida a uma centrifugação clínica. Foram feitas medidas Capítulo 5 Ensaios Biológicos 263 Oliveira, DM (2012) de absorbâncias do sobrenadante nos comprimentos de onda de 645 e 663 nm189. A quantidade de clorofila foi obtida pela fórmula: Clorofila (µg mL-1) = 20,2 (Abs645) + 8,02 (Abs663) A síntese de ATP foi determinada utilizando-se um micro-eletrodo conectado a um potenciômetro com escala expandida, com pH ajustado em aproximadamente 8,0. Para esta determinação foi utilizado o seguinte meio reacional: clorofila (20 µg mL-1), sacarose (100 µmol L-1), MgCl2.6H2O (5 µmol L-1), KCl (10 µmol L-1) e K+[tricina]¯ (1 µmol L-1), pH 8 (1 µmol L-1 KOH) na presença de ADP (1 µmol L-1) e KH2PO4 (3 µmol L-1). Como aceptor de elétrons para a síntese de ATP foi usado 100 µmol L-1 do herbicida dicloreto de 1,1’-dimetil-4,4’-bipiridínio (Paraquat). Para avaliar a ação dos compostos 8, 9 e 19a na inibição da síntese de ATP, soluções dos mesmos foram adicionadas ao meio reacional em concentrações 50, 100, 200 e 300 µmol L-1 e as medidas comparadas com o controle [(1200 µmol L-1 ATP) x (mg de clorofila) x (h-1)] = 100% de atividade. Resultados e discussão Os compostos lupeol (8), acetato de lupeolila (9) e peracetildulcitol (19a), nas concentrações de 50, 100, 200 e 300 µmol L-1 em soluções de DMSO, foram testados e tiveram seus efeitos medidos sobre a síntese de ATP em cloroplastos isolados de folhas de espinafre (Spinacea oleracea L.). Pela análise dos resultados, mostrados na Figura 4.6, foi possível observar que os compostos testados 8 e 19a apresentaram significativos efeitos inibitórios sobre a síntese de ATP, em toda faixa de concentração (50-300 µmol L-1) avaliada. 0 50 100 150 200 250 300 0 20 40 60 80 100 Lupeol (8) Dulcitol peracetilado (19a) Acetato de lupeoíla (9) Concentração (µM) Sí nte se de A TP (% ) Figura 5.6: Efeitos dos compostos 8, 9 e 19a sobre a síntese de ATP em cloroplastos de Spinacea oleracea L. 28 10 5 1 3 12 14 17 23 26 19 22 H 29 30 OH (8) 1 2 3 7 10 12 15 19 20 22 23 28 CH3 30 29 H H H H O C 1' CH3 2' O H H-29a H H-29b (9) 1 6 O O O O O O Me-1' 1' O 4' O 3' O Me-6' 6' O 2' O 5' O (19a) Capítulo 5 Ensaios Biológicos 264 Oliveira, DM (2012) Entretanto, o composto 9, devido aos baixos efeitos de inibição, pode ser considerado inativo. Os valores de I50 calculados, representando a concentração requerida para provocar 50% de inibição (obtida por interpolação gráfica), para os compostos 8 e 19a foram de 143 e 122 µmol L-1, respectivamente. Os resultados apresentados para o composto 19a mostraram que a maior atividade inibitória da síntese de ATP em cloroplastos de Spicacea oleracea pode alcançar a inibição completa (100%) quando aplicado (in vitro) em concentrações superiores a 325 µmol-1. Assim, como o processo fotossintético é essencial para o desenvolvimento autotrófico das plantas, foi constatado que o composto 19a apresenta um promissor potencial herbicida e agente ativo no processo de alelopatia da planta que o contém. 2012 Conclusão 265 Oliveira, DM ( ) CONCLUSÃO Os resultados obtidos no estudo químico-farmacológico de folhas de Maytenus acanthophylla contribuem com novas informações científicas a respeito dessa planta, na medida em que promove o incremento de dados e conhecimentos relativos a atividades biológicas, propriedades físico-químicas das substâncias isoladas, bem como, o fornecimento de detalhes sobre a estrutura e conformação de compostos novos e a revisão de outros conhecidos. Esta contribuição é significativa para ás áreas de Farmácia, Química Orgânica, Química Analítica e de Materiais, bem como para a Quimiotaxonomia da planta estudada, porque três constituintes químicos identificados e isolados das folhas de M. acanthophylla são inéditos e vários ainda não foram descritos para a espécie, bem como para família Celastraceae. Na obtenção e caracterização dos constituintes químicos da planta, foram utilizados diferentes técnicas cromatográficas e diversos métodos computacionais, espectroscópicos e espectrométricos (CGAR, IV, CG-EM, IES-EM, RMN 1D e 2D e raios-X). Durante o processo de elucidação estrutural foi criado um banco de dados inteligente (MATCH-5) contendo deslocamentos químicos de carbono-13 para ser utilizado na pesquisa e identificação de TTPC’s isolados. Desde 2007 o programa Match-5 vem sendo utilizado no NEPLAM com ótima acessão pelos usuários. Dos extratos hexânico e acetato-etílico das folhas foram isolados, identificados e caracterizados 12 TTPC’s, sendo quatro alcoóis, dois dióis, quatro ésteres, uma cetona e um ceto- álcool, pertencentes às séries dos friedelanos (5, 6, 7, 13, 14, 15 e 15a), lupanos (8 e 9), oleananos (10 e 12) e ursanos (11). Os TTPC’s friedelano-dióis pachisandiol B (14) e 3β,24-di- hidroxifriedelano (15) ainda não tinham sido isolados em plantas da família Celastraceae. Os resultados do estudo conformacional de 14 foram publicados na revista Strutural Chemistry145. Este artigo apresenta uma proposta metodológica, baseada em dados RMN e cálculos ab initio para se determinar a preferência conformacional do sistema pentacíclico, bem como, sobre a elucidação da geometria de estruturas de TTPC’s semelhantes aos friedo-oleananos. A literatura fornece resultados de vários estudos farmacológicos informando o quanto os TTPC’s lupeol (8) e acetato de 3β-lup-20(29)-en-3-ila (9) são portadores de atividades anti- inflamatória (antiartrite), antimalárica, entre outras. Neste estudo, os compostos 8 e 9 foram isolados em quantidades significativas das partes aéreas de M. acanthophylla, que consiste em mais um fato para mostrar a importância químico-farmacológica a essa planta. Em testes biológicos realizados neste estudo, voltados a medir a capacidade de substâncias atuarem como 2012 Conclusão 266 Oliveira, DM ( ) inibidoras da fotossíntese de ATP em Spinacea oleracea L, 8 apresentou fraca atividade e 9 foi inativo. O estudo dos extratos em hexano e em acetato de etila possibilitou o isolamento e a caracterização da estrutura de 3 (1,4-trans-poliisopreno), bem como propor um mecanismo para o processo químico de degradação espontânea que ocorre com esse biopolímero. O coroamento do conhecimento adquirido no estudo de 3 permitiu propor, em parceria com pesquisadores da Faculdade de Odontologia da UFMG, uma nova invenção/aplicação, que gerou um pedido de patente solicitado pela UFMG sob o título: “Processo de preparação de um dispositivo de liberação controlada de agentes antibióticos ou antissépticos incluídos ou associados em ciclodextrina em uma base de guta-percha, produtos e usos” (PI 0702738-9/UFMG). O estudo químico também possibilitou isolar e identificar o triterpeno esqualeno (2) e o ácido araquídico (17), um ácido graxo de relativa importância na indústria de cosméticos capilares. No extrato acetato-etílico também foi obtido o β-sitosterol (16), um fitoesteroide recentemente muito procurado e valorizado, devido a recentes descobertas de propriedades como protetor cardiovascular e regulador dos níveis de colesterol no sangue. Os estudos dos extratos polares (metanólicos e hidrometanólicos) empregando CLAE e técnicas espectrométricas e espectrocópicas possibilitaram o isolamento e a caracterização de três novos flavonóis glicosilados: o 3-O-{[α-L-ramnopiranosil-(1→6)]-O-[β-D-xilopiranosil(1→3)-O- α-L-ramnopiranosil(1→2)]]-β-D-galactopiranosídeo de quercetina (21), 3-O-{[α-L- ramnopiranosil(1→6)]-O-[β-D-xilopiranosil(1→3)-O-α-L-ramnopiranosil(1→2)]}-β-D-galacto- piranosídeo de canferol (22) e 3-O-{[α-L-ramnopiranosil(1→6)]-O-[β-D-xilopiranosil(1→3)-O-α- L-ramnopiranosil(1→2)]}-β-D-galactopiranosídeo de isoramnetina (23). O isolamento desses flavonoides contribui de forma significativa para a distinção de M. acanthophylla na área farmacológica e coloca-a ao lado de M. aquifolium e M. ilicifolia em importância nessa área. Os flavonoides 21 e 22 foram testados em soluções contendo radical livre (DPPH) e apresentaram excelentes níveis de neutralização dessa espécie. Corroborando com esses resultados, os estudos contidos na literatura indicam que os flavonoides antioxidantes isolados de espécies de Maytenus possuem comprovada atividade gastroprotetora. Os ensaios laboratoriais que mostraram o valor medicinal de plantas do gênero Maytenus concorrem para a validação do uso na medicina popular das mesmas. O estudo por cromatografia gasosa do extrato metanólico identificou oito carboidratos (18 e 19) das folhas de M. acanthophylla. O alditol galactitol (19) foi o constituinte mais abundante 2012 Conclusão 267 Oliveira, DM ( ) nesses extratos. O derivado peracetilado de 19, o hexaacetato de galactitol (19a) apresentou boa atividade inibitória da síntese de ATP em cloroplastos de alface (Spinea oleraceae L.) e a estrutura desse composto poderá servir como modelo à síntese de novos compostos com ação herbicida. Amostras dos extratos preparados das folhas de M. acanthophylla, em ensaios para medir ações citotóxicas contra as células tumorais, não foram ativas para MCF-7 (tumor de mama); TK- 10 (tumor renal) e UACC-62 (melanoma). Esses extratos também foram inativos em testes de atividade fungicida com espécies de Candida, bem como, não apresentaram atividades leishmanicida e nem antibiórica em ensaios bacteriológicos contra várias bactérias Gram- positivas e Gram-negativas. Por outro lado, o extrato metanólico das folhas mostrou significativa atividade analgésica em camundongos e, no ensaio para estabelecer o potencial citotóxico e a influência dos glicosídeos 20 e 23 sobre a proliferação de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC), esses glicosídeos agiram reduzindo significativamente a proliferação dessas células. Nesse ensaio, glicosídeo 23 mostrou um efeito inibitório maior, demonstrando um potencial imunomodulador dos linfócitos ativados e, ambos os glicosídeos 20 e 23, nas concentrações testadas, não apresentaram efeitos citotóxicos. O estudo apresentado nesta tese foi abrangente, sistemático e atendeu satisfatoriamente aos objetivos traçados neste curso de doutorado. Entretanto, devido ao grande potencial químico- farmacológico apresentado nas folhas de M. acanthophylla, justifica-se a continuidade dos estudos dessa espécie, visando a obtenção de novos compostos químicos, a partir do preparo de maiores quantidades de extratos, principalmente dos mais polares, e assim possibilitar o isolamento de vários novos constituintes minoritários, a exemplo dos flavonoides glicosídicos que foram apenas detectados por este estudo. Na área de Química dos Materiais, o constituinte 3 consiste em um biopolímero que pode servir como um polímero de engenharia, matéria prima para produção de terpenoides, bem como para a criação de novos plásticos dotados de propriedades biodegradáveis, resinas, colas, membranas inteligentes, condutores poliméricos, etc. Os estudos de plantas com alto valor agregado de qualidades químico-farmacológicas, como se pôde observar em M. acanthophylla, se tornam viáveis, tanto por contribuir para o conhecimento da nossa flora, como por poder estimular um modelo de exploração econômica da biomassa baseado em sustentabilidade, devido à possibilidade de renovação desse recurso natural a partir do cultivo racional dessas plantas. Oliveira, DM (2012) Capítulo 3 Referências Bibliográficas 268 Referências Bibliográficas 1 Hartmann, T., From waste products to ecochemicals: Fifty years research of plant secondary metabolism. Phytochemistry 2007, 68, (22-24), 2831-2846. 2 Stahl, C. 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