UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS 

FACULDADE DE FARMÁCIA 

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ANÁLISES CLÍNICAS E 

TOXICOLÓGICAS 

 

 

 

ISABELA AURORA RODRIGUES 

 

 

 

 

Avaliação funcional de vesículas extracelulares de 

Acanthamoebade diferentes genótipos 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Belo Horizonte 

2021 



 
 

ISABELA AURORA RODRIGUES 

 

 

 

 

AVALIAÇÃO FUNCIONAL DE VESÍCULAS EXTRACELULARES 

DE ACANTHAMOEBADE DIFERENTES GENÓTIPOS 

 

 

 

 

 

 

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Análises Clínicas e 

Toxicológicas daFaculdade deFarmácia da  

Universidade Federal de Minas Gerais para 

obtenção do título de doutor (a) em Análises 

Clínicas e Toxicológicas. 

 

 

 

Orientadora:  Dra. Adriana Oliveira Costa 

Co-orientador: Dr. Rodrigo Pedro P. Soares 

 

 

 

 

Belo Horizonte 

2021 

  



 
 

 

 

 

 

 

 

 

  



 
 

 



 
 

 

 

 



 
 

Agradecimentos 

Ao meu Deus pelo olhar atento, proteção e pelas inúmeras bênçãos que me 

proporcionou.  

Meus sinceros agradecimentos aos meus pais Edson e Mary pelo incentivo e 

exemplo de vida inspirador. 

Agradeço à minha família e aos amigos pelo apoio constante e incondicional 

mesmo não entendendo a rotina e dificuldade de uma vida científica.  

Ao meu filho, que ainda no meu ventre, compartilha comigo todos os meus 

sentimentos e me fortalece. 

À minha orientadora Dra. Adriana Costa por acreditar em mim desde o princípio e 

me confiar este trabalho e as demais tarefas, pela amizade, generosidade e pelo 

apoio indispensável dentro e fora do laboratório. Com certeza, é a pessoamais 

humana que conheço e o meu maior exemplo profissional. 

Ao meu coorientador Dr. Rodrigo Soares pela experiência passada, pelo 

tratamento cordial, ensinamentos e paciência.  

À Profa Dra Ana Cláudia Trocolli Torrecilhas, pela valiosa colaboração na 

realização do projeto. 

Aos colaboradores Armando, Paula e Felipe pelo suporte e auxílios nos 

experimentos. 

Às amizades cultivadas na UFMG eCentro de Pesquisas René Rachou. 

A todo o corpo docente e discente do programa de pós de Análises Clínicas e 

Toxicológicas- ACT e do Centro de Pesquisas René Rachou pela estrutura e apoio 

oferecido.  

Aos técnicos: Beto, Vanda, Leninha, Mariza e as meninas da limpeza pelo carinho 

comigo e manutenção mantendo o ambiente agradável. 

Aos Laboratórios parceiros: Imunologia Celular, Toxicologia e Biologia Molecular 

do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da Faculdade de Farmácia 

e aos laboratórios do Grupo Funcional de Parasitologia (GFP) e PROREC da 

FIOCRUZ pela estrutura e suporte. 

Às agências financiadoras CAPES pela concessão da minha bolsa e a Fundação 

de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais – FAPEMIG pelo financiamento.  

A todos que de certa forma contribuíram para este trabalho, de forma direta ou 

indireta. 

E por último, e não menos importante, as minhas “meninas” que pertencem ao 

melhor gênero de amebas, que me proporcionaram orgulho com os dados 

gerados.  

 

 



 
 

Resumo 

As amebas do gêneroAcanthamoeba são protozoários de vida livre 

amplamente dispersos no ambiente. Em algumas situações, elas são capazes 

de se adaptar a um tipo de vida parasitária, se transformando em patógenos 

que causam graves infecções em humanos. A capacidade de 

Acanthamoebacausar infecções por Acanthamoeba envolve fatores como a 

produção de proteases, que podem ser liberadas livremente no meio ambiente 

ou, conforme demonstrado em estudos recentes, compartimentadas em 

vesículas extracelulares (VEs). No entanto, a caracterização comparativa das 

VEs de diferentes cepasainda não foi descrita. O objetivo deste estudo foi 

realizar a comparação entre VEs produzidas por Acanthamoebade diferentes 

genótipos, avaliando as características físicas, perfil de proteases e de 

produção de óxido nítrico e citocinas após estimulação de macrófagos murinos. 

Foram utilizadas quatro cepas com diferentes características de 

patogenicidade, sendo três de origem ambiental (amostras de genótipos T1, 

T2, T11)e uma de caso de ceratite amebiana (amostra de genótipo T4). As VEs 

foram obtidas por ultracentrifugação, quantificadas por análise de rastreamento 

de nanopartículas e analisadas por microscopia eletrônica de varredura e 

transmissão. O perfil de proteases das VEs foi determinado por zimografia. A 

produção de óxido nítrico e citocinas por macrófagos peritoneais de murinosfoi 

medida após estimulação com VEs, usando camundongos de linhagens 

selvagens (BALB/c e C57BL/6) e nocautes para TLR2 e TLR4 (C57BL/6 TLR2 -

/-  e  TLR4 -/-). Todas as cepas, independentemente do genótipo, liberaram 

VEs e não houve diferença no tamanho ou concentração entre elas. As VEs 

exibiram atividade predominante de serinoproteases (pH 7,4 e 3,5), com 

atividade mais intensa nas cepas T4 e T1. As VEs da cepa ambiental não 

patogênica T11 exibiram um perfil mais pró-inflamatório, induzindo níveis mais 

elevados de óxido nítrico, fator de necrose tumoral alfa e interleucina-6, via 

TLR4 / TLR2, do que aquelas cepas com características patogênicas (T4, T1) e 

moderadamente patogênica (T2). A produção de óxido nítricopor macrófagos 

foi significativamente menorquando esses foram interagidos com VEs pré-

incubadas com inibidores de proteases ou inativadas por aquecimento. Em 

conjunto, esses dados indicam que VEs de Acanthamoebaexibem efeitos 

imunomoduladores queestão relacionados a seu potencial patogênico e que 

são dependentes da integridade das proteases. 

Palavras-chave: genótipos; interação parasita-hospedeiro; imunidade inata; 

proteases. 

  



 
 

Abstract 

Amoebas of the genus Acanthamoeba are free-living protozoa widely dispersed 

in the environment. In some situations, they can adopt a parasitic lifestyle and 

acts as pathogens that cause serious infections in humans. The ability of 

Acanthamoeba to cause infectionsinvolves factors as the production of 

proteases, which can be released freely in the environment or, as shown in 

recent studies, compartmentalized in extracellular vesicles(EVs). However, the 

comparative characterization of EVs of different strains has not yet been 

described.This study aimed to compare EVs produced by Acanthamoeba from 

different genotypes, evaluating physical features, profile of proteases and of 

nitric oxide and cytokines production after stimulation of murine macrophages. 

Four strains with different pathogenic characteristics were used: three from an 

environmental origin (samples of genotypes T1, T2, T11) and one obtained from 

a keratitis case (sample of genotype T4). Despite their genotype, all strains 

released EVs with no differences in size or concentration. EVs exhibited a 

predominant activity of serine proteases (pH 7.4 and 3.5), with more intense 

activity in those from T4 and T1 strains. Despite their genotype, all strains 

released EVs with no differences in size or concentration. EVs exhibited a 

predominant activity of serine proteases (pH 7.4 and 3.5), with more intense 

activity in those from T4 and T1 strains. Compared with pathogenic (T4 and T1) 

and moderately pathogenic (T2) strains, EVs from the environmental, 

nonpathogenic T11 strain exhibited a more proinflammatory profile, inducing 

higher levels of NO, tumor necrosis, and interleukin-6 via TLR4/TLR2.  Pre-

incubation with EVs treated with protease inhibitors or heating drastically 

decreased nitrite concentration production in macrophages. Altogether, these 

data indicated that EVs from Acanthamoeba exhibit immunomodulatory effects 

related to their pathogenic potential and dependent on the integrity of the 

proteases. 

Keywords: genotypes; host-parasite interaction; innate immunity; proteases. 



 
 

 

LISTA DE FIGURAS  

Figura 1: Atual classificação filogenética de Acanthamoeba 3 

Figura 2: Esquema comparativo dos grupos morfológicos de Acanthamoeba 4 

6 Figura 3: Formas evolutivas de Acanthamoeba spp 

Figura 4: Encefalite amebiana granulomatosa 10 

Figura 5: Lesões características de Ceratite Amebiana 12 

Figura 6: O processo de invasão da córnea por Acanthamoeba 13 

Figura 7:Liberação de microvesículas e exossomos. 20 

Figura 8: Esquema de transferência de estruturas por VEs 21 

Figura 9: Esquema das amostras e dos animais utilizados nos ensaios 

imunológicos 

37 

Figura 10: Análise de rastreamento de partículas (NTA) de vesículas 

extracelulares (VEs) de Acanthamoeba 

39 

Figura 11:Microscopia eletrônica de varredura de trofozoítos de 

Acanthamoeba em processo de vesiculação.: 

41 

Figura 12:Microscopias eletrônicas de transmissão de trofozoítos de 

Acanthamoeba em vesiculação. 

42 

Figura 13: Zimografia das VEs de cepas de Acanthamoeba 44 

Figura 14:Produção de óxido nítrico (NO), TNF-α e IL-6 por macrófagos 

peritoneais primados com INF e estimulados com VEs de Acanthamoeba. 

45 

Figura 15:Viabilidade celular dos macrófagos das linhagens BalbC e C57Bl/6  

durante estimulação com VEs. 

46 

Figura 16: Produção de NO por Acanthamoeba VEs aquecidas e pré-

incubadas com diferentes inibidores de proteases 

47 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
 

 

LISTA DE TABELAS 

Tabela 1: Função das vesículas extracelulares em diferentes parasitos 

humanos........................................................................................................... 23 

 

Tabela 2:Características principais das amostras de Acanthamoeba utilizadas 

no presente estudo: .......................................................................................... 27 

  



 
 

Lista de símbolos e abreviações 

α-alfa 

< - menor 

° C - Grau Celsius 

AIDS - Síndrome da Imunodeficiência Adquirida 

ATCC - America Type Culture Collection  

AVL -  Amebas de Vida Livre  

CA -  Ceratite Amebiana 

CBA -  Cytometric Bead Array 

cm2 -  centímetro quadrado  

CN -  Controle Negativo 

EAG - Encefalite Amebiana Granulomatosa 

EDTA – Ácido etilenodiaminotetracético 

E64(1 - [L - N - (trans - epoxysuccinyl) - leucyl ] amino - 4 - guanidinobutane) 

h - hora  

HIV - Síndrome da Imunodeficiência Adquirida 

IL-6 interleucina 6 

IL-12 interleucina 12 

INF ɣ Interferón gama 

kDa:-  kilodaltons 

M: molar 

MAPK – MAP quinase 

mg miligrama  

MIP-133 Proteína induzida por manose de aproximadamente 133 kDa  

MTT {brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil tetrazolium]}. 

mL mililitro  

mM milimolar  

NaOH Hidróxido de Sódio  

nm -  nanômetro 

NTA - Nanoparticle Tracking Analysis 

NO Óxido nítrico 

pH - Potencial Hidrogeniônico 

pg - picograma 

PMSF - Fluoreto de Fenilmetilsulfonila 



 
 

PYG -  Meio Proteose Peptone-Extrato de Levedo-Glicose 

RIPA1x PBS, 1% Nonidet P-40, 0.5% desoxicolato de sódio, 0.1% SDS 

RNA -  ácido ribonucleico 

RPM -  rotação por minuto 

RPMI - Roswell Park Memorial Institute (meio de cultura) 

SDS- PAGE - Dodecil-sulfato de sódio de poliacrilamida 

SFB -  Soro Fetal Bovino 

TNF- α – Fator de nerose tumoral 

TRIS -Tris-hidroximetilaminometano  

TRITON X-100 - Polietilenoglicol-terc-octilfenil éter 

U -unidade de atividade enzimática  

VEs - vesículas extracelulares  

μL -microlitro  

μm - micrômetro 

μM- micromol 

xg - gravidade 

 

 

 



 
 

SUMÁRIO 

1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 14 

2. REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................................................ 16 

2.1 Classificação taxonômica, morfológica e molecular do gênero Acanthamoeba .............. 16 

2.2. Morfologia e biologia de Acanthamoeba ......................................................................... 18 

2.3 Infecções causadas por Acanthamoeba ............................................................................ 21 

2.3.1 Encefalite Amebiana Granulomatosa (EAG) .............................................................. 21 

2.3.2 Ceratite Amebiana ..................................................................................................... 23 

2.3.3.Tratamento das infecções causadas porAcanthamoeba ........................................... 27 

2.4 Patogenicidade de Acanthamoeba ................................................................................... 28 

2.4.1 Mecanimos indiretos .................................................................................................. 29 

2.4.3 Mecanismos diretos ................................................................................................... 30 

2.5Atividade imunológica em infecções por Acanthamoeba ................................................. 31 

2.6Vesículas extracelulares ..................................................................................................... 33 

2.6.1 Interação e função das VEs ........................................................................................ 34 

3. OBJETIVOS ............................................................................................................................... 39 

3.1 Objetivo Geral: .................................................................................................................. 39 

3.2 Objetivos Específicos: ........................................................................................................ 39 

3.2.1 ..................................................................................................................................... 39 

3.2.4 ..................................................................................................................................... 39 

3.2.5 ..................................................................................................................................... 39 

4. METODOLOGIA ........................................................................................................................ 40 

4.1 Cultivo dos Isolados de Acanthamoeba ............................................................................ 40 

4.2 Condições de vesiculação .................................................................................................. 42 

4.3 Isolamento das vesículas extracelulares ........................................................................... 42 

4.4 Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) ........................................................... 43 

4.5 Microscopia eletrônica ...................................................................................................... 43 

4.6 Atividade de proteases nas VEs de Acanthamoeba .......................................................... 45 

4.7Indução de marcadores inflamatórios por VEsde Acanthamoeba .................................... 46 

4.7.1 Animais ....................................................................................................................... 46 

4.7.2 Preparo dos macrófagos ............................................................................................ 46 

4.7.3 Estimulação dos macrófagos ...................................................................................... 46 

4.7.4 Dosagem de óxido nítrico ........................................................................................... 47 

4.7.5Dosagem de IL-6 e TNF- α ........................................................................................... 48 

4.7.6 Viabilidade dos macrófagos estimulados por VEs e lisado celular ............................ 48 



 
 

4.7.7Papel das proteases carreadas por VEs na produção de NO ...................................... 49 

4.8 Análise estatística .............................................................................................................. 49 

5. RESULTADOS ........................................................................................................................... 52 

5.1Acanthamoeba produz VEs com características comuns entre os diferentes genótipos .. 52 

5.2 As VEs carreiam proteases predominantemente classificadas como serinoproteases .... 57 

5.3 As VEs das cepas patogênicas e não patogênicas apresentaram diferentes níveis de 

ativação pró-inflamatória em macrófagos murinos ............................................................... 58 

5.4. A produção de Óxido Nítrico pelas VEs das cepas consideradas patogênicas depende da 

integridade das proteases ....................................................................................................... 60 

6. DISCUSSÃO .......................................................................................................................... 62 

7. CONCLUSÃO ............................................................................................................................ 71 

8. REFERÊNCIAS ........................................................................................................................... 72 

9. ANEXOS ................................................................................................................................... 87 

 

  



14 
 

 

1. INTRODUÇÃO 

As amebas de vida livre (AVL) são protozoários distribuídos amplamente 

na natureza, podendo ser encontradas tanto em ambientes naturais como o 

solo, vegetação, água (lagos, rios, etc),quanto em artificiais, como sistemas de 

arcondicionado, piscinas, acessórios e equipamentos hospitalares (CLARKE; 

NIEDERKORN, 2006).Elas constituem um grupo amplo e diversificado 

composto por vários gêneros e centenas de espécies (PAGE, 1988). São 

consideradas predadoras de bactérias e atuam controlando a sua população no 

solo e em ambientes aquáticos. Outra característica dessas amebas é a 

capacidade de resistir ao processo de cloração da água, o que possibilita a 

proteção de alguns microrganismos fagocitados, como fungos e bactérias, 

servindo como um reservatório para infecções em humanos. (CHAVATTE et 

al., 2016; MARCIANO-CABRAL et al., 2003). Diferentemente da espécie 

Entamoeba histolytica, que é fundamentalmente um organismo parasita do ser 

humano, as amebas de vida livre não necessitam de hospedeiro para 

sobreviver. No entanto, são seresanfizóicos, poreventualmente serem capazes 

de se adaptar a um tipo de vida parasitária e causar infecções em humanos e 

outros vertebrados (KHAN et al., 2006;MARTINEZ; VISVESVARA, 

1997).Nesse grupo, também denominado AVL com potencial patogênico, 

incluem-se Naegleria fowleri, Sappinia pedata, Balamuthia mandrillaris eas 

espécies do gênero Acanthamoeba.  

O gênero Acanthamoebarepresenta as AVL potencialmente patogênicas 

mais frequentemente isoladas do ambiente (LORENZO-MORALES et al., 

2005), estando associado a duas graves infecções principais: a Encefalite 

Amebiana Granulomatosa (EAG) e a Ceratite Amebiana (CA). A EAG ocorre 

predominantemente em indivíduos imunocomprometidos e é uma infecção 

considerada rara, mas com alta taxa de letalidade (THAMTAM et al., 2016). A 

CA tem aumentado em número nos últimos anos, especialmente devido ao uso 

de lentes de contato, associada ao manuseio inadequado ou falta de 

higienecom esses acessórios (LORENZO-MORALES et. al., 2015). 

Diversos fatores têm sido investigados para compreender a capacidade 

de Acanthamoebaagir como patógeno. O gênero é composto por várias 



15 
 

 

espécies (PUSSARD & PONS, 1977), porém atualmente a classificação de 

isolados é realizada com base em genótipos determinados por sequenciamento 

do 18SrDNA. As infecções ocorrem mais frequentemente por Acanthamoeba 

de genótipo T4, embora outros também estejam envolvidos com menos 

frequência (MACIVER et al., 2013). Linhagens de Acanthamoeba com maior 

potencial patogênico apresentam algumas características fisiológicas que as 

tornam capazes de estabelecer o processo infeccioso. Fatores como a 

expressão de moléculas de adesão, produção de proteases que agem sobre os 

tecidos, capacidade de se transformar em formas cística durante a infecção, 

são alguns exemplos do que vem sendo estudado para compreender a 

fisiopatologia das infecções (CLARKE; ALIZADEH; NIEDERKORN, 2006; 

RETANA-MOREIRA et al., 2015). Considerando que algumas infecções por 

Acanthamoebasão oportunistas, fatores do hospedeiro também devem ser 

considerados, e por isso elementos da resposta imune também são 

investigados (MACIVER et al., 2013; REN & WU, 2011).     

Recentemente, foi demonstrado que Acanthamoeba produz e 

liberavesículas extracelulares (VEs), que parecem estar envolvidas em 

mecanismos de patogenicidade dessas amebas (GONÇALVES et al., 2018; 

LIN et al., 2019). As VEs são estruturas ou partículas com membranas, já 

identificadas como componentes produzidos por diversos tipos celulares, e que 

desempenham papeis em processos patológicos e fisiológicos (CAMPOS et al., 

2015). Os estudos realizados com VEs de Acanthamoeba são recentes e 

utilizaram apenas uma linhagem (GONÇALVES et al., 2018; LIN et al., 2019). 

Não há informações sobre a variação de perfil de produção VEs ou diferenças 

em aspectos funcionais entre diferentes linhagens ou genótipos de 

Acanthamoeba. Considerando esta lacuna, a hipótese de que VEs de 

Acanthamoebade diferentes genótipos apresentam características funcionais 

distintas é investigada nesse trabalho.   



16 
 

 

2. REVISÃO DA LITERATURA 

2.1 Classificação taxonômica, morfológica e molecular do gênero 

Acanthamoeba 

As amebas do gênero Acanthamoebaforam inicialmente descritas em 

1930 por Castellani, porém utilizando a denominação de gênero Hartmannella 

e da espécie Hartmannella castelanii. Volkonsky, em 1931, dividiu o gênero 

Hartmannella em três subgêneros: Hartmannella, Glaeseria eAcanthamoeba. 

Após duas décadas, Singh (1952), Pussard (1966) e Singh e Das (1970), 

questionaram a classificação dessas amebas e após avaliar diversas cepas de 

Hartmanella e Acanthamoeba, Page (1967) concluiu que a formada 

classificação estabelecida era duvidosa na diferenciação de espécies, porém, 

que a presença de acantopódios e as características dos cistos eram 

suficientes para uma proposta de classificação do gênero baseada nas 

características morfológicas. Em 1975, Sawyer e Griffin estabeleceram uma 

nova classificação filogenética incluindo a família Acanthamoebidae (KHAN, 

NAVEED AHMED, 2006). Em 1988, o gênero Hartmannella foi alocado na 

família Hartmannellidae estabeleceu-se a atual classificação filogenéticadas 

AVLs (Figura 1). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 1: Atual classificação filogenética de Acanthamoeba em relação às 

outras amebas de vida livre. Fonte: adaptado de KHAN, 2006. 

  



17 
 

 

 

 

Aproximadamente, 25 espécies de Acanthamoeba são descritas com 

base na morfologia dos cistos proposta pela classificação tradicional. Porém, 

ainda assim, a variedade morfológica e as alterações decorrentes das 

condições de cultura em uma determinada cepa podem dificultar ou impedir a 

identificação.(SIDDIQUI; KHAN, 2012). 

Com isso, uma classificação simplificada foi adotada, permitindo categorizar os 

isolados em grupos I, II, e III, de acordo com o tamanho do cisto e a morfologia 

do endocisto e ectocisto (PUSSARD, M.; PONS, 1977)(Figura 2). 

 

Grupo I II III 

Diâmetro 16 a 30μm  ≤ a 18μm  ≤ a 18μm  

Forma do 

endocisto 

Aspecto estrelado, 

braços bem visíveis 

Levemente 

estrelado, oval ou 

poliédrico 

Oval ou 

levemente 

angular 

Forma do 

ectocisto 

Contorno circular, 

liso ou ondulado 

Segue o contorno 

do Endocisto. 

Fino e liso ou 

fracamente 

ondulado 

Forma 

microscópica 

observada 

   

 

Figura 2:Esquema comparativo dos grupos morfológicos de Acanthamoeba.Classificação 

baseada na morfologia dos cistos dos 3 diferentes grupos de Acanthamoeba. Fonte: 

modificado de QVARNSTROM et al., 2009. 

 

 

Basicamente, espécies pertencentes ao grupo I apresentam cistos 

grandes (acima de 16-18 μm de diâmetro), caracterizados pela forma estrelada 

do endocisto e a parede externa é esférica e lisa (APARECIDA DA SILVA; 

ARISTEU DA ROSA, 2003; MARCIANO-CABRAL et al., 2003).  Já as espécies 

do grupo II apresentam cistos de tamanho médio menor que 18 μm, sendo que 



18 
 

 

o endocisto pode apresentar-se de forma estrelada, oval, triangular ou 

quadrangular. Já o ectocisto segue o contorno do endocisto e é geralmente 

rugoso (SCHUSTER; VISVESVARA, 2004a; WALOCHNIK; OBWALLER; 

ASPÖCK, 2000). 

O grupo III compreende as espécies que também possuem tamanho 

médio menor que 18 μm, com endocisto de forma oval ou globosa, nunca 

estrelado. O ectocisto delgado e liso é justaposto ao endocisto e, às vezes, 

difícil de ser observado (PUSSARD, PONS, 1977; SCHUSTER; VISVESVARA, 

2004a).   

Embora a morfologia de grupos ainda seja utilizada na identificação dos 

isolados, estudos moleculares com foco nas sequências da pequena 

subunidade de genes nucleares 18S rRNA são atualmente a principal 

ferramenta para caracterização taxonômica de Acanthamoeba(FUERST; 

BOOTON; CRARY, 2015). 

A existência de 12 genótipos foi relatada após analisar essa sequência em 53 

isolados (STOTHARD et al., 1998). Até então, um total de 20 genótipos foram 

descritos (CORSARO et al., 2015; MAGNET et al., 2014). 

Cada genótipo exibe ao menos 5% de divergência genética dos outros 

genótipos e existem 12 regiões variáveis na região 18S do rRNA, sendo que 

todas devem ser consideradas para a determinação de um novo genótipo 

(CORSARO; VENDITTI, 2010). Essa classificação genotípica permite associar 

alguns a um maior potencial em causar infecções. Dos genótipos isolados e 

descritos, o genótipo T4 é o mais frequentemente envolvido em casos clínicos 

de ceratite e encefalite (MACIVER et al., 2013). 

As causas para essa prevalência são incertas, entretanto, acredita-se que 

amebas desse genótipo possuam maior virulência e propriedades que 

aumentam sua capacidade de infecção, assim como maior resistência a 

agentes quimioterápicos. 

 

2.2. Morfologia e biologia de Acanthamoeba 

As amebas do gênero Acanthamoeba apresentam duas formas evolutivas em 



19 
 

 

seu ciclo de vida: a fase do cisto, com uma mínima atividade metabólica, e a 

fase do trofozoíto que apresenta um crescimento vegetativo (Figura 3) 

(SIDDIQUI e KHAN, 2012). Ambas as fases podem ser encontradas nos 

ambientes e em tecidos infectados (YUEHUA et al., 2014).  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 3:Formas evolutivas de Acanthamoeba spp: A. Trofozoito em 

microscopia de contraste de fase com vacúolo contrátil (vc), vacúolos 

alimentares (va) e núcleo (n).  B. Trofozoíto em microscopia eletrônica de 

varredura com acantopódios evidentes (ac). C. Cistos em cultura axênica 

em microscopia óptica convencional com ectocisto (ec) e endocisto (en) 

evidentes. D. Cistos em microscopia eletrônica de varredura com 

ostíolos evidentes (o).Fonte: autoria própria. 

 

As formas ativas de Acantamoeba são os trofozoítos, que são 

pleiomórficos, emitem pseudópodes finos de forma afilada, denominados 

acantopódios, que são estruturas características do gênero (Figura 3 A e B). 

Os trofozoítos variam em tamanho, que pode ser de 14 a 40 µm de diâmetro, 

(KINDE et al., 2007). O citoplasma do trofozoíto é abundante e granuloso, com 



20 
 

 

movimentos polidirecionais. Ele apresenta diversos vacúolos digestivos com 

um ou dois deles representando vacúolo contrátil responsável pelo controle 

osmótico da célula (LLOYD; MELLOR; WILLIAMS, 1983; VAN 

WAEYENBERGHE et al., 2013)(Figura 3 A e B).Os trofozoítos se multiplicam 

assexuadamente por fissão binária, processo que se inicia quando os 

trofozoítos se dividem ao atingir certo tamanho. O corpo celular torna-se 

esférico e coberto por pseudópodos curtos, que depois se alonga e finalmente 

o organismo divide-se em duas partes. Sendo que, enquanto isso, o núcleo já 

se dividiu por mitose(YOUSUF; SIDDIQUI; KHAN, 2013).  

A locomoção, adesão e captura de microrganismos envolve a ação de 

pseudópodes emitidos pelos trofozoítos que utilizam para se alimentar de 

bactérias, fungos, leveduras, matéria orgânica, vírus e algas, além de outras 

partículas do substrato. Eles podem sobreviver em cultivo axênico e ingerir 

nutrientes líquidos por meio da pinocitose (BOWERS; KORN, 1968; KHAN et 

al., 2006).  

Os cistos são observados em condições adversas, como alta temperatura, 

dessecação, falta de nutrientes e presença de alguns agentes químicos 

(desinfetante e antimicrobiano) e físicos (calor, frio e radiação ultravioleta). São, 

portanto, considerados as formas de resistência do microrganismo (AKSOZEK 

et al., 2002). O cisto possui tamanho de 10-20 µm aproximadamente e 

apresentam parede externa dupla composta pelo ectocisto, forma mais 

esférica, e endocisto, que apresenta formas variáveis de triangulares a 

estrelares, com junções entre as duas camadas, evidenciando estruturas 

chamadas de ostíolos, que sãoporos existentes na parede do cisto(Figura 3 C 

e D).(PAGE, 1988; SCHUSTER; VISVESVARA, 2004a).  

A composição do cisto inclui aproximadamente 35% de carboidratos, sendo a 

celulose o principal açúcar, 33% de proteínas, 6% de lipídios e outros materiais 

não identificados (SIDDIQUI; KHAN, 2012). A membrana plasmática é 

constituída por aproximadamente 33% de proteínas, 25% de fosfolipídios, 13% 

de esteróis e 29% lipofosfoglicanos. (DEARBORN; KORN, 1974; SIDDIQUI; 

KHAN, 2012; SMITH; KORN, 1968). Sua formação envolve a ação da 

serinoprotease CSP21 que é uma proteína específica envolvida no processo de 

revestimento do trofozoíto durante o encistamento. O desencistamento, por sua 



21 
 

 

vez, ocorre quando o cisto é exposto a condições ideais de crescimento para o 

trofozoíto, sendo essas alterações ambientais detectadas através de poros 

existentes na parede do cisto, conhecidos como ostíolos. O trofozoíto deixa 

então o cisto, separando-se da parede que o protegia, completando o ciclo 

(KHAN, NAVEED AHMED, 2006). 

 

2.3 Infecções causadas por Acanthamoeba 

As amebas do gêneroAcanthamoebapodem causar em humanos dois 

tipos principais de infecções: uma em que as amebas infectam o hospedeiro 

por meio de lesões cutâneas ou pelo trato respiratório, se disseminando por via 

hematogênica até o encéfalo e outra constituída por infecção da córnea.  

 O primeiro tipo determina quadros que afetam a nasofaringe, o ouvido, 

a pele (acantamebíase cutânea), com posterior disseminação, estando 

associado a indivíduos imunocomprometidos por meio de infecções por HIV 

(DOWELL et al., 2015), tratamento com imunossupressor após transplante de 

órgãos, alcoolismo, abuso de drogas, tratamento com esteroides, quimioterapia 

e radioterapia para tumores malignos(CHOMICZ et al., 2010). Portadores de 

outras doenças como diabetes, Lupus Eritematoso Sistêmico (THAMTAM et al., 

2016), insuficiência renal, cirrose, tuberculose, úlcera na pele e doença de 

Hodgkin também são afetados, devido a uma queda no sistema imunológico 

que favorece o crescimento e disseminação destas amebas (DA ROCHA-

AZEVEDO; TANOWITZ; MARCIANO-CABRAL, 2009).  

O segundo tipo de infecção por Acanthamoeba, a Ceratite Amebiana 

(CA), não tem relação com imunosupressão. O aumento da sua incidência nas 

últimas décadas é atribuído à popularização de lentes de contato (KHAN et al., 

2006; RADFORD; MINASSIAN; DART, 2002).  

 

2.3.1 Encefalite Amebiana Granulomatosa (EAG) 

A Encefalite Amebiana Granulomatosa (EAG), é uma doença de 

progressão lenta e é quase sempre fatal, com uma taxa de mortalidade de 85% 

(TORNO et al., 2000;,ZAMORA; HENDERSON; SWIATLO, 2014). A EAG  se 



22 
 

 

desenvolve quando as amebas que infectaram o indivíduo por via cutânea ou 

respiratória, atravessam a barreira hematoencefálica e atingem o encéfalo. 

Embora esse primeiro tipo de infecção por Acanthamoebaocorra 

prioritariamente em imunocomprometidos, há algunsrelatos de casos em 

pacientes sem sinais de imunodepressão (DA ROCHA-AZEVEDO; TANOWITZ; 

MARCIANO-CABRAL, 2009). 

Os sintomas incluem dor de cabeça, febre, alterações comportamentais, 

hemiparesia, letargia, rigidez de nuca, afasia, ataxia, vômitos, náuseas, 

paralisia do nervo craniano, aumento da pressão intracraniana, convulsões e 

finalmente a morte. O óbito é devido à hemorragia, lesões necróticas com 

irritação meníngea grave e encefalite (KHAN et al., 2006). 

Seu diagnóstico definitivo pode ser estabelecido pela associação de 

dados clínicos e exames complementares como exame no líquido 

cefalorraquidiano (LCR); (KINDE et al., 2007), feito pela visualização dos 

trofozoítos ou cistos através da coloração de Gram, Giemsa, hematoxilina e 

eosina, porém estas colorações não diferem as os protozoários de macrófagos, 

por exemplo. A melhor maneira para identificação das amebas seria através da 

morfologia da parede dos cistos e da forma nuclear e dos vacúolos do 

trofozoítos (CALIOT et al., 2017). 

O protozoário pode ainda ser cultivado facilmente in vitro em meios 

especiais. Os altos títulos de anticorpos específicos para detecção de 

Acanthamoebano soro de pacientes são indicativos de infecção por EAG, 

porém o fato de poder existir um alto índice de anticorpos em indivíduos 

saudáveis devido ao constante contato entre humanos e amebas, impede que 

a sorologia seja utilizada na rotina diagnóstica (ZAMORA; HENDERSON; 

SWIATLO, 2014). 

Técnicas moleculares também podem ser usadas no diagnóstico, porém 

estas apresentam alto custo e são de acesso limitado (DA ROCHA-AZEVEDO; 

TANOWITZ; MARCIANO-CABRAL, 2009). Não existe um tratamento eficaz e 

recomendado, uma vez que as amebas apresentam baixa sensibilidade a 

agentes antimicrobianos e muitos destes agentes são incapazes de atravessar 

a barreira hematoencefálica, no sistema nervoso central. A terapia é realizada 

através da combinação de antimicrobianos, antifúngicos e anti-inflmatórios. 



23 
 

 

(KHAN et al., 2006; SIDDIQUI; KHAN, 2012).  

 

 

. 

Figura 4:Encefalite amebiana granulomatosa. Relato de caso de um paciente de 

28 anos diagnosticado com Lupus eritematosa sistêmico e EAG. A: Pequenas áreas 

necróticas macroscópicas (círculo amarelo). B: forma do cisto de Acanthamoeba 

evidenciando a parede enrugada. Fonte: THAMTAM et al., 2016 

 

2.3.2 Ceratite Amebiana 

A ceratite por Acanthamoeba é uma doença de reconhecimento 

relativamente recente e nas últimas décadas, caracterizada pela destruição 

progressiva da córnea causada pela invasão por Acanthamoeba, podendo ser 

uni ou bilateral (CLARKE; ALIZADEH; NIEDERKORN, 2006).  

No Brasil, os primeiros casos foram descritos por Nosé et al. em 1988. A 

infecção se desenvolve em pessoas imunocompetentes e foi ligada 

principalmente às espécies: A. poliphaga, A. Castellani, A. rhysodes, A. 

hatchetti, A. culbertsoni, A. astronyxis, A. quina e A. lugdunensis (KHAN et al., 

2003).  O seu manejo clínico tem sido motivo de vários estudos, sendo 

considerada uma infecção de difícil diagnóstico e tratamento (WALOCHNIK et 

al., 2000; KHAN et al., 2003). 

Dentre os fatores de risco para a infecção, os principais são os danos 

pré-existentes na córnea, que podem ocorrer por traumas com objetos 

estranhos como iodo, terra e lentes de contato. O uso das lentes é o principal 

fator de risco para CA, especialmente quando há falha no processo de 

higienização das lentes de contato de uso diário. O uso de soluções salinas 



24 
 

 

caseiras, produzidas com sal de cozinha para a limpeza das lentes de contato 

apresentou-se como um fator de risco importante no desenvolvimento dos 

primeiros casos (SIDDIQUI; KHAN, 2012). Testes em lentes de contato usadas 

mostraram a presença de diversos sacarídeos após apenas 30 minutos de uso, 

que podem agir como receptores para trofozoítos de Acanthamoeba, 

aumentando a probabilidade de ocorrer ligação das amebas às lentes de 

contato. (SCHUSTER; VISVESVARA, 2004b).  

O quadro clínico, inicialmente, pode ser confundido com outras 

infecções da córnea, causadas por diferentes microrganismos, podendo levar a 

erro no diagnóstico.  A ceratite dendrítica resultante do vírus herpes simplex ou 

adenovírus apresenta características similares a CA (BROWN et al., 2017; DA 

ROCHA-AZEVEDO; TANOWITZ; MARCIANO-CABRAL, 2009). Na fase 

avançada, a infecção se assemelha a um quadro clínico de ceratite fúngica ou 

uma úlcera da córnea. Também é possível confundir o diagnóstico da CA com 

ceratite bacteriana, já que ambas apresentam sintomatologia semelhante 

(RETANA-MOREIRA et al., 2015; SIDDIQUI; KHAN, 2012). 

Os principais sintomas da doença são olhos avermelhados, 

lacrimejamento, fotofobia, dor e edema na pálpebra. Uma constante hiperemia 

conjuntival e inflamação na córnea também podem ocorrer (Figura 5). 

 

 

Figura 5:Lesões características de Ceratite Amebian.: A: Infiltrado em forma 

de anel, característico em CA. B: Lesões na córnea após a aplicação do 

corante fluoresceína de sódio (LORENZO-MORALES et. al., 2015). 

 

Quando trofozoítos infiltram os nervos da córnea, pode ocorrer um 

quadro de neurite e necrose. Coriorretinite ocorre raramente em casos que o 



25 
 

 

parasita invade a retina. 

No início da infecção, as amebas ficam restritas ao epitélio da córnea, 

mas progridem e invadem o estroma, onde provocam grande inflamação. O 

achado clínico mais característico é a presença de um infiltrado inflamatório 

estromal em forma de anel, constituído principalmente por neutrófilos 

(ERTABAKLAR et al., 2009; KINDE et al., 2007; MARCIANO-CABRAL et al., 

2003). Deste modo, os trofozoítos se ligam à glicoproteínas de manose 

presentes no epitélio da córnea hospedeira através da proteína ligadora de 

manose (MBP) de 136 kDa da membrana trofozoítica (Figura 6 A). Micro-

traumas levam ao aumento da expressão de glicoproteínas de manose no 

epitélio da córnea, sendo esse um fator de risco determinante para a instalação 

da doença.   

A exposição de trofozoítos de Acanthamoeba a manose induz aumento 

da expressão de uma protease de 133kDa, conhecida como MIP133.A MIP133 

é um fator citopático que atua pela indução de apoptose em queratinócitos, 

células do corpo ciliar, células epiteliais do pigmento de retina, células do 

epitélio da córnea e células endoteliais da córnea (Figura 6 B e C) (CLARKE, 

DANIEL W.; NIEDERKORN, 2006b). Uma intensa dor é relatada por pacientes 

com CA e acredita-se que seja devido à produção da Ceratoneurite radial 

causada pelo acúmulo dos trofozoítos próximos aos nervos da córnea (Figura 

6 E). Os trofozoítos em sua maioria não penetram a nível intraocular (Figura 6 

F). Clarke e colaboradores (2005), em experimentos in vivo, demonstraram que 

os trofozoítos que conseguem penetrar a esse nível são eliminados por um 

intenso infiltrado inflamatório. As proteases são fatores de virulência já 

identificados em diversos microrganismos como vírus, bactérias e protozoários. 

Os trofozoítos de Acanthamoeba utilizam proteases, tais como 

serinoproteases, cisteína proteases, elastase e metaloproteases, para invadir o 

estroma (Figura 6 D) (CLARKE; NIEDERKORN, 2006). Proteases secretadas 

por Acanthamoeba apresentam capacidade de degradar diversos componentes 

da matriz extracelular. Kong e colaboradores (2000) identificaram uma 

serinoprotease de 33kDa em uma cepa do genótipo T12, com a capacidade de 

degradar fibrinogênio, IgG, IgA, albumina, hemoglobina, além de também 

degradar os principais componentes da matriz extracelular: colágeno tipo I, 



26 
 

 

colágeno tipo IV e fibronectina. Cepas patogênicas exibem proteases 

específicas, como o ativador de plasminogênio de 40 kDa, que não são 

encontradas em cepas ambientais (MITRO et al., 1994). As metaloproteases de 

matriz são enzimas proteolíticas que também possuem papel importante para a 

degradação de componentes da matriz extracelular no processo de invasão por 

Acanthamoeba(CLARKE; NIEDERKORN, 2006). Nesse contexto, as proteases 

em Acanthamoeba são fundamentais para que essa ameba de vida livre 

obtenha sucesso ao infectar e colonizar um hospedeiro. No entanto, ainda 

existem muitos fatores do mecanismo molecular que regula a patogenicidade 

em Acanthamoebaque necessitam de um maior entendimento. 

 

 

Figura 6:O processo de invasão da córnea por Acanthamoeba. A) Os trofozoítos 

aderem ao epitélio da córnea. B) Destruição do epitélio pela ação da protease MIP133. 

C) Rompimento da membrana de Bowman e invasão do estroma. D) Degradação do 

estroma pela ação de diversas proteases. E) Acúmulo de trofozoítos próximos ao nervo 

da córnea causando ceratoneurite. F) Incapacidade dos trofozoítos em penetrar a nível 

intraocular. Fonte: adaptado de CLARK; NIEDERKORN, 2006). 

 

Um método de diagnóstico rápido e eficaz ainda é necessário para o 

manejo de casos de CA. A confirmação da infecção muitas vezes só é 

realizada pela biópsia ou raspado da córnea, o que pode acontecer após a 



27 
 

 

retirada da córnea (RETANA-MOREIRA et al., 2015; SCHAUMBERG; SNOW; 

DANA, 1998). 

Mesmo após o diagnóstico correto, ainda há dificuldade em encontrar o 

tratamento eficaz, uma vez que cistos de amebas são extremamente 

resistentes à ação de fármacos e agente químicos (SCHAUMBERG; SNOW; 

DANA, 1998). 

 

2.3.3.Tratamento das infecções causadas porAcanthamoeba 

O tratamento para a acantamebíase deve ser iniciado imediatamente 

após o diagnóstico e até mesmo suspeita clínica, por ser uma infecção difícil de 

tratar e estar associadas a prognósticos ruins do paciente, como deficiência 

visual em caso da CAeóbito em caso de EAG.  

Os principaisobjetivos do tratamento incluem reduzir a carga parasitária, 

inibir o crescimento domicrorganismoe impedir a invasão dos tecidos do 

hospedeiro (KHAN, 2006). 

A farmacoterapia adotada deve ser combinada considerando a 

resistência do protozoário às drogas utilizadas. Os componentes da dupla 

parede dos cistos de Acanthamoeba atuam como uma barreira física natural 

que impede àabsorção dos fármacos. 

A miltefosina, composto utilizado para o tratamento de câncer e 

leishmaniose, pode ser utilizada para o tratamento (WALOCHNIK et al., 

2002).As biguanidas são capazes de destruir a membrana plasmática do 

trofozoíto (SEAL, 2003). Enquanto asdiamidinas, por sua vez, não possuem 

mecanismo de ação completamente elucidado. Entretanto, o uso combinado 

das duas drogas apresenta um mecanismo de ação eficaz no tratamento. O 

uso de antibióticos como bezetacil, anfotericina B e tetraciclina associados a 

corticóides também são eficazes, mas muitas vezes apresentam alta toxicidade 

ao paciente.  

Dentre os benefícios do uso de corticosteroides para o tratamento da 

CApor Acanthamoeba, estão o alívio da dor e a melhoria da visão a curto e 

longo prazo (PARQUEet al., 2014). Entretanto, a diminuição da resposta imune 

causada pelo uso desses medicamentos pode piorar o quadro visto 



28 
 

 

quemacrófagos e neutrófilos são capazes de eliminar facilmente os trofozoítos 

de Acanthamoeba (KHAN, 2006). 

Um exemplo clássico da dificuldade no tratamento consiste no regime de 

rígido no tratamento da CA,que é demonstrado pelo fato das soluções tópicas 

serem administradas em intervalos inferiores de 1 hora em alguns casos. Ele 

também é muito longo, podendo demorar até um ano para ser concluído, o que 

pode gerar completo desconforto e perda da qualidade de vida do paciente, 

além de custos financeiros (KHAN, 2006). 

A busca de novos agentes amebicidas é muito importante para melhorar 

otratamento para amebíase. Atualmente, têmsido testados extratos vegetais 

com essa finalidade que apresentam baixa toxicidade a células humanas e alta 

efetividade contra cistos e trofozoítos de Acanthamoeba. Além disso, os 

avanços das técnicas de biologia molecular para encontrar biomarcadores e 

entender a patogenicidade de Acanthamoeba podem servir como alvo 

terapêutico (SIDDIQUI et al., 2016). 

 

2.4 Patogenicidade de Acanthamoeba 
 

Embora as manifestações clínicas das infecções acometidas por 

Acanthamoebasão bem descritas, os mecanismos precisos associados com a 

patogênese da Acanthamoebanão foram totalmente esclarecidos. 

Compreender a base da patogenicidade daAcanthamoeba é crucial para o 

desenvolvimento de intervenções terapêuticas. É bem estabelecido que a 

patogenicidade seja um processo complexo que envolve múltiplos fatores, 

tanto voltado em parte pelo parasita quanto em parte pelo hospedeiro, e não há 

um determinante único que cause ou que permita que esses parasitas 

produzam essas doenças em humanos.  

Os fatores conhecidos voltados à patogênese são os mecanismos indiretos e 

diretos, tanto dependente quanto independente de contato entre a ameba e o 

tecido do receptor, ligados também às características intrínsecas do 

hospedeiro. 

 



29 
 

 

2.4.1 Mecanimos indiretos 

I. Morfologia: As diferentes formas de vida apresentadas por Acanthamoeba 

(cistos e trofozoítos) são consideradas mecanismos associados ao poder 

patogênico deste organismo (DEARBORN; KORN, 1974). O trofozoíto é um 

fagócito capaz de fagocitar células, processo importante tanto na sobrevivência 

no ambiente, habilitando-o a incorporar partículas alimentares e outros 

microrganismos, quanto na patogênese das infecções, por sua habilidade de 

engolfar partes celulares por formação amebostomos. Além disso, sua forma 

de resistência conhecida como cistos podem manter sua integridade e 

conservar a patogenicidade durante vários anos em condições adversas, sendo 

este um importante fator na propagação de infecções causadas por esta 

ameba. A capacidade de rápida transformação em cistos tem sido também 

considerada um fator de patogenicidade (ROCHA AZEVEDOet al., 2009).  O 

encistamento nos tecidos infectados também é considerado uma importante 

forma de Acanthamoeba resistir ao sistema de defesa do hospedeiro, 

sobrevivendo a mecanismos inflamatórios e ao uso de para combater a 

infecção (SIDDIQUIet al., 2009). 

II. Tolerância à temperatura e osmolaridade e diferentes pHs: Ao 

estabelecer infecções sistêmicas ou encefalite, Acanthamoebaé exposta a 

temperaturas maiores do que habitualmente enfrenta no ambiente. De forma 

similar, na ceratite amebiana, as amebas são expostas à alta 

osmolaridaderepresentada pela salinidade da lágrima. Portanto, o crescimento 

a altas temperaturas e a alta osmolaridade é descrito como características 

associadas à patogenicidade de Acanthamoebaem se estabelecer no 

hospedeiro (WALOCHNIKet al., 2000; KHAN et al., 2001; KHANet al., 2002). 

Além disso, Acanthamoeba pode crescer em faixas de pH de 4 a 12 (KHAN et 

al., 2006), evidenciando uma alta adaptabilidade a condições extremas. 

III. Resistência a substâncias químicas: Os trofozoítos de Acanthamoebasão 

considerados sensíveis a uma variedade de compostos usados para o 

tratamento de infecções, incluindo agentes químicos desinfetantes, como as 

biguanidinas, compostos quartenários de amômia, cloro, dióxido de cloro e 

peróxido de hidrogênio (KHAN, 2003). Em relação aos cistos, essa resistência 

é aumentada, o que, inclusive, constitui um dos problemas no tratamento das 



30 
 

 

infecções, já que as amebas adotam essa forma também nos tecidos 

afetados·. 

 

2.4.3 Mecanismos diretos 

 

I. Adesão: A adesão é um mecanismo dependente de contato considerado o 

primeiro passo durante a patogênese das infecções por Acanthamoeba, uma 

vez que os trofozoitos utilizam da aderência em células hospedeiras mediadas 

por uma adesina, isto é, uma proteína de ligação à manose (MBP) presente na 

superfície do trofozoito para prosseguir sua invasão para tecidos mais 

profundos das células epiteliais da córnea.  

II. Fagocitose e apoptose: A fagocitose em Acanthamoeba foi demonstrada 

utilizando uma variedade de partículas, incluindo esferas de látex, bactérias e 

leveduras. Recentemente foi demonstrada também a capacidade da ameba em 

digerir células epiteliais da córnea, através de estruturas presente na superfície 

do trofozoito semelhantes a estruturas vistas em outros protozoários, tais como 

Naegleria eE. histolytica. Vários estudos sugerem que Acanthamoebainduz 

apoptose em células de neuroblastoma que representam ainda outro 

mecanismo de morte celular do hospedeiro (SIDIQUI et al 2011)]. Eles 

observaram que o DNA da célula hospedeira apresentava uma cromatina 

condensada, formação de membranas e formação de corpos apoptóticos, 

todos esses marcadores bem conhecidos em condições de apoptose. Contudo, 

se apoptose e fagocitose têm papéis independentes na patogênese das 

infecções por Acanthamoeba ou se a apoptose é um processo primário, que é 

estimulado pela ligação de parasitas com as células hospedeiras e leva a 

eventos secundários, como a fagocitose ainda permanece desconhecida 

(SIDIQUI et al.,2011).  

III. Ecto-ATPases: As Ecto-ATPases são glicoproteínas presentes na 

membrana plasmática. Quando estas proteínas extracelulares são hidrolisadas 

o ADP (Adenosina difosfatada) é formado (SISSONSet al., 2004). Este ADP 

pode ter efeitos tóxicos nas células hospedeiras, sugerindo que as ATPases 

possuem um importante papel na patogenese de Acanthamoeba. 



31 
 

 

IV. Secreção de proteases: As proteases são produzidas por vários 

microrganismos como vírus, bactérias, protozoários, leveduras e são capazes 

de produzir danos à membrana da célula do hospedeiro facilitando a migração 

durante a infecção. Grandes quantidades dessas proteases são secretadas por 

cepas Acanthamoeba, sendo que as amebas de origem clínica produzem maior 

quantidade que as ambientais (KHAN, 2006; LORENZO-MORALES et al., 

2015). O principal papel fisiológico das proteases é a degradação do substrato 

(KHAN, 2006), o que justifica o fato de serem observados em outras amebas 

de vida livre potencialmente patogênica, como Naegleria, Balamuthia, 

Entamoeba (KLEMBA & GOLDBERG, 2002). As proteases também são 

consideradas um fator de virulência relevante na invasão de tecidos, migração 

do patógeno e no desenvolvimento da patologia no hospedeiro (KHAN et al., 

2000; KOESHLER et al., 2009; OMANA-MOLINA et. al., 2013; YANG et al., 

2015).  

 

2.5Atividade imunológica em infecções por Acanthamoeba 

Anteriormente,foram descritos os diversos fatores de patogenia capazes de 

modular a resposta imunológica do hospedeiro porAcanthamoeba. Os 

mecanismos de defesa empregados pelo organismo estão diretamente 

associados aos mecanismos de citólise e ativação celular, tanto de 

macrófagos, como de neutrófilos, mediados pelo Fator de Necrose Tumoral alfa 

(TNF-α). A presença de anticorpos específicos favorece a produção de 

interferon gamma (IFN-γ) (VAN KLINK et al, 1996).  

Os macrófagos atuam como primeira linha de defesa na eliminação dos 

trofozoítos, uma vez que foi observado que a sua ausência nos tecidos 

infectados favorece o aumento da incidência da infecção pelas amebas, 

agravando a enfermidade e determinando o prolongamento do curso clínico da 

ceratite (STEWARTet al., 1992). Ainda não é bem elucidado o papel dos 

neutrófilos frente à infecção, mas sabe-se que essas células são tão 

importantes quanto os macrófagos na fase inicial de invasão celular 

considerando que também são encontrados em número elevado em úlceras 



32 
 

 

cutâneas e em córneas de pacientes com ceratite. Acredita-se que sua 

atividade seja influenciada pela presença do TNF-α (FERRANTE, 1991). 

Baseado nesses indícios já foi possível determinar que sua atuação apresente 

um excelente desempenho na eliminação de Acanthamoeba durante a infecção 

da córnea, através de estudos envolvendo animais de experimentação, nos 

quais a diminuição significativa do número de neutrófilos está diretamente 

proporcional ao aparecimento precoce da doença e a sua forma mais 

agravada, enquanto oaumento dos neutrófilos levou a uma melhora dos 

animais (HURT et al., 2003).  Experimentos in vitro mostram que os anticorpos 

específicos são capazes de ativar o mecanismo lítico do complemento, porém 

tem se observado que mesmo que esses anticorpos sejam ausentes, os 

trofozoítos de Acanthamoeba são capazes de ativar o mecanismo da cascata 

do complemento. Isto é possível, por causa da presença de proteínas 

reguladoras do complemento, como a CD55, na composição da lágrima e do 

epitélio corneal, que protegem o tecido dos trofozoítos de Acanthamoeba 

(FERRANTE e ROWN-KELLY, 1983; TONEY e MARCIANO-CABRAL, 

1998).Estudos abordando a resposta imune após o contato com trofozoítos 

deAcanthamoeba, in vivo e in vitro, indicaramaumento na expressão de mRNA 

de TLR4, MyD88, IL-8, TNF-α, IL-12 e NF-kB nas células da córnea de ratos 

infectadas (RENet al., 2010; REN & WU, 2011).  

Em outros estudos, houve uma expressão aumentada de TLR4 / TLR2 no 

cérebro, pulmões e olhos de camundongos infectados por Acanthamoeba 

cerebral e sistêmica. Os dados indicaram que a presença de padrões 

moleculares associados a patógenos (PAMPs) de Acanthamoebasão 

reconhecidos pelo hospedeiro (DERDA et al., 2016; WOJTKOWIAK-GIERA et 

al., 2016; KOTet al., 2019). As proteases produzidas pelos trofozoítos são 

capazes de induzir a produção de IL-12e IL-6em macrófagos murinos (CANOet 

al., 2019). Os mecanismos envolvidos na liberação de proteases na matriz 

extracelular podem incluir a liberação direta pelos parasitas ou 

compartimentadas em vesículas. 



33 
 

 

 

2.6Vesículas extracelulares 

As vesículas extracelulares (VEs) são estruturas membranares produzidas e 

liberadas por vários tipos celulares. Existem três tipos principais de vesículas 

extracelulares: os corpos apoptoticos, as microvesículas e os exossomos. 

(Figura 7). 

 

Figura 7: Liberação de microvesículas e exossomos.As MVs originam-se 

diretamente por brotamento da membrana plasmática (1). Os exosomos, por sua vez, 

são formados no interior de corpos multivesiculares (MVBs) por invaginação das 

membranas de endosomos precoces (2). Os exosomos são liberados pela fusão de 

MVBs com a membrana plasmática (3). MVBs podem sofrer fusão com lisossomos (4). 

Símbolos representativos indicados no quadro à direita (Modificado de Raposo, G. 

2013).  

 

Os corpos apoptóticos apresentam o tamanho de 1 a 5 µm e a sua liberação já 

é bem conhecida em células danificadas ou em apoptose (HRISTOV et al., 

2004). Embora os corpos apoptóticos sejam bem descritos em células 

danificadas, apenas recentemente a produção de VEs por células viáveis ou 

normais tem sido descrita.Neste contexto as microvesículas (MVs) e os 

exossomos apresentam uma maior relevância, considerando que a sua 

produção seja um aspecto do metabolismo regular das células viáveis. 

Conceitualmente, a classificação é baseada quanto ao seu tamanho,origem e 



34 
 

 

conteúdo. Enquanto as MVs são liberadas a partir da membrana plasmática e 

apresenta o tamanho de 100nm a 1µm de diâmetro (RAPOSO; 

STOORVOGEL, 2013), os exossomos variam o tamanho entre 30 a 150 

nanômetros e possuem uma origem endocítica, sendo liberados após a fusão 

de corpos multivesiculares com a membrana (STOORVOGEL et al., 2002). 

Além da sobreposição de tamanho entre estas duas classes, diferenças em 

propriedades tais como a morfologia, densidade flutuante e composição são 

insuficientes para uma distinção clara entre elas (BOBRIE et al., 2011).Além 

da sobreposição de tamanho entre estas duas classes, diferenças em 

propriedades tais como a morfologia, densidade flutuante e composição são 

insuficientes para uma distinção clara entre elas (BOBRIE et al., 2011). 

 

2.6.1 Interação e função das VEs 

As funções das VEs em processos fisiológicos ou patológicos dependem 

da sua capacidade de interagir com as células-alvo e o tipo de célula que 

produz (Figura 8).  Sua produção já foi demonstrada em diferentes organismos 

e circunstâncias diferentes (BARTENEVA; MALTSEV; VOROBJEV, 2013).  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 8:Esquema de transferência de estruturas por VEs. As proteínas asssociadas à 

membrana (triângulos), as transmembranares (retângulos) e RNAs (retas sigmóides) são 

seletivamente incorporados em VEs. As VEs podem encaixar na membrana plasmática de 



35 
 

 

uma célula-alvo (1). As vesículas ligadas podem fundir-se diretamente com a membrana 

plasmática (2) ou ser endocitados (3). As vesículas endocitadas podem fundir-se com a 

membrana de um compartimento endocítico (4).Ambas as vias resultam na liberação de 

proteínas e RNAs na membrana ou citosol da célula alvo. A fusão e a endocitose são 

realizadas apenas por exossomos, mas as MVs derivadas da membrana plasmática podem ter 

destinos semelhantes. 



36 
 

 

 

Há diferentes tipos de interação das VEs com as células-alvo (RAPOSO; 

STOORVOGEL, 2013). Em alguns casos, esta interação é restringida a 

superfície celular através da ligação ao receptor. Outro caso envolvido com a 

ligação a receptores éseguida por fusão da vesícula com a membrana 

plasmática da célula alvo; ou inclusive a captação endocítica da vesícula. 

Neste último caso, as VEs podem permanecer dentro de endossomos e serem 

direcionadas para um lisossomo ou pode ocorrer à fusão da membrana da VE 

com a membrana do endossomo, com a consequente descarga do conteúdo 

para o citoplasma (transferência horizontal); ou as VEs podem ser devolvidas 

para o espaço extracelular após a fusão da membrana do endossomo 

contendo VEs com a membrana plasmática (transcitose)(TORRECILHAS et al., 

2012).  

Desta forma, a interação de VEs com células-alvo permite a 

transferência intercelular de componentes de membrana. Além de moléculas 

de superfície e proteínas citoplasmáticas, o mRNAs e miRNAs podem ser 

direcionados para as células-alvo. Esta transferência de material pode 

representar um mecanismo de transferência genética, permitindo que 

diferentes tipos celulares influenciem no fenótipo de outras células através da 

liberação de VEs(COLOMBO; RAPOSO; THÉRY, 2014; TORRECILHAS et al., 

2012). 

A interação das VEs liberadas por células secretoras com as células - alvo é 

específica, é necessário que haja reconhecimento através de receptores 

específicos e não de forma aleatória, com qualquer célula após um contato 

qualquer sem reconhecimento. Por exemplo, as vesículas liberadas por 

plaquetas interagem com macrófagos e células do endotélio, mas não com 

neutrófilos(COCUCCI; RACCHETTI; MELDOLESI, 2009). Esta especificidade 

parece está determinada por moléculas de adesão presentes na superfície das 

VEs. 

A descoberta que vesículas extracelulares participam em mecanismos 

de comunicação intercelular à distância (VALADI et al., 2007) levou a um 

interesse renovado sobre esta classe de estruturas e os estudos mostraram 



37 
 

 

que estas estruturas podem atuar em processos neoplásicos e distúrbios 

trombóticos, imunológicos e hematológicos (MENCK et al., 2017).  

Além da comunicação interna, VEs vem sendo particularmente 

importante no processo de interação parasito-hospedeiro em protozoários, 

associadas como fator de virulência em mecanismos invasivos de diversos 

parasitas, como Plasmodium falciparum (MANTEL; MARTI, 2014a), 

Trypanosoma cruzi (CAMPOS et al., 2015), Leishmania sp (ATAYDE et al., 

2015), Trichomonas vaginallis (TWU et al., 2013)(Tabela 1).  

. 

Tabela 1: Função das vesículas extracelulares em diferentes parasitos 

humanos 

Protozoário Função das VEs Referências 

Trichomonas 

vaginalis 

Aumento da adesão de parasitas. (TWU et al., 

2013) 

Trypanosoma 

cruzi 

Aumento da penetração em células 

hospedeiras 

(TORRECILHAS 

et al., 2009) 

Plasmodium 

falciparum 

Transferência de fatores de 

resistência a drogas e envolvimento 

na diferenciação sexual 

(MANTEL; 

MARTI, 2014a) 

Toxoplasma 

gondii 

Estimulação de resposta pró-

inflamatória 

(BHATNAGAR et 

al., 2007) 

Leishmania Modulação da resposta imune (SILVERMAN; 

REINER, 2011) 

Trypanosoma 

brucei 

Exportação de proteínas (GEIGER et al., 

2010) 

Acanthamoebaca

stellani 

Carreia lipases, proteases e 

glicosidases sem significado 

biológico bem elucidado. 

(GONÇALVES et 

al., 2019) 

 

 

A patogênese das infecções por Acanthamoeba é dependente de diversos 

fatores já citados como a produção de substâncias citopáticas como enzimas 

proteolíticas, glicoproteínas com manose e resíduos de N-acetilglucosamina 



38 
 

 

que levam à lesão do hospedeiro (ALIZADEH et al., 2008; SIDDIQUI; KHAN, 

2012). A produção dessas substâncias parece estar associada a características 

intrínsecas da linhagem, sendo possível identificar proteases específicas 

expressas em cepas consideradas patogênicas e não observadas nas não 

patogênicas (KHAN et al., 2006). Outro aspecto importante é a produção do 

efeito citotóxico causado sem a necessidade do contato direto com o tecido. 

Esta ação a distância pode ser mediada por meio de estruturas membranares 

ou endocíticas, sendo liberadas pelo protozoárioisoladas ou compartimentadas 

em vesículas, assim como visto em outros parasitas. Portanto, estudar e 

conhecer as propriedades das vesículas extracelulares produzidas pelos 

trofozoítos de diferentes linhagenspode auxiliar no conhecimento da 

patogênese desse organismo.(GONÇALVES et al., 2019). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



39 
 

 

 

 

3. OBJETIVOS 

3.1 Objetivo Geral: 

Avaliar comparativamente VEs produzidas por Acanthamoeba de diferentes 

genótipos quanto a  características físicas e funcionais  

 

3.2 Objetivos Específicos: 

3.2.1 Obter e purificar VEs de quatro cepas de Acanthamoeba de genótipos 

distintos(T1,T2, T4 e T11) por centrifugação diferencial; 

3.2.2. Caracterizar as VEs quanto ao seu tamanho e quantidade produzida 

pelas diferentes cepas de Acanthamoeba;  

3.2.3 Avaliar o perfil das proteases de VEs de Acanthamoeba e a sua atividade; 

3.2.4Avaliar o potencial pró-inflamatório das VEs em ensaios de produção de 

óxido nítrico, IL-6e TNF-α por macrófagos peritoniais de linhagens distintas de 

camundongos (BALBC, C57BL/6 selvagem e nocautesToll-like 2 e 4). 

3.2.5Avaliar o papel das proteases carreadas pelas VEs na atividade pró-

inflamatória em macrófagos murinos.  

. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



40 
 

 

4. METODOLOGIA 

4.1 Cultivo dos Isolados de Acanthamoeba 

Quatro isolados de genótipos distintos de Acanthamoeba foram 

utilizados,conforme descrito abaixo:  

I. ALX: isolado obtido de um caso clínico de ceratite amebiana, em 2006, 

na cidade de Vitória, Espírito Santo, Brasil. O isolamento foi realizado em 

placas de ágar soja contendo 200μL de Escherichia coli (ATCC 25922) e no 

mesmo ano a cultura foi axenizada em meio PYG (proteose-peptona extrato de 

levedo) com 10% de soro bovino fetal. Este isolado apresenta características 

de maior patogenicidade conforme testes fisiológicos de termo e 

osmotolerância e apresenta características do grupo morfológico II pertencente 

ao genótipo T4 (DUARTE et al., 2013).  

II. R2P5:isolado obtidode poeira doméstica também na cidade de Vitória, 

Espírito Santo, em meio ágar soja, tem características do grupo morfológico II 

de Pussard e Pons (1978) e pertence ao genótipo T1, conforme descrito por 

POSSAMAI (2018). O genótipo T1 tem sido encontrado em casos de encefalite 

amebiana granulomatosa (SISSONS et al., 2004). Em 2014 o isolado R2P5 foi 

axenizado em PYG com 10% de soro bovino fetal no Laboratório de 

Parasitologia Clínica da Faculdade de Farmácia – UFMG por tratamento de 

cistos com antibióticos conforme descrito por ALFIERI (2000) e modificado por 

DUARTE (2013)  (ALFIERI et al., 2000; DUARTE et al., 2013).  

III. AP4: cepa obtida do American Type Culture Collectionde código ATCC 

#30872, que apresenta características de menor patogenicidade, conforme 

estudo de ROCHA-AZEVEDO & SILVA-FILHO (2007). Em outro estudo, 

porém, essa cepa induziu encefalite e infecção sistêmica após reisolamentos 

de modelo animal (VERÍSSIMOet al 2013) indicando que apresenta certo 

potencial patogênico. É uma cepa de origem ambiental isolada de água 

(Turkegee, Alabama, Estados Unidos da América) e identificada como genótipo 

T2 por DUARTE et al. (2013) e vem sendo mantida no laboratório em meio 

PYG com 10% de soro bovino fetal. 

IV. AR15:isolado obtido de poeira de janela em ambiente doméstico, na 

cidade de Vitória, Espírito Santo, em meio ágar soja e axenizado em meio PYG 



41 
 

 

com 10% de soro bovino fetal em 2007. Apresenta características de baixa 

patogenicidade, conforme testes fisiológicos e foi classificada como 

pertencente ao genótipo T11 (DUARTE et al., 2013). 

As características das amostras estão resumidas na Tabela 2. Para os 

experimentos, as culturas foram adaptadas a PYG sem soro bovino fetal, 

contendoantibiótico enrofloxacina (10 µg/mL). Os repiques de manutenção 

foram realizados em tubos com 5 mL do mesmo meio, à temperatura ambiente, 

mensalmente.  

 

Tabela 2Características principais das amostras de Acanthamoeba utilizadas 

no presente estudo: 

Isolados Origem 
Isolamento
(a) 

Axenização(b) Genótipo(c) 
Osmotolerância 

(1M)/ 

termotolerância(d) 

ALX 

Caso de 

ceratite, 

Vitória, ES-

Brasil 

2006 2006 T4 + / 42°C 

R2P5 

Ambiente 

doméstico 

Vitória, ES-

Brasil 

2011 2014 T1 - /40º C 

AP4 

Água- 

Turkegee, 

AL-EUA 

(ATCC3087

2) 

1965 NC T2 NC 

AR15 

Ambiente 

doméstico 

Vitória, ES-

Brasil 

2007 2008 T11 - / 37°C 

(a) Isolamento realizado em placa de meio semi-sólido (ágar soja) com Escherichia coli  
(b) Tratamento de cistos com antibióticos e axenização em meio PYG com 10% de soro bovino 

fetal (DUARTE et al., 2013; POSSAMAI et al., 2018).  
(c) Genotipagem por sequenciamento de fragmento do 18S rDNA (DUARTE et al., 2013, 

POSSAMAI et al., 2018).  

(d) Ensaios de patogenicidade em cultivo em meio semi-sólido (ágar soja), com tolerância a 1M 
e a 40ºC/42º C sendo indicativos de maior patogenicidade.  

NC: não conhecido 
  



42 
 

 

4.2 Condições de vesiculação 

Para a realização dos ensaios de vesiculação, as culturas foram 

repicadas semanalmente em garrafas de cultivo de área 75 cm2 com 200mL de 

meio PYG com antibiótico (enrofloxacina 10g/mL) e incubadas em estufa a 

32º C. Os repiques escalonados foram realizados para obter a concentração 

aproximada de 107 trofozoítos por mL,após 72h de crescimento (fase 

exponencial). Os trofozoítos foram transferidos das garrafas para tubos de 

15mL, submetidos a duas lavagens em Salina de Pagepor centrifugação a 400 

x g por 10 minutos em temperatura ambiente. Os trofozoítos foram 

quantificados em Câmara de Neubauer, usando Trypan blue 0,4 % para 

exclusão de formas inviáveis e então submetidos a uma lavagem adicional por 

centrifugação, realizada em meio de RPMI - 1640, livre de soro bovino fetal, 

preparado com água ultrapura e filtrado em membrana de 0,22 μm. O 

sedimento foi suspendido em meio RPMI e uma quantidade contendo 1 x 107 

trofozoítos foi transferida para 20 mL desse mesmo meio, em tubos cônicos 

graduados de 50 mL resultando em uma concentração final de 5 x 105 

trofozoítos/mL.Os tubos foram incubados em estufa a 37º C para a 

vesiculação, por 2 horas sob agitação de 180 rpm. Após esse período, uma 

alíquota de 100 L do material foi retirada para avaliação da viabilidade celular, 

em câmara de Neubauer utilizando Trypan blue 0,4%.  

 

4.3 Isolamento das vesículas extracelulares 

As culturas vesiculadas foram submetidasà centrifugação diferencial 

para separação das vesículas extracelulares, conforme a seguir: 

1. Os 20 mL da cultura foram centrifugados a 700 x g durante 10 min, a 20º C 

para sedimentação dos trofozoítos. O sobrenadante contendo as vesículas 

extracelulares foi transferido a um novo tubo. 

2. O sobrenadante foi centrifugado a 2000 x g durante 10 min a 20º C para 

sedimentação de detritos celulares. 

3. O sobrenadante contendo as VEs foi recuperado e filtrado em filtro 0,22 µm 

(Millipore®). O filtrado foi submetido à ultracentrifugação a 100.000 x g 

durante 120 min a 4ºC, em ultracentrífuga Beckman Coulter, Inc. O 



43 
 

 

sobrenadante foi descartado e as VEs foram suspensas em 100 uL de meio 

RPMI - 1640 pH 7,2 (previamente filtrado com membrana de 0,22 µm, 

Millipore®). Essas amostras foram armazenadas a -80ºC.  

 

4.4 Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) 

As amostras purificadas após a ultracentrifugação foram quantificadas e 

avaliadas por Análise de rastreamento de nanopartículas (Nanotracking Particle 

Analysis- NTA), utilizando o equipamento Nanosight LM10. O sistema 

NanoSight LM10 (NanoSight Ltd. Amesbury, Reino Unido) utiliza uma 

tecnologia baseada no espalhamento dinâmico de luz e no movimento 

Browniano para obter distribuição de tamanho e concentração das partículas 

em suspensão. As partículas no fluido são iluminadas por um feixe de laser 

(532 nm) finamente focado através de um prisma de vidro. As partículas foram 

visualizadas utilizando um microscópio óptico convencional, com aumento de 

20x equipado com uma câmera de vídeo com sensor de imagem tipo SCMOS 

(scientific complementary metal-oxide semiconductor).  

Para as análises, as amostras foram diluídas 10 vezes em PBS, 

previamente autoclavado e filtrado em membrana de 0,22 µm (Millipore®). Para 

cada amostra, foram feitas leituras em triplicata de vídeos de 60 segundos de 

duração com 25 quadros por segundo (25 FPS) e temperatura fixa de 25 oC. 

Os parâmetros Blur e Max Jump Distance permaneceram configurados na 

opção automática, o parâmetro nível da câmara variou entre 9 e 10 e o limite 

de detecção foi configurado em 3 para todas as leituras. Como controles 

negativos, foram usadas as amostras de meio submetidas ao processo de 

vesiculação, sem trofozoítos. As análises foram realizadas com o programa 

NTA (versão 3.0). 

 

4.5 Microscopia eletrônica 

A microscopia eletrônica foi utilizada para identificar e confirmar por 

imagem a produção de vesículas pelos isolados. Trofozoítos de 

Acanthamoebaem garrafas de cultivo, incubados a 32º C, foram preparados e 



44 
 

 

transferidospara meio de vesiculação (RPMI), conforme item anterior 3.2. A 

vesiculação foi realizada a 37º C sob agitação por uma hora. Os trofozoítos 

foram concentrados por centrifugação (400g a 4°C) e suspendidos em meio 

RPMI fresco, com menor volume para obter a concentração de 1x107 

trofozoítos por mL.  

Para microscopia eletrônica de varredura (MEV), as amostras foram 

fixadas durante 60 minutos em temperatura ambiente, com 2,5% de 

glutaraldeído em tampão de fosfato 0,1 M (pH 7,2), contendo sacarose 0,146 M 

e CaCl2 5 mM. Após a fixação, as amostras foram transferidas e pós-fixadas 

em 1% de tetróxido de ósmio, desidratado em gradiente de etanol, seguida por 

gradiente de acetona (25 mM) e incorporado em resina Epon, corados por 

acetato de uranila. As amostras foram fotografadas em microscópio eletrônico 

JEOL JSM-5600 e documentadas.  

Para a microscopia eletrônica de transmissão (MET), o sedimento 

resultante do processo de vesiculação foi suspendido em tampão de fosfato 

0,1M com 2,5% Glutaraldeído em formaldeído para a fixação primária. A 

amostra foi incluída em agarose a 4% em uranila para proteção aos processos 

envolvendo os reagentes químicos. A fixação secundária foi realizada com 2% 

de tetróxido de ósmio (OsO4) e mantida por uma hora em temperatura 

ambiente. Após a fixação secundária, foram realizadas sucessivas lavagens 

com água ultrapura para retirada do tetróxido de ósmio por centrifugação a 400 

g por 2 minutos em temperatura ambiente e consecutivos banhos de 

desidratação em gradiente de acetona e etanol (30,50,70 e 100%) para a 

inclusão da amostra em uma resina de epon miscível em acetona que 

permaneceu polimerizando por 24 horas. A resina já polimerizada passou por 

uma triagem em um ultramicrótomo realizando cortes semifinos utilizando 

bisturi de diamantes de 1 µm em lâminas sob a água, ressecados em chapa de 

platina aquecida a 100°C, corados com azul de toluidina a 4% e visualizados 

em microscópio ótico convencional para visualização dos trofozoítos de 

Acanthamoeba. Após a confirmação da morfologia celular intacta, as amostras 

incluídas na resina novamente foram cortadas com cortes semifinos com 

lâminas de 50 a 70 µm. As fatias cortadas foram coletadas com uma grade de 



45 
 

 

cobre coberta com carbono, contrastadas com citrato de chumbo e visualizadas 

diretamente no microscópio eletrônico de transmissão Tecnai G2-12-

SpiritBiotwin FEI – 120 Kv, do Centro de Microscopia da UFMG. 

 

4.6 Atividade de proteases nas VEs de Acanthamoeba 

Com o intuito de avaliar se a VEs secretadas por Acanthamoeba 

apresentam atividade de proteases, foi realizado o Ensaio de Zimografia, com 

base nos procedimentos de CARVALHO et al. (2011), com algumas 

modificações. Amostras de 25 μg das vesículas extracelulares produzidas e 

purificadas foram utilizadas para cada isolado, em quatro alíquotas para cada 

um, sendo uma correspondente ao extrato original e as outras três previamente 

incubadas com um inibidor de proteases por 30 minutos a temperatura 

ambiente. Os inibidores utilizados foram fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF) na 

concentração de 1 mM, ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) a 50 mM e 

E64 a 10 mM, inibidores de serino, metalo e cisteína proteases, 

respectivamente.  As amostras foram diluídas em tampão de amostra não 

redutor 6X (BIORAD ®) e analisados por SDS PAGE co-polimerizado com 100 

mg/mL de gelatina. A corrida foi realizada em tampão PH 7,4 a 80 V para a 

largada do gel de compactação e a 100 V para a corrida no gel de 

fracionamento. Após a separação das proteínas, o gel foi incubado em 2,5% de 

solução de Triton X-100 por 60 minutos para hidratação, sendo em seguida 

transferido para os tampões de desenvolvimento para a atividade proteolítica, 

sendo um tampão de pH neutro (50 mM de Tris-HCl, pH 7.4, contendo 10 mM 

de CaCl2) e um tampão ácido (acetato de sódio, pH 3,5) na temperatura de 

37°C por 48 horas. Após esse período, o gel foi incubado em Coomassie 

Brilliant Blue para coloração por três horas e em seguida, foi descorado por três 

vezes sequenciais (tempos de 15, 30 e 60 minutos) em solução descorante de 

metanol (30%) e ácido acético (10%) para a visualização das bandas claras 

correspondentes às áreas de digestão pelas proteases. 

  



46 
 

 

4.7Indução de marcadores inflamatórios por VEsde Acanthamoeba 

 

4.7.1 Animais 

Os macrófagos peritoneais foram obtidos de camundongos BALB/c, C57BL/6 

selvagem e seus respectivos knockout para receptores Toll, sendo C57BL/6 

TLR2−/− e C57BL/6 TLR4−/−.Os animais foram mantidos no biotério do 

Instituto René Rachou-Fiocruz Minas e manuseados de acordo com as boas 

práticas em experimentação animal. Os experimentos foram aprovados pelo 

Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEUA) da Fundação Oswaldo 

Cruz (FIOCRUZ), sob o número de protocolo P-17/14-2. 

 

4.7.2 Preparo dos macrófagos 

Os animais foram submetidos à aplicação intraperitoneal de tioglicolato 

de sódio a 2% eapós 72 horas, foram sedados, anestesiados, abertos 

delicadamente sem ferir o peritônio. Osmacrófagos intraperitoniais foram 

recuperados por suspensão em meio RPMI – 1640 sem soro bovino fetal, 

seguido de três lavagens com solução de PBS estéril a 4°C em 400xg por 10 

minutos.  Após o procedimento, os animais foram eutanasiados por 

deslocamento cervical. Os macrófagos obtidos foram suspendidos em RPMI 

acrescido a 10% com soro bovino fetal, quantificados e um total de 1x105 

células foram plaqueadas individualmente em poços de 200 μL.  Após a 

incubação em estufa a 37º C com 5% de CO2 por 5 horas, o sobrenadante da 

cultura celular foi removido para a retirada de células não aderentes.Por fim, 

interferon gama (INF ) na concentração de 3U/mL foi adicionado às culturas, 

que foram incubadas novamente por 18 horas nas mesmas condições 

anteriores.  

 

4.7.3 Estimulação dos macrófagos 

Os macrófagos primados com INF foram estimulados com 5 x 

108vesículas/mL(108 por poço). Como controles positivos, foram incluídos o 

lipopolissacarídeo (LPS) de Escherichia coli(100 ng/mL) e extrato de 



47 
 

 

Staphylococcus aureus(100 ng/mL). O meio RPMI com IFN‐γ (3U/mL) foi 

utilizado como controle negativo. Paralelamente, foi realizada a estimulação 

com extrato celular de trofozoítos para avaliar a viabilidade dos macrófagos, 

conforme procedimentos detalhados posteriormente no item 3.7.6.Os lisados 

foram preparados com trofozoítos em tampão RIPA (1x PBS, 1% Nonidet P-40, 

0.5% desoxicolato de sódio, 0.1% SDS) acrescido de inibidores de proteases e 

fosfatases (PMSF 0,1%, Aprotinina 50 KIU/ml e 100 mM ortovanadato de 

sódio). Cada poço recebeu 10 µL de lisado, correspondente a 106 trofozoítos, 

resultando numa proporção de 10 amebas para um macrófago. A placa foi 

incubada por 48 horas a 37º C, em estufa a 5% de CO2. 

Ao final do período de incubação, a placa foi centrifugada a 700g X por 

10 minutos e a 4°C, e o sobrenadante foi utilizado para dosagem de óxido 

nítrico e de citocinas.  

 

4.7.4 Dosagem de óxido nítrico 

A realização da curva da Griess e dosagem de óxido nítrico foi realizada 

conforme descrita pelo fabricante (kit Griess Reagent System, 

Promega).Resumidamente, 50 μL da solução de sulfalidamida (1% de 

sulfalidamida em 5% de ácido fosfórico) foram adicionados ao sobrenadante e 

mantidos por 10 minutos a temperatura ambiente protegida da luz. O reagente 

NED (cloridrato de N-(1-naftil) etilenodiamina)foi adicionado às amostras e a 

concentração de nitrito produzida pelos macrófagos foi comparada aos níveis 

detectados em filtro de 540 nm em leitor de placas com os obtidos em curva 

padrão de concentrações conhecidas de nitrato de sódio NaNO3 fornecidos 

pelo kit. Essa metodologia permite quantificar os níveis de NO através do nitrito 

(NO2) que reage com a sulfanilamida para produzir o íon diazonido. Os 

nitrogênios (diazo compostos) reagem com o reagente NED, formando um 

cromóforo de coloração rosa que apresenta boa leitura em picos de 

absorvância de 540 nm (BRYAN; GRISHAM, 2007). Esse ensaio foi realizado 

em todas as linhagens demacrófagos conforme descrito na Figura 9.  

 

 



48 
 

 

4.7.5Dosagem de IL-6 e TNF- α 

Uma outra fração do sobrenadante foi utilizada para dosagem da 

citocina pró-inflamatória IL-6 e TNF-α utilizando o método de Cytometric Bead 

Array - CBA (BD, Pharmingen, EUA) que se baseia no uso de esferas de 

poliestireno marcadas com diferentes graus de fluorescência, recobertas com 

anticorpos específicos, que são detectados nos canais FL3 ou FL4. Esse 

sistema permite uma análise quantitativa das citocinas marcadas com 

ficoeritrina - PE. Resumidamente, 50 µL do sobrenadante da amostra foram 

misturados a 50 µL de duas populações distintas de beads com distintas 

intensidades de fluorescência conjugadas a anticorpos de captura específicos 

anti-citocinas IL-6 e TNF-α (Cytokine Kit, BD, Pharmingen, EUA; Catalog. n. 

560484) e em seguida foi adicionado 50 µL do reagente de detecção das 

citocinas. Em seguida, 18 µL do coquetel de anticorpos foram conjugados com 

ficoeritrina – PE e incubados por 3 horas, à temperatura ambiente sob abrigo 

de luz. Após a incubação, as esferas de captura foram lavadas com PBS e 

centrifugadas a 340 g, por 7 minutos e o sobrenadante foi descartado. O 

mesmo procedimento foi realizado para a obtenção da curva-padrão. Os 

resultados foram gerados em gráficos e tabelas utilizando-se o software 

CellQuest (BD).Esse ensaio foi realizado em nas linhagens de camundongo 

Balb C e C57BL / 6 selvagem conforme descrito na Figura  9. 

 

4.7.6 Viabilidade dos macrófagos estimulados por VEs e lisado 

celular 

Para avaliar a viabilidade dos macrófagos após a estimulação com VEs 

e com lisado de trofozoítos, foi utilizado o teste de MTT {brometo de [3-(4,5-

dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil tetrazolium]}, que é um ensaio colorimétrico usado 

para avaliar a viabilidade celular. Desidrogenases mitocondriais, presentes 

apenas em células metabolicamente viáveis, clivam o anel de tetrazólio, 

transformando-se de um composto de coloração amarela em um composto de 

coloração azul escuro, chamado de formazan {E,Z- 1-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-

1,3-diphenylformazan}, que são cristais insolúveis em soluções aquosas. Assim 

sendo, a produção de formazan reflete o estado funcional da cadeia 



49 
 

 

respiratória. 

Após a retirada de todo o sobrenadante, os macrófagos aderidos aos 

poços da placa foram lavados duas vezes com 200 µL de PBS estéril a 

temperatura de 4ºC e posteriormente foi adicionado 100 µL da solução de MTT 

a 0,5mg/mL. A placa foiincubada por 2 horas em estufa a 37º C com 5% de 

CO2. A solução de MTT foi retirada e em seguida, 100µL de DMSO puro foi 

adicionado a cada poço. A placa foi agitada por 5 minutos e depois foi deixada 

em repouso por mais 5 minutos para estabilização da cor. A leitura foi feita em 

leitor de ELISA a 540 nm. 

 

4.7.7Papel das proteases carreadas por VEs na produção de NO 

Para avaliar a relação das proteases carreadas pelas VEs com a ação 

pró-inflamatória, VEs de duas linhagens de maior potencial patogênico que 

apresentaram melhor desempenho na zimografia(ALX e R2P5) foram utilizadas 

em um ensaio de produção de NO. Macrófagos peritoneais de camundongos 

Balb/C foram preparados conforme descrito anteriormente (item 4.7.2) eforam 

estimulados com VEs (5 × 108 /mL) não tratadas e também  submetidas aos 

seguintes tratamentos prévios: (1) incubação à temperatura ambiente, por 30 

minutos,com os inibidores de serinoproteases, metaloproteases e 

cisteínaproteases (PMSF, EDTA, E64 a 5mM); (2) aquecimento a 100º C por 5 

minutos em banho maria. O Lipopolissacarídeo (LPS)eo meio RPMI foram 

usados como controles adicionais positivo e negativo, respectivamente. A 

incubação, recuperação do sobrenadante e dosagem de NO foi realizada 

conforme descrito nos itens 4.7.3e 4.7.4. 

4.8 Análise estatística 

As diferenças no tamanho e concentração de VEs foram analisadas pelo teste 

One-Way ANOVA para amostras com a distribuição normal e pelo Kruskal-

Wallis para os dados não paramétricos, utilizando o software GraphPad Prism 

5.0. O nível de significância foi de 95% (p<0.05).  

Os resultados dos ensaios com macrófagos murinos foram avaliados por 

meio do teste não paramétrico de Kruskal-Wallis seguido pelo teste post hoc de 



50 
 

 

Dunn para comparações múltiplas entre grupos (linhas acima das barras). O 

teste T de Student foi usado para comparar as diferenças de estimulação dos 

marcadores entre cada amostra de Acanthamoeba e as letras acima das barras 

indicam diferenças estatísticas (p <0,05) (NOGUEIRA et al., 2020). 

  



51 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  .   

 

 

 

 

 

Figura 9:Metodologia resumida e esquematizada.Os quatro genótipos foram preparados 

conforme descrito detalhadamente nos itens anteriores da metodologia para seus respectivos 

ensaios em diferentes etapas do isolamento das vesículas. As quatro linhagens de 

camundongos foram utilizadas para diferentes ensaios com diferentes amostras. As linhagens 

Balb/C, C57Bl/6, TLR2KO e TLR4KO utilizaram extrato celular e VEs para a dosagem de óxido 

nítrico. As linhagens selvagens (Balb/C e C57Bl/6) utilizaram as mesmas amostras para avaliar 

a produção de óxido nítrico, IL-6 e TNF-α, sendo que o selvagem Balb/C utilizou vesículas e 

inibidores de proteases das cepas de genótipos considerados mais patogênicos (ALX-T4 e 

R2P5-T1). 

 

 



52 
 

 

 

5. RESULTADOS 

 

5.1Acanthamoeba produz VEs com características comuns entre os 

diferentes genótipos 

 

A avaliação por NTA das preparações vesiculares indicou que as 

diferentes cepas de Acanthamoebaproduzem VEs com perfil homogêneo, 

conforme indicado pela ausência de picos secundários (Figura 10 A-D), com 

predominância de tamanhos entre 100 a 200 nm (Figura 10 E).Quando 

avaliadas as replicatas das medições capturadas pelo software (10 para cada 

amostra), foi observado tamanhos de VEs entre 120 nm a 186 nm e 

concentrações entre 3,4 x 109 a 5,1 x 1011 partículas/mL (Figura 10 F-

G).Comparando o tamanho e quantidade de VEs entre as amostras dos 

diferentes genótipos, não foram observadas diferenças significativas no perfil 

de produção entre elas (p=0,2801).  

  



53 
 

 

 

 

Figura 10:Análise de rastreamento de partículas (NTA) de vesículas extracelulares (VEs) de 

Acanthamoeba.A-D: Gráficos de distribuição gerados por NTA representativo de uma das 

replicatas de VEs produzidas pelas cepas ALX (genótipo T4), R2P5 (genótipo T1), AP4 (genótipo 

T2) e AR15 (genótipo T11) de Acanthamoeba, respectivamente.  E. Distribuição dos tamanhos em 

relação à quantidade de VEs produzidas pelas cepas de Acanthamoeba correspondente a 

replicata representada. F- G. Comparação entre replicatas de medições (n=10) de tamanho e 

quantidade de VEs produzidas pelas cepas de Acanthamoeba. Não houve diferença significativa 

entre as diferentes cepas (p= 0,2801, Teste ANOVA p<0,05). 

 

 

 

 

 



54 
 

 

 

 

 

Nas imagens de MEV obtidas, foi possível visualizar a presença de 

acantopódios numerosos, estruturas típicas desse gênero, nos trofozoítos das 

quatro amostras (Figura 11 A, C, E, G). Os isolados ALX e R2P5 

apresentaram aparentemente maior número de acantopódios.  

Além disso, a MEV permitiu visualizar claramente estruturas vesiculares 

compatíveis com VEs na superfície dos trofozoítos (Figura 11 A-H). Em 

relação à MET, foi possível visualizar o citoplasma granuloso contendo 

materiais ribossômicos distribuídos em algumas imagens e a presença de 

mitocôndrias (Figura 12 A-H).Estruturas compatíveis com VEs foram 

visualizadas tanto no citoplasma (Figura 12 A, B) quanto sendo exteriorizadas 

na superfície celular (Figura 12 D), apresentando aspecto caraterístico de 

bicamada lipídica. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



55 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 11:Microscopia eletrônica de varredurade trofozoítos de Acanthamoeba em 

processo de vesiculação.: As imagens foram capturadas durante o processo de vesiculação 

pelos trofozoitos de diferentes genótipos e origens de Acanthamoeba ALX-T4 (A-B), R2P5 –T1 

(C-D), AP4-T2(E-F),AR15-T11(G-H). A fileira da esquerda (A,C,E e G) apresenta as células 

emitindo os  acantopódios (setas brancas)  que são estruturas típicas do gênero e a fileira da 

direita, em maior tamanho, indica a presença de estruturas compatíveis com VEs na superfície 

dos trofozoítos indicadas pelas setas pretas (B,D,F,e H). 



56 
 

 

 

Figura 12:Microscopias eletrônicas de transmissão de trofozoítos de Acanthamoeba em 

vesiculação. Cepas ALX, genótipo T4 (A-B), R2P5, genótipo T1 (C-D), AP4, genótipo T2 (E-F) 

e AR15, genótipo T11 (G-H). A fileira da esquerda (A,C,E,e G) indica, em tamanho menor, a 

presença de VEs no interior das células, citoplasma rico em material ribossômico, mitocôndrias 

(mi), na fileira da direita (B,D,F e G) indicam a presença de VEs próximas as membranas 

celulares. 

  



57 
 

 

5.2 As VEs carreiam proteases predominantemente classificadas como 

serinoproteases 

 

       As amostras de VEs purificadas foram avaliadas quanto à presença de 

proteases, que são consideradas fatores envolvidos na patogênese de 

Acanthamoeba. Em tampões de pH ácido e neutro, foi possível visualizar áreas 

de degradação da gelatina, devido a atividade de proteases.  

O ensaio de zimografia indiciou que as VEs de todas as cepas testadas 

exibiram atividade em pH 7,4, com padrão de bandas idêntico de 100, 59 e 47 

kDa (Figura 13, painel superior). Entretanto, a atividade mais intensa foi 

observada nas amostras correspondentes às cepas ALX e R2P5 (genótipos T4 

e T1, respectivamente). Em meio ácido (pH 3,5), essas duas cepas exibiram 

bandas mais evidentes de 100 e 59 kDa, enquanto uma atividade muito fraca 

de banda de 100 kDa foi detectada em amostras correspondentes às cepas 

AP4 (T2) e AR15 (T11) (Figura 13, painel inferior). 

      A atividade das proteases foi totalmente anulada pelo inibidor da 

serinoprotease (PMSF) em ambos os pHs (Figura 3, painéis inferior e 

superior do PMSF). O inibidor de metaloproteases (EDTA) e cisteína protease 

(E64) diminuíram a intensidade do sinal nas bandas das cepas T4(ALX) e 

T1(R2P5), em comparação com controles não tratados em ambos os pHs 

(Figura 13, EDTA e E64 painéis inferior e superior). Além disso, uma 

diminuição da atividade da protease de 47 kDa por esses inibidores foi 

observado em VEs de todas as cepas em pH 7,4 (Figura 13, EDTA e E64, 

painéis superiores).  Estes inibidores não afetaram substancialmente o perfil 

de proteases das cepas T4 (ALX) e T1(R2P5) em pH 3,5, no entanto, uma 

banda de 100 kDa tornou-se evidente nas amostras de VEs T2 e T11 (100 

kDa)(Figura 13, EDTA e E64, painéis inferiores). 

  



58 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 13:Zimografia das VEs de cepas de Acanthamoeba.  Amostras de VEs aplicadas em 

gel de poliacrilamida 10% copolimerizada com gelatina a 10mg/mL. Amostras aplicadas sem 

inibidores de protease estão na primeira coluna à esquerda e na sequência, as amostras foram 

tratadas por 30 minutos antes da aplicação, com PMSF (5 mM), EDTA (50 m )   e E64  (10 mM 

), respectivamente. Na fileira superior, a reação de digestão foi realizada em tampão de TRIS-

HCL/CaCl2 pH 7,4. Na inferior, foi utilizado tampão de acetato de sódio pH 3,5. Cada cepa foi 

designada por seu genótipo (T4=ALX, T1=R2P5, T2=AP4 e T11=AR15). PM representa 

marcador de massa molecular e as marcações com traços na borda dos géis a massa 

estimada das bandas principais (100kDa, 75kDa, 59 kDa e 47kDa de cima para baixo em todos 

os géis).   

 

5.3 As VEs das cepas patogênicas e não patogênicas apresentaram 

diferentes níveis de ativação pró-inflamatória em macrófagos murinos 

 

Na avaliação funcional das VEs em relação à ativação de macrófagos 

peritoneais murinos, um perfil de ativação semelhante foi observado em 

macrófagos BALB / C e C57BL / 6, na qual a cepa AR15 (T11) induziu uma 

maior produção de NO do que as outras cepas (Figura 14). Em camundongos 

C57BL / 6 e C57BL / knockout TLR2 (- / -) e TLR4 (- / -), todos as VEs foram 

capazes de induzir níveis variáveis de NO via TLR4 e secundariamente via 

TLR2 (Figura 14). Como esperado, o LPS (controle TLR4) e extrato de S. 

aureus (controle TLR2) induziram níveis mais elevados de NO via macrófagos 

TLR2 (- / -) e TLR4 (- / -), respectivamente. Considerando que VEs de 

Acanthamoeba induziram NO via TLR4 / TLR2, os mesmos sobrenadantes 



59 
 

 

resultantes desse ensaio foram submetidos ao ensaio para a produção de TNF-

α e IL-6 apenas em camundongos selvagens (BALB / C e C57BL / 6). Assim 

como visualizado no ensaio da reação de Griess para dosagem de NO, uma 

maior produção de TNF-α e IL-6 foi detectado para a cepa AR15 em 

comparação com ALX, R2P5 e AP4(Figuras 15). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 14:Produção de óxido nítrico (NO) (A), TNF-α (B) e IL-6 (C) por macrófagos 

peritoneais primados com INF e estimulados com VEs de Acanthamoeba. Cepas ALX, 

R2P5, AP4 e AR15, pertencentes aos genótipos T4, T1, T2 e T11, respectivamente. 

Sobrenadantes coletados após 48 h de interação de VEs com macrófagos BALB-c e C57BL / 6 

selvagem e C57BL / 6nocautes (TRL2KO e TRL4KO). A concentração de NO foi medida pela 

reação de Griess. TNF-α e IL-6 foram determinados por análise de CBA-flex. LPS e 

Staphylococcus aureus (S. a.): controles TLR4 e TLR2, respectivamente. C: meio RPMI com 

INF Diferença significativa (p<0,05) indicada por asteriscos. 

  



60 
 

 

No experimento adicional para avaliar a viabilidade dos macrófagos 

durante os ensaios de estimulação, foram observados valores acima de 100% 

quando utilizadas as VEs e abaixo de 50% quando utilizado o extrato total de 

trofozoítos (Figura 15).Não houve diferença significativa quando comparadas 

as diferentes cepas entre si, em cada grupo (VEs e extrato total).  

 

 

 

Figura 15:Viabilidade celular dos macrófagos das linhagens BalbC (A) e C57Bl/6 (B) 

durante estimulação com VEs. As amostras de macrófagos estimulados com VEs 

apresentaram uma atividade mitocondrial superior a 100% enquanto os macrófagos em contato 

com os extratos celulares das quatro cepas de Acanthamoeba apresentaram uma viabilidade 

menor ou igual a 50%. 

 

 

5.4. A produção de Óxido Nítrico pelas VEs das cepas consideradas 

patogênicas depende da integridade das proteases 

Comparando com a estimulação por VEs íntegras, a produção de NO 

por macrófagos peritoneais de camundongos C57BL/6 foi significativamente 

menor quando esses foram expostos a VEs submetidas ao aquecimento ou 

pré-tratadas com inibidores de proteases (Figura 16).  A diminuição de 



61 
 

 

estimulação foi mais evidente nas amostras pré-incubadas com PMSF (inibidor 

de serinoprotease) para a cepa ALX e PMSF e EDTA (inibidor de 

metaloprotease) para a cepa R2P5.   

 

 

Figura 16:Produção de NO por Acanthamoeba VEs aquecidas e pré-incubadas a 

diferentes inibidores de proteases. VEs foram submetidos ao aquecimento e aos 

inibidores de proteases antes da exposição aos macrófagos. Os sobrenadantes foram 

coletados após 48 h de interação EVs com macrófagos de C57BL / 6. A concentração 

de nitrito foi medida pela reação de Griess. LPS (controle positivo) e RPMI (controle 

negativo) foram usados. Os asteriscos indicam diferenças estatísticas (P <0,05). 

  



62 
 

 

6. DISCUSSÃO 

 

Nos últimos anos, diversos estudos têm demonstrado que protozoários 

patogênicos produzem e liberam VEs e que essas estruturas podem atuar de 

forma crucial nos mecanismos de invasão e imunomodulação do hospedeiro 

(TORRECILHASet al., 2012, TWUet al., 2013, MANTEL & MARTI., 2014, 

SOARESet al., 2017). Mais recentemente, a produção de VEs por trofozoítos 

de Acanthamoeba foi demonstrada, indicando o possível envolvimento na 

patogênese das infecções por mecanismos independentes de contato, como a 

ação citotóxica em células de cultivo (GONÇALVESet al., 2018; LIN et al., 

2019; RETANA-MOREIRA et al., 2020). Um ponto em comum nesses trabalhos 

sobre VEs de Acanthamoeba foi à avaliação de uma única cepa, em que foram 

estudados aspectos estruturais e funcionais.  

No presente estudo, foi proposta uma abordagem ampla e comparativa 

de VEs de Acanthamoeba, envolvendo quatro cepas diferentes.  Com isso, 

pretendeu-se avaliar se VEs de Acanthamoeba apresentariam características 

funcionais diferentes, que poderiam refletir a diversidade dentro do gênero, 

conhecido por apresentar linhagens genotipicamente distintas e com maior ou 

menor propensão a causar infecção (MACIVERet al, 2013, outros). 

Como etapa inicial, foi realizado o procedimento de vesiculação, que 

utilizou trofozoítos em fase exponencial de crescimento. Nessa etapa, o 

controle e o acompanhamento dos níveis de viabilidade são importantes, uma 

vez que células que estão em processo de morte celular programada, ou 

apoptose, liberam os corpos apoptóticos, que são estruturas vesiculares que 

surgem em resposta às condições de estresse metabólico e apresentam 

composição específica e distinta das demais classes vesiculares (exossomos e 

microvesículas)(RAPOSO; STOORVOGEL, 2013). Nesse trabalho, a 

viabilidade de todas as culturas foi avaliada no início e ao final do processo, 

sendo superior a 93%, sendo a maior parte das amostras acima de 95%, 

indicando assim que as preparações vesiculares obtidas eram 

preponderantemente compostas por vesículas liberadas por trofozoítos viáveis, 

que não estivessem em processo apoptótico. Além disso, o processo de 

filtração em membrana de 0,22 µm, realizado na purificação das VEs, contribui 



63 
 

 

para a remoção de corpos apoptóticos (1 a 5 µm) e detritos celulares que 

eventualmente estivessem presentes (RAPOSO; STOORVOGEL, 2013). 

Até hoje, foram descritos inúmeros métodos de isolamento que podem 

selecionar VEs, dentre eles a ultracentrifugação, diferenças no gradiente de 

densidade, filtração, fracionamento, cromatografia, enriquecimento, 

imunopreciptação e outros kits desenvolvidos com tecnologia de ponta. Porém, 

cada método de isolamento e análise apresenta seu próprio conjunto de 

benefícios e desvantagens, e já foram demonstrados que diferentes métodos 

podem resultar em perfis proteômicos diferentes nas VEs, complicando ainda 

mais a sua caracterização bioquímica e a identificação de biomarcadores 

específicos (DOYLE & WANG.,2019). No presente estudo, optou-se por etapas 

de filtração e centrifugação, que são consideradas válidas para obtenção de 

VEs de acordo com um consenso entre pesquisadores que são referência na 

área (THÉRYet al., 2018). Esses autores publicaram em 2018 um documento 

que determina as informações mínimas para estudos de vesículas 

extracelulares (Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 - 

MISEV2018). Nessa publicação, são recomendados os procedimentos para 

conduzir e relatar trabalhos relacionados às VEs identificando seus respectivos 

marcadores para aprimorar o rigor e a reprodutibilidade desses estudos. 

Estudos anteriores mostraram que os tamanhos dos VEs de 

Acanthamoeba podem variar de 111,3-166,7 nm (GONÇALVESet al., 2018; 

LINet al., 2019; RETANA-MOREIRA et al, 2020). Consistente com essas 

observações, VEs derivados de Acanthamoeba no presente trabalho exibiram 

um perfil homogêneo, com mais de 92% das partículas encontradas na faixa 

esperada de 100-200 nm (tamanho médio geral de 137,2 ± 14,7 nm). Essas 

dimensõessão correspondentes ao esperado tanto para microvesículas (100 

nm a 1000nm) quanto para exossomos (30 a 150 nm) (THÉRY et al., 2006). No 

MISEV 2018 foi determinado que o termo “Vesícula extracelular” deve ser 

utilizado sempre que não for possível indicar os subtipos microvesículas ou 

exossomos, que só podem ser adotados se houver outros procedimentos que 

permitam a identificação e caracterização dessas partículas (THÉRYet al., 

2018). Características como a composição proteica, lipídica e a maneira da 

qual as VEs são formadas e originadas também são usadas para a 



64 
 

 

classificação. No entanto, é importante considerar que para Acanthamoeba, os 

estudos sobre VEs ainda estão iniciando e não existem até o momento, 

marcadores que permitam realizar a identificação de possíveis marcadores. 

Futuramente, com o maior conhecimento sobre VEs de Acanthamoeba, há a 

possibilidade de aplicação em diagnóstico ou tratamento. Em outras áreas o 

uso de VEs para identificação de doenças já é uma realidade. Um exemplo é o 

estudo de células tumorais pancreáticas que liberam exossomos que 

apresentam as moléculas glypican-1 e CD63. Esses biomarcadores são a base 

de uma tecnologia diagnóstica de biopsia líquida na etapa inicial do câncer que 

permite a identificação dos exossomos por imunofluorescência em um chip 

(LEWIS et al., 2018). Em protozoários, um estudo demonstrou a presença de 

vesículas extracelulares no plasma de pacientes com malária como potencial 

biomarcador de diagnóstico precoce da doença, considerando que os 

pacientes apresentaram baixa parasitemia no limite de detecção por esfregaço 

sangu