Stefany Fontes Domingues CARACTERIZAÇÃO DAS INTERAÇÕES PROTÉICAS ENVOLVIDAS NO TRÁFEGO CELULAR DO TRANSPORTADOR DE COLINA DE ALTA AFINIDADE – CHT1 Belo Horizonte Departamento de Farmacologia Instituto de Ciências Biológicas Universidade Federal de Minas Gerais 2006 Stefany Fontes Domingues CARACTERIZAÇÃO DAS INTERAÇÕES PROTÉICAS ENVOLVIDAS NO TRÁFEGO CELULAR DO TRANSPORTADOR DE COLINA DE ALTA AFINIDADE – CHT1 Dissertação submetida ao Curso de Pós- Graduação do Departamento de Farmacologia da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito parcial para obtenção do grau Mestre em Ciências Biológicas: Farmacologia Bioquímica e Molecular Orientador: Marco Antônio Máximo Prado Co-orientadora: Vânia Ferreira Prado Belo Horizonte Fevereiro 2006 II Esse trabalho foi realizado no Laboratório de Neurobiologia Molecular do Departamento de Bioquímica e Imunologia e no Laboratório de Neurofarmacologia do Departamento de Farmacologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, com auxílio das seguintes instituições: - Conselho Nacional do Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) - Guggenheim Foundation III Agradecimentos Agradeço a Deus por conduzir os caminhos da minha vida a todo instante, por ser a minha luz e por mais uma vez permitir que eu realizasse outro sonho. Aos meus pais pelo apoio incondicional, por confiarem em mim e pelo amor. À minha querida irmã, pelo carinho, torcida, amizade, companheirismo, enfim, pelo amor fraternal. Aos meus orientadores pelos ensinamentos e pelo exemplo de competência. Aos professores Marcus Vinícius e Marco Aurélio pelos ensinamentos. A todos os amigos e colegas dos laboratórios de Neurofarmacologia e Neurobiologia Molecular. A Fabíola, pela amizade ouropretana interminável, pelos ensinamentos, conversas, pela paciência e pelo exemplo de profissionalismo. A Lucimar pelos conselhos, pela ajuda, paciência e amizade. Às amigas Ana Cristina e Dani, as metades da laranja que são fundamentais durante meu dia-a-dia em BH. Agradeço pela amizade de coração, pela paciência, brincadeiras, pelo respeito, conselhos, enfim por tudo. Aos amigos Bruno, Gegê e Bráulio pelas brincadeiras, palhaçadas, conselhos, conversas, companheirismo e por fazerem com que o trabalho se torne um assunto sério, porém agradável. Às inesquecíveis Jáila e Monalisa que sempre farão parte da minha vida e que sempre me alegram com sua presença e com seus conselhos. Amo vocês. IV “Tudo que não me mata me fortalece” Friedrich Nietzsche V Índice Lista de figuras e tabela Lista de abreviaturas Símbolos dos aminoácidos Resumo Abstract 1 – Introdução 1.1 – A acetilcolina e o sistema colinérgico 1.2 – A dinâmica da transmissão colinérgica 1.2.1 – A liberação de neurotransmissores 1.2.2 – A liberação de ACh 1.2.3 – O CHT1 e o sistema colinérgico 1.2.4 – A localização celular do CHT1 1.2.5 – A regulação da transmissão colinérgica 1.2.6 – CHT1 e a doença de Alzheimer 1.3 – Tráfego celular 1.4 – Duplo híbrido em leveduras 2 – Objetivos 2.1 – Objetivo geral 2.2 – Objetivos específicos 3 – Material e métodos 3.1 – Vetor pACT2 3.2 – Vetor pGBKT7 IX X XII XIII XIV 01 02 04 04 05 08 12 13 17 18 20 22 23 23 24 25 25 VI 3.3 – Saccharomyces cerevisiae AH109 3.4 – Duplo híbrido em leveduras 3.5 – Vetores eucariotos 3.5.1 – pCDNA 3.1 (-) 3.5.2 – pCMV-Myc 3.6 – Cultura celular 3.6.1 – HEK 293 3.6.2 – SN56 3.7 – Plaqueamento e transfecção 3.7.1 – Lipofectamina 3.7.2 – Fosfato de cálcio 3.8 – Co-imunoprecipitação 3.9 – Transporte de colina 3.10 – Gel SDS-PAGE e Western blot 3.10.1 – CHT1-FLAG 3.10.2 – SEC14-Myc 3.11 - Imunofluorescência 4 – Resultados 4.1 – Interações detectadas no duplo híbrido em leveduras 4.1.1 – Interação CHT1 x MAP1A 4.1.2 – Interação CHT1 x BRI3 4.1.3 – Interação CHT1 x Rab14 4.1.4 – Interação CHT1 x Niscarina 4.1.5 – Interação CHT1 x Flotilina 4.1.6 – Interação CHT1 x SEC14 like 4.2 – Co-imunoprecipitação CHT1 – SEC14 like 4.3 – O CHT1-FLAG co-localiza com SEC14 like – myc em células SN56 diferenciadas 4.4 – O transporte de colina de alta afinidade realizado pelo CHT1- FLAG é alterado pela superexpressão de SEC14 like – myc em células 28 28 29 29 29 29 29 30 31 31 31 32 33 34 34 34 35 36 37 37 40 42 44 46 48 50 53 VII HEK 293 5 – Discussão 5.1 – Duplo híbrido em leveduras 5.2 – Considerações sobre o duplo híbrido em leveduras 5.3 – O CHT1 e o sistema colinérgico 5.4 – Análise das interações observadas no duplo híbrido em leveduras 5.4.1 – Interação CHT1 x MAP1A 5.4.2 – Interação CHT1 x BRI3 5.4.3 – Interação CHT1 x Flotilina1 5.4.4 – Interação CHT1 x SEC14like 5.5 – A distribuição do CHT1 é modificada pela superexpressão de SEC14like em células SN56 5.6 – SEC14like quando superexpressa diminui a atividade do CHT1 em 30% 6 – Conclusões 7 – Referências bibliográficas 58 61 62 65 66 67 69 70 71 73 77 78 80 82 VIII Lista de Figuras e Tabela Figura 1: Desenho esquemático representando a neurotransmissão colinérgica 06 Figura 2: Estrutura secundária proposta para o CHT1 11 Figura 3: Mapa esquemático do vetor pACT2 26 Figura 4: Mapa esquemático do vetor pGBKT7 27 Figura 5: CHT1 e MAP1A interagem no duplo híbrido em leveduras 39 Figura 6: CHT1 e BRI3 interagem no duplo híbrido em leveduras 41 Figura 7: CHT1 e Rab14 não interagem no duplo híbrido em leveduras 43 Figura 8: CHT1 e Niscarina não interagem no duplo híbrido em leveduras 45 Figura 9: CHT1 e Flotilina1 interagem no duplo híbrido em levedura 47 Figura 10: CHT1 e SEC14like interagem no duplo híbrido em leveduras 49 Figura 11: Co-imunoprecipitação CHT1-FLAG x SEC14like-myc 52 Figura 12: Imagens de imunofluorescência em microscopia confocal em células SN56 diferenciadas, transfectadas isoladamente com CHT1-FLAG e SEC14like-myc 55 Figura 13: Imagens de imunofluorescência em microscopia confocal em células SN56 diferenciadas, co-transfectadas com CHT1- FLAG e SEC14like-myc 56 Figura 14: Imagens de imunofluorescência em microscopia confocal em células SN56 diferenciadas, co-transfectadas com CHT1- FLAG e SEC14like-myc 57 Figura 15: Análise do taxa de transporte de colina de alta afinidade em células HEK 293 60 Figura 16: Esquema do sistema de duplo híbrido em leveduras criado por Fields e Song em 1989 64 Figura 17: Análise da estrutura primária de SEC14like 76 Tabela 1: Resultado do screening em duplo híbrido em leveduras utilizando como “iscas” VMAT2 ou VAChT, e como “presa” uma biblioteca de cDNA de cérebro humano. 21 IX Lista de Abreviaturas A Adenina Ach Acetilcolina AchE Acetilcolinesterase AD Doença de Alzheimer ADE Adenina AP Proteína adaptadora ATP Adenosina trifosfato ATPase Adenosina trifosfatase Ca2+ Íon cálcio Cl- Íon cloreto Ch Colina ChAT Colina acetiltransferase CHT1 Transportador de colina de alta afinidade CCVs Vesículas recobertas por clatrina CCT CTP-fosfocolina-citidil-transferase DMEM Dulbecco´s Modified Eagle Medium DNA-AD DNA activation domain DNA-BD DNA binding domain Dpm Desintegrações por minuto GEF Proteínas trocadoras de nucleotídeos de guanina GABA Ácido γ-aminobutírico GLUT4 Transportador de glicose HC-3 Hemicolínio 3 HBS Hepes buffered saline kb Quilobases kD Quilodaltons Km Constante de Michaelis-Menten Ki Constante de inibição MCS Sítio múltiplo de clonagem X μM Micromolar mRNA RNA mensageiro nM Nanomolar Par-4 Prostate apoptosis response-4 PBS Phosphate buffered saline PEG Polietilenoglicol PKA Proteína quinase A PKC Proteína quinase C PP1 Proteína fosfatase 1 PP2A Proteína fosfatase 2A SNAP-25 Synaptosome-associated protein of 25000 dalton t-SNAREs Target membrane - SNAREs v-SNAREs Vesicle associated - SNAREs SNC Sistema nervoso central SV40 Simian virus 40 TBS Tris buffered saline TGN Trans Golgi network UAS Upstream activating sequences VAChT Transportador vesicular de acetilcolina VAMP-2 Proteína de membrana associada a vesículas ou sinaptobrevina VGAT Transportador vesicular de GABA VMAT2 Transportador vesicular de monoaminas YTH Duplo híbrido em leveduras XI Símbolos dos aminoácidos A Alanina C Cisteína D Ácido Aspártico E Ácido Glutâmico F Fenilalanina G Glicina H Histidina I Isoleucina K Lisina L Leucina M Metionina N Asparagina P Prolina Q Glutamina R Arginina S Serina T Treonina V Valina W Triptofano Y Tirosina XII Resumo O transportador de colina de alta afinidade (CHT1) é responsável por recaptar a colina presente na fenda sináptica, proveniente da degradação da acetilcolina (ACh), em neurônios colinérgicos. Sua atividade é de grande importância uma vez que neurônios colinérgicos têm uma baixa capacidade para síntese de novo de colina. Embora seja um transportador de membrana plasmática, o CHT1 encontra-se em reciclagem contínua entre vesículas intracelulares e a membrana plasmática em modelos celulares neuronais. O tráfego celular parece ter um importante papel na regulação da atividade desse transportador. Em nosso trabalho procuramos identificar proteínas que poderiam interagir com o CHT1 através do sistema de duplo híbrido em leveduras. Verificamos a interação do transportador com BRI3, Flotilina, SEC14like e MAP1A. Essas proteínas têm em comum a participação em eventos de tráfego celular. No intuito de caracterizar de maneira mais profunda essas interações, escolhemos a proteína SEC14like para dar continuidade aos nossos experimentos. SEC14like é homóloga à proteína SEC14 de levedura, cuja função é essencial para o transporte de proteínas através do complexo de Golgi de leveduras, além de ter papel importante na síntese e metabolismo de fosfatidilinositol e fosfatidilcolina. Em humanos, SEC14like é uma proteína ainda pouco descrita. Utilizamos co-imunoprecipitação, microscopia confocal e experimentos de transporte de colina para delinear com mais clareza a relevância da interação CHT1-SEC14like. Através de ensaios de co- imunoprecipitação, verificamos que essa interação ocorre em células de mamíferos. Observamos também, utilizando microscopia confocal que o padrão de distribuição do transportador foi modificado em células que superexpressam SEC14like. A análise da captação de colina, sugere que a superexpressão de SEC14like, altera a atividade do transportador, diminuindo em torno de 30% a taxa de transporte de colina. Esses dados sugerem uma nova possibilidade de regulação da atividade colinérgica, envolvendo uma proteína de importância no tráfego celular e o CHT1. XIII Abstract The high affinity choline transporter (CHT1) is responsible for choline uptake, which is derived from acetylcholine degradation, in the synaptic cleft of cholinergic neurons. CHT1 activity is very important since cholinergic neurons have very low ability to synthesize acetylcholine de novo. Although CHT1 is mainly a plasma membrane transporter, it is found predominantly recycling between intracellular vesicles and the cell surface. Cellular trafficking seems to play an important role in the transporter activity. In the present experiments, we identified proteins that might interact with CHT1, using yeast two hybrid system. We found that CHT1 interacts with BRI3, Flotillin, SEC14like and MAP1A. These proteins participate in cellular trafficking. To further characterize these interactions we chose SEC14like, a protein that is homologous to yeast SEC14, which is essential in promoting protein transport through the yeast Golgi complex. SEC14like also plays a crucial role in phosphatidylinositol and phosphatidylcholine synthesis and metabolism. SEC14like function in humans is poorly understood. We used co-immunoprecipitation, confocal microscopy and choline uptake to further identify the importance of CHT1-SEC14like interaction. Co-immunoprecipitation assays showed that the two proteins form complexes in mammal cells. Using confocal microscopy, we found that the pattern of distribution of CHT1 was altered in cells that overexpressed SEC14like. Choline uptake analysis suggested that SEC14like overexpression modified transporter activity, decreasing 30% the rate of choline transport. All these data suggest a new possibility of regulation of cholinergic activity by control of the cellular trafficking of CHT1. XIV 1 1 – Introdução 2 1.1 – A acetilcolina e o sistema colinérgico A acetilcolina (ACh) foi o primeiro neurotransmissor a ser descrito, sendo denominado inicialmente como “Vagusstoff” por Otto Loewi, em 1921. Em um experimento clássico e amplamente citado, ele estimulou o nervo vago do coração perfundido de uma rã e permitiu que o líquido de perfusão entrasse em contato com o coração de outra rã. Como resultado a atividade do coração da rã receptora foi diminuída através da ação da “substância do vago”, parassimpatina. Em 1926, Loewi e Navratil apresentaram evidências para caracterizá-la como ACh. Essa foi a primeira caracterização química de uma substância que produzia efeitos fisiológicos, um marco histórico para a farmacologia. A ACh possui um importante papel na neurotransmissão do sistema nervoso central e periférico, é essencial na sinalização de neurônios pré- ganglionares do sistema nervoso autônomo, tanto nos ramos simpáticos como parassimpáticos (Birks et al., 1961). É o neurotransmissor de sinapses pós- ganglionares parassimpáticas controlando órgãos como coração, pulmões, glândulas exócrinas e endócrinas, intestino e bexiga (Hoffman & Taylor, 2001). Nas fibras simpáticas pós-ganglionares que suprem as glândulas sudoríparas, a ACh age sob receptores muscarínicos. Ela é o neurotransmissor da junção neuromuscular sendo sintetizada por todos os neurônios motores na medula espinhal e no tronco encefálico, exercendo o controle da contração muscular (Misgeld et al., 2002). A neurotransmissão colinérgica tem um importante papel modulatório, especialmente sobre funções cognitivas. Manipulações farmacológicas que interferem com a atividade colinérgica podem alterar o resultado de tarefas como aprendizagem, atenção e memória (Gold, 2003). Os neurônios colinérgicos do sistema nervoso central apresentam uma distribuição bastante difusa. Interneurônios colinérgicos estão presentes no corpo estriado. Além desses neurônios, existem dois sistemas colinérgicos modulatórios importantes, de projeção difusa no encéfalo, o complexo prosencefálico basal e o pontemesencefalotegmental (Bear et al., 2002). O 3 primeiro complexo é assim denominado em função da dispersão que os neurônios colinérgicos assumem entre diversos núcleos relacionados entre si e localizados no centro do telencéfalo, medial e ventralmente aos núcleos da base. Destacam-se os núcleos do septo medial, responsáveis pela inervação colinérgica do hipocampo e o núcleo basal de Meynert, que provê a inervação colinérgica do neocórtex. O complexo pontemesencefalotegmental inclui as células da ponte e do tegmento mesencefálico que utilizam ACh, responsáveis pela regulação da excitabilidade de núcleos retransmissores sensoriais, principalmente no tálamo dorsal, juntamente com os sistemas noradrenérgico e serotoninérgico (Bear et al., 2002). Existem disfunções do sistema colinérgico classicamente associadas a desordens que afetam funções cognitivas, das quais se destacam: doença de Alzheimer (AD), doença de Parkinson e demência dos corpos de Lewy (Perry et al., 1995). Acredita-se que a degeneração de neurônios colinérgicos do prosencéfalo basal que se projetam para o córtex pré-frontal esteja associada à demência na doença de Alzheimer (Whitehouse et al., 1982). Os fármacos mais eficazes no tratamento da AD são inibidores da acetilcolinesterase (AChE), tais como donepezil, rivastigmina ou galantamina (Kaduszkiewicz et al., 2005). A esclerose amiotrófica lateral e a doença de Huntington são outras desordens neurodegenerativas nas quais neurônios colinérgicos são afetados (Oda, 1999). Os mecanismos celulares que contribuem para alterações na neurotransmissão colinérgica ainda não são bem definidos. A elucidação desses mecanismos é importante para o desenvolvimento de hipóteses, acerca da atividade neuronal que se encontra alterada em doenças neurodegenerativas associadas ao sistema colinérgico. A determinação da sinalização ou tráfego de proteínas e transportadores envolvidos nesse sistema pode revelar possíveis vias regulatórias que venham a se constituir em alvos farmacológicos e terapêuticos no futuro. 4 1.2 – A dinâmica da transmissão colinérgica 1.2.1 – A liberação de neurotransmissores O compartimento pré-sináptico pode ser caracterizado como uma entidade altamente dinâmica contendo os componentes necessários para acoplamento das vesículas, exocitose, endocitose, reciclagem de membrana e recuperação do neurotransmissor (Fernandez-Chacon & Südhof, 1999; Lin & Scheller, 1997) As vesículas sinápticas normalmente se agrupam em áreas subjacentes à membrana sináptica, denominadas zonas ativas. Essas regiões possuem um pool de vesículas prontamente liberáveis. As vesículas sinápticas possuem proteínas que desempenham papéis diferentes, tais como transporte de neurotransmissores, controle do tráfego intracelular ou ainda da fusão de membranas (Hoffman & Taylor, 2001; Südhof, 2004). Um estímulo que leva à despolarização da membrana pré-sináptica por um potencial de ação permite que ocorra a abertura de canais de cálcio sensíveis a voltagem. O aumento da concentração de Ca2+ livre é de grande importância no processo de exocitose, uma vez que a liberação de neurotransmissores e hormônios acontece em fração de segundos ou milissegundos após o aumento deste íon (Rettig & Neher, 2002). Existe um grupo de proteínas associadas à membrana que em conjunto são chamadas de SNAREs (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion attachment protein receptor), que formam a maquinaria mínima necessária para a fusão de vesículas com a membrana pré-sináptica (Weber et al., 1998). Essas proteínas são divididas entre as que estão associadas a vesículas, v-SNAREs (que inclui sinaptobrevina, também chamada VAMP-2, ou proteína de membrana associada a vesículas), e as localizadas na membrana plasmática, t-SNAREs (representadas por sintaxina e SNAP-25). A hipótese proposta é que v-SNAREs associam-se com t-SNAREs para formar um complexo molecular responsável pela fusão de membranas (Sollner et al., 1993). Sinaptotagmina I é considerada 5 um sensor de cálcio, uma proteína integral de vesículas sinápticas, que possui dois sítios de ligação ao cálcio e tem um papel essencial na exocitose dessas vesículas (Littleton et al., 2001; Fernandez-Chacon et al., 2001; Mackler et al., 2002). Em 2004, Tucker e colaboradores demonstraram que, na presença de Ca2+, sinaptotagmina I interage eficientemente com t-SNAREs que estão inseridas na bicamada lipídica da membrana sináptica, permitindo que ocorra a fusão de vesículas sinápticas com a membrana. A perda dessa interação está associada com a diminuição da exocitose de vesículas dependente de Ca2+. 1.2.2 – A liberação de ACh A neurotransmissão colinérgica depende da atividade de proteínas envolvidas na síntese, transporte e degradação da ACh, como demonstrado na Figura 1. Com a passagem de um estímulo elétrico, despolarização neuronal e influxo de íons cálcio, ocorre a fusão de vesículas sinápticas com a membrana pré-sináptica, liberando ACh na fenda sináptica. Uma vez na fenda a ACh pode, brevemente, ativar receptores nicotínicos ou muscarínicos, antes de ser hidrolisada pela enzima AChE, que libera colina e acetato. A colina é eficientemente recaptada para o neurônio pré-sináptico através do transportador de colina de alta afinidade (CHT1, em neurônios colinérgicos) fornecendo substrato para síntese de novas moléculas de acetilcolina. De fato, estudos farmacológicos revelam que a liberação de ACh não é sustentada sem que ocorra a recaptação mediada pelo transportador (Birks et al., 1961; Van der Kloot et al, 2002). Neurônios colinérgicos possuem baixa capacidade de sintetizar colina de novo e, portanto, grande parte da colina necessária para a síntese de ACh provém de um sistema de recaptação de colina de alta afinidade, que permite que a colina presente na fenda sináptica seja reutilizada na síntese de ACh no interior do neurônio pré-sináptico (Tucek et al., 1984; Birks,1961; Jope & Jenden, 1979). 6 ChAT CHT1 VAChT Figura 1: Desenho esquemático representando a neurotransmissão colinérgica (modificado de Purves et al., 2001). 7 A taxa de síntese de acetilcolina satura-se em paralelo com o transporte de colina em concentrações de colina acima de 5 μM (Haga, 1971). Vários estudos demonstram que a taxa de síntese de ACh está bem correlacionada com a atividade do CHT1, além disso o transporte de colina realizado pelo CHT1 é rapidamente estimulado pelo aumento da atividade neuronal (Murrin & Kuhar, 1976; Collier & Ilson, 1977; Polak et al., 1977; Sherman et al., 1978). Esses dados indicam que a demanda por colina é alta quando a síntese e liberação de ACh são elevadas. A ACh é sintetizada por ação da enzima colina acetiltransferase (ChAT), que cataliza a reação entre acetil-CoA e colina. A ChAT é sintetizada no soma e transportada até o terminal axonal. Através de estudos de cinética enzimática, demonstrou-se que ela não se encontra saturada pelos níveis pré-sinápticos de colina (Haga, 1971), indicando que a enzima encontra-se em excesso cinético em relação a seus substratos. No neurônio pré-sináptico os níveis de acetil-CoA, um dos substratos da ChAT, são mantidos através do metabolismo da glicose. A produção de acetil-CoA citoplasmática ocorre a partir do precursor mitocondrial citrato, sob ação da enzima ATP-citrato liase, sendo essa enzima mais expressa em neurônios colinérgicos do que em qualquer outra célula do sistema nervoso central (Tomaszewicz et al., 2003; Beigneux et al., 2004). Inicialmente, acreditava-se que a atividade da ChAT regularia a síntese de ACh, porém, vários estudos indicam que o suprimento de colina é o passo limitante para a síntese de ACh (Blusztajn & Wurtman, 1983; Collier & Katz, 1974; Simon & Kuhar, 1975; Kuhar & Murrin, 1978; Oregan & Collier, 1981; Saltarelli et al., 1987). Acredita-se que a ChAT se apresente em duas formas nos terminais nervosos colinérgicos, uma forma solúvel (cerca de 80-90%) presente na região citoplasmática e uma forma não iônica ligada à membrana, provavelmente de vesículas sinápticas (10-20%) (Pahud et al., 1998; Carrol, 1994). Vários estudos indicam que o transporte de colina de alta afinidade é essencial para a síntese de ACh, e sugerem que a ChAT poderia estar acoplada a esse transportador (Kuhar & Murrin, 1978; Tucek et al., 1984). Barker e colaboradores (1975) demonstraram que a ChAT acetila colina mais eficientemente quando associada à membrana do que quando se encontra em sua forma solúvel. Entretanto, 8 outros estudos sugerem que, apesar do transporte de colina de alta afinidade ser o passo limitante para a síntese de ACh, o acoplamento do CHT1 com a ChAT não existe (Jope et al., 1978). Rylett e colaboradores (1993) demonstraram que a ChAT e o sistema de transporte de colina apresentam mecanismos regulatórios diferentes. A colina, além de ser substrato da ChAT para síntese de ACh, tem papel importante na constituição de fosfolípides de membrana como a fosfatidilcolina (Ziesel et al., 1981). A principal fonte de colina para síntese de ACh é a dieta (Fernstrom, 1981; Zeisel, 1981). A colina também pode ser obtida através da ação da fosfolipase D sobre a fosfatidilcolina presente na membrana, sendo transportada pelo plasma sangüíneo, ou ainda pela síntese na glia (Tucek, 1984). A ACh recém formada é então transportada para o interior de vesículas sinápticas pelo transportador vesicular de acetilcolina (VAChT). O VAChT é uma proteína que apresenta 12 domínios transmembrânicos. Esse transportador, que se encontra presente na membrana de vesículas sinápticas, troca uma molécula de ACh por dois prótons vesiculares, concentrando o neurotransmissor nas vesículas sinápticas (Rebois et al., 1980; Parsons, 2000; Prado & Prado, 2002). 1.2.3 – O CHT1 e o sistema colinérgico Existem dois tipos de transporte de colina, bem caracterizados e distintos entre si. Em altas concentrações a colina é transportada por um sistema de baixa afinidade, que não depende de sódio e é inibido seletivamente por altas concentrações de hemicolínio-3 (HC-3), com Km de 100 μM e Ki de aproximadamente 50 μM. Este sistema se encontra distribuído em vários tipos celulares e parece estar envolvido na síntese de fosfatidilcolina. O outro é um sistema de transporte de alta afinidade por colina, Km=1-5 µM, depende de sódio e cloreto, sendo inibido por baixas concentrações de HC-3, Ki 10-100 nM (Okuda et al, 2000). O sistema de alta afinidade está presente principalmente 9 em neurônios colinérgicos e é responsável por suprir colina para a síntese de ACh (Haga, 1971; Kuhar & Murrin, 1978). HC-3 é um composto bicíclico, análogo da colina, inicialmente caracterizado como um agente letal, paralítico respiratório (Schueler, 1955; Macintosh et al., 1956). A intoxicação por HC-3, ao contrário da intoxicação por toxinas tetânica e botulínica, é reversível e pode ser aliviada através de respiração artificial até o completo metabolismo da droga. A administração de colina também reverte o quadro de intoxicação por HC-3, sugerindo que ambas competem pelo mesmo sítio ativo (Ferguson & Blakely, 2004). A importância do íon sódio para o transporte de colina de alta afinidade foi demonstrada em experimentos onde sinaptosomas foram incubados em um meio onde o sódio foi substituído por lítio. A conseqüência foi uma diminuição no transporte de colina de alta afinidade em 95% (Yamamura & Snyder, 1973). Já o transporte de colina de baixa afinidade foi reduzido em 60% com a substituição de sódio por lítio. Acredita-se que a colina seja co-transportada com o sódio, utilizando para isso a força do grandiente eletroquímico fornecido pela bomba Na+/K+ ATPase (Nelson, 1998). O íon Cl- também tem participação importante na atividade do transportador (Yamamura & Snyder, 1973; Kuhar & Zarbin, 1978). A ligação dos íons sódio e cloreto ao transportador levariam a mudanças conformacionais que permitiriam a ligação do substrato (colina), liberado juntamente com o cloreto e posterior liberação do íon sódio (Nelson, 1998). Estudos recentes (Brandon (2004), Ferguson (2003)) sugerem que existem mecanismos pós-traducionais que controlam a taxa de captação de colina pré- sináptica. A afirmação de que o transporte de colina de alta afinidade existe especificamente em neurônios colinérgicos foi amparada por experimentos que demonstraram uma diminuição no transporte de colina de alta afinidade no hipocampo, após desnervação da via septo-hipocampal, um conhecido trato colinérgico (Kuhar et al., 1973) O gene para o CHT1 foi recentemente clonado (Okuda et al., 2000). O CHT1 de humanos codifica uma proteína de 580 aminoácidos, que apresenta alta homologia com os genes de rato (98%) e camundongo (93%). A estrutura secundária proposta para o CHT1 foi de uma proteína transmembrânica 10 (contendo treze domínios transmembrânicos), com a porção amino-terminal extracelular e a região carboxi-terminal intracelular (Apparsundaram et al., 2000) como mostrado na Figura 2. Dados experimentais indicam que a região amino- terminal do transportador é realmente extracelular, uma vez que essa pôde ser detectada em células intactas através da utilização de anticorpos contra um epítopo FLAG adicionado à região amino-terminal do CHT1 (Ribeiro et al., 2005). Através de análises de Northern-blot, utilizando extratos de várias regiões do cérebro humano, foi identificado um transcrito de aproximadamente 5kb no putamen, coluna espinhal e medula (Apparsundaram et al., 2000). Esse achado está de acordo com a distribuição de neurônios colinérgicos incluindo interneurônios do gânglio basal e neurônios motores do tronco encefálico e coluna espinhal. 11 Figura 2: Estrutura secundária proposta para o CHT1 (Apparsundaram et al., 2000). 12 1.2.4 – A localização celular do CHT1 Apesar do CHT1 atuar na membrana plasmática, estudos de imunofluorescência e microscopia confocal indicaram que ele se encontra predominantemente em endossomos e vesículas sinápticas em modelos celulares neuronais, e que existe uma reciclagem contínua entre a membrana e essas organelas via endocitose mediada por clatrina (Ribeiro et al., 2003). No sistema nervoso central, o CHT1 está distribuído predominantemente em vesículas pré-sinápticas que também apresentam o transportador VAChT. Esses dados dão suporte à observação de que o CHT1 se distribui nas mesmas frações que apresentam outros marcadores de vesículas sinápticas (sinaptofisina, VGAT, VMAT2) (Ferguson et al., 2003; Ribeiro et al., 2003). A distribuição do transportador nos neurônios pré-sinápticos é de certa forma inesperada, uma vez que, baseado na sua função, acreditava-se que o CHT1 estivesse presente principalmente na membrana plasmática, que é o local para transporte de colina nos terminais nervosos. O transportador de GABA também é encontrado em vesículas sinápticas, embora essas vesículas não contenham o neurotransmissor, uma vez que o transportador vesicular de GABA não está presente na membrana dessas vesículas (Deken et al.,2000). Já em relação ao CHT1, foi mostrado que a maioria das vesículas que contêm o transportador de colina também contêm VAChT, e portanto ACh (Ferguson et al., 2003). Isso é indicativo de que, ao contrário do que ocorre para o transportador de GABA, a regulação do tráfego das moléculas de CHT1 presentes em vesículas sinápticas está acoplada à exocitose do neurotransmissor. A presença do CHT1 na membrana plasmática está acoplada à atividade neuronal. O aumento da liberação de ACh em conseqüência da exocitose de vesículas sinápticas é capaz de aumentar a expressão do transportador na membrana plasmática, uma vez que ele se encontra presente nessas vesículas. De maneira contrária, a diminuição da exocitose contribui para uma diminuição no transporte de colina em função do menor aporte de CHT1 à membrana (Ferguson et al., 2003; Ribeiro et al., 2003). A modulação da atividade de 13 transportadores, pelo aumento ou diminuição de sua concentração na membrana plasmática parece ser um tema recorrente como indicam os estudos do transportador de glicose (GLUT4) regulado por insulina (Sweeney et al., 1999) e do transportador de GABA pré-sináptico (Deken et al., 2000). 1.2.5 – A regulação da transmissão colinérgica Em um estudo realizado em camundongos heterozigotos para uma mutação no gene CHAT, observou-se que os níveis da atividade da enzima estavam diminuídos em 40-50% em comparação com camundongos selvagens, porém, os níveis de ACh cerebrais assim como a liberação de ACh evocada por despolarização em fatias de hipocampo eram normais (Brandon et al., 2004). Os camundongos apresentaram uma capacidade de adaptação a essa nova condição através da regulação da atividade do CHT1. Houve um aumento no aporte de colina, ou seja, o transporte de colina de alta afinidade e os níveis protéicos de CHT1 estavam aumentados em 50-100%, em comparação com os animais selvagens, o que permitiu uma compensação para síntese de ACh. Este dado corrobora estudos anteriores (Murrin & Kuhar, 1976; Collier & Ilson, 1977; Polak et al., 1977; Sherman et al., 1978; Marchbanks, 1982), indicando que uma resposta adaptativa do sistema numa demanda maior por ACh, estimula a atividade do CHT1, ressaltando a relevância da regulação da atividade do transportador para o sistema colinérgico. A administração de anestésicos como pentobarbital, um inibidor da propagação de impulsos nervosos no trato septo-hipocampal (diminuindo a transmissão colinérgica no SNC), causa uma diminuição tanto no transporte de colina de alta afinidade como na síntese de ACh (Simon & Kuhar, 1975). Ocorre uma alteração na velocidade máxima da reação, sem que haja alteração no Km, indicando que a diminuição do transporte não reflete diminuição da afinidade pelo CHT1 por colina (Wheeler, 1979; Kuhar & Murrin, 1978). Em 2004, Ferguson e colaboradores demonstraram in vivo a contribuição do CHT1 para a neurotransmissão colinérgica, utilizando camundongos nocaute 14 para o CHT1. Os camundongos CHT -/- sobreviviam apenas por uma hora após o nascimento. Acredita-se que a morte ocorreu em decorrência de um déficit na transmissão colinérgica na junção neuromuscular do diafragma e músculos intercostais, que controlam a respiração. Os camundongos heterozigotos para a mutação mantinham os níveis de captação de colina semelhantes aos camundongos selvagens, uma compensação para a redução significativa dos níveis protéicos de CHT1. A existência de um pool intracelular de CHT1, presente em vesículas sinápticas, foi confirmada através de estudos de ligação de [3H]HC-3 em heterozigotos, dando apoio à idéia de que a atividade e tráfego do CHT1 podem ser regulados por uma demanda maior de ACh em neurônios colinérgicos. Pode-se inferir que mutações ou polimorfismos no gene que codifica o CHT1 humano, localizado no cromossomo 2 (Apparsundaram et al., 2000), podem trazer prejuízos a neurotransmissão colinérgica. Essas alterações poderiam modificar a atividade, acoplamento iônico ou tráfego do CHT1. Okuda e colaboradores (2002) fizeram um screening em uma população judaica Ashkenazi, em busca de polimorfismos na região codificadora do gene CHT1 humano. Foi observada uma mutação pontual no códon para o aminoácido 89, a qual ocasiona a troca de uma isoleucina por uma valina (I89V), localizada no terceiro domínio transmembrânico da proteína. A freqüência alélica observada de I89V foi de 6% na população estudada. A avaliação funcional do transportador mutado, utilizando células de mamíferos, revelou uma diminuição de 40-50% no Vmáx para a taxa de captação de colina comparada com o transportador normal. No entanto, não foi observada nenhuma alteração na afinidade do transportador para colina, sódio, cloreto e o seu inibidor específico HC-3, ou seja, não houve uma mudança na capacidade de ligação do transportador. A diminuição no transporte de colina não estava associada a uma diminuição da expressão do transportador na membrana, confirmada por estudos de biotinilação de membrana plasmática. Esse polimorfismo pode representar um fator predisponente para disfunções do sistema colinérgico. Considerando a estrutura primária do CHT1, foi observado que um motivo dileucina bem conservado (527DKTILV532) presente na região C-terminal do CHT1 de rato, humano e de camundongo, é essencial para internalização 15 constitutiva do transportador (Ribeiro et al., 2005). Motivos dileucina e tirosina são motivos de interações protéicas bem caracterizados. Eles estão envolvidos no direcionamento de proteínas de membrana plasmática para vesículas recobertas por clatrina. Essas proteínas são internalizadas através de associação com subunidades de complexos protéicos adaptadores (Kirchhausen, 1999). As mutações L531A e V532A alteram significativamente a distribuição do transportador assim como o transporte de colina. Ocorre um bloqueio da internalização do CHT1 e um aumento da expressão do transportador na membrana plasmática em cerca de duas vezes e conseqüentemente um aumento no transporte de colina (Ribeiro et al., 2005). Através de análise da seqüência primária dos aminoácidos, verificou-se que o CHT1 apresenta sítios potenciais para fosforilação por proteína quinase C (PKC) e A (PKA), o que poderia ser de grande importância para a regulação de sua função (Apparsundaram et al., 2000). O CHT1 é uma fosfoproteína e ativadores de PKC e inibidores de PP1/PP2A têm a capacidade de diminuir a recaptação de colina, assim como diminuir a expressão do transportador na membrana plasmática (Gates et al., 2004). Mecanismos ligados à fosforilação parecem ter papel importante no controle da endocitose de muitos transportadores de membrana plasmática (Gates et al., 2004). A fosforilação pode levar a alterações de expressão na membrana plasmática dos transportadores de dopamina (Huff et al., 1997; Vaughan et al., 1997), serotonina (Qian et al., 1997; Ramamoorthy et al., 1998), glutamato (Casado et al., 1991) norepinefrina (Apparsundaram et al., 1998) e GABA (Corey et al., 1994; Beckman et al., 1999). Em alguns casos, não é só a fosforilação do próprio transportador que controla seu tráfego e atividade, mas a fosforilação de proteínas que interagem com ele, alterando sua distribuição e localização celular. Por exemplo, a expressão do transportador de GABA na superfície celular pode ser alterada por PKC, em um mecanismo envolvendo sintaxina, que é uma proteína do complexo SNARE que interage diretamente com o transportador de GABA (Beckman et al., 1998; Beckman & Quick, 1998). Também já foi mostrado que a interação entre o transportador de dopamina e PICK1 leva a um aumento dos níveis do transportador na membrana plasmática (Torres et al., 2001). 16 A glicosilação de muitos transportadores de membrana plasmática no retículo endoplasmático-Golgi mostrou-se essencial para permitir a expressão desses na membrana plasmática (Asano et al., 1993; Tate & Blakely, 1994; Olivares et al., 1995; Melikian et al., 1996). O CHT1 é uma proteína que pode ser glicosilada (Ferguson et al., 2003). É possível então que o padrão de glicosilação do transportador de colina seja um dos mecanismos a definir o direcionamento do CHT1 para diferentes vesículas intracelulares ou para a membrana plasmática, sendo essa uma maneira de controlar o transporte de colina. No tocante à regulação direta da atividade do CHT1, Xie e Guo (2004) demonstraram que Par-4 (prostate apoptosis response-4), uma proteína que tem um importante papel na disfunção neuronal e morte celular em doenças neurodegenerativas, interage com o CHT1 e regula a atividade do transportador. Os níveis de expressão da proteína Par-4 estão significativamente aumentados no córtex, hipocampo e em neurônios colinérgicos em modelos in vivo e in vitro da doença de Alzheimer (Guo et al., 1998). Além disso, Par-4 contribui para apoptose e produção excessiva do peptídeo β-amilóide 1-42 em células neuronais que apresentam mutações na proteína presenilina-1 (Guo et al., 2000), cuja atividade é crítica para a produção do peptídeo β-amilóide (Parihar & Hemnani, 2004). A superexpressão de Par-4 inibiu o transporte de colina mediado pelo CHT1 em mais de 50% sem no entanto alterar a afinidade do transportador por colina ou HC-3. A interação física CHT1-Par-4 reduziu a expressão do transportador na membrana plasmática. Esse trabalho demonstra a relevância do estudo de proteínas que apresentam interação com o transportador e que, em um futuro próximo, podem esclarecer melhor os mecanismos de regulação do tráfego do transportador e do transporte de colina. Dentro deste contexto é de grande relevância elucidar os mecanismos pelos quais o CHT1 é mobilizado para a superfície celular. A compreensão dos mecanismos envolvidos no tráfego intracelular do CHT1 e como o tráfego afeta a sua atividade são essenciais para o desenvolvimento de estratégias que aumentariam a atividade do transportador, especialmente no desenvolvimento de mecanismos farmacológicos que melhorariam os sintomas de doenças nas quais existe uma hipofunção do sistema colinérgico, como na doença de Alzheimer. 17 1.2.6 – CHT1 e a doença de Alzheimer A doença de Alzheimer é uma desordem neurodegenerativa progressiva e irreversível, que ocorre gradualmente cujos resultados são: perda de memória, alterações comportamentais, mudanças na personalidade e um declínio nas atividades intelectuais (Parihar & Hemnani, 2004). Essa doença é acompanhada principalmente por três alterações estruturais no cérebro: perda difusa de neurônios; presença de depósitos protéicos intracelulares chamados de aglomerados neurofibrilares (NFT); além dos depósitos protéicos extracelulares denominados placas amilóides (Aβ) ou placas senis, rodeadas por neurônios cuja morfologia está alterada (Leslie, 2002; Torreilles & Touchan, 2002). Os peptídeos β-amilóides podem inibir a liberação de ACh e o transporte de colina de alta afinidade em certas regiões cerebrais, principalmente no córtex e hipocampo, que são regiões intimamente associadas à patologia da doença (Kar et al., 1998). Inúmeros mecanismos têm sido propostos para explicar a maneira pela qual a presença desses peptídeos poderia levar à morte neuronal, tais como aumento de cálcio intracelular, produção de espécies reativas de oxigênio e óxido nítrico, diminuição da fluidez da membrana, alterações do núcleo e citoesqueleto, além de processos inflamatórios e auto-imunes (Drouet et al., 2000; Vajda, 2002). Várias evidências sugerem que um dos principais sistemas afetados na doença de Alzheimer é o colinérgico: ocorre maior prejuízo na memória recente em pacientes com Alzheimer quando se administra bloqueador muscarínico como escopolamina; severa redução no número de neurônios do prosencéfalo basal desses pacientes; dramática diminuição na atividade do CHT1, ChAT e disponibilidade de ACh no hipocampo e córtex em pacientes com Alzheimer; menor número de receptores muscarínicos e nicotínicos no SNC desses pacientes. Além disso, observa-se a eficiência parcial do uso de inibidores da acetilcolinesterase para o tratamento de alguns dos sintomas cognitivos nos estágios iniciais da doença (Cooper, 1994; Oda, 1999). Uma vez que a disponibilidade de ACh é regulada essencialmente pelo aporte de colina, a caracterização do transporte de colina de alta afinidade 18 realizado pelo CHT1, assim como as possíveis vias de regulação do transportador é de fundamental importância para que se possa elucidar como as alterações no sistema colinérgico afetam o desenvolvimento da doença de Alzheimer, o que poderia contribuir para um possível controle dessa enfermidade. 1.3 - Tráfego celular Os componentes protéicos de membranas de vesículas sinápticas são sintetizados no corpo celular dos neurônios. Inicialmente seguem um caminho comum a todos os componentes do caminho secretório, são inseridos na membrana do retículo endoplasmático (ER) e transportados através do complexo de Golgi até a rede trans-Golgi (TGN) (Bennet & Scheller, 1994). Enquanto a maioria das proteínas vesiculares está concentrada em regiões sinápticas, uma quantidade significativa é detectada na região do complexo de Golgi (Baumert et al., 1990), refletindo a abundância dessas proteínas que estão em trânsito através das vias biossintéticas e de degradação. A partir do TGN, os componentes das vesículas sinápticas são seletivamente direcionados para o terminal nervoso e esse processo ocorre via transporte axonal. As proteínas de vesículas sinápticas são direcionadas para a membrana plasmática durante os vários ciclos de exocitose (Südhof & Jahn, 1991; Südhof, 2004). Posteriormente, as proteínas de vesículas sinápticas incorporadas na membrana plasmática, sofrem endocitose e voltam a constituir a membrana de vesículas sinápticas, num processo de reciclagem. O direcionamento de proteínas que fazem parte da composição dessas vesículas envolve a formação de complexos proteína-proteína específicos (Bennet & Scheller, 1994). A internalização de proteínas a partir da membrana plasmática acontece em vesículas, que em sua maioria são revestidas. A função das proteínas de revestimento é selecionar as proteínas a serem endocitadas e interagir com proteínas do complexo endocítico, facilitando a estabilização das vesículas (Boehm & Bonifacino, 2001). As principais classes de vesículas são aquelas 19 revestidas por clatrina (CCVs). Esse tipo de vesícula participa não só da endocitose a partir da membrana, como também do transporte entre Golgi e endossomos, entre outros. Existem várias proteínas que participam das CCVs, entre elas as proteínas adaptadoras (AP1, AP2, AP3), cada uma regulando o tráfego entre diferentes organelas. O AP2, por exemplo, está presente em vesículas que são endocitadas a partir da membrana plasmática, enquanto o AP1 participa de vesículas que trafegam entre Golgi e endossomos (Robinson, 1987). O AP2 apresenta uma função fundamental na endocitose via clatrina, uma vez que é capaz de se ligar à clatrina, à fosfolípides de membrana e a outros componentes do complexo endocítico. Além disso, AP2 também tem a função de selecionar proteínas de membrana, tais como receptores e transportadores, para endocitose (Owen, 2004). Alguns estudos indicam que transportadores de neurotransmissores são freqüentemente regulados por mudanças de expressão na superfície celular. A vantagem desse tipo de regulação é que isso pode ocorrer em um espaço de tempo curto e prevenir um potencial consumo de tempo durante o processo de transcrição e tradução (Robinson, 2002). Em vários sistemas biológicos, a habilidade em alterar a expressão de transportadores e receptores na membrana plasmática é uma estratégia altamente conservada e dinâmica (Hicke, 1999). Como exemplo pode-se citar a regulação do tráfego celular dos receptores acoplados à proteína G. Freqüentemente, a ligação do agonista leva a um aumento da endocitose do receptor, diminuindo respostas celulares subseqüentes ao agonista (Laporte et al., 2000). No tocante ao CHT1, uma vez que esse é mobilizado constitutivamente entre a membrana plasmática e compartimentos intracelulares, em ciclos contínuos de endocitose e exocitose (Ribeiro et al., 2003; Ferguson et al., 2003), o delineamento desse tráfego é essencial para entendermos a regulação e controle do transporte de colina de alta afinidade e conseqüentemente a transmissão colinérgica nas sinapses. 20 1.4 – Duplo híbrido em leveduras Com o intuito de identificar as proteínas que poderiam interagir com o VAChT, o nosso grupo de pesquisa iniciou na Duke University (Durhan, North Caroline, USA) um screening utilizando uma biblioteca de cDNA de cérebro humano como “presa”, e como “isca” utilizou a região C-terminal do transportador VAChT, assim como a região C-terminal do transportador vesicular de monoaminas VMAT2. Essas proteínas são homólogas e possuem funções similares. É importante ressaltar que foram feitos experimentos de imunoblots para garantir que a expressão das proteínas de interesse, cujas seqüências foram inseridas nos devidos plasmídeos, foi detectada em leveduras. As colônias positivas foram isoladas e as “presas” foram identificadas através de seqüenciamento do inserto contido no plasmídeo pACT2, ou seja, o plasmídeo utilizado para a construção da biblioteca de cDNA de cérebro humano. Ao realizar o seqüenciamento foram identificadas as proteínas listadas na Tabela 1. As interações foram confirmadas refazendo-se o ensaio de duplo híbrido em leveduras com cada proteína. O estudo da distribuição do VAChT em células SN56 revela que o transportador está localizado em endossomos primários e de reciclagem, bem como em vesículas tipo sinápticas (Santos et al., 2001; Barbosa, Jr. et al., 2002; Ferreira et al., 2005). No sistema nervoso central, dados de microscopia confocal indicam que o CHT1 está distribuído predominantemente em vesículas pré-sinápticas, que também apresentam o transportador VAChT, exibindo uma extensa co-localização com o mesmo (Ferguson et al., 2003; Ribeiro et al., 2003). Essa co-localização pode ser observada não só no corpo celular, mas também nos processos e varicosidades das células. O tráfego do CHT1 é muito similar ao tráfego do VAChT. CHT1 e VAChT exibem motivos de endocitose similares, sendo que um motivo tipo dileucina presente na região C-terminal desses dois transportadores parece ser essencial para a endocitose dos mesmos (Tan et al., 1998; Santos et al., 2001; Barbosa, Jr. et al., 2002; Ribeiro et al., 2005). Portanto, é possível que proteínas importantes para o tráfego do VAChT sejam importantes também para o tráfego do CHT1. 21 VMAT2 (isca 1) Clone Tamanho cDNA Interação confirmada no duplo híbrido em leveduras? Proteínas identificadas MAP1A 37.1 2,3 kb Sim MAP1A 54.4 2,35 kb Sim BRI3 43.1 2,1 kb Não MAP1A 41.1 2,55 kb Sim VAChT (isca 2) Clone Tamanho cDNA Interação confirmada no duplo híbrido em leveduras? Proteínas identificadas Rab14 5.6 0,9 kb Sim EIF4A2 (Euc. Transl. Init. Fact) 6.3 0,9 kb Sim BRI3 8.7 1 kb Sim MAP1B 9.2 2,4 kb Sim EIF4A2 10.1 1 kb Sim Kchip2 13.3 2,4 kb Sim SRC like kinase Fyn kinase 23.1 2,6 kb Não SEC14 Like or homologue 23.2 0,8 kb Sim Rab 14 34.3 3 kb Sim MAP1A 38.3 2,1 kb Sim EIF4A2 42.6 0,6 kb Sim Flotillin1 43.3 1,2 kb Sim Clathrin light chain A 52.1 1,2 kb Sim Nischarin 53.6 1 kb Sim Tabela 1: Resultado do screening em duplo híbrido em leveduras utilizando como “iscas” VMAT2 ou VAChT, e como “presa” uma biblioteca de cDNA de cérebro humano. 22 2 – Objetivos 23 2.1 – Objetivo geral Nosso objetivo é estudar se a interação do CHT1 com proteínas citoplasmáticas pode modular a atividade do transportador e elucidar mecanismos envolvidos nesse processo. 2.2 – Objetivos específicos - Identificar proteínas que interajam com o CHT1. - Determinar se o tráfego celular do CHT1 é modificado pela interação com essas proteínas. - Verificar se o CHT1 colocaliza com essas proteínas. - Avaliar se interações proteína-proteína afetam o transporte de colina de alta afinidade. 24 3 – Material e métodos 25 3.1 - Vetor pACT2 (CLONTECH Laboratories, Inc.) Os cDNA´s que codificam as regiões das proteínas de interesse, utilizadas nos experimentos, foram clonados no sítio múltiplo de clonagem (MCS) do vetor pACT2 (8,1 kb) de modo que a orientação e a janela aberta de leitura (open reading frame – ORF) fossem corretas. O MCS está posicionado na região 3´ da seqüência do domínio de ativação do DNA (DNA-AD) da proteína GAL4 (aminoácidos 768-881). O promotor ADH1 promove a expressão da proteína híbrida em altos níveis na levedura hospedeira. Essa proteína é direcionada para o núcleo da levedura através da seqüência de localização nuclear do antígeno SV40, que foi clonado na região 5´ da seqüência GAL4 AD. pACT2 replica-se de maneira autônoma em E. coli e S. cerevisiae. Possui o gene bla que confere resistência a ampicilina em E. coli, além disso, possui o marcador nutricional LEU2 que permite que leveduras auxotróficas transformadas com o vetor cresçam em meio de cultura deficiente desse aminoácido. O mapa do vetor pACT2 AD está representado na Figura 3. 3.2 - Vetor pGBKT7 (CLONTECH Laboratories, Inc.) O cDNA que codifica a região C-terminal do CHT1 (aminoácidos 498-580) foi clonado no sítio múltiplo de clonagem (MCS) do vetor pGBKT7 (7,3 kb) de modo que a orientação e a janela aberta de leitura (open reading frame – ORF) fossem corretas. O vetor expressa essa proteína em fusão com os aminácidos 1-147 do domínio de ligação ao DNA (DNA-BD) da proteína GAL4. O epítopo c- Myc também é expresso em fusão. Em leveduras, o promotor ADH1 promove a expressão de altos níveis das proteínas híbridas. A transcrição é finalizada pelos sinais de término de transcrição T7 e ADH1 (TT7 & ADH1). pGBKT7 replica de maneira autônoma em E. coli e S. cerevisiae a partir das origens de replicação pUC e 2μ ori, respectivamente. O vetor possui gene que confere resistência a kanamicina para seleção em E. coli e o marcador nutricional TRP1 para seleção em leveduras. O mapa do vetor pGBKT7 está representado na Figura 4. 26 Figura 3: Mapa esquemático do vetor pACT2 (CLONTECH Laboratories, Inc.) 27 Figura 4: Mapa esquemático do vetor pGBKT7 (CLONTECH Laboratories, Inc.) 28 3.3 - Saccharomyces cerevisiae AH109 A cepa AH109 foi construída para detectar interações proteína-proteína por screening em duplo híbrido. AH109 possui os genes repórteres ADE2, HIS3, lacZ e MEL1, que são expressos somente na presença de interações protéicas baseadas na ativação da transcrição por GAL4. 3.4 – Duplo híbrido em leveduras A técnica de duplo híbrido em leveduras foi realizada de acordo com os procedimentos descritos por Gietz & Schiestl (1995). Em resumo, leveduras S. cerevisiae haplóides AH109 foram crescidas por 16 horas a 30ºC em 20mL de meio YPDA (peptona 2%, extrato de levedura 1%, glicose 2%, adenina 0,003% pH 7,0) sob leve agitação. Após este período foi feita uma diluição das células (10mL da cultura líquida em 40mL de meio YPDA) e o crescimento foi acompanhado até atingirem uma DO600 de 0,8 (cerca de 8x106 células). As leveduras foram centrifugadas por 5 minutos a 2.500 g, ressuspendidas em 25 mL de água estéril e centrifugadas novamente. As células foram lavadas com 1 mL de acetato de lítio 100 mM e transferidas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugou-se o tubo por 15 segundos a 9.500 g, o sobrenadante foi descartado e o pellet formado foi ressuspendido novamente com 400 μL de acetato de lítio 100 mM. Foram feitas alíquotas de 50 μL em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, que foram centrifugados e descartou-se o sobrenadante. Em seguida adicionou-se lentamente os reagentes de transformação seguindo a ordem: 240 μL PEG (50% W/V, Clontech), 36 μL acetato de lítio 1,0 M (Clontech), 25 μL de DNA de esperma de salmão (3 μg/mL, Invitrogen) previamente desnaturado (fervido por 5 minutos e rapidamente resfriado em gelo) e os pares de vetores (~0,5 – 1 μg) de acordo com as combinações experimentais a serem testadas. 29 Os tubos foram vigorosamente agitados (~1minuto), incubados em estufa a 30ºC por 30 minutos. Em seguida foram incubados em banho-maria a 42ºC (heat shock) por 25 minutos. Posteriormente as células foram centrifugadas por 15 segundos a 9.500 g, o sobrenadante retirado e o pellet ressuspendido com 1mL de água estéril. As leveduras co-transformadas foram plaqueadas em meio mínimo SD Agar base (Clontech) adicionado do suplemento DO - Leu/-Trp (Yeast Nitrogen Base 0,17%, sulfato de amônio 0,5%, glicose 2%) para avaliar a eficiência de transformação. As interações protéicas geradas a partir da co-transformação foram determinadas através do plaqueamento das leveduras em placas contendo meio mínimo SD Agar base (Clontech) adicionado do suplemento DO –Leu/-Trp/-His/-Ade, contendo ou não 3-AT na concentração de 5 e 10mM, para verificar a ativação dos genes repórteres HIS3 e ADE2. 3.5 – Vetores eucariotos Trabalhamos com os seguintes vetores eucariotos: 3.5.1 - pCDNA 3.1 (-) (Invitrogen): nesse vetor está subclonado o cDNA que codifica CHT1-FLAG. 3.5.2 - pCMV-Myc (Clontech): nesse vetor está subclonado o cDNA que codifica SEC14 like – myc. 3.6 – Cultura celular 3.6.1- HEK 293 Nos experimentos de transporte de colina e co-imunoprecipitação foram utilizadas células embrionárias renais humanas (HEK 293), adquiridas do banco de células do Rio de Janeiro – Cell bank. HEK 293 são células epiteliais 30 imortalizadas com adenovírus E1A – Adenovírus humano tipo 5 (Graham, 1977). As células foram crescidas em garrafas de cultura (35mmx60mmx100mm) com 5mL de meio DMEM (Dulbecoo’s modified Eagle’s medium – Sigma), acrescidos de 10% (v/v) de soro fetal bovino (Gibco) além de 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco) em estufa a 37°C com atmosfera de 95% de ar e 5% de CO2. O meio foi trocado a cada 48 horas, e as células removidas mecanicamente para outras garrafas quando atingiam aproximadamente 90% de confluência. 3.6.2- SN56 As células SN56 foram cedidas pelo Professor Bruce Wainer (Department of Pathology, Emory University School of Medicine, Atlanta, GA, USA). As células SN56 são derivadas de neurônios septais (Hammond et al. 1990) e apresentam várias características colinérgicas (Blusztajn et al., 1983; Barbosa, Jr. et al., 2002; Kushmerick et al., 2001). Essas células apresentam vesículas tipo sinápticas em suas varicosidades (Hammond et al., 1990) e expressam várias proteínas de vesículas sinápticas, incluindo sinaptotagmina I (Barbosa, Jr. et al., 2002). Tais características são mais pronunciadas quando as células são diferenciadas (Blusztajn et al., 1983; Kushmerick et al., 2001). As células SN56 foram mantidas em meio DMEM (Sigma), adicionado de 10% de soro fetal bovino (Gibco); 2 mM de L-glutamina e 1% de penicilina- estreptomicina (Gibco) em garrafas de cultura de 50 mL em estufa de CO2 à 5% e 37°C. As células foram diferenciadas neste mesmo meio, mas sem soro fetal, suplementado com 1mM de dibutiril – AMPc (Sigma) por 2 dias. O meio foi trocado a cada dois dias, exceto durante a diferenciação, quando era trocado a cada 24 horas. 31 3.7 - Plaqueamento e transfecção Para utilização das células para transfecção, essas eram removidas mecanicamente para placas de 35 ou 100mm, ou ainda para lamínulas para experimentos de microscopia confocal. Para isso, as células eram contadas em câmara de Neubauer – Improved Neubauer, 1x10 mm de profundidade (Boeco). Essas células eram então incubadas por 12 a 18 horas em estufa a 37°C com atmosfera de 95% de ar e 5% de CO2 para então serem utilizadas para transfecção. Para transfecção foram utilizados dois métodos: 3.7.1 - Lipofectamina: Esse é um método de transfecção mediado por lipossomo. Os procedimentos foram realizados de acordo com as especificações do fabricante (Lipofectamina 2000, Life Technologies). As transfecções foram realizadas utilizando o meio Optimen (Gibco) para se diluir o DNA e a lipofectamina. Foram usados 1 a 2 μg de DNA para transfecção de células em placas de 35 mm. Para transfecção de células SN56 utilizou-se 2,5 μl de lipofectamina para cada μg de DNA. As células foram incubadas com o meio de transfecção por 4 horas a 37°C com atmosfera de 95% de ar e 5% de CO2, sendo que o meio de transfecção foi substituído por meio de cultura. 24 a 48 horas após a transfecção as células foram utilizadas para experimentos. 3.7.2 - Fosfato de cálcio: O método de transfecção utilizado é uma modificação do método de transfecção por cálcio (Ferguson & Caron, 2004). Células HEK 293 foram plaqueadas em um número de 1,2x106 células por placas de 100 mm, o que gera uma confluência celular próxima a 60%, sendo essa a ideal para a eficiência do método aqui descrito. A transfecção foi realizada um dia após 32 plaqueamento. Para a transfecção, adicionou-se em tubo de 1,5 mL em torno de 4 a 6 μg de DNA + água suficiente para o volume de 450 μl. Juntou-se então 50 μl de CaCl2 2,5 M e depois gotejou-se cuidadosamente 500 μl HBS 2x. Solução de 2x HEPES-buffered saline (HBS): NaCl 0,28 M, HEPES 0,05 M, Na2HPO4 1,5 mM. O pH foi acertado para 7,05 – 7,12 utilizando-se NaOH 5 M. Um pH exato é de extrema importância para garantir a eficiência de transfecção, sendo que essa eficiência deve ser testada cada vez que se preparar novo HBS. É importante que o HBS 2x seja adicionado vagarosamente para que o complexo Ca2+/DNA se forme e se mantenha estável, assegurando alto nível de transfecção. Após adição do HBS 2x pipetou-se novamente o volume total (agora de 1 mL) por duas vezes para promover a homogeneidade da mistura. Nessa etapa também é importante que a pipetação seja realizada vagarosamente, gotejando-se a mistura. Em seguida, a mistura de transfecção foi adicionada à cultura de células presentes nas placas de 100 mm. A mistura de transfecção e as células foram mantidas por 18 a 20 horas a 37°C com atmosfera de 95% de ar e 5% de CO2. Após esse período as células foram lavadas por três vezes com o próprio meio de cultura. Quando necessário, as células foram replaqueadas, 4 horas após a troca do meio, para a realização de experimentos. Os experimentos foram realizados no segundo dia após a transfecção. 3.8 – Co-imunoprecipitação Os experimentos de co-imunoprecipitação foram realizados de acordo com as indicações do fabricante das esferas de agarose revestidas com anticorpo anti-FLAG (Sigma-Aldrich). Foram utilizadas células HEK 293 co- expressando CHT1-FLAG e SEC14-Myc. Em banho de gelo, as células foram lavadas duas vezes com TBS pH 7,6 (Tris buffered saline, 20mM tris base, 137mM NaCl). Em seguida lisadas com um tampão de lise (1% CHAPS, 0,1M tampão fosfato de sódio, pH 7,2, Glicerol 10%, 150mM NaCl) contendo inibidores de proteases (AEBSF 0,1 mM e 10 μg/mL de leupeptin e aprotinin). Os lisados foram transferidos para tubos de 1,5mL e colocados em um aparelho 33 rotatório na câmara fria (4ºC) por uma hora. Após essa incubação, as amostras foram centrifugadas a 13.500 g por 20 min a 4ºC. Os sobrenadantes foram transferidos para tubos novos, sendo então dosados pelo método de Bradford (Bradford, 1976) para se determinar o conteúdo protéico. 800 μg de cada amostra foram incubados com 40 μL de esferas de agarose revestidas com anticorpo anti-FLAG (Sigma-Aldrich), previamente lavadas por três vezes com TBS, em aparelho rotatório na câmara fria (4ºC) por duas horas. As esferas foram centrifugadas e lavadas três vezes com tampão de lise e três vezes com TBS, sendo posteriormente ressuspendidas em 20 μL de tampão de amostra SDS-PAGE 3X. As amostras foram então resolvidas em gel SDS-PAGE, transferidas para membrana de nitrocelulose, sendo posteriormente reveladas por imunoblot, onde se utilizou anticorpos anti-CHT1 policlonal (1:1000, cedido por Dr. Jane R. Rylett, University of Western Ontario, Canada) ou anti-Myc (1:3000, para detectar SEC14, Covance Research Products). 3.9 - Transporte de Colina Os experimentos de transporte de colina foram realizados de acordo com procedimentos descritos por Ribeiro e colaboradores (2003). As células a serem testadas foram lavadas duas vezes com meio Krebs e pré-incubadas a 37°C por 10 min no mesmo meio. Para as células que foram tratadas com HC-3, esse foi adicionado nessa etapa e mantido também na etapa de incubação com colina. Depois da pré-incubação esse meio foi trocado por meio KREBS + colina 1 μM (colina não radioativa + 0,012 nM de colina radioativa: [Methyl-3H] Choline Cloride Ethanol Solution, atividade específica 83,0 Ci/mMol (Amersham – Life Science)), apresentando cerca de 1 μCi por placa. Incubou-se as células a 37°C pelo tempo de 10 min. Depois da incubação, as células foram colocadas sobre o gelo e lavadas 3 vezes com meio KREBS gelado para se retirar a colina presente no sobrenadante. Retirou-se o meio e adicionou-se 1 mL de NaOH 0,1 M para promover a lise celular. As células foram incubadas por 30 min à temperatura ambiente para que a lise fosse completa. Depois desse tempo, 34 homogeneizou-se as células por pipetação. 300 μL desse lisado foram adicionados a frascos contendo 3 mL de solução de Bray (líquido de cintilação), utilizados para medida da radioatividade por cintilação líquida no Liquid Scintilation Analyzer (Packard). Os resultados foram expressos em dpm (número de desintegrações por minuto). 3.10 - Gel SDS-PAGE e Western blot As amostras foram submetidas a eletroforese em gel NuPAGETM 4-12% Bis-Tris (Invitrogen), sendo posteriormente transferidas para membrana de nitrocelulose, de acordo com procedimentos descritos por Towbin e colaboradores (1979). 3.10.1 - CHT1-FLAG: as membranas foram incubadas em solução de bloqueio (PBS pH 7,4, contendo 0,15% de Triton e 8% de leite) por 30 min. Em seguida, incubou-se as membranas por 1,5 h com anticorpo primário anti-CHT1 (1:1000, cedido por Dr. Jane R. Rylett, University of Western Ontario, Canada) em solução de bloqueio. As membranas foram lavadas três vezes e incubadas com anticorpo secundário (horsedish peroxidase-conjugated donkey, KPL, 1:2500) IgG anti-coelho em solução de bloqueio por uma hora. Após serem lavadas três vezes novamente, as membranas foram submetidas à detecção quimioluminescente, utilizando kit ECL (Amersham). Bandas imunorreativas não saturadas foram submetidas a scanner. 3.10.2 - SEC14-Myc: o procedimento foi o mesmo para a detecção de CHT1-FLAG, porém a solução de bloqueio utilizada foi TBS pH 7,6, contendo Tween 20 0,05% e 8% de leite. O anticorpo primário utilizado foi anti-Myc (1:3000, Covance Research Products) em solução de bloqueio e o anticorpo secundário (horsedish peroxidase-conjugated donkey, KPL,1:2500) anti- camundongo IgG em solução de bloqueio. 35 3.11 - Imunofluorescência Os experimentos de imunofluorescência foram realizados de acordo com procedimentos descritos por Canfield & Levenson (1993) . As células foram lavadas três vezes em PBS 1x (tampão fosfato salina, pH 7.4) e então fixadas com paraformaldeído 3% durante 20 minutos. As células foram novamente lavadas três vezes e então incubadas na solução de bloqueio/permeabilização (PBS 1x contendo 2.5% de soro de cabra, 0.05% de nonindet P-40 e 1% de albumina bovina) por 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, as células foram incubadas com anticorpo primário (diluído na solução de bloqueio/permeabilização) por uma hora a temperatura ambiente. O anticorpo monoclonal anti-Myc (1:3000, Covance Research Products) foi utilizado como anticorpo primário, bem como o anticorpo policlonal anti-FLAG (1:500, Sigma- Aldrich). Após a incubação com o anticorpo primário, as células foram lavadas três vezes por 5 minutos com PBS 1x. Anticorpos secundários conjugados com Alexa Fluor 568 ou Alexa Fluor 488 (Molecular Probes) foram utilizados. Experimentos controles, com omissão do anticorpo primário foram realizados para verificar a especificidade da marcação, bem como marcação de células não transfectadas com anticorpos primários e secundários. A maioria das imagens de células fixadas foi coletada utilizando um sistema de confocal Bio-Rad (modelo MRC 1024, acoplado a um microscópio Zeiss –Axiovert 100), utilizando o software lasersharp (versão 3.1, Bio-Rad) com objetiva de 100x de imersão em óleo. Outro microscópio confocal também foi utilizado, o Zeiss LSM510 META Confocal Microscope, do CEMEL da UFMG, Belo Horizonte-MG. Para excitar as preparações foi utilizado laser UV de argônio (488 nm) ou laser de argônio-kriptônio (através das linhas 488 nm ou 568 nm). 36 4 – Resultados 37 4.1 - Interações detectadas no duplo híbrido em leveduras Nosso objetivo inicial foi verificar se as interações positivas entre o VAChT e as várias proteínas “pescadas” na biblioteca de cDNA de cérebro humano, que parecem ter papel no tráfego de proteínas, também seriam verdadeiras para o CHT1. Para isso escolhemos as seguintes proteínas para iniciar os experimentos de duplo híbrido, utilizando como “isca” a região C- terminal do CHT1: 1 – MAP1A 2 – BRI3 3 – Rab14 4 – Nischarin 5 – Flotilina1 6 – SEC14like 4.1.1 – Interação CHT1 x MAP1A Nos experimentos que realizamos, o gene que codifica a região C- terminal do CHT1 foi clonado no vetor pGBKT7 e o gene que codifica a cadeia leve de MAP1A foi clonado no vetor pACT2. Ao avaliar a ativação dos genes repórteres, utilizamos dois controles negativos, ou seja, transformamos leveduras AH109 com pGBKT7-CHT1 e pACT2 sem o inserto, ou pGBKT7 sem o inserto e pACT2-MAP1A. Na Figura 5, podemos observar o resultado do experimento. Em A, estão representadas as placas onde as leveduras transformadas foram plaqueadas em meio de cultura deficiente dos aminoácidos leucina e triptofano. Podemos observar que houve crescimento homogêneo nas três condições avaliadas. Esse crescimento indica que houve transformação, ou seja, a levedura 38 Saccharomyces cerevisiae AH109 foi capaz de assimilar eficientemente os dois plasmídeos. Como os plasmídeos pACT2 e pGBKT7 possuem genes que levam à produção de enzimas envolvidas na biossíntese de leucina e triptofano respectivamente, as leveduras que assimilaram os dois plasmídeos cresceram nas placas contendo meio de cultura deficiente nesses aminoácidos. Na Figura 5 B, estão apresentados os resultados do plaqueamento das leveduras em meio de cultura deficiente em leucina (L), triptofano (W), histidina (H) e adenina (A). O intuito dessa etapa do experimento foi verificar se existe interação física entre as proteínas em estudo. Caso exista essa interação, os domínios de ligação ao DNA e de ativação da transcrição de GAL4 serão aproximados, permitindo a ativação da transcrição dos genes repórteres (HIS3 e ADE2) e conseqüentemente, o crescimento da levedura. Como podemos observar existe interação física entre CHT1 e MAP1A (Figura 5 B). Onde foram plaqueadas leveduras transformadas com um dos plasmídeos sem o inserto de cDNA, não houve ativação dos genes repórteres e portanto, não houve o crescimento das leveduras. Isso sugere que a interação entre a região C- terminal do CHT1 e a cadeia leve de MAP1A no duplo híbrido em leveduras é específica. Em C e D, plaqueamos as leveduras em meios de cultura deficientes em leucina, triptofano, histidina e adenina, porém na presença de 3-AT, o inibidor competitivo do gene HIS3, nas concentrações de 5 e 10mM. O crescimento das leveduras nesse meio indica que a interação observada é uma interação forte, pois a expressão do gene HIS3 é fortemente inibida, dificultando qualquer crescimento referente a uma ativação constitutiva do gene em questão. 39 Figura 5: CHT1 e MAP1A interagem no duplo híbrido em leveduras. (A) Controle de transformação do experimento: crescimento em meio de cultura isento de leucina e triptofano. (B) Interação positiva entre CHT1 e MAP1A, houve ativação dos genes repórteres HIS3 e ADE2 e crescimento em meio de cultura isento de leucina, triptofano, histidina e adenina. (C) e (D) representam condições mais estringentes na presença de 3-AT, nas concentrações de 5 e 10mM respectivamente (o crescimento nessas condições indica interação forte). Os dados são representativos de 4 experimentos independentes. 40 4.1.2 – Interação CHT1 x BRI3 BRI3 pertence à família de proteínas integrais de membrana contendo pelo menos três membros, BRI1, BRI2 e BRI3 (Vidal et al., 2001). A expressão de BRI1 está associada à osteogênese e condrogênese assim como a maturação de células T (Vidal et al., 2001). Uma mutação pontual no códon de parada da proteína BRI2 resulta na formação de um peptídeo amiloidogênico, responsável por um tipo de demência no Reino Unido (Vidal et al., 1999; Vidal et al., 2000). Até o momento, muito pouco se sabe sobre a função fisiológica de BRI3, uma proteína de 267 aminoácidos ancorada à membrana, exceto que ela é altamente expressa no cérebro humano, especialmente no córtex e hipocampo (Vidal et al., 2001). Como podemos observar na Figura 6, existe interação específica entre CHT1 e BRI3. Em A podemos observar que houve crescimento homogêneo das leveduras que foram transformadas e plaqueadas em meio de cultura isento de L e W, indicando que houve transformação. Houve a ativação dos genes repórteres da levedura Saccharomyces cerevisiae AH109, em função da interação física entre CHT1 e BRI3, com o crescimento em meio de cultura isento de L,W,H e A como podemos observar em B. 41 Figura 6: CHT1 e BRI3 interagem no duplo híbrido em leveduras. (A) Controle de transformação do experimento: crescimento em meio de cultura isento de leucina e triptofano. (B) Interção positiva entre CHT1 e BRI3, houve ativação dos genes repórteres HIS3 e ADE2 e crescimento em meio de cultura isento de leucina, triptofano, histidina e adenina. Os dados são representativos de 4 experimentos independentes. 42 4.1.3 – Interação CHT1 x Rab14 Proteínas Rab pertencem à superfamília das pequenas GTPases semelhantes a Ras, que são essenciais para a regulação do tráfego entre diferentes compartimentos intracelulares (Deneka et al., 2003). Como outras GTPases, as proteínas Rab ciclam entre um estado ativo, ligado a GTP, e um estado inativo, ligado a GDP. No estado ativo, Rabs recrutam proteínas efetoras específicas para a membrana (Novick & Zerial, 1997). Em um trabalho recente, Larance e colaboradores (2005) demonstraram que a regulação do tráfego intracelular do transportador de glicose (GLUT4) envolve a atividade de Rab14, entre outras proteínas. Não observamos interação física entre o CHT1 e Rab14 no duplo híbrido em leveduras. Na Figura 7 podemos observar em A, a transformação do experimento, com crescimento das leveduras transformadas e plaqueadas em meio de cultura isento de L e W. Em B, observamos que não houve interação entre CHT1 e Rab14, uma vez que não houve crescimento das leveduras em meio de cultura isento de L,W,H e A. 43 Figura 7: CHT1 e Rab14 não interagem no duplo híbrido em leveduras. (A) Controle de transformação do experimento: crescimento em meio de cultura isento de leucina e triptofano. (B) Ausência de interação entre CHT1 e Rab14. Não houve ativação dos genes repórteres HIS3 e ADE2 como indicado pela ausência de crescimento em meio de cultura isento de leucina, triptofano, histidina e adenina. Os dados são representativos de 4 experimentos independentes. 44 4.1.4 – Interação CHT1 x Niscarina Niscarina é uma proteína que interage com integrinas e sua superexpressão em fibroblastos leva a mudanças na organização do citoesqueleto e uma grande inibição da migração celular. A superexpressão influencia a organização dos filamentos de actina em vários tipos celulares. Ocorre a formação de filamentos anormais em forma de cesta ao redor da periferia celular (Alahari et al., 2000). Estudos de fracionamento celular e imunofluorescência indicam que Niscarina é uma proteína citosólica solúvel. Ela é altamente expressa em linhagens celulares neuronais, mais do que em células epiteliais ou fibroblastos, embora níveis basais de expressão sejam encontrados em praticamente todos os tipos celulares (Alahari et al., 2000). Não observamos interação física entre o CHT1 e Niscarina utilizando a técnica de duplo híbrido em leveduras. Na Figura 8 podemos observar em A, a transformação desse experimento. Houve crescimento homogêneo das leveduras que foram transformadas e plaqueadas em meio de cultura isento de L e W. Em B, verificamos que não houve ativação dos genes repórteres da levedura Saccharomyces cerevisiae AH109, uma vez que não observamos crescimento em meio de cultura isento de L,W,H e A. 45 Figura 8: CHT1 e Niscarina não interagem no duplo híbrido em leveduras. (A) Controle de transformação do experimento: crescimento em meio de cultura isento de leucina e triptofano. (B) Ausência de interação entre CHT1 e Niscarina. Não houve ativação dos genes repórteres HIS3 e ADE2 como indicado pela ausência de crescimento em meio de cultura isento de leucina, triptofano, histidina e adenina. Os dados são representativos de 3 experimentos independentes. 46 4.1.5 – Interação CHT1 x Flotilina1 Flotilina é uma proteína integral de membrana que faz parte da composição de caveolae. Caveolae são microdomínios da membrana plasmática que se apresentam como pequenas invaginações, de diâmetro aproximado de 25-150 nm. Estão envolvidos no tráfego vesicular e transdução de sinais e possuem inúmeras funções definidas (Bickel et al., 1997). Como podemos observar na Figura 9, existe interação específica entre CHT1 e Flotilina1. Em A, observamos crescimento homogêneo das leveduras que foram transformadas e plaqueadas em meio de cultura isento de L e W, indicando que houve eficiência de transformação. Em B, e houve a ativação dos genes repórteres da levedura Saccharomyces cerevisiae AH109, em função da interação física entre CHT1 e Flotilina1, com o crescimento das leveduras em meio de cultura isento de L,W,H e A. 47 Figura 9: CHT1 e Flotilina1 interagem no duplo híbrido em leveduras. (A) Controle de transformação do experimento: crescimento em meio de cultura isento de leucina e triptofano. (B) Interação positiva entre CHT1 e Flotilina1, houve ativação dos genes repórteres HIS3 e ADE2 e crescimento em meio de cultura isento de leucina, triptofano, histidina e adenina. Os dados são representativos de 4 experimentos independentes. 48 4.1.6 – Interação CHT1 x SEC14like SEC14 é a principal proteína envolvida na transferência de fosfatidilinositóis (PI) em Saccharomyces cerevisiae. Em humanos seu homólogo é conhecido como SEC14like. Estudos de fracionamento celular demonstraram que SEC14 é uma proteína encontrada no citoplasma. Acredita- se que ela seja um fator citosólico que promove o transporte de proteínas a partir do complexo de Golgi, presumivelmente em função da sua habilidade de ligação a fosfolípides (Bankaitis et al, 1989). O complexo de Golgi é comum a todas as células eucariotas, esta organela é de fundamental importância para a regulação do tráfego de proteínas intracelulares que transitam entre os últimos estágios do caminho secretório, na reciclagem de membrana a partir da superfície celular, e na comunicação entre diversas etapas do caminho endocítico (Griffiths et al, 1986). Na Figura 10 podemos verificar que existe interação específica entre CHT1 e SEC14like. Houve crescimento homogêneo das leveduras que foram transformadas e plaqueadas em meio de cultura isento de L e W, indicando que houve transformação e houve a ativação dos genes repórteres da levedura Saccharomyces cerevisiae AH109, em função da interação física entre CHT1 e SEC14like, com o crescimento das leveduras em meio de cultura isento de L,W,H e A. 49 Figura 10: CHT1 e SEC14like interagem no duplo híbrido em leveduras. (A) Controle de transformação do experimento: crescimento em meio de cultura isento de leucina e triptofano. (B) Interação positiva entre CHT1 e SEC14like, houve ativação dos genes repórteres HIS3 e ADE2 e crescimento em meio de cultura isento de leucina, triptofano, histidina e adenina. Os dados são representativos de 4 experimentos independentes. 50 Em humanos, SEC14like é uma proteína ainda pouco descrita, por isso, para delinear com maiores detalhes a relevância da interação CHT1- SEC14like, procuramos analisar e melhor caracterizar essa interação. Posteriormente, nosso grupo tem interesse em caracterizar também as demais interações verificadas para o CHT1 nesses ensaios. A interação CHT1-SEC14like detectada no duplo híbrido em leveduras ocorreu entre a porção C-terminal do CHT1 e a porção C-terminal da proteína SEC14like. Esse foi o fragmento “pescado” no screening de duplo híbrido em leveduras utilizando VMAT2 e VAChT como “isca”. Para a realização dos experimentos subseqüentes, fizemos a clonagem da janela aberta de leitura da proteína SEC14like completa no vetor pCMV-Myc. A clonagem foi realizada por RT-PCR a partir de um pool de RNA mensageiros de células HeLa por Sebastian Marion e Vânia Prado. 4.2 – Co-imunoprecipitação CHT1 – SEC14like No intuito de confirmar se a interação detectada entre CHT1 e SEC14 like no duplo híbrido em leveduras, também ocorreria em células de mamíferos, nós realizamos ensaios de co-imunoprecipitação. Para isso, transfectamos de forma transiente células HEK 293 com vetores eucariotos pCDNA 3.1 (-) (Invitrogen), onde se encontra inserido o cDNA que codifica CHT1-FLAG; e pCMV-Myc (Clontech) que possui o cDNA que codifica a proteína completa SEC14like-myc, cujo peso molecular aproximado é de 70kD. A inserção do epítopo FLAG foi realizada na porção N-terminal do CHT1. Essa construção foi capaz de conferir às células HEK 293 um transporte de colina de alta afinidade, indicando que a inserção da seqüência FLAG não levou a alterações da função do transportador de colina (Ribeiro et al., 2003). As células foram lisadas em um tampão de lise contendo CHAPS 1%, a proteína CHT1-FLAG foi imunoprecipitada através da incubação com esferas de agarose conjugadas com o anticorpo de camundongo anti-FLAG, sob agitação por duas horas a 4ºC. Em seguida realizamos eletroforese em SDS-PAGE e 51 Western blot com anticorpos anti-CHT1 policlonal (coelho) e anti-myc monoclonal (camundongo). Os nossos experimentos mostram como indicado na Figura 11 A que, em células de mamíferos a proteína SEC14like-myc co-imunoprecipitou com CHT1- FLAG, nas células HEK293 que foram co-transfectadas tanto com CHT1-FLAG como SEC14like-myc. As células que foram transfectadas somente com SEC14like-myc e incubadas com as esferas, não apresentaram a banda referente à proteína CHT1-FLAG, indicando que as esferas de agarose conjugadas com anticorpos anti-FLAG precipitaram especificamente CHT1- FLAG. Como pode ser observado nas canaletas 3 e 4 da Figura 11 A, o nível de expressão de SEC14like-myc nas células HEK293 foi o mesmo, nas células co- transfectadas com CHT1-FLAG ou nas células transfectadas apenas com SEC14like-myc. Isso sugere que a interação entre CHT1-FLAG e SEC14like- myc não foi resultado de uma superexpressão de SEC14like-myc nas células que foram co-transfectadas com CHT1-FLAG. Esses resultados sugerem que, em células de mamíferos, existe interação entre CHT1 e SEC14like. 52 B) A) IB-Myc SEC14 ~70kDa IP C HT 1 F lag – S ec 14 M yc IP S ec 14 M yc No n tra ns fe ct ed IB-CHT1 policlonal ~ 50kDa Ly sa te C HT 1 F lag – S ec 14 M yc Ly sa te Se c1 4 M yc 1 2 3 4 5 Figura 11: Co-imunoprecipitação CHT1-FLAG x SEC14like-myc (proteína completa) em células HEK 293. Em A) estão representados imunoblots utilizando anticorpos anti-Myc, em B) estão representados imunoblots utilizando anticorpos anti-CHT1 policlonal. Os imunoblots identificados em A) e B) representam a mesma membrana. As canaletas 1 e 2 mostram o resultado da co-imunoprecipitação em células transfectadas com os cDNA’s indicados, que foram incubadas com as esferas revestidas com anti-FLAG. As canaletas 3 e 4 mostram o lisado das células transfectadas com os cDNA’s indicados. A canaleta 5 mostra o lisado de células HEK 293 não transfectadas. Os dados são representativos de 4 experimentos independentes. 53 4.3 – O CHT1-FLAG co-localiza com SEC14like-myc em células SN56 diferenciadas Uma vez caracterizada a interação CHT1-FLAG e SEC14like-myc, nosso próximo objetivo foi determinar se a localização celular do CHT1-FLAG e sua distribuição era modificada em função da superexpressão SEC14like-myc nas células SN56. Para isso utilizamos células SN56 diferenciadas, que foram transfectadas de forma transiente. As células foram analisadas por microscopia confocal após dois dias de diferenciação em dibutiril –AMPc (Sigma). Como pode ser observado na Figura 12 A, nas células transfectadas somente com o CHT1-FLAG, o transportador localizava-se predominantemente na região intracelular, em processos e varicosidades, onde se acumulam vesículas tipo sinápticas. No corpo celular a marcação se mostrou pontuada, com um padrão de distribuição sugerindo a presença do transportador em endossomos. Esses experimentos de localização celular indicam que o CHT1 encontra-se predominantemente em organelas intracelulares em células em cultura. Esses resultados corroboram estudos anteriores (Ribeiro et al., 2003; Ferguson et al., 2003). A análise das imagens de microscopia confocal de células SN56 que foram transfectadas somente com SEC14like-myc revelam dois padrões característicos. Em torno de 50% das células analisadas a distribuição de SEC14like-myc se mostrou bastante homogênea, em um padrão muito pouco pontuado (Figura 12 C), distribuído nas células como um todo. Esse dado de certa forma já era esperado, uma vez que SEC14 é uma proteína solúvel no citoplasma e que se encontra em trânsito contínuo entre membranas. Um outro padrão de distribuição foi observado, onde essa proteína encontra-se concentrada em vesículas grandes, sobretudo próximas à região perinuclear (Figura 12 B). Quando utilizamos células SN56 co-transfectadas com CHT1-FLAG e SEC14like-myc, observamos que o padrão de distribuição de SEC14like-myc 54 não se mostrou muito alterado, porém a distribuição de CHT1-FLAG se mostrou bastante concentrada no corpo celular (Figura 13 B e 14 B). Observamos também que existe grande co-localização entre as duas proteínas em células fixadas, sugerindo que elas se encontram nos mesmos compartimentos nessas células. Esse dado, juntamente com os dados anteriores sugere fortemente que SEC14like interage com CHT1. A superexpressão de SEC14like-myc modificou a localização celular de CHT1-FLAG sugerindo que a interação entre essas proteínas altera ou regula de alguma maneira o tráfego celular do transportador. Isso é de grande importância pois, uma vez que o CHT1 se encontra predominantemente em estruturas localizadas no citoplasma, uma proteína que altera seu padrão de distribuição pode regular seu tráfego e conseqüentemente sua atividade. 55 A ASEC14 - Myc B SEC14 - Myc C Figura 12: Imagens de imunofluorescência em microscopia confocal em células SN56 diferenciadas, transfectadas isoladamente com CHT1-FLAG e SEC14 like – myc. (A) Padrão de distribuição de CHT1-FLAG e em (B) observamos a expressão de SEC14 like – myc. (C) Expressão de SEC14 like – myc em um padrão mais solúvel, menos pontuado. Imagens representativas de pelo menos 20 células analisadas em cada experimento. Foram realizados 5 experimentos em dias alternados. 56 CHT1 – FLAG SEC14 – Myc A B C D Figura 13: Imagens de imunofluorescência em microscopia confocal em células SN56 diferenciadas, co-transfectadas com CHT1-FLAG e SEC14like-myc. (A) Padrão de distribuição de CHT1-FLAG, em (B) observamos a expressão de SEC14like-myc. Em (C) temos a imagem de luz transmitida da célula em foco e em (D) temos a sobreposição das imagens de (A) e (B). Imagens representativas de pelo menos 20 células analisadas em cada experimento. Foram realizados 5 experimentos em dias alternados. 57 A B C D CHT1 – FLAG SEC14 – Myc Figura 14: Imagens de imunofluorescência em microscopia confocal em células SN56 diferenciadas, co-transfectadas com CHT1-FLAG e SEC14like-myc. (A) Padrão de distribuição de CHT1-FLAG, em (B) observamos a expressão de SEC14like-myc. Em (C) temos a imagem de luz transmitida da célula em foco e em (D) temos a sobreposição das imagens de (A) e (B). A distribuição do CHT1 se concentra sobretudo no corpo celular. Imagens representativas de pelo menos 20 células analisadas em cada experimento. Foram realizados 5 experimentos em dias alternados. 58 4.4 – O transporte de colina de alta afinidade realizado pelo CHT1-FLAG é alterado pela superexpressão de SEC14like-myc em células HEK 293 Nossos dados demonstraram que existe interação física entre CHT1- FLAG e SEC14like-myc e a superexpressão de SEC14like-myc altera o padrão de distribuição normalmente encontrado para o CHT1 em células SN56. Assim, nosso próximo objetivo foi verificar se essa interação é capaz de alterar a atividade do transportador. Para estudar os processos de tráfego e regulação do CHT1 nós optamos pela expressão heteróloga das proteínas em uma linhagem celular bem caracterizada, as células HEK 293. Essa linhagem celular não expressa o CHT1, visto que não se trata de uma linhagem celular colinérgica. Isso torna essa cultura celular um sistema interessante para o estudo do transporte de colina realizado pelo CHT1 recombinante. Linhagens celulares com características colinérgicas poderiam expressar o transportador de colina de alta afinidade endógeno, o que dificultaria o teste de funcionalidade do CHT1 expresso heterologamente. Ribeiro e colaboradores (2003) já haviam demonstrado que células HEK 293 transfectadas transientemente com o cDNA do CHT1 foram capazes de apresentar transporte de colina de alta afinidade, dependente de sódio e sensível a HC-3. Como ocorre com outras células, as células HEK 293 apresentam um sistema de transporte de colina de baixa afinidade. Para analisar especificamente o transporte de colina de alta afinidade, era necessário excluir a parcela realizada pelo transporte de baixa afinidade. Assim, transfectamos as células com CHT1-FLAG ou, como controle, transfectamos as células com o vetor sem o inserto de cDNA que codifica o CHT1. Realizamos o experimento de transporte de colina e verificamos que as células que expressavam CHT1-FLAG, quando na presença de colina e 1μM de HC-3, apresentavam a taxa de transporte de colina semelhante às células que não expressavam CHT1-FLAG (dados não mostrados). Subtraindo o transporte de colina na ausência de HC-3 59 por aquele realizado pelas células na presença de HC-3, analisamos especificamente o transporte de colina de alta afinidade. A metodologia utilizada para estudar o transporte de colina está descrita em materiais e métodos. Em resumo, as células foram incubadas a 37°C por 10 minutos em meio KREBS contendo colina radioativa. Após esse período, as células foram lavadas três vezes com meio KREBS gelado para remoção da colina radioativa presente no sobrenadante. As células foram então lisadas utilizando NaOH 0,1 M, e esse lisado foi utilizado para determinação da radioatividade por cintilação líquida. Como sempre ocorre alguma variação no número de células por placa, utilizou-se a dosagem de proteínas para normalizar os resultados obtidos. Dessa forma, os resultados são expressos como dpm/μg de proteína, que fornece a estimativa do transporte de colina levando-se em conta o número de células por placa. Como pode ser observado na Figura 15 A, a captação de colina, expressa em dpm/μg de proteína, em células transfectadas com CHT1-FLAG e células co- transfectadas com CHT1- FLAG e SEC14like-myc foi estatisticamente diferente (p<0,01). Para essa análise utilizamos o teste t de student´s pareado. As células que co-expressavam CHT1- FLAG e SEC14like-myc tiveram uma diminuição em torno de 30% no total de colina captada quando comparadas com as células transfectadas apenas com CHT1-FLAG. Essa diminuição não foi reflexo de uma diminuição da expressão do transportador nas células em questão, uma vez que nas duas condições a expressão do transportador foi semelhante, como podemos verificar na Figura 15 B. 60 A) B) CHT1 CHT1 SEC14 IB CHT1 policlonal ~50kD → Figura 15: (A) Análise percentual da taxa de transporte de colina de alta afinidade em células HEK 293 que expressavam CHT1-FLAG isoladamente e que co-expressavam CHT1-FLAG e SEC14like-myc. O asterisco representa uma diferença estatisticamente significante, utilizando teste t de student´s pareado, entre as duas condições analisadas (p<0,01). (B) Imunoblot dos lisados das células utilizadas nos experimentos de transporte de colina, transfectadas somente com o cDNA que codifica o CHT1 ou com os cDNA´s que codificam CHT1 e SEC14. Utilizamos anticorpo policlonal anti-CHT1 para revelar a membrana de nitrocelulose. A expressão do transportador é bem semelhante nas duas condições de transfecção. Os dados são representativos de 13 experimentos independentes. 61 5 – Discussão 62 5.1 – Duplo híbrido em leveduras A chave para vários processos biológicos reside na interação física entre proteínas. Mecanismos tais como síntese de DNA, ativação transcricional, tradução de proteínas, transdução de sinais, envolvem complexos protéicos. Inúmeras proteínas intracelulares podem estar associadas a receptores ou canais e participam de maneira bem definida da transdução de sinais, em nível de regulação dos mesmos (Browning et al., 1985; Levitan, 1985). Além disso, essas proteínas podem dirigir fisiologicamente etapas subcelulares de sinalização de receptores, corroborando com a plasticidade neuronal (Migaud et al., 1998). Um aspecto de grande relevância no estudo da função de redes moleculares no interior das células reside em elucidar como elas contribuem para a rede neuronal, em nível de circuitos, e como essa rede dirige a plasticidade neuronal. De maneira geral, supõe-se que proteínas que interagem diretamente entre si possam participar dos mesmos processos celulares. Assim, ao se detectar a interação entre uma proteína de função ainda não estabelecida, e outra de atividade classicamente determinada, pode-se inferir um possível caminho celular no qual a proteína de atividade desconhecida participa (Oliver, 2000). Inúmeras estratégias baseadas em estudos de proteômica têm sido usadas no intuito de determinar a rede de interações entre as proteínas expressas em uma célula (Causier, 2002). Várias técnicas foram desenvolvidas, desde abordagens bioquímicas como co-imunoprecipitação e cromatografia de afinidade, a ensaios genético-moleculares como o duplo-híbrido em leveduras (yeast two hybrid system - YTH). Em 1989, Fields e Song desenvolveram o ensaio de duplo híbrido em leveduras, um ensaio genético-molecular que detecta interações proteína- proteína in vivo. O sistema utiliza o produto do gene GAL4 de leveduras Saccharomyces cerevisiae. GAL4 é uma proteína com dois domínios funcionais que ativa a transcrição de genes que codificam enzimas envolvidas no metabolismo da galactose. O domínio N-terminal se liga a regiões específicas do DNA (UASG, onde G se refere especificamente ao gene GAL4), sendo também 63 chamado de DNA-BD (DNA binding domain), já o domínio C-terminal possui regiões acídicas, necessárias para ativar a transcrição, também chamado de DNA-AD (DNA activation domain). UAS (upstream activating sequences) são regiões reconhecidas por ativadores de transcrição específicos, capazes de aumentar a transcrição de genes adjacentes. O domínio N-terminal se liga ao DNA de maneira específica, mas isoladamente não é capaz de ativar a transcrição. O C-terminal possui regiões ativadoras, mas sem o domínio de ligação ao DNA é incapaz de ativar a transcrição porque ele falha em localizar a região UAS. Esses dois domínios não necessariamente devem estar presentes no mesmo polipeptídeo para formar um fator de transcrição ativo, mas precisam estar na vizinhança ou em proximidade um do outro. Uma interação não covalente é capaz de levar à expressão do gene repórter regulado por estes sítios de ligação (Fields, 1993). A Figura 16 mostra um esquema representativo do sistema acima descrito. Embora inicialmente desenvolvido para detectar interações físicas entre duas proteínas conhecidas, o duplo híbrido em leveduras rapidamente se tornou um sistema amplamente utilizado em screenings para avaliar interações proteína-proteína através do uso de bibliotecas de cDNA’s de determinado tecido ou órgão, e uma proteína conhecida. As proteínas da biblioteca são denominadas de “presa” nesse sistema, enquanto a proteína em estudo é chamada de “isca”. O uso do duplo híbrido em leveduras para rastrear uma biblioteca de cDNA resulta numa detecção imediata de inúmeros genes para proteínas que interagem com a proteína alvo, assim como a determinação dos domínios dessas proteínas envolvidos na interação (Fields, 1993). Em muitos sistemas comerciais disponíveis, a expressão das proteínas híbridas é alcançada através do uso de um promotor constitutivo, presente no gene ADH1 de leveduras. O promotor ADH1 permite um alto nível de expressão de seqüências (proteínas híbridas inseridas nos vetores) que estão sob o seu controle. A localização nuclear é direcionada através de seqüências internas no domínio de ligação da proteína híbrida ou por uma seqüência SV40 (Simian Virus 40), ligada ao N-terminal do domínio de ativação da proteína híbrida (McAlister-Henn, 1999). 64 Ativação da transcrição Figura 16: Esquema do sistema de duplo híbrido em leveduras criado por Fields e Song em 1989. X representa uma proteína híbrida em fusão com o domínio N- terminal de GAL4 e Y representa outra proteína híbrida em fusão com o domínio C-terminal de GAL4. UASG Gene repórter N- terminal Y X C- terminal UASG Gene repórter N-terminal C-terminal X Y 65 O sistema de duplo híbrido em leveduras empregado nos nossos experimentos utiliza como genes repórteres ADE2 e HIS3, cujos produtos de ativação levam à expressão de enzimas envolvidas na biossíntese de adenina e histidina. Dessa forma, o crescimento da levedura em meios restritivos para esses nutrientes indica interação positiva. O gene repórter HIS3 é considerado um gene repórter fraco, ou seja, ele apresenta certo nível de expressão constitutiva. Para suprimir este contraponto é comum adicionar a substância 3- aminotriazol (3-AT), um análogo da histidina, inibidor do produto de ativação do gene HIS3, imidazolglicerol-fosfato dehidratase, para que seja reduzido o crescimento background durante o ensaio. 5.2 – Considerações sobre o duplo híbrido em leveduras Embora o sistema do duplo híbrido seja um método eficiente para a análise de interação proteína-proteína, existem algumas limitações que devem ser avaliadas: como o sistema é baseado na ativação da transcrição, o gene da proteína a ser estudada não pode apresentar uma atividade transcricional intrínseca ; algumas proteínas quando em fusão com o domínio de ligação ao DNA de GAL4, podem apresentar certa toxicidade para a levedura hospedeira, possivelmente devido a um alto nível de expressão; o ensaio requer que a interação proteína-proteína ocorra no núcleo da levedura, para isso, os vetores devem ser direcionados eficientemente para o núcleo da mesma; uma causa potencial de resultados falso-negativos é que a levedura pode não promover as modificações pós-traducionais necessárias (como glicosilação) requeridas para que a proteína assuma sua conformação nativa ou mesmo por assumir uma conformação terciária diferente, quando expressas em fusão com os domínios do fator de transcrição (Coates & Hall, 2003). Tendo em vista os argumentos acima relatados, é necessário que abordagens alternativas sejam usadas para complementar o sistema de duplo-híbrido onde ele tem falhado na detecção de tais interações (Aronheim, 2000). 66 5.3 – CHT1 e o sistema colinérgico A regulação da atividade do sistema colinérgico está diretamente relacionada à regulação da atividade do CHT1, uma vez que o transporte de colina é a etapa limitante da síntese de acetilcolina. Além disso, vários estudos indicam que regulação da atividade do CHT1 está diretamente associada à atividade neuronal (Simon & Kuhar, 1975; Kuhar & Murrin, 1978; Saltarelli et al., 1987). A regulação da recaptação de colina é modulada pelo influxo de íons cálcio, o que demonstra uma semelhança com a exocitose de vesículas sinápticas (Saltarelli et al., 1987). As vias de regulação da transmissão colinérgica são múltiplas. Camundongos heterozigotos para mutações no gene CHAT demonstraram um aumento no transporte de colina, assim como nos níveis protéicos de CHT1 em 50-100%, compensando a atividade diminuída da enzima e mantendo os níveis basais de ACh (Brandon et al., 2004). O CHT1 é essencial para a vida como demonstrado por Ferguson e colaboradores em 2004, utilizando animais nocaute para o transportador. Esses animais morriam uma hora após o nascimento, porém os animais heterozigotos apresentavam uma taxa de transporte de colina semelhante aos animais selvagens, demonstrando o quão importante é a regulação da atividade do CHT1. O pool intracelular de CHT1 teve importante participação, mostrando que a regulação do tráfego celular também influi na atividade colinérgica. Mutações pontuais no transportador também afetam a atividade do mesmo, de maneiras diferentes. Mutações em um motivo dileucina bem conservado na região C-terminal do CHT1 alteram a internalização e atividade do transportador significativamente, com um aumento em cerca de duas vezes da taxa de transporte de colina (Ribeiro et al., 2005). Já Okuda e colaboradores (2002) demonstraram que uma mutação pontual no terceiro domínio transmembrânico do CHT1 é responsável por uma diminuição na captação de colina em 40-50%. Essas mutações alteram diferentemente a atividade do CHT1 e podem ser capazes de modificar significativamente a transmissão colinérgica. 67 Todos esses dados nos mostram o quão importante é o estudo da regulação do tráfego celular do transportador e da sua atividade. Com base nisso, procuramos identificar através do sistema de duplo híbrido em leveduras, proteínas presentes no cérebro de humanos que poderiam interagir com o CHT1. 5.4 – Análise das interações observadas no duplo híbrido em leveduras Nos experimentos que realizamos, observamos a interação do CHT1 com as proteínas MAP1A, BRI3, SEC14like e Flotilina1. Existem vários trabalhos sugerindo a participação de BRI3, MAP1A e Flotilina1 em doenças neurodegenerativas: - Na doença de Alzheimer as alterações bioquímicas e protéicas supostamente relacionadas com a patogênese da doença, envolvem modificações no citoesqueleto via interação da proteína tau anormal com MAP1A (Alonso et al., 1996; Alonso et al., 1997). - A enzima conversora da proteína β-amilóide (BACE1), também associada à doença de Alzheimer interage com BRI3 (Wickham et al., 2004). Uma mutação pontual no códon de parada da proteína BRI2 resulta na formação de um peptídeo amiloidogênico, responsável por um tipo de demência no Reino Unido (Vidal et al., 1999). - A distribuição de Flotilina1 no hipocampo, amígdala e córtex do cérebro de pacientes com doença de Alzheimer demonstrou um padrão de acúmulo em neurônios que continham aglomerados neurofribrilares (Girardot et al., 2003). Flotilina1 parece ter um papel importante também em neuropatias associadas à proteína prion (Pimpinelli et al., 2005). 68 Nas condições experimentais que utilizamos, CHT1 não interagiu com Niscarina nem com Rab14. Niscarina é uma proteína que está envolvida na organização do citoesqueleto e na migração celular. Ela interage com integrinas e sua superexpressão em fibroblastos leva a mudanças na organização do citoesqueleto e uma grande inibição da migração celular (Alahari et al., 2000). As glicoproteínas de superfície celular da família das integrinas possuem um papel importante na interação das células com a matriz extracelular. As integrinas podem influenciar o comportamento celular através da interação de seus domínios citoplasmáticos com proteínas intracelulares regulando a adesão, forma e motilidade celular (Liu et al., 2000). O mecanismo pelo qual Niscarina regula o tráfego celular envolve a interação e inibição da quinase ativada por p21 (PAK1), controlando dessa maneira uma cadeia de eventos envolvidos em transdução de sinais, como por exemplo a atividade da proteína Rac1 que regula a motilidade celular via interação com PAK1 (Reddig et al., 2005). A inibição de PAK1 através da interação com Niscarina está diretamente correlacionada com a inibição da migração celular (Alahari et al., 2004). Em mamíferos Rab14 está presente em diversos tecidos, o que sugere que essa proteína está envolvida em um evento de tráfego de membranas comum a vários tipos celulares. No cérebro, coração, rins, pulmões e placenta, são encontrados altos níveis de expressão de Rab14. A análise em estudos de microscopia revelou sua presença em compartimentos biossintéticos (retículo endoplasmático, Golgi e TGN) e endossomais (Junutula et al., 2004). Além disso, estudos de imunolocalização de Rab14 em células NRK (Normal Rat Kidney) mostraram que essa proteína colocaliza-se com o receptor de transferrina – TfR, um marcador de endossomos primários e de reciclagem. Isso nos sugere que Rab14 provavelmente regula o transporte de membranas entre esses compartimentos. Em resumo, diversas evidências sugerem que Rab14 e Niscarina têm um papel importante no tráfego celular. É possível que essas proteínas sejam importantes para o tráfego do VAChT, uma vez que nós observamos a interação VAChT-Rab14 e VAChT-Niscarina no duplo híbrido em leveduras. 69 Experimentos adicionais serão necessários para confirmar essas interações e para avaliar seu papel funcional. Entretanto, usando o sistema do duplo híbrido nós não conseguimos detectar interações entre Rab14 ou Niscarina com CHT1, sugerindo que essas proteínas não participam do tráfego de CHT1. Apesar do CHT1 e o VAChT se co-localizarem em organelas intracelulares e possuírem motivos protéicos semelhantes (endossomos, vesículas sinápticas) (Ribeiro et al., 2003; Ferguson et al., 2004; Ribeiro et al., 2005), esses transportadores exercem suas funções em compartimentos diferentes. Portanto, acredita-se que algumas etapas do tráfego/reciclagem desses dois transportadores, como por exemplo, a endocitose seja regulada diferentemente. De fato, os resultados do duplo híbrido mostram que nem todas as proteínas que interagem com o VAChT interagem também com o CHT1. 5.4.1 – Interação CHT1 x MAP1A A polimerização, estabilização, assim como as propriedades dinâmicas dos microtúbulos são influenciadas por interações com proteínas MAP (Microtubule Associated Proteins) (Iqbal et al., 2005). MAP1A e MAP1B são complexos protéicos multiméricos, consitutídos de uma cadeia pesada e várias cadeias leves (LC2 e LC1 respectivamente). Em cada tipo de MAP, a cadeia pesada e uma das cadeias leves são geradas pela clivagem proteolítica do respectivo precursor. LC1 e LC2 possuem a capacidade de se ligar à cadeia pesada tanto de MAP1A como de MAP1B. Além disso as cadeias leves são responsáveis pela ligação a microfilamentos de actina e microtúbulos, permitindo aumento da polimerização de microtúbulos (Noiges et al., 2002). No cérebro de pacientes com a doença de Alzheimer, existe uma hiperfosforilação anormal da proteína tau (que também participa da formação e estabilização de microtúbulos, sendo sua atividade regulada pelo grau de fosforilação), que resulta na formação de aglomerados neurofibrilares, característicos dessa enfermidade (Iqbal et al., 1986; Lee et al., 1991). A proteína tau anormal, hiperfosforilada, não interage com microtúbulos/tubulina e, 70 além disso, seqüestra tau normal, assim como MAP1A, MAP1B e MAP2, causando inibição e desestruturação dos microtúbulos in vitro (Alonso et al., 1996; Alonso et al., 1997). No cérebro de adultos, MAP1A está presente em dendritos, incluindo dendritos das células de Purkinje e neurônios piramidais do hipocampo e córtex. Os níveis de MAP1A aumentam no cérebro após a segunda semana de nascimento, quando informações aferentes são estabelecidas, dendritos são ramificados e alongados e as sinapses são formadas. Em contraste, ocorre um declínio de MAP1B após o nascimento, sendo encontrada principalmente em axônios (Szebenyi et al., 2005). Em 2001 Orzech e colaboradores identificaram interação entre MAP1A e a proteína adaptadora AP1, que está associada com a formação de vesículas envolvidas no transporte exocítico a partir do TGN. É possível que o controle do tráfego de vesículas no citoplasma envolva a participação da proteína AP1, via interação direta com MAP1A, através de um caminho “microtubular”, direcionado por MAP1A. Em nossos experimentos verificamos que a porção C-terminal do CHT1 interagiu com a cadeia leve de MAP1A no duplo híbrido em leveduras. Essa interação pode ser de importância uma vez que MAP1A tem um papel importante na reorganização do citoesqueleto celular. É possível que MAP1A tenha alguma participação no tráfego celular do CHT1, porém, é necessário um estudo mais aprofundado para confirmar essa interação e conseqüentemente a relevância da mesma. 5.4.2 – Interação CHT1 x BRI3 Em 2004, Wickham e colaboradores demonstraram que BRI3 interage com a enzima conversora da proteína β-amilóide (BACE1). Na doença de Alzheimer a base biológica relacionada à vulnerabilidade do cérebro ao peptídeo amilóide ainda não é bem compreendida, embora se acredite que altos níveis da proteína precursora amilóide (APP) assim como níveis de expressão maiores e 71 maior atividade da enzima BACE1, pró-amiloidogênica, tenham um papel crucial na susceptibilidade do sistema nervoso central à doença (Yang et al., 2003). No sistema nervoso central os peptídeos amilóides são gerados por clivagens seqüenciais proteolíticas da APP por duas enzimas ligadas à membrana: BACE1 cliva APP gerando o fragmento C-terminal APPβ- (APPβ- CTFs) (Hussain et al., 1999; Lin et al., 2000). A clivagem de APPβ-CTFs pela - secretase leva à produção de peptídeos Aβ (Takasugi et al., 2003). A análise funcional da seqüência das proteínas BRI revelou um domínio funcional denominado BRICHOS de aproximadamente 100 aminoácidos, que é encontrado em uma grande variedade de proteínas envolvidas em demência, alterações respiratórias e câncer (Sanchez-Pulido et al., 2002). Em BRI3, o domínio BRICHOS se encontra entre os resíduos de aminoácidos 136-231 (Vidal et al., 2001), uma região que estaria na região ancorada à membrana e que interage com BACE1. Ainda não sabemos se a interação CHT1-BRI3 observada no duplo híbrido em leveduras possui alguma relevância funcional. É necessário que a interação detectada no duplo híbrido em leveduras seja confirmada utilizando outras metodologias para que possamos avaliar mais concretamente a importância da mesma. A análise dessa interação é interessante uma vez que BRI3 pode estar associada à doença de Alzheimer. 5.4.3 – Interação CHT1 x Flotilina1 Em células endoteliais, caveolae medeiam a translocação de macromoléculas entre o lúmen vascular e o espaço sub-endotelial, assim caveolae contêm proteínas que estão envolvidas no tráfego vesicular (Bickel, 2002). Caveolae podem ser considerados como sítios onde pequenas moléculas são concentradas, através da ligação a glicosilfosfatidilinositóis (GPI) ligados a receptores e atravessam a membrana plasmática em direção ao citosol. 72 Caveolae também podem participar da retransmissão de sinais extracelulares para o citosol através da organização de moléculas envolvidas na transdução de sinais (Bickel et al., 1997). A associação de lípides da membrana plasmática forma microdomínios denominados lipid rafts. Esses domínios são regiões ricas em colesterol, fosfolipídeos e glicoesfingolipídeos, que são pouco solubilizados em detergentes não iônicos, uma propriedade resultante da alta organização das cadeias lipídicas nesses locais. Caveolae foram originalmente identificados em lipid rafts (Pike, 2004). Uma grande variedade de proteínas incluindo caveolina, proteínas ancoradas por GPI, e várias proteínas envolvidas em sinalização celular foram encontradas associadas a esses microdomínios. A identificação dessas proteínas em lipid rafts, levou à hipótese de que essa região está intimamente envolvida em processos de transdução de sinais, além de eventos endocíticos, assim como tráfego de colesterol (Parton & Richards, 2003). A glia e os neurônios são enriquecidos em rafts e a proteína flotilina é um marcador desses rafts no cérebro, que colocaliza com lipídeos saturados. Flotilina 1 e 2 são proteínas ubíquas ligadas a vários eventos celulares. A distribuição celular dessas proteínas parece depender do tipo celular e da diferenciação da célula em questão (Liu et al., 2005): em células de linfoma elas estão presentes em organelas intracelulares que lembram lisossomos; em macrófagos, Flotilina1 está presente em fagossomos; em linhagens celulares derivadas de rim de hamster, está localizada na superfície celular. Baumann e colaboradores (2000) demonstraram que Flotilina1 está envolvida na translocação do transportador de glicose (GLUT4) em resposta à insulina, via recrutamento de proteínas Cbl fosforiladas e proteínas associadas a Cbl (CAP) para os microdomínios de rafts. Depósitos de agregados protéicos caracterizam várias doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer, doença de Huntington e doenças associadas à proteína prion PrPSc. As isoformas de prion estão associadas a lipid rafts. Ao infectar células GT1-7 (uma linhagem celular derivada do sistema nervoso central) com a proteína prion normal (PrPc) e a proteína prion alterada (scrapie, PrPSc), Pimpinelli e colaboradores (2005) demonstraram que PrPSc colocaliza com Flotilina1 e LAMP1 (um marcador de 73 endossomos tardios) em células GT1-7. Isso sugere que a proteína prion patológica está presente nesses locais. Já a PrPc não colocaliza com Flotilina1 em GT1-7. Esses dados indicam que Flotilina1 pode ter um papel importante na distribuição de PrPSc . Girardot e colaboradores (2003) analisaram a distribuição de Flotilina1 no hipocampo, amídala e córtex do cérebro de pacientes com doença de Alzheimer. Eles observaram que Flotilina1 se acumulava em neurônios que continham aglomerados neurofribrilares, porém não houve colocalização com a proteína tau, indicando que tau não está em contato direto com Flotilina1. É possível que Flotilina1 esteja presente em compartimentos onde se encontram agregados protéicos e que tenha alguma participação em desordens neurodegenerativas (Pimpinelli et al., 2005). No tocante ao CHT1, estudos de microscopia confocal utilizando células que co-expressam CHT1 e Flotilina1 podem indicar se o CHT1 se encontra em rafts e se Flotilina tem algum papel na localização celular do transportador. Como rafts são domínios que parecem estar envolvidos na transdução de sinais (Parton & Richards, 2003), a presença do CHT1 nesses compartimentos pode indicar possível local onde o tráfego do transportador pode ser modulado. 5.4.4 – Interação CHT1 x SEC14like SEC14 é uma proteína solúvel que, em leveduras, possui atividade de transferência de fosfatidilinositol (PI) e fosfatidilcolina (PC). Ela modifica o metabolismo lipídico e afeta o transporte vesicular. Acredita-se que SEC14 controle o transporte vesicular a partir do TGN através de alterações do ambiente lipídico local. Aparentemente, a regulação do metabolismo lipídico local promove o recrutamento de proteínas essenciais para a formação de vesículas. Além disso, alterando as propriedades físicas dos lípides, é possível que a formação e a fusão de vesículas sejam aceleradas em função de alterações energeticamente favoráveis na estrutura da membrana (Wong et al., 2005). 74 Proteínas que transferem fosfatidilinositol (PITP) são proteínas ubíquas e que transportam fosfatidilinositol (PI) ou fosfatidilcolina (PC) entre membranas e participam do metabolismo celular de fosfolípides durante a transdução de sinais e tráfego de vesículas (Hsuan et al, 2001). Deleções no gene SEC14 ou alterações funcionais em seu transcrito inibem o transporte protéico mediado pelo Golgi, o que resulta em morte celular (Phillips et al., 1999). De fato Fernandez Murray e McMaster (2005) demonstraram que SEC14 regula a taxa de síntese e degradação de PC. SEC14 age como regulador positivo de Nte1, uma fosfolipase presente na membrana do retículo endoplasmático, que degrada PC produzindo glicerofosfocolina e ácidos graxos livres. Quando ligada a PC, SEC14 regula sua biossíntese, através da inibição da atividade da enzima CCT (CTP-fosfocolina-citidil-transferase, uma enzima limitante na biossíntese de PC, envolvida na via CDP-colina), prevenindo a utilização de diacilglicerol pelo complexo de Golgi (Cockcroft, 1998). Em leveduras existe outra via que leva à formação de PC através da metilação de fosfatidiletanolamina, formando PC. Quando ligada a PI, SEC14 promove a síntese de fosfoinositídeos, diminuindo a produção de DAG (Litvak et al., 2005). Procuramos caracterizar estruturalmente SEC14like através da análise da sua seqüência primária de aminoácidos, utilizando como ferramenta o programa PROSITE (http://www.expasy.org/prosite). Verificamos que a proteína apresenta três domínios de importância: PRELI_MSF1, CRAL_TRIO e GOLD. A seqüência primária de aminoácidos de SEC14like assim como o esquema dos domínios em questão estão apresentados na Figura 17. O domínio PRELI_MSF1 é um módulo protéico encontrado em proteínas eucarióticas que está presente em várias proteínas, entre elas PRELI humana e MSF1 de levedura, assim como o domínio N-terminal da proteína humana SEC14like. O domínio PRELI_MSF1 tem aproximadamente 170 aminoácidos e sugere-se que tenha alguma função associada a ligação à membrana plasmática (Anantharaman & Aravind, 2002). CRAL_TRIO é um domínio estruturalmente conservado de aproximadamente 170 aminoácidos, que constitui uma região hidrofóbica capaz de fazer ligações com lipídeos. É encontrado em proteínas ativadoras de 75 GTPases (GAPs), em proteínas trocadoras de nucleotídeos de guanina (GEF) e uma família de proteínas ligadoras de regiões hidrofóbicas, incluindo SEC14 e as proteínas que têm a capacidade de ligar a α-tocoferol. O domínio CRAL- _TRIO pode constituir uma proteína inteira ou ser apenas uma região da mesma. Sua função ainda não foi claramente determinada, embora se acredite estar envolvida no direcionamento e tráfego de proteínas mitocondriais, assim como estruturação e remodelamento de actina, necessários para a migração e crescimento celular. Esse domínio é encontrado em inúmeras proteínas eucariotas (Sha et al., 1998; Zimmer et al., 2000). O domínio GOLD (Golgi dynamics) representa uma região encontrada em várias proteínas do complexo de Golgi de eucariotos e proteínas envolvidas no tráfego de lípides. Geralmente possui de 90 a 150 aminoácidos. Esse domínio também pode se encontrar associado ao domínio RUN, que parece ter papel importante na interação de várias proteínas com o citoesqueleto. Acredita-se que GOLD tenha a função de mediar diversas interações proteína-proteína (Aravind et al., 2002). Os três domínios encontrados na estrutura primária de SEC14like, reforçam a hipótese dessa proteína atuar como uma proteína adaptadora, com a possibilidade de interagir diretamente com outras proteínas e também com diferentes lípides das membranas celulares. Para confirmar se a interação CHT1-SEC14like detectada no sistema de duplo híbrido em leveduras ocorre também em células de mamíferos, realizamos experimentos de co-imunoprecipitação. Nossos resultados mostram que SEC14like e CHT1 interagem em células HEK 293. Analisando a Figura 17 podemos verificar que o fragmento da proteína SEC14like utilizado no duplo híbrido em leveduras (C-terminal), é parte da constituição do domínio GOLD. Como GOLD tem a capacidade de mediar interações proteína-proteína, podemos inferir que a interação CHT1-SEC14like ocorra via esse domínio. 76 M V Q K Y Q S P V R V Y K Y P F E L I M A A Y E R R F P T C P L I P M F V G S D T V N E F K S E D G A I H V I E R R C K L D V D A P R L L K K I A G V D Y V Y F V Q K N S L N S R E R T L H I E A Y N E T F S N R V I I N E H C C Y T V H P E N E D W T C F E Q S A S L D I K S F F G F E S T V E K I A M K Q Y T S N I K K G K E I I E Y Y L R Q L E E E G I T F V P R W S P P S I T P S S E T S S S S S K K Q A A S M A V V I P E A A L K E G L S G D A L S S P S A P E P V V G T P D D K L D A D Y I K R Y L G D L T P L Q E S C L I R L R Q W L Q E T H K G K I P K D E H I L R F L R A R D L N I D K A R E I M C Q S L T W R K Q H Q V D Y I L E T W T P P Q V L Q D Y Y A G G W H H H D K D G R P L Y V L R L G Q M D T K G L V R A L G E E A L L R Y V L S I N E E G L R R C E E N T K V F G R P I S S W T R L V D L E G L N M R H L W R P G V K A L L R I I E V V E A N Y P E T L G R L L I L R A P R V F P V L W T L V S P F I D D N T R R K F L I Y A G N D Y Q G P G G L L D Y I D K E I I P D F L S G E C M C E V P E G G L V P K S L Y R T A E E L E N E D L K L W T E T I H Q S A S V F K G A P H E I L I Q I V D A S S V I T W D F D V C K G D I V F N I Y H S K R S P Q P P K K D S L G A H S I T S P G G N N V Q L I D K V W Q L G R D Y S M V E S P L I C K E G E S V Q G S H V T R W P G F Y I L Q W K F H S M P A C A A S S L P R V D D V L A S L Q V S S H K C K V M Y Y T E V I G S E D F R G S M T S L E S S H S G F S Q L S A A T T S S S Q S H S S S M I S R Figura 17: Estrutura primária de SEC14like. Os domínios protéicos PRELI_MSF1, CRAL_TRIO e GOLD estão identificados em azul, verde e vermelho, respectivamente. Os aminoácidos sublinhados representam o fragmento protéico (C-terminal) utilizado dos ensaios de duplo híbrido em leveduras. 77 5.5 – A distribuição do CHT1 é modificada pela superexpressão de SEC14like em células SN56 Para avaliarmos se a distribuição celular do CHT1 é alterada pela superexpressão de SEC14like, realizamos estudos de microscopia confocal e imunofluorescência em células SN56, que é um modelo celular neuronal colinérgico. A análise desses dados revelou que o CHT1, quando transfectado sozinho em células SN56 diferenciadas, apresentava-se bastante pontuado e localizava-se predominantemente na região intracelular em processos e varicosidades, onde se acumulam vesículas tipo sinápticas. Em células que co- expressavam ambas as proteínas verificamos que houve uma modificação no padrão geral de distribuição do CHT1. Observamos que o transportador se concentrava em vesículas maiores, sobretudo na região perinuclear. Havia grande co-localização entre CHT1 e SEC14like, sugerindo que elas se encontram nos mesmos compartimentos nessas células. Portanto, a superexpressão de SEC14like-myc modificou a localização celular de CHT1-FLAG. É possível que a interação resulte em uma modificação no tráfego celular do CHT1 por duas vias: - A superexpressão de SEC14like, pode resultar em uma alteração na rota de tráfego do CHT1. Como SEC14like é uma proteína envolvida no tráfego protéico, sua superexpressão pode direcionar o CHT1 equivocadamente para outras vesículas citoplasmáticas, atrasando a sua chegada e direcionamento para a membrana plasmática. - Outra explicação seria algum tipo de impedimento estérico, ou seja, a interação CHT1- SEC14like (quando superexpressa) pode impedir ou dificultar a interação do transportador com outras proteínas envolvidas no tráfego. Dessa forma haveria uma modificação no trajeto normalmente utilizado, direcionando-o para outras estruturas que não as classicamente utilizadas. 78 Nossos dados demonstram que existe uma interação entre CHT1 e SEC14 e sugerem que SEC14like tem participação no tráfego celular do CHT1. Como esse tráfego é altamente dinâmico e complexo, a elucidação de toda maquinaria protéica recrutada é essencial para entender como a célula consegue regular esse processo, especialmente no caso do CHT1, que possui inúmeras vias de regulação. 5.6 – SEC14like quando superexpressa diminui a atividade do CHT1 em 30% A modulação da atividade de transportadores através da interação com outras proteínas é um tema recorrente e de grande importância. Por exemplo, o transportador de creatina CRT, membro do grupo de transportadores dependente de sódio e cloreto (assim como o CHT1), é responsável pelo transporte de creatina para o interior da célula. A inibição farmacológica da glicosilação do CRT por tunicamicina faz com que haja diminuição de 49% da atividade do transportador (Straumann et al., 2006). Além disso ocorre diminuição da expressão do transportador não glicosilado na membrana plasmática. Em nossos experimentos, procuramos avaliar a relevância funcional da interação CHT1-SEC14like. Para isso utilizamos o ensaio de transporte de colina em células HEK 293. Observamos que houve uma diminuição no transporte de colina em torno de 30% quando havia superexpressão de SEC14like em comparação com a atividade do transportador quando transfectado isoladamente. Esses dados somados às evidências de que a superexpressão de SEC14like em células SN56 modificam a distribuição do transportador, indicam que o CHT1 permanece por mais tempo no interior da célula. Experimentos adicionais como biotinilação de membrana plasmática, são necessários para 79 demonstrar a real proporção entre o CHT1 presente na membrana plasmática e aqueles que permanecem no interior celular. A partir da análise desses dados podemos afirmar que essa interação é importante para a elucidação de mais uma possível via de regulação da atividade do CHT1 e da própria transmissão colinérgica. A contribuição do nosso trabalho para o sistema colinérgico é apenas um pequeno passo para identificar a maquinaria citoplasmática envolvida em toda sua dinâmica. 80 6 – Conclusões 81 Em nosso estudo utilizando o sistema de duplo híbrido em leveduras, tendo como “isca” o transportador de colina de alta afinidade – CHT1, verificamos os seguintes resultados: ªInteração positiva entre o CHT1 e as seguintes proteínas: - BRI3 - SEC14like - MAP1A - Flotilina1 ªNesse sistema o transportador não interage com: - Niscarina - Rab14 ªUm estudo mais aprofundado da interação CHT1 x SEC14like indicou que a interação observada pelo sistema de duplo híbrido em leveduras, também é observada em células de mamíferos, em ensaios de co-imunoprecipitação. ªEm células de mamíferos existe co-localização entre essas proteínas e há uma alteração na distribuição do transportador. ªA atividade do transportador também foi modificada em função dessa interação como observamos nos experimentos de transporte de colina, com diminuição de cerca de 30% da atividade normal. 82 7 – Referências bibliográficas 83 Alahari,S.K., Lee,J.W. & Juliano,R.L. 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