Programa de pós-graduação em Neurociências Universidade Federal de Minas Gerais Cristiano Soares Simões Modulação da Amígdala Basolateral sobre o Colículo Inferior no condicionamento clássico ao medo Belo Horizonte 2020 Ficha elaborada pela Biblioteca do Instituto de Ciências Biológias da UFMG Ficha elaborada pela Biblioteca do Instituto de Ciências Biológias da UFMG Ficha catalográfica elaborada pela bibliotecária Rosilene Moreira Coelho de Sá – CRB 6 – 2726 043 Simões, Cristiano Soares. Modulação da amígdala basolateral sobre o colículo inferior no condicionamento clássico ao medo [manuscrito] / Cristiano Soares Simões. – 2020. 73 f. : il. ; 29,5 cm. Orientador: Prof. Dr. Márcio Flávio Dutra Moraes. Coorientador: Dr. Flávio Afonso Gonçalves Mourão. Tese (doutorado) – Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências. 1. Neurociências. 2. Medo. 3. Complexo Nuclear Basolateral da Amígdala. 4. Colículo inferior - Teses. 5. Muscimol. I. Moraes, Márcio Flávio Dutra. II. Mourão, Flávio Afonso Gonçalves. III. Universidade Federal de Minas Gerais. Instituto de Ciências Biológicas. IV. Título. CDU: 612.8 Este trabalho foi desenvolvido no Núcleo de Neurociências (NNC) do Departamento de Fisiologia e Biofísica do Instituto de Ciências Biológicas (ICB), Bloco A4 sala 168/240, da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), com auxílio das seguintes agências de fomento: - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES; - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq; - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais – FAPEMIG. Aos meus filhos Antônio e Valentina. AGRADECIMENTOS Iniciei meu doutorado com quase 40 anos, dois filhos e uma vida financeira instável. Havia passado os quatro anos anteriores afastado da academia, desde que havia voltado de Natal, onde fiz meu mestrado e cheguei a iniciar o que seria uma primeira tentativa frustrada de fazer o doutorado. As chances de sucesso eram tão improváveis e as recomendações contrárias tão insistentes que entrei de cenho franzido e passos duros, vislumbrando adiante uma travessia árida, teimosa e solitária, quase quixotesca, por minha própria conta e risco. Supus que, ao final do percurso, não haveria muitos nomes a listar nesta página. Nunca estive tão redondamente enganado em minha vida. Este quixote não teria passado sequer do primeiro moinho sem a ajuda de uma gama diversa de pessoas muito generosas. Em primeiro lugar, agradeço à minha família pelo apoio e formação de toda uma vida. À minha mãe, meus irmãos e sobrinhos, mas principalmente ao meu pai que, mesmo achando que “ciência é coisa de gente doida” e “coisa de poeta”, nunca me faltou. Em segundo lugar, à família científica que me acolheu no NNC. Não digo isso de maneira casual e protocolar. Desde o primeiro e-mail que troquei com o Márcio em 2009, pedindo conselhos sobre o caminho a seguir na minha incipiente carreira acadêmica, o NNC tem significado para mim casa e acolhimento. Não apenas científico mas até mesmo um teto para morar. Mestre, creio que sejamos ambos bons com as palavras. Mas às vezes nada é mais eloqüente que um singelo muito obrigado. Muito obrigado pela casa, tanto a científica quanto a residencial. Muito obrigado pelas portas abertas do laboratório, do apê da Castelo Serpa, da sua casa e da sua família, da do Dr. Tasso e Dona Maria, e obrigado pelo cheiro de mineiridade boa que exala de cada uma delas. Muito obrigado pelo apoio, pelo suporte, pela paciência, pela compreensão das minhas limitações e pelo reconhecimento das minhas qualidades. Mas, sobretudo, muito obrigado pelo respeito e honestidade intelectuais. Creio que este será o maior legado que levarei do NNC. Muito obrigado, Mestre. E muito obrigado também à pessoa sem a qual você não abriria essas portas. Talvez sequer encontrasse as chaves! Hahaha! Obrigado, Grace, pelo carinho, respeito, compreensão e acolhimento ao longo desses anos. Você é um exemplo de batalhadora científica para todos nós. Aos demais professores do NNC, André e Juliana, também pelo respeito, apoio e troca científica ao longo dos anos. Bruno e Cleiton, que mal consigo chamar de professores, tamanho o senso de camaradagem e amizade, que vai além da troca científica. Obrigado pela assistência e ombro amigo de ambos durante os momentos de maior turbulência. “Bruno, hoje tem Anos 80 na Obra, bora?” E Cleiton, cuidado com café forte e ovo mexido salgado de manhã, faz mal para a pressão! Aos professores da pós que também foram fundamentais nesta jornada, em momentos pontuais ou ao longo dela: Paula Scalzo, Fabrício Moreira, Antônio Oliveira e Hani Yehia. E meu especial agradecimento, carinho e amizade à Profa. Angela Ribeiro, que ministrou a primeira aula de Neuro que assisti na vida, na especialização, em 2004, e se tornou, desde então, uma grande amiga e incentivadora da minha carreira científica. Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e do Programa de Pós-Graduação em Neurociências, cujo apoio, muitas vezes discreto, é sempre fundamental para que a engrenagem da pesquisa não pare de funcionar: ao cruzeirense Taquinho, Cássio, Samir, Dona Nely e, principalmente, à Nilda, à Carmen e ao camarada Carlos Magno pela constante presteza e eficiência na atuação junto à secretaria da pós. Aos colegas do NNC, pelo convívio e tantas e tão boas experiências compartilhadas nas bancadas, nos corredores, na copinha, nos butecos e pela vida. Um agradecimento especial à minha irmãzinha Bia, adversária ferrenha nas pegadinhas, mas companheira indispensável igualmente nas risadas e nos lamentos. Aos ex-alunos do Darkside que tocaram os primórdios do projeto “​steady-state​”, representados aqui na figura do grande amigo André Lockmann, que me passou o bastão, e com quem a amizade se mantém para além das fronteiras da ciência. Aos companheiros de Darkside que passaram e seguiram seus caminhos, mas não sem deixar boas lembranças: Pedrão, o fotógrafo de notebook; Paulitcho, “menino bão”, o genro que toda mãe pediu a deus; Hyo, companheira de ralação; e os recém-doutores na saúde Henrique (“Je ne me sois, Moravito!”) e Eric (“Simões tá na pista, Levíticos!”). Aos ainda habitantes do Dark. Lari, companheira de butecos, aflições e de “Cracolândia”. Léo também, mas especialmente pela melhor notícia de todo o doutorado: o comportamento funcionou! Sr. Medeiros, que convergiu colaborações, mas sobretudo por compartilhar a ironia pela vida (“Tudo bem, Sr. Simões?”, “Você quer a resposta retórica ou a verdadeira, Sr. Medeiros?”). Matheus, pela brilhante colaboração na histologia. E Jonesito, esse ser de luz (“música é formação de caráter”), meu companheiro de Mineirão e guru das análises (“O que você acha deste sinal, John?”, “Hmmm…”). Aos colegas da pós em Neuro, representados aqui pela minha querida amiga Joana Andrade. Que grande presente este improvável reencontro na neuro depois de tanto tempo, desde os idos da Ciclope, hein, Jojô! (mas ninguém precisa saber que esses tempos foram no século passado!) Aos amigos da vida, que são tantos e tão valiosos. Os pelejandos, minha família sem DNA, sempre monitorando o estado das coisas e sempre me incentivando, pois eles me conhecem muito bem e sabem o que isto significa para mim. Agora vai, Mateusão! Ao meu fiel amigo Marcelo, pelo apoio recíproco durante momentos de grande e coincidente instabilidade para ambos e por ter testemunhado alguns dos momentos mais assustadores desse período (“Cronometra pra mim, Celesa?”). À suave força feminina de Giulia, Cris Arima, Cris Abreu, Kia e Bruna, que me ampararam, sustentaram e acenderam faróis ao longo do meu denso nevoeiro. À minha psiquiatra Ana Emília, mais um exemplo dessa elegante força feminina capaz de derrubar e refundar a presunçosa resiliência masculina em apenas uma frase (e com o auxílio estabilizador de meia xícara de Sertralina e várias pitadas de Rivotril ao longo de dois anos). Aos alunos da FEAD e do curso de especialização, cujo convívio sempre foram uma fonte revigorante de prazer pela produção e propagação do conhecimento. Aos meus filhos Antônio e Valentina, por razões que escapam às palavras, mas que o coração entende, porque acelera, e os olhos confirmam, porque embaçam. Mas até onde o verbo consegue ir, meus filhos, obrigado por me reinventarem, desde o parto e até hoje, a cada dia, a cada mudança. Foram tantas que já não me lembro de quem eu era antes de vocês. E me entusiasma imaginar para onde ainda vamos. Amor é isso. Eu sei. E, finalmente -- mas não menos importante --, àquele que nos dá a energia da vida, a força vital, a confiança para seguir em frente, firmes e vigilantes, apesar dos percalços do dia-a-dia: o café! AGRADECIMENTO ESPECIAL AO FLÁVIO “Joga logo esse anel em Mordor, Simões!”, soltou ele numa dessas madrugadas em que discutíamos os resultados da tese e do artigo. Um pequena epifania, despretensiosa e brincalhona, sarcástica e cheia de referências, bem ao nosso estilo, que definiu nossa amizade, afinidade e parceria ao longo desta saga que foi o doutorado. Se você a acompanhou, certamente se perguntou com surpresa por que o Flávio estava ausente das páginas anteriores. Bom, aqui está a razão: ele precisa de uma página inteira. Se seu nome está lá, por favor, não fique com ciúmes. Vocês todos foram espetaculares e fundamentais. Principalmente você, Mestre! Você foi nosso Gandalf, o idealizador de tudo, mas que às vezes precisou correr por outros caminhos para trazer a cavalaria no momento certo. Mas sem seu respectivo Samwise Gamgee, nem aquele Sr. Frodo e nem este teriam passado sequer das fronteiras do Condado. Assim como o outro, comecei a jornada animado e cheio de coragem, mas não esperava que a carga fosse pesar tanto e que eu fosse me sentir tão fragilizado ao longo do caminho. E, em muitos desses momentos, foi o bom e velho Flavitcho, com sua obstinação, dedicação e amizade, que me carregou, me puxou, me fez continuar e não me deixou entregar os pontos. Eu tenho muita sorte em encontrar amigos por onde passo. Não falo de colegas, falo de amigos mesmo, desses em que a gente pode confiar 100% e que se tornam irmãos presenteados pela vida. A afinidade com muitos deles nasceu e foi cultivada através da música. Com o Flávio não foi diferente. Do Nick Cave ao Mogwai, do Cohen ao Godspeed, do Jeff Buckley ao Sigur Rós, da PJ Harvey à Cat Power, de Cartola a Gil Scott-Heron, do Constantina ao Hurtmold, passando pela concordância de que o Morrissey, apesar de espetacular, é um chato e que o Johnny Marr é um cara massa, nossas “músicas para se ouvir no térreo” nos aproximaram e nos mantêm unidos, companheiros de dias malditos e benditos. E hoje, na parede da minha sala, ao lado do pôster do Nick Cave, está o do Possuídos. Sua relação com sua banda é uma espécie de metonímia da sua vida, Flavitcho. Da sua dedicação, da sua persistência, do seu amor pelo que faz e do amor com que faz, da coerência entre seus ideais e ações. Uma capacidade executiva associada a uma sensibilidade estética que são raros de se ver em uma mesma pessoa. Poucas cenas te definem tanto como a que eu vi durante o show na ocupação embaixo do viaduto Santa Teresa. Ou durante a interrupção causada pela briga. Você lá, sentado no canto, de pernas cruzadas, fumando tranquilo, enquanto o pau quebrava lá embaixo, em meio àquele cenário de caos urbano. Em poucos minutos aquele sujeito pacato e sossegado se transformaria novamente no vocalista anarquista e visceral. O “monstro”, que eu até então desconhecia, completava ali o “médico”, trazendo à luz o equilíbrio do lado escuro da vida, cuja beleza tensa e obtusa sabemos enxergar e admirar. Tudo fez sentido. Obrigado, Flavitcho. Bora escovar dente? “O homem de bom senso jamais comete uma loucura de pouca importância” (Johann Wolfgang Von Goethe) RESUMO Foi demonstrado que o condicionamento ao medo aumenta as respostas evocadas em regime permanente no colículo inferior por um tom de longa duração modulado em amplitude. Neste trabalho testamos a hipótese de que a amígdala basolateral modula esse efeito, uma vez que ela desempenha um papel crucial na avaliação da relevância biológica de estímulos ambientais. Nós inibimos essa estrutura através da microinjeção local de um agonista do receptor GABAa (muscimol) antes da sessão de teste de evocação da memória associativa em um paradigma auditivo de condicionamento ao medo e registramos a atividade evocada no núcleo central do colículo inferior. De acordo com nossos resultados, o tratamento com o muscimol diminuiu a expressão do comportamento de congelamento durante a sessão de teste, mas aumentou o arrasto do envelope de modulação na atividade do colículo inferior. Repetimos o protocolo de injeção com outro grupo de ratos, mas utilizando o som como estímulo neutro, sem pareamento a estímulos aversivos, e observamos que o aumento da atividade evocada no colículo inferior como resultado da inibição da amígdala basolateral é independente da tarefa de condicionamento. Nossos achados sugerem que essa estrutura exerce um controle inibitório tônico sobre a codificação da informação sensorial nos estágios iniciais da via auditiva. ABSTRACT It has been shown that fear conditioning improves the steady-state evoked potentials driven by a long-lasting amplitude-modulated tone in the inferior colliculus. In this work, we tested the hypothesis that the amygdala modulates this effect since it plays a crucial role in assessing the biological relevance of environmental stimuli. We inhibited the basolateral nucleus of the amygdala of rats by injecting a GABAa receptor agonist (muscimol) before the recall test session of an auditory fear conditioning paradigm and recorded the evoked activity in the central nucleus of the inferior colliculus. According to our results, the treatment with muscimol decreased the expression of freezing behavior during the recall test session but increased the entrainment of the modulation envelope in the activity of the inferior colliculus. We repeated the injection protocol with another group of rats but without pairing the tone to an aversive stimulus and observed that the enhancement of the stimulus-driven activity in the inferior colliculus is a result of the inhibition of the basolateral amygdala, regardless of the conditioning task. Our findings suggest that this structure exerts a tonic inhibitory control over the encoding of sensory information at the early stages of the sensory pathway. SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 2 1.1 Mariposas sentem medo? 2 1.2 Aprendizado associativo 5 1.2.1 Condicionamento Clássico 5 1.3 Complexo Amigdalóide 7 1.4 Mecanismos de memória associativa na Amígdala Basolateral 10 1.5 Modulação Top-down 18 1.6 Colículo Inferior 20 1.7 Respostas Evocadas em Regime Permanente 22 1.8 Estudo das Respostas Evocadas em Regime Permanente no Colículo Inferior no Condicionamento Auditivo Clássico ao Medo 24 2. HIPÓTESE E JUSTIFICATIVA 27 3. OBJETIVOS 28 4. MATERIAIS E MÉTODOS 29 4.1 Diretrizes éticas 29 4.2 Animais experimentais 29 4.3 Cirurgia de implante de eletrodos e cânulas 29 4.4 Histologia 30 4.5 Condicionamento Auditivo Clássico ao Medo (CACM) 31 4.6 Registros eletrofisiológicos e análise de dados 34 4.7 Análises estatísticas 35 5. RESULTADOS 36 5.1 Histologia e posicionamento dos eletrodos 36 5.2 Eletrofisiologia 37 5.3 O tratamento da BLA com muscimol prejudicou a expressão do comportamento condicionado 38 5.4 A energia e a sincronização de fase das REARPs no CI aumentaram durante a apresentação do CS no tratamento com salina e também com muscimol 39 5.5 Ajuste da hipótese: energia e sincronização de fase das REARPs no CI aumentam no tratamento com muscimol independente do condicionamento 40 5.6 Análise da BLA 40 6. DISCUSSÃO 42 7. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS 45 8. REFERÊNCIAS 46 1 1. INTRODUÇÃO 1.1 Mariposas sentem medo? “O que é o medo? Um produzido dentro da gente, um depositado; e que às vezes se mexe, sacoleja, e a gente pensa que é por causas: por isto ou por aquilo, coisas que só estão é fornecendo espelhos.” (Riobaldo Tatarana) Mariposas e morcegos formam um clássico exemplo de corrida armamentista evolutiva nas relações presa-predador. O desenvolvimento de hábitos noturnos e coloração opaca conferiram uma vantagem adaptativa a esses insetos em relação a predadores diurnos de visão acurada, como os pássaros. Morcegos insetívoros, no entanto, são capazes de identificar suas presas com grande precisão em ambientes escuros, mesmo em pleno vôo, uma vez que o fazem por ecolocalização. Por outro lado, ao longo da história evolutiva algumas espécies de mariposas desenvolveram, em contraponto, estratégias de defesa baseadas em órgãos auditivos especializados, sensíveis a vibrações na faixa de frequência das vocalizações ultrassônicas que os morcegos utilizam no processo de ecolocalização. Essas estruturas são compostas de membranas timpânicas localizadas de cada lado do tórax desses insetos, sob suas asas, conectadas a duas classes de neurônios sensoriais, A1 e A2. Os neurônios A1 são mais sensíveis, respondendo a estímulos de mais baixa intensidade (FIGURA 1A). Quanto mais intenso o som, maior a frequência e menor a latência de disparos dessas células, o que permite à mariposa codificar a posição relativa do morcego no ambiente mesmo a longa distância. Ambos fazem sinapses com interneurônios nos gânglios torácicos que, por sua vez, ativam neurônios motores que controlam o movimento das asas (FIGURA 1B). O som eventualmente chegará a cada membrana com uma leve defasagem de tempo e intensidade, acarretando uma pequena diferença na taxa de disparo dos neurônios A1 (FIGURA 1C). Essa variação será refletida em um desbalanço na velocidade de batimento das asas, fazendo com que a mariposa mude de direção, se afastando da fonte sonora. Caso essa manobra não seja suficiente para dissuadir o ataque e o morcego permaneça em sua investida, sua aproximação fará com que as 2 vocalizações se tornem mais intensas, alcançando o limiar de ativação dos neurônios A2. A alta taxa de ativação desses sensores acelera o batimento das asas provocando movimentos aleatórios que dificultam a aproximação dos morcegos. Em último caso, sob a iminência do bote definitivo de seu predador, a resposta neuronal se torna tão alta que alcança um patamar de saturação que interrompe por completo o movimento das asas, fazendo com que a mariposa mergulhe em queda livre até o solo. A relva gera um fundo ruidoso para o sonar dos morcegos, funcionando como uma camuflagem acústica para as mariposas que, desta forma, são bem sucedidas em sua estratégia de defesa ​(ALCOCK, 2016) ​. Figura 1 - Padrão de ativação de células A1 e A2 e integração sensório-motora na mariposa para execução do comportamento de fuga do predador. (A) Frequência de disparo das células sensoriais em função da intensidade do som. (B) Diferença de ativação das células A1 conforme intensidade em cada lado do corpo da mariposa. (C) Esquema anatômico do sistema nervoso da mariposa e conexão com a musculatura da asa. Adaptado de ​(ALCOCK, 2016) ​. 3 https://paperpile.com/c/PbugT0/BoRP https://paperpile.com/c/PbugT0/BoRP As mariposas conseguem, dessa forma, detectar a presença de seu predador e colocar em prática um comportamento efetivo de evasão. Mas seria possível dizer que elas conseguem fugir porque têm medo dos morcegos? Essa é uma pergunta bastante traiçoeira. A própria definição de medo vem sendo objeto de um vigoroso debate reaceso recentemente dentro das neurociências e áreas correlatas ​(MOBBS et al., 2019)​. Para Joseph LeDoux, um dos maiores expoentes desta área de pesquisa, essa pergunta sequer faria sentido, pois o medo e outras emoções implicariam um componente subjetivo e consciente, divergente dos mecanismos comportamentais e fisiológicos, que não poderia ser estudado em animais ​(LEDOUX; DAW, 2018; LEDOUX, 2014; LEDOUX; PINE, 2016; LEDOUX; PHELPS; ALBERINI, 2016; MOBBS et al., 2019)​. De outro lado, reeditando uma espécie de releitura contemporânea da disputa entre as teorias da emoção de James-Lange e Cannon-Bard, pesquisadores não menos proeminentes na área, como Michael Fanselow, acenam com evidências de que esses aspectos seriam convergentes e, portanto, passíveis de abordagem na pesquisa com animais ​(FANSELOW; PENNINGTON, 2017; MOBBS et al., 2019)​. De toda forma, parece haver consenso de que o conceito de medo passa por um estado interno do organismo, provocado pela percepção de uma ameaça iminente, e que favorece a execução de um comportamento de defesa para além de um simples reflexo sensório-motor. Com base na ideia acima e no mecanismo descrito anteriormente, poderíamos dizer que as mariposas não apenas não temem os morcegos como sequer identificam sua existência como uma ameaça em si. Embora sua estratégia de fuga seja bastante engenhosa e eficiente, ela se baseia em um padrão comportamental estereotipado e em um mecanismo sensório-motor inato, altamente especializado e selecionado para responder apenas a uma categoria muito específica de estímulos. A vantagem adaptativa desse tipo de mecanismo está na eficiência e especificidade da resposta. Por outro lado, a gama de estímulos nocivos que se pode evitar fica limitada àqueles que apresentam as características físicas capazes de provocar o reflexo de defesa, o que pode representar um grande risco em nichos com variações ambientais dinâmicas. 4 https://paperpile.com/c/PbugT0/RZUOP https://paperpile.com/c/PbugT0/LfRLX+CCGZg+v4m7K+RZUOP+lghQv https://paperpile.com/c/PbugT0/LfRLX+CCGZg+v4m7K+RZUOP+lghQv https://paperpile.com/c/PbugT0/Ly7AQ+RZUOP https://paperpile.com/c/PbugT0/Ly7AQ+RZUOP 1.2 Aprendizado associativo “Mestre não é quem sempre ensina, mas quem de repente aprende.” (Riobaldo Tatarana) Estratégias alternativas de identificação e evitação de ameaças surgiram ao longo da evolução de forma a contornar essa limitação. Aos mecanismos inatos de reflexos sensório-motores se somaram, em grupos de vertebrados como répteis, aves e mamíferos, estruturas capazes de associar as características físicas de um estímulo ao efeito que produzem sobre o organismo ​(JANAK; TYE, 2015; MCDONALD, 1998)​. Um efeito nocivo, por exemplo, induz a associação entre o evento que o precedeu e padrões de respostas comportamentais capazes de afastar o indivíduo da fonte de perigo, através da integração de redes neuronais dinâmicas passíveis de alterações plásticas e dependentes, portanto, da experiência prévia do indivíduo. Uma vez estabelecidas, essas redes serão novamente acionadas pela identificação de estímulos com padrões semelhantes de ativação sensorial, que passam a funcionar como pistas regulares preditivas da iminência de uma ocorrência potencialmente prejudicial ​(DUVARCI; PARE, 2014)​. Esse tipo de habilidade cognitiva, denominada aprendizado associativo, possibilitou a ampliação do repertório de estímulos reconhecidos como relevantes à sobrevivência do indivíduo e se tornou crucial para o desenvolvimento de estratégias adaptativas de sobrevivência. 1.2.1 Condicionamento Clássico O mecanismo geral descrito acima se aproxima bastante da definição de uma das formas mais básicas de aprendizado associativo, o condicionamento clássico, que veio a se tornar um dos paradigmas experimentais mais utilizados no estudo dos mecanismos mnemônicos associados ao comportamento. Ele foi descrito inicialmente por Ivan Pavlov, no final do século XIX, como o processo pelo qual um estímulo inicialmente neutro ganha relevância emocional (estímulo condicionado, CS) ao ser temporalmente pareado a um evento incondicionalmente relevante (estímulo incondicionado, US). Após a consolidação da 5 https://paperpile.com/c/PbugT0/ALNE9+BqT0X https://paperpile.com/c/PbugT0/egZZr memória associativa, a apresentação do CS sozinho é capaz de deflagrar a expressão das respostas incondicionadas. No caso do estudo das reações defensivas e suas emoções correlatas, o CS é pareado a um estímulo naturalmente aversivo, como o cheiro de um predador ou um choque por corrente elétrica nas patas, configurando o que se convencionou chamar de condicionamento clássico ao medo. O estado orgânico interno de preparação para a rápida execução de comportamentos de luta ou fuga, desencadeado através da mediação do sistema nervoso autônomo simpático, é associado por alguns autores ao próprio conceito de emoção, caso da teoria dos marcadores somáticos de António Damásio ​(DAMÁSIO, 19 de novembro de 2012)​. A resposta adaptativa nesse tipo de paradigma, portanto, não está codificada em circuitos reflexos inatos, mas depende da experiência prévia do indivíduo. Desta forma, a integração entre a entrada sensorial e a resposta motora adequada pressupõe a existência de estruturas intermediárias capazes de atribuir valência (positiva ou negativa) aos estímulos, promover a associação entre o CS e o US através de alterações plásticas de longo prazo que tornem essa associação estável e duradoura e desencadear respostas viscerais autonômicas e comportamentais de defesa correlatas ao medo. Curiosamente, esses mecanismos intermediários estavam previstos na tese de doutorado de Donald Hebb, um dos mais influentes neurocientistas da história (FIGURA 2). A ideia da sinapse hebbiana teve sua origem no esforço de seu autor em conceber mecanismos que pudessem explicar a então recente descoberta de Ivan Pavlov. Naquele momento inicial de sua carreira, Hebb hipotetizava que neurônios ativos atraem as projeções de outras células, criando o que ele chamou de “rotas neurais” ​(HEBB, 1949) ​. Figura 2 - Anotações e diagramas manuscritos por Donald Hebb utilizados em sua tese de doutorado. As ideias aqui ilustradas seriam a base de sua ideia de sinapse que influenciaria várias gerações de neurocientistas. Retirado de ​(HEBB, 1949)​. 6 https://paperpile.com/c/PbugT0/2McYE https://paperpile.com/c/PbugT0/2McYE https://paperpile.com/c/PbugT0/y1lyH https://paperpile.com/c/PbugT0/y1lyH https://paperpile.com/c/PbugT0/y1lyH Estruturas do lobo temporal medial têm sido associadas ao processamento de informações emocionalmente relevantes desde a década de 30 do século passado, com os trabalhos clássicos de James Papez e Paul McLean na descrição do chamado sistema límbico. Heinrich Klüver e Paul Bucy observaram o efeito deletério de lesões nessa região para o processamento emocional em macacos-rhesus ​(JANAK; TYE, 2015; SAH et al., 2003)​. Esse achado foi replicado mais tarde, na mesma espécie, com manipulações restritas à amígdala, evidenciando um prejuízo em comportamentos reforçados por condicionamento clássico, como, por exemplo, a capacidade de reconhecer pistas preditivas de um choque elétrico (WEISKRANTZ, 1956)​. A partir dessas descobertas, um rico campo de estudos foi inaugurado, sobretudo a partir da década de 1990, relacionando essa estrutura ao processamento de memórias aversivas. 7 https://paperpile.com/c/PbugT0/ePPPb+BqT0X https://paperpile.com/c/PbugT0/IClqj 1.3 Complexo Amigdalóide, o “metro quadrado mais caro” do cérebro “Ou se fosse que algum perigo se produzia por ali, e eu colhia o aviso? Não é que, com muitos, dose disso sucedesse? Eu sabia, tinha ouvido falar: jagunços que pegam esse condão, adivinham o invento de qualquer sobrevir, por isso em boa hora escapam.” (Riobaldo Tatarana) O número de estudos sobre a relação entre a amígdala e o medo aprendido chegou a uma média aproximada de 400 artigos publicados por ano na primeira década deste século (DUVARCI; PARE, 2014) e continua crescendo. Uma busca pelo termo “​fear learning​” no portal Pubmed entre os anos 2011 e 2020 retorna quase 10.000 resultados, mais que dobrando a média em relação aos dez anos anteriores. O termo “​amygdala​” sozinho eleva em pelo menos duas vezes esses números, evidenciando o grande interesse sobre essa estrutura, uma das mais concorridas dentro das neurociências e áreas correlatas. A amígdala é uma pequena estrutura em formato de amêndoa, localizada bilateralmente no pólo rostral do lobo temporal medial (FIGURA 3A). A julgar apenas por seu tamanho, não se poderia suspeitar que tantos processos cerebrais e funções biológicas dependem fundamentalmente da integridade de sua intrincada circuitaria interna (FIGURA 3C). Não se trata, portanto, de um único núcleo, mas de uma série de subnúcleos interligados por conexões unidirecionais ou recíprocas que compõem o que se convencionou chamar de Complexo Amigdalóide ​(SAH et al., 2003)​. Seus dois principais subnúcleos são o basolateral (BLA), subdividido em lateral (LA), basal (BA) e basomedial (BM), e o central (CeA), subdivido em lateral (CeL) e medial (CeM) (DUVARCI; PARE, 2014; JANAK; TYE, 2015; SAH et al., 2003)​. A BLA é composta por neurônios principais glutamatérgicos, que perfazem cerca de 80% de suas células neuronais, e aproximadamente 20% de interneurônios GABAérgicos ​(DUVARCI; PARE, 2014)​. Essas células inibitórias, por outro lado, são predominante na CeA e em densos aglomerados espalhados lateralmente à BLA e entre os dois núcleos principais, sendo, por isso, chamadas de células intercalares ​(DUVARCI; PARE, 2014) ​ (FIGURA 3C). 8 https://paperpile.com/c/PbugT0/egZZr https://paperpile.com/c/PbugT0/ePPPb https://paperpile.com/c/PbugT0/ePPPb+BqT0X+egZZr https://paperpile.com/c/PbugT0/egZZr https://paperpile.com/c/PbugT0/egZZr A BLA é a principal porta de entrada do fluxo informacional no complexo amigdalóide. A LA recebe aferências sensoriais ascendentes, vindas de núcleos do tálamo, e descendentes, originárias de córtices sensoriais associativos ​(QUIRK; REPA; LEDOUX, 1995) e primários ​(FREESE; AMARAL, 2005) ​. A BA, além de receber projeções internas unidirecionais de neurônios glutamatérgicos da LA, estabelece conexões recíprocas (portanto também de saída) com áreas do hipocampo e da região medial do córtex prefrontal, que são essenciais na modulação do comportamento de medo ​(VIDAL-GONZALEZ et al., 2006)​. Interessante notar o aumento da BLA em relação à CeA ao longo do processo evolutivo em diferentes grupos de mamíferos, refletindo o aumento de áreas corticais que se comunicam com a BLA, especialmente em primatas comparativamente a outras espécies, como os roedores ​(CHAREYRON et al., 2011; JANAK; TYE, 2015) ​ (FIGURA 3B). Na outra ponta, a CeA -- mais especificamente a CeM -- é a principal porta de saída da informação processada na amígdala ​(DUVARCI; PARE, 2014)​. Essa estrutura recebe projeções glutamatérgicas diretas da BA e projeções inibitórias da CeL, que por sua vez recebe influência excitatória direta da LA ou inibitória indiretamente via células intercalares (DUVARCI; PARE, 2014; SAH et al., 2003)​. Os neurônios GABAérgicos de saída da CeM têm alvos variados distribuídos pelo encéfalo, mas são de fundamental relevância para o estudo do condicionamento clássico ao medo os núcleos do tronco encefálico, como a substância periaquedutal cinzenta, núcleos parabraquiais, núcleo do trato solitário e núcleo dorsal do vago ​(DUVARCI; PARE, 2014; HOPKINS; HOLSTEGE, 1978) (FIGURA 3C). São esses núcleos que deflagram as respostas viscerais autonômicos e controlam a expressão de comportamentos de defesa avaliados nesse tipo de paradigma, como o congelamento em ratos e outros roedores. Os neurônios glutamatérgicos da LA projetam internamente para a BA, BM e diretamente para a CeL. Projeções semelhantes conectam a BA aos dois núcleos da CeA, influenciando diretamente as eferências de saída do complexo amigdalóide ​(DUVARCI; PARE, 2014) (FIGURA 3C). Os neurônios principais da BA representam, portanto, a via mais curta de integração sensório-motora entre os estímulos aversivos de entrada e as projeções eferentes de expressão do comportamento de defesa. O bloqueio farmacológico de receptores glutamatérgicos do tipo NMDA na BA -- mas não em núcleos da CeA -- 9 https://paperpile.com/c/PbugT0/WnFVj https://paperpile.com/c/PbugT0/WnFVj https://paperpile.com/c/PbugT0/YjkdV https://paperpile.com/c/PbugT0/bGQVh https://paperpile.com/c/PbugT0/Ujysy+BqT0X https://paperpile.com/c/PbugT0/egZZr https://paperpile.com/c/PbugT0/egZZr+ePPPb https://paperpile.com/c/PbugT0/lYS7B+egZZr https://paperpile.com/c/PbugT0/egZZr https://paperpile.com/c/PbugT0/egZZr prejudicam tanto a aquisição da memória associativa ​(FANSELOW; KIM, 1994; GOOSENS; MAREN, 2003) quanto sua expressão ​(LEE et al., 2001; MAREN et al., 1996)​, a depender se é realizado respectivamente antes da tarefa de condicionamento ou de sua evocação. A ativação de receptores inibitórios GABA ​A na BLA, através da microinjeção local do agonista muscimol, também prejudica tanto a aquisição quanto a evocação da memória de medo, com maior decaimento do comportamento de congelamento na aplicação pré-teste, ou seja, na execução do comportamento aprendido ​(HELMSTETTER; BELLGOWAN, 1994)​. Figura 3 - Localização, núcleos e circuitaria intrínseca do Complexo Amigdalóide. (A) Localização no lobo temporal medial do cérebro humano, em vermelho (Licença Creative Commons). (B) Tamanho relativo dos seus núcleos principais (basolateral e central) em ratos e humanos. Adaptado de ​(JANAK; TYE, 2015)​. (C) Circuitaria intrínseca diferenciando neurônios excitatórios (em vermelho) e inibitórios (em azul) e suas respectivas projeções. Adaptado de ​(DUVARCI; PARE, 2014) ​. Apesar de historicamente associada ao processamento de estímulos de valência aversiva, estudos recentes vêm desvendado o envolvimento da amígdala também no aprendizado associado a estímulos positivos ​(TYE et al., 2008)​. Embora em ambos os tipos de tarefa haja o recrutamento e potenciação de neurônios glutamatérgicos da LA via receptores NMDA, grupos neuronais que respondem a um tipo a um tipo de valência não respondem ao 10 https://paperpile.com/c/PbugT0/sJlfv+lz7D5 https://paperpile.com/c/PbugT0/sJlfv+lz7D5 https://paperpile.com/c/PbugT0/VRgUW+Mvdhf https://paperpile.com/c/PbugT0/5Ag5t https://paperpile.com/c/PbugT0/BqT0X https://paperpile.com/c/PbugT0/egZZr https://paperpile.com/c/PbugT0/HjqtN outro e vice-versa, revelando especificidade na capacidade da LA em distinguir valência do estímulo ​(JANAK; TYE, 2015; TYE et al., 2008)​. 11 https://paperpile.com/c/PbugT0/HjqtN+BqT0X 1.4 Mecanismos de memória associativa na Amígdala Basolateral “Com assim, a gente se diferenciava dos outros -- porque jagunço não é muito de conversa continuada nem de amizades estreitas: a bem eles se misturam e desmisturam, de acaso, mas cada um é feito um por si.” (Riobaldo Tatarana) Estímulos acústicos pareados a choques nas patas são os mais comumente empregados nos desenhos experimentais de paradigmas de condicionamento clássico ao medo. Aferências diretas do núcleo geniculado medial (NGM), estrutura da via auditiva localizada no tálamo (LEDOUX; FARB; RUGGIERO, 1990)​, projetam sobre neurônios da LA que apresentam, assim, respostas evocadas por estímulos acústicos ​(BORDI; LEDOUX, 1992)​. Esses potenciais se caracterizam por um padrão de curta latência média, embora bastante variável, o que pode ser explicado pela sobreposição, no mesmo alvo das terminações talâmicas, de projeções corticais que chegam à LA com pequena, mas significativa defasagem temporal (LEDOUX; FARB; ROMANSKI, 1991; QUIRK; REPA; LEDOUX, 1995)​. Neurônios da LA respondem também a estímulos somatossensoriais através de projeções diretas do núcleo intralaminar posterior do tálamo e são temporalmente mais precisos que os auditivos, já que sua latência de resposta é menos variável, embora maior em média ​(ROMANSKI et al., 1993)​. Existem ainda aqueles que respondem às duas modalidades simultaneamente, revelando terminações polimodais convergentes sobre os neurônios principais da LA (ROMANSKI et al., 1993) ​. A convergência anatômica das projeções das duas modalidades se transforma em sincronia temporal a partir do pareamento entre o estímulo acústico e a robusta aferência somatossensorial que codifica o choque. Os disparos neuronais coincidentes promovem um mecanismo de facilitação sináptica hebbiana que reforça a conexão inicialmente fraca entre as fibras auditivas e os neurônios da LA, fazendo com que o CS passe a recrutá-los independentemente da apresentação concomitante do US. Como resultado, essas células passam a responder com maior taxa de disparo às reapresentações do som inicialmente neutro (QUIRK; REPA; LEDOUX, 1995)​. Os neurônios com maior alteração no número de disparos foram os de menor latência, corroborando a ideia de que as projeções talâmicas do geniculado 12 https://paperpile.com/c/PbugT0/OBbfN https://paperpile.com/c/PbugT0/Nq5KR https://paperpile.com/c/PbugT0/goqhs+WnFVj https://paperpile.com/c/PbugT0/IgY9y https://paperpile.com/c/PbugT0/IgY9y https://paperpile.com/c/PbugT0/IgY9y https://paperpile.com/c/PbugT0/WnFVj são fundamentais para um rápido estabelecimento do circuito de resposta condicionada (QUIRK; REPA; LEDOUX, 1995)​. Além da frequência de ativação, houve também um aumento também na amplitude e inclinação dos potenciais evocados ​(ROGAN; STÄUBLI; LEDOUX, 1997)​. Essas alterações foram mantidas até 4 dias após a realização da tarefa de condicionamento, evidenciando um processo de potenciação de longo prazo ​(ROGAN; STÄUBLI; LEDOUX, 1997) ​. Figura 4 - Mecanismos de detecção de disparos coincidentes por células-alvo induzem plasticidade pós-sináptica. Adaptado de ​(FELL; AXMACHER, 2011) ​. Mecanismos como o descrito acima se baseiam essencialmente na detecção de disparos coincidentes na célula-alvo para gerar plasticidade ​(FELL; AXMACHER, 2011) (FIGURA 4), exigindo técnicas de alta resolução temporal para seu estudo detalhado. A expressão de rodopsinas sensíveis à luz em canais ionotrópicos permeáveis ao sódio permite um controle temporal preciso da ativação de células geneticamente modificadas através de estimulação óptica. Dois estudos tiraram proveito dessa técnica para ativar diretamente as terminações na LA, em substituição ora ao som ora ao choque, para testar a efetivação da associação entre CS e US. No primeiro, canais de rodopsina do tipo 2 (ChR2) foram expressos em neurônios principais da LA e ativados simultaneamente à apresentação de um som neutro, o que foi suficiente para substituir o choque e gerar o comportamento de congelamento durante a reapresentação do mesmo som ​(JOHANSEN et al., 2010)​. No 13 https://paperpile.com/c/PbugT0/WnFVj https://paperpile.com/c/PbugT0/jrU7q https://paperpile.com/c/PbugT0/jrU7q https://paperpile.com/c/PbugT0/jrU7q https://paperpile.com/c/PbugT0/jrU7q https://paperpile.com/c/PbugT0/TCdD https://paperpile.com/c/PbugT0/TCdD https://paperpile.com/c/PbugT0/zdF5y segundo, os ChR2 foram expressos nos terminais das projeções auditivas talâmicas e corticais e acionados simultaneamente ao choque nas patas. Nova reapresentação do estímulo óptico sozinho foi capaz de gerar a resposta condicionada, muito embora em uma tarefa de condicionamento operante ​(NABAVI et al., 2014) ​. O resultado bem sucedido desse tipo de mecanismo é que o som passa a exercer o papel de um preditor do estímulo nocivo, permitindo que o indivíduo se antecipe à sua ocorrência e execute o comportamento de defesa a contento. Uma vez estabelecido esse mecanismo, a ativação dos neurônios da LA a partir da apresentação do estímulo condicionado se sustenta até a iminência do choque, mesmo que o som seja interrompido antes ​(PARÉ; COLLINS, 2000)​. Nesse trabalho, gatos foram condicionados com uma sequência de 4 tons, seguida de uma pausa silente de 5 e mais 2 tons, ao final dos quais o choque era aplicado (FIGURA 5A). Após o condicionamento, a taxa de disparo dos neurônios registrados na LA duplicou não apenas durante a apresentação dos pré-tons mas também durante o período de silêncio e estiveram correlacionados a um aumento da pressão arterial, indicando que os animais se antecipavam à provável aplicação do choque ​(PARÉ; COLLINS, 2000) (FIGURA 5A e 5B). Além disso, pares de células registradas simultaneamente tiveram um aumento significativo na sincronização de seus disparos na faixa de frequência da banda teta (4-8 Hz), novamente tanto durante a apresentação dos pré-tons quanto no período de silêncio ​(PARÉ; COLLINS, 2000) ​ (FIGURA 5C). Neurônios piramidais glutamatérgicos da BLA têm características celulares intrínsecas que os tornam propensos a apresentarem flutuações do potencial de membrana a uma taxa coincidente com a banda teta ​(PAPE et al., 2005; PAPE; PARÉ; DRIESANG, 1998)​, o que leva a crer que esses ritmos podem gerados na própria BLA. A atividade conjunta de uma população dessas células, cada uma gerando correntes transmembrana pós-sinápticas excitatórias, promove flutuações na concentração iônica do meio extracelular que são percebidas nos eletrodos de registro como deflexões de voltagem que, em função do tempo, descrevem Potenciais de Campo Locais (LFP) ​(BUZSÁKI; ANASTASSIOU; KOCH, 2012)​. Essas flutuações geram variações cíclicas na excitabilidade neuronal que funcionam como janelas de oportunidade para disparos temporizados, um mecanismo que parece ser fundamental para a comunicação entre diferentes áreas do cérebro, inclusive a amígdala, e sua 14 https://paperpile.com/c/PbugT0/CWuOA https://paperpile.com/c/PbugT0/UAgr https://paperpile.com/c/PbugT0/UAgr https://paperpile.com/c/PbugT0/UAgr https://paperpile.com/c/PbugT0/UAgr https://paperpile.com/c/PbugT0/c4rz+dczv https://paperpile.com/c/PbugT0/dEXj integração em processos de memória associativa ​(FELL; AXMACHER, 2011)​. Ritmos de baixa frequência são considerados ideais para sincronizações a longa distância, entre estruturas remotas, ao passo que as de alta frequência refletem a ativação de circuitos locais de alta precisão temporal ​(FELL; AXMACHER, 2011) ​. Figura 5 - Oscilação preditiva de neurônios da LA na banda de frequência teta. (A) Aumento da pressão arterial em gatos condicionados no período de silêncio imediatamente anterior à apresentação do US. (B) Aumento da energia na banda teta tanto durante a apresentação do CS quando no período silente entre as apresentações do CS e do US. (C) Correlação cruzada entre pares de neurônios disparando em sincronia na banda teta em ambos os períodos. Adaptado de ​(PARÉ; COLLINS; PELLETIER, 2002) 15 https://paperpile.com/c/PbugT0/TCdD https://paperpile.com/c/PbugT0/TCdD https://paperpile.com/c/PbugT0/IbFd Esse parece ser o caso da atividade em teta na amígdala, já que em tarefas de condicionamento clássico ao medo observa-se um aumento na energia e sincronia nessa banda não apenas em seus circuitos intrínsecos, como descrito acima, mas também na sincronia entre a BLA e a região CA1 do hipocampo ​(SEIDENBECHER et al., 2003) (FIGURA 6 E-H). Esse efeito foi visto não apenas durante as reapresentações do CS​+ mas até mesmo, embora em menor intensidade, na presença de um CS ​-​, revelando o estabelecimento de um processo robusto de facilitação da comunicação entre as duas áreas ​(SEIDENBECHER et al., 2003)​ (FIGURA 6 A-D). O padrão de sincronização da BLA parece variar também de acordo com a área com a qual estabelece a comunicação. Duas regiões adjacentes do córtex prefrontal medial (mPFC) desempenham papéis opostos na regulação do comportamento de medo (VIDAL-GONZALEZ et al., 2006)​. A área infralímbica (IL) atua na extinção da memória aversiva através de conexões com as células intercalares, o que resulta na inibição das células de projeção da CeM. A região pré-límbica (PL) atua de maneira oposta, favorecendo a expressão do comportamento de congelamento através de eferências excitatórias nos neurônios da BA que projetam para CeM. Durante a evocação do aprendizado associativo em camundongos condicionados, oscilações em 4 Hz emergem no PL e são preditivas de ocorrências de congelamento ​(KARALIS et al., 2016)​. A inibição farmacológica dessa área suprime o comportamento e sua estimulação optogenética é suficiente para gerá-lo, mesmo na ausência do CS. A dinâmica dessa oscilação se mostrou independente da atividade em teta relacionada à comunicação amígdalo-hipocampal ​(KARALIS et al., 2016)​. A comunicação com o mPFC se dá também em faixas de frequência altas, como a banda gama (40-120 Hz). Durante a expressão do comportamento de medo, há um aumento do acoplamento cruzado entre as atividades em teta e gama alta (70-120 Hz) nos circuitos intrínsecos da BLA, embora haja uma redução da energia da banda de alta frequência (STUJENSKE et al., 2014)​. Em ambientes seguros, por outro lado, o acoplamento dessa banda passa a ser dirigido pelo ritmo teta gerado no mPFC, evidenciando uma competição de diferentes osciladores de baixa frequência pelo direcionamento da atividade local na BLA em contextos distintos ​(STUJENSKE et al., 2014)​. 16 https://paperpile.com/c/PbugT0/hn7k https://paperpile.com/c/PbugT0/hn7k https://paperpile.com/c/PbugT0/hn7k https://paperpile.com/c/PbugT0/bGQVh https://paperpile.com/c/PbugT0/0Ma0 https://paperpile.com/c/PbugT0/0Ma0 https://paperpile.com/c/PbugT0/EzJg https://paperpile.com/c/PbugT0/EzJg Figura 6 - Aumento de conectividade entre a região CA1 do Hipocampo e a BLA na banda teta durante tarefa após condicionamento ao medo. (A e E) Traçado do sinal eletrográfico original das duas áreas. (B e F) Espectrogramas mostrando o aumento da atividade na banda teta em CA1 durante apresentação do tanto do CS​- quanto do CS ​+ e na BLA sobretudo na apresentação do CS ​+​, que está correlacionado com os episódios de congelamento (marcado com a letra f na borda inferior). (C, D, G e H) Autocorrelação da atividade de neurônios registrados nas duas áreas. Adaptado de ​(SEIDENBECHER et al., 2003) 17 https://paperpile.com/c/PbugT0/hn7k A relação entre as atividades em baixa e alta frequência sugere a existência de uma comunicação de áreas remotas direcionando a atividade de circuitos locais. No caso descrito acima, diferentes fases do ciclo da onda teta funcionam como janelas de oportunidade para o aumento da probabilidade de disparos de alta frequência dos circuitos locais, com as oscilações gama de baixa frequência e alta frequência ocorrendo em diferentes pontos (STUJENSKE et al., 2014) (FIGURA 7C). Esse é um mecanismo de acoplamento fase-fase entre diferentes frequências (FIGURA 7D), uma vez que a maior ou menor probabilidade de disparo da onda gama é função do ângulo da fase em teta, ou seja, de sua posição no ciclo (FELL; AXMACHER, 2011) (FIGURA 7D). Em ambientes seguros e também durante o processo de extinção, em que o mPFC dirige o circuito local na BLA, existe não apenas uma sincronização de fase entre os circuitos como também um aumento da energia do circuito local ​(STUJENSKE et al., 2014)​, evidenciando um mecanismo de acoplamento fase-amplitude entre essas diferentes faixas de frequência ​(FELL; AXMACHER, 2011) (FIGURA 7D). Embora os neurônios glutamatérgicos da BLA apresentem flutuações de potencial de membrana na faixa de frequência de teta, como visto, os mecanismos oscilatórios dessa região são fortemente modulados por sua atividade inibitória intrínseca. São várias as classe de interneurônios GABAérgicos presente na BLA, mas os mais numeroso são os positivos para a proteína ligante de cálcio parvalbumina (PV ​+​), que fazem sinapses perissomáticas e dendríticas proximais diretamente com os neurônios principais que projetam para a CeM (DUVARCI; PARE, 2014)​. A ativação das células PV ​+​, portanto, seria capaz de impedir a expressão de comportamento de medo, o que de fato acontece ​(HELMSTETTER; BELLGOWAN, 1994)​. Além dos neurônios glutamatérgicos, as células PV ​+ também fazem contato com interneurônios positivos para somatostatina (SOM ​+​), que por sua vez têm sinapses dendríticas com as células excitatórias ​(WOLFF et al., 2014)​. Esse arranjo permite um controle fino da janela temporal de integração entre CS e US. A chegada do estímulo CS ativa neurônios PV ​+​, que por sua vez inibem os SOM ​+​, desinibindo a atividade dendrítica e aumentando a resposta auditiva evocada. A chegada das projeções do US, no entanto, inibe ambos, aumentando ainda mais a resposta no soma das células piramidais ​(WOLFF et al., 2014)​. O perfil de disparos em alta frequência dos interneurônios PV ​+ e a morfologia perissomática de suas sinapses com os neurônios glutamatérgicos as torna candidatas 18 https://paperpile.com/c/PbugT0/EzJg https://paperpile.com/c/PbugT0/TCdD https://paperpile.com/c/PbugT0/EzJg https://paperpile.com/c/PbugT0/TCdD https://paperpile.com/c/PbugT0/egZZr https://paperpile.com/c/PbugT0/5Ag5t https://paperpile.com/c/PbugT0/5Ag5t https://paperpile.com/c/PbugT0/JndYA https://paperpile.com/c/PbugT0/JndYA https://paperpile.com/c/PbugT0/JndYA potenciais a geradoras de ritmos gama. No entanto, sua participação mais evidente foi descrita na regulação de duas faixas de oscilações em teta que competem entre si pelo direcionamento do circuito em processos de extinção (6-12 Hz) ou aquisição (3-6 Hz) da memória de medo (DAVIS et al., 2017) ​. Figura 7 - Mecanismos de acoplamento entre oscilações de diferentes frequências. (A) Exemplos de fase relativa entre dois sinais com e sem acoplamento. (B) Comunicação neural entre duas regiões por disparos sincronizados pelas fases da onda lenta. (C) Sincronização e plasticidade entre duas regiões através de disparos no pico da onda teta. (D) Exemplos de acoplamento entre diferentes frequências. Adaptado de ​(FELL; AXMACHER, 2011) ​. 19 https://paperpile.com/c/PbugT0/mcOj https://paperpile.com/c/PbugT0/TCdD Uma terceira classe de interneurônios, positivos para colecistoquinina (CCK​+​), também atua sobre neurônios principais que contribuem para a extinção do comportamento de medo. O efeito de sua ativação portanto é pró-comportamento de defesa, evidenciando uma orquestração pouco linear da participação de interneurônios gabaérgicos na geração de mecanismos, oscilatórios ou não, de memória associativa na BLA. Essa regulação não se limita à BLA, mas ganha contornos ainda mais sofisticados na CeA, onde os neurônios GABAérgicos são prevalentes. Um exemplo bastante ilustrativo desses mecanismos são as células ON e OFF presentes na CeL e seu papel na expressão do comportamento de medo (CIOCCHI et al., 2010)​. Elas se diferenciam em termos de marcadores genéticos, já que apenas as células CeL​OFF expressam a proteína quinase C delta (PKCδ), e padrão de ativação eletrofisiológica, uma vez que as células CeL​ON têm menor latência de resposta à apresentação do estímulo condicionado. Por sua posição no circuito, seu padrão de ativação também é oposto. A informação do CS vinda da BLA projeta diretamente sobre as CeL​ON ativando-os, mas de maneira indireta sobre as CeL​OFF através da modulação pelas células intercalares, causando um efeito final inibitório. Como os dois grupo de células se modulam reciprocamente, a menor latência das CeL​ON faz com que inibam as CeL​OFF​, inibindo sua projeção para CeM, que por sua vez projeta livremente para a PAG ​(CIOCCHI et al., 2010; JANAK; TYE, 2015) ​. Figura 8 - Circuitos funcionais do condicionamento ao medo no Complexo Amigdalóide. (A) Circuito funcional ativado durante evocação da memória condicionada. (B) Circuito funcional ativado durante extinção da memória condicionada. Neurônios excitatórios em vermelho e inibitórios em azul. Adaptado de ​(DUVARCI; PARE, 2014) ​. 20 https://paperpile.com/c/PbugT0/RsczV https://paperpile.com/c/PbugT0/RsczV+BqT0X https://paperpile.com/c/PbugT0/RsczV+BqT0X https://paperpile.com/c/PbugT0/egZZr 1.5 Modulação Top-down “O senhor vê: existe cachoeira; e pois? Mas cachoeira é barranco de chão, e água caindo por ele, retombando; o senhor consome essa água, ou desfaz o barranco, sobra cachoeira alguma?” (Riobaldo Tatarana) Os mecanismos envolvidos nos processos de memória associativa, tanto na sua aquisição como evocação, como visto na seção anterior, dependem da atividade integrada de diferentes estruturas cerebrais. Em várias delas, a evocação da relação entre CS e US depende tanto atividade induzida pelo estímulo de entrada quanto da reverberação de circuitos previamente envolvidos na consolidação da memória. O sucesso do aprendizado via condicionamento clássico depende, portanto, de dois fluxos de ativação neural: aquela que é diretamente evocada pelo estímulo e a que resulta da reverberação de redes neuronais internas de armazenamento de padrões associativos semelhantes ​(BUZSAKI, 2006; ENGEL; FRIES; SINGER, 2001; GILBERT; SIGMAN, 2007; VARELA et al., 2001)​. De acordo com essa ideia, um mesmo estímulo sensorial, invariante em suas características físicas, pode induzir padrões de ativação neuronal bastante diferentes de acordo com a valência emocional associada, gerando estados internos transitórios que favorecem a execução de respostas comportamentais específicas. Esse modelo se aproxima bastante do conceito de “assembléias celulares”, que são redes difusas de neurônios recrutados em diferentes estruturas cerebrais, capazes de agir transitoriamente como um circuito fechado, gerando facilitação a outros sistemas ​(HEBB, 1949)​. A regulação dos mecanismos de aquisição de memória entre BLA e mPFC ​(KARALIS et al., 2016; STUJENSKE et al., 2014) e BLA e HIPO ​(LESTING et al., 2013) e de extinção entre BLA e mPFC ​(DAVIS et al., 2017; LESTING et al., 2013)​ são exemplos desses circuitos transitoriamente ativados. A visão clássica da neurociência, até há alguns anos atrás, no entanto, descrevia a organização das vias sensoriais primárias não como circuitos fechados, mas de acordo com uma hierarquia linear em que a informação segue um fluxo direcional ascendente, através de 21 https://paperpile.com/c/PbugT0/e8L9c+9F7Nc+A0RQT+CmDMd https://paperpile.com/c/PbugT0/e8L9c+9F7Nc+A0RQT+CmDMd https://paperpile.com/c/PbugT0/y1lyH https://paperpile.com/c/PbugT0/0Ma0+EzJg https://paperpile.com/c/PbugT0/rlnug https://paperpile.com/c/PbugT0/rlnug+mcOj https://paperpile.com/c/PbugT0/rlnug+mcOj projeções de alimentação direta, até que os padrões de representação do estímulo sejam projetados no córtex daquela modalidade sensorial ​(GILBERT; SIGMAN, 2007)​. De acordo com esse modelo, o cérebro seria um órgão passivo à espera de uma estimulação externa e só faria sentido pensar em padrões diversos de respostas evocadas por um estímulo invariante se elas fossem medidas em estados cerebrais distintos, como nos diferentes estágios do sono, durante a vigília ou sob anestesia. Nesses casos, a atividade neuronal é altamente influenciada pelos estados internos do sistema e essencialmente independente da experiência prévia do organismo ​(BUZSAKI, 2006; FONTANINI; KATZ, 2008; GILBERT; SIGMAN, 2007)​. Um forte conjunto de evidências, no entanto, vem revendo esse modelo e mostrando a fundamental importância de projeções descendentes retroalimentadas na modulação ativa das vias sensoriais primárias ​(GILBERT; SIGMAN, 2007)​. De acordo com essa concepção, as vias ascendentes (​bottom-up​) e descendentes (​top-down​) se modulam reciprocamente, de maneira ativa e contínua, e a representação do estímulo seria o padrão de ativação resultante dessa interação em diferentes áreas do encéfalo ​(BUZSAKI, 2006; GROSSBERG, 1980; VARELA et al., 2001)​. O viés anatômico de uma “impressão” cortical do estímulo daria lugar, assim, a um padrão dinâmico de conexões entre circuitos ​(VARELA et al., 2001)​, ao longo de uma atividade reverberatória contínua, em que o aspecto temporal passaria a ter um papel tão crucial quanto o anatômico ​(BUZSAKI, 2006)​. De acordo com essa perspectiva, a percepção seria um processo ativo e altamente seletivo, constantemente dependente da modulação mútua entre estados internos do organismo e a atividade evocada por estímulos externos. A vantagem adaptativa desse modelo é a possibilidade de gerar expectativas e predições probabilísticas acerca de eventos sensoriais iminentes em função das memórias de experiências pregressas ​(BAR, 2009; ENGEL; FRIES; SINGER, 2001; KVERAGA; GHUMAN; BAR, 2007)​, conforme ocorre nos processos de aprendizado associativo, incluindo o condicionamento clássico ao medo ​(PARÉ; COLLINS, 2000) ​. Grande parte do esforço recente para entender os fundamentos dessa natureza construtiva da percepção tem sido colocada nos circuitos dinâmicos formados pela modulação recíproca entre áreas corticais e o tálamo ​(BARCZAK et al., 2018; SIROTA et al., 2008) e, como visto anteriormente, entre essas áreas e estruturas límbicas ​(DAVIS et al., 2017; KARALIS et al., 2016; LESTING et al., 2013; LIKHTIK et al., 2014; STUJENSKE et al., 2014; VIDAL-GONZALEZ et al., 2006)​. Embora a amígdala apresente essas projeções 22 https://paperpile.com/c/PbugT0/CmDMd https://paperpile.com/c/PbugT0/9F7Nc+y6zDN+CmDMd https://paperpile.com/c/PbugT0/CmDMd https://paperpile.com/c/PbugT0/U4kYI+e8L9c+9F7Nc https://paperpile.com/c/PbugT0/U4kYI+e8L9c+9F7Nc https://paperpile.com/c/PbugT0/e8L9c https://paperpile.com/c/PbugT0/9F7Nc https://paperpile.com/c/PbugT0/uwWZL+TSrIv+A0RQT https://paperpile.com/c/PbugT0/uwWZL+TSrIv+A0RQT https://paperpile.com/c/PbugT0/UAgr https://paperpile.com/c/PbugT0/uCBYT+kwKUg https://paperpile.com/c/PbugT0/0Ma0+EzJg+kwAS+rlnug+mcOj+bGQVh https://paperpile.com/c/PbugT0/0Ma0+EzJg+kwAS+rlnug+mcOj+bGQVh https://paperpile.com/c/PbugT0/0Ma0+EzJg+kwAS+rlnug+mcOj+bGQVh recíprocas funcionais com o córtex e outras, com áreas límbicas, que influenciam o processo de condicionamento ao medo ​(SEIDENBECHER et al., 2003)​, do ponto de vista adaptativo faz sentido imaginar essa estrutura como uma fonte de modulação em si, capaz de facilitar a entrada e processamento de informações sensoriais emocionalmente relevantes e de formar circuitos de resposta rápida com áreas talâmicas ou ainda mais caudais, no tronco encefálico, como visto no aumento da taxa de disparos evocados por um estímulo condicionado a partir de projeções talâmicas do núcleo geniculado medial ​(QUIRK; REPA; LEDOUX, 1995) ​. 23 https://paperpile.com/c/PbugT0/hn7k https://paperpile.com/c/PbugT0/WnFVj 2008)​. Alguns deles recebem projeções eferentes massivas de áreas de processamento de mais alta ordem de complexidade, como córtices sensoriais primários e associativos ​(BAJO; KING, 2012; WINER et al., 2002)​, o que permite supor que a via auditiva está sujeita a modulação dependente de experiência por vias retroalimentadas desde seus primeiros estágios, ainda no tronco encefálico. Neurônios do CI participam da detecção de novidades através da modulação de sua frequência de disparo pela probabilidade de ocorrência de diferentes estímulos auditivos em experimentos baseados no paradigma ​oddball ​(MALMIERCA et al., 2009; PÉREZ-GONZÁLEZ; MALMIERCA; COVEY, 2005)​. Experimentos de condicionamento clássico revelaram que tanto o padrão de respostas evocadas ​(BIRT; NIENHUIS; OLDS, 1979; DISTERHOFT; STUART, 1977; JI; SUGA, 2009; MARK; HALL, 1967) quanto a própria organização tonotópica do CI ​(GONZALEZ-LIMA; AGUDO, 1990) podem ser alteradas em função da valência do estímulo não-condicionado (apetitivo ou aversivo). Parâmetros de resposta eletrofisiológica, como a taxa e a latência de disparo de neurônios do CI, estão correlacionados ao desempenho comportamental resultante do condicionamento, muito embora em uma tarefa de condicionamento operante auditivo em primatas ​(METZGER et al., 2006)​. As alterações intrínsecas ao CI descritas acima seguem em alimentação direta até o NGM e posteriormente à LA, sítio de associação e potenciação do estímulo auditivo condicionado, que por sua vez projeta para a BA, de onde partem eferências diretas para o CI (MARSH et al., 2002)​, algo aparentemente incomum em se tratando de projeções amigdalares para estruturas sensoriais de tronco encefálico. Teríamos, assim, um circuito fechado e eventualmente funcional durante processos de condicionamento clássico. De fato, a inativação da BLA é capaz de promover alterações no padrão de respostas evocadas no CI ​(NOBRE, 2013; NOBRE; BRANDÃO, 2011) e o CI está envolvido no processamento de sons aversivos em tarefas de condicionamento clássico ao medo ​(LEDOUX; SAKAGUCHI; REIS, 1984; NOBRE; CABRAL; BRANDÃO, 2010)​, indicando uma forte conectividade funcional entre essas duas estruturas nesse tipo de paradigma. De fato, em diferentes espécies de mamíferos o CI é alvo de várias projeções descendentes originárias de estruturas superiores da via auditiva, como o córtex auditivo 25 https://paperpile.com/c/PbugT0/CHJ7w https://paperpile.com/c/PbugT0/17S4G+xOx0p https://paperpile.com/c/PbugT0/17S4G+xOx0p https://paperpile.com/c/PbugT0/NKGX7+jjZuu https://paperpile.com/c/PbugT0/NKGX7+jjZuu https://paperpile.com/c/PbugT0/oNBav+sexKd+zPJmT+Hl8TG https://paperpile.com/c/PbugT0/oNBav+sexKd+zPJmT+Hl8TG https://paperpile.com/c/PbugT0/9VQ39 https://paperpile.com/c/PbugT0/8Ai41 https://paperpile.com/c/PbugT0/8Ai41 https://paperpile.com/c/PbugT0/y0fam https://paperpile.com/c/PbugT0/H5ju5+Bm2ST https://paperpile.com/c/PbugT0/H5ju5+Bm2ST https://paperpile.com/c/PbugT0/YkOnE+RGuce https://paperpile.com/c/PbugT0/YkOnE+RGuce (Adams, 1980; Bajo & King, 2012; Diamond, Jones, & Powell, 1969; Faye-Lund, 1985; FitzPatrick & Imig, 1978), em especial células piramidais da camada V do córtex auditivo primário (A1), e outras áreas do lobo temporal (Beyerl, 1978; Coleman & Clerici, 1987), além de estruturas auditivas subcorticais, como o núcleo geniculado medial (Kuwabara & Zook, 2000; Senatorov & Hu, 2002). Estruturas não-auditivas também projetam ao CI, como o córtex visual (Cooper & Young, 1976), o colículo superior (Doubell, Baron, Skaliora, & King, 2000; Harting, 1977) e áreas límbicas, em especial a amídala basal (BA), conforme observado em morcegos (Marsh, Fuzessery, Grose, & Wenstrup, 2002). Essa última projeção mostra um vínculo particularmente interessante, pois o complexo basolateral da amídala está classicamente envolvido em tarefas de condicionamento ao medo [refs revisão] e a lesão do CI, bem como do NGM, impedem a associação de um estímulo auditivo em uma tarefa desse tipo (LeDoux, Sakaguchi, & Reis, 1984). 26 1.7 Respostas Evocadas em Regime Permanente “Atrás de nós, eu ouvia os passos postos da grande cavalaria, o regular, esse empurro continuado.” (Riobaldo Tatarana) Grande parte dos estímulos acústicos utilizados em tarefas de condicionamento clássico ao medo foi composta por cliques sonoros de curtíssima duração. Os potenciais evocados por esses estímulos são igualmente transitórios e em geral dependentes apenas da via de entrada. Processos plásticos, ainda assim, podem ser analisados a partir de alterações de parâmetros eletrofisiológicos como latência de resposta e amplitude em função do condicionamento. No entanto, essas informações nos permitem conhecer apenas os estágios inicial e final do sistema, mas não os processos que intermediários. Outra desvantagem desse tipo de resposta para o estudo da dinâmica de associação entre áreas diferentes é que elas são muito curtas para sobrepor temporalmente a atividade de dois circuitos. Uma forma de contornar essa limitação seria a apresentação de uma sequência desses estímulos, mas ainda assim a taxa de apresentação, por maior que fosse, não evitaria que a resposta evocada por um estímulo terminasse antes da apresentação do próximo (BIACABE et al., 2001; SHAW, 1992)​. A escala temporal de alterações neuronais pode ser da ordem de dezenas de milissegundos e o impacto sobre a conectividade dos circuitos pode estar na mesma escala temporal ​(BUZSAKI, 2006; VARELA et al., 2001)​. Portanto, é possível que a segunda apresentação de um estímulo durante uma tarefa já encontre um circuito significativamente alterado pelo primeiro. A utilização de tons puros de longa duração poderia contornar essa limitação, já que têm duração suficiente para sobrepor temporalmente a informação ascendente de alimentação direta e a descendente retroalimentada por estruturas mais rostrais ​(LESTING et al., 2013)​. Essa sobreposição, no entanto, se dá de forma que a contribuição de cada via para o padrão de atividade resultante é praticamente indistinguível, do ponto de vista espectral, da atividade intrínseca dos circuitos analisados. 27 https://paperpile.com/c/PbugT0/tbFC+eCy3 https://paperpile.com/c/PbugT0/9F7Nc+e8L9c https://paperpile.com/c/PbugT0/rlnug Para avaliar a contribuição da atividade sensorial aos mecanismos de memória associativa, seria interessante que os estímulos tivessem um componente oscilatório embutido que pudesse ser comparado em termos de sincronia e acoplamento com os ritmos endógenas de estruturas como a amígdala basolateral. Estímulos estacionários contínuos vêm sendo utilizados para gerar potenciais oscilatórios sustentados de longa duração, abrindo um campo de pesquisa de enorme potencial para a integração de circuitos com atividade reverberatória no cérebro. As primeiras respostas desse tipo foram observadas na via auditiva ​(GALAMBOS; MAKEIG; TALMACHOFF, 1981)​. Nessa modalidade, que vem liderando as pesquisas com a técnica desde então ​(PICTON et al., 2003)​, os estímulos correspondem geralmente a um tom puro modulado em amplitude por um envelope senoidal de frequência conhecida. A natureza das respostas gerou alguma controvérsia por serem consideradas explicáveis como a somação linear de respostas transitórias e não por arrasto oscilatório ​(ZHANG et al., 2013)​. No entanto, existem diferenças nos dois tipos de respostas, sobretudo pelo fato de que potenciais transitórios correlacionam aos seus estímulos geradores essencialmente através de da amplitude do sinal, ao passo que as respostas evocadas em regime permanente (REARPs) o fazem por sincronia de fase ​(ZHANG et al., 2013)​, o que representa um grande trunfo no estudo de interações entre atividade evocada e redes oscilatórias intrínsecas. A contribuição das REARPs para esse tipo de estudo reside no fato de que seu componente oscilatório, induzido pelo envelope de modulação do sinal, é capaz de arrastar (​entrain​) a atividade de populações neuronais recrutadas pelo estímulo tanto nas vias sensoriais quanto potencialmente em estruturas associativas capazes de gerar potenciais evocados auditivas, como a LA (FIGURA 9). Esse arrasto gera um componente de frequência na faixa de modulação do sinal de entrada que funciona como uma assinatura eletrográfica facilmente rastreável por análise espectral do sinal no domínio da frequência e por isso as REARPs têm sido utilizadas no monitoramento de vias recrutadas por estímulos específicos (BROWN; NORCIA, 1997; FUJIKI; JOUSMÄKI; HARI, 2002; WEISZ et al., 2007) ​. Além disso, as REARPs oferecem uma escala temporal que permite observar a sobreposição contínua entre dois fluxos de informação: o sinal invariante de entrada e sua modulação pelo fluxo descendente de retroalimentação do sistema ​(GALAMBOS; MAKEIG; 28 https://paperpile.com/c/PbugT0/qsCh6 https://paperpile.com/c/PbugT0/qsCh6 https://paperpile.com/c/PbugT0/4BMUP https://paperpile.com/c/PbugT0/RYKmq https://paperpile.com/c/PbugT0/RYKmq https://paperpile.com/c/PbugT0/lPN5T+0HT67+YROB3 https://paperpile.com/c/PbugT0/qsCh6+4BMUP TALMACHOFF, 1981; PICTON et al., 2003)​. Neste cenário, a coerência entre o potencial das REARPs e o envelope de modulação da amplitude do estímulo refletiria a variabilidade temporal desse estímulo ​(KALITZIN et al., 2002) como um correlato de comunicação entre áreas. A energia dos potenciais evocados, por sua vez, seria um reflexo da excitabilidade de neurônios alvo a partir de aferências pré-sinápticas ​(PASTOR et al., 2002)​. Por fim, a fase do de acoplamento entre estímulo e resposta retroalimentada indicaria o atraso da resposta em relação ao estímulo ​(KUWADA et al., 2002)​, de forma similar à latência dos potenciais evocados transitórios. Alguns desses parâmetros, como energia e fase, são alterados por tarefas de aprendizado auditivo em humanos ​(BOSNYAK; EATON; ROBERTS, 2004; GANDER; BOSNYAK; ROBERTS, 2010; ROBERTS; BOSNYAK; THOMPSON, 2012)​, sugerindo que outros paradigmas de aprendizado associativo, como o CACM, também podem influenciá-los. As REARPs podem assim potencialmente complementar os achados obtidos até hoje com potenciais evocados transitórios ​(ZHANG et al., 2013)​, oferecendo um novo horizonte de análises de processamento de memórias associativas. 29 https://paperpile.com/c/PbugT0/qsCh6+4BMUP https://paperpile.com/c/PbugT0/5l6S https://paperpile.com/c/PbugT0/9sfy https://paperpile.com/c/PbugT0/avHa https://paperpile.com/c/PbugT0/IWnd+D2Si+s5h5 https://paperpile.com/c/PbugT0/IWnd+D2Si+s5h5 https://paperpile.com/c/PbugT0/RYKmq Figura 10 - Potenciais evocados auditivos transitório e em regime permanente. (A) Potencial auditivo transitório registrado no Colículo Inferior. (B) Trecho de envelope da moduladora em 53,71 Hz. (C) Trecho correspondente ao início da apresentação do estímulo em que o envelope de modulação começa a arrastar a atividade em curso no Colículo Inferior. Cabeça de seta: deflexão negativa característica do potencial evocado transitório observado no início da aplicação do estímulo estacionário. 30 1.8 Estudo das Respostas Evocadas em Regime Permanente no Colículo Inferior no Condicionamento Auditivo Clássico ao Medo “Zé Bebelo carecia de rédeas de um outro diverso poder e forte sentir, que tomasse conta, désse rumo a ele” (Riobaldo Tatarana) Para avaliar essa hipótese e a viabilidade das REARPs como ferramenta de investigação da interação entre a memória associativa e o processamento sensorial, nosso grupo submeteu um grupo de 10 ratos Wistar com eletrodos implantados no CI para registro de potenciais de campo local (LFP) a um protocolo de condicionamento ao medo. O grupo experimental (n=5) recebeu 5 pareamentos entre estímulos condicionados (CS) auditivos e choques nas patas (400 µA, 2s) enquanto o grupo controle (n=5) recebeu o mesmo número de estímulos mas sem o pareamento temporal. Os estímulos auditivos foram compostos por tons puros de 10 kHz modulados em amplitude a uma freqüência de 53,71 Hz, com 85 dB de intensidade e 30 s de duração. Foram avaliadas as respostas no CI e o comportamento defensivo de congelamento dos animais em sessões 24 hs antes (pré-condicionamento) e 24 hs após (teste) o condicionamento. Os resultados mostraram que o aumento do comportamento de congelamento por parte dos animais re-expostos ao CS​+ foi acompanhado de um aumento tanto do acoplamento da fase relativa ao estímulo de entrada quanto da amplitude das REARPs, sugerindo um processo de sincronização neural induzido pelo processo de condicionamento ​(LOCKMANN; MOURÃO; MORAES, 2017) ​. Esse trabalho confirma a alteração dos parâmetros de fase e amplitude das REARPs após uma tarefa de CACM. Esta evidência, em conjunto com as outras apresentadas anteriormente, sugere que a amígdala -- especificamente a BLA -- pode desempenhar um papel fundamental na modulação dessas respostas no CI, de modo que a inibição dessa estrutura prejudique o arrasto do envelope de modulação do CS relacionado ao CACM no CI. 31 https://paperpile.com/c/PbugT0/1E5YE 1.9 Hipótese do trabalho “Eu quase que nada não sei. Mas desconfio de muita coisa.” (Riobaldo Tatarana) No presente trabalho, portanto, levantamos a hipótese de que o aumento da sincronia da fase relativa e da amplitude das REARPs pelo CS são dependentes da atividade modulatória da BLA e que a inibição desta estrutura atenuará esses efeitos. 32 2. JUSTIFICATIVA A memória associativa é um processo cognitivo fundamental que está na base de nossa capacidade de interagir adequadamente com o ambiente. Ao longo das últimas décadas tivemos um formidável avanço no entendimento dos processos neurofisiológicos subjacentes a esse processo e seu papel no comportamento, mas ainda estamos apenas começando a compreender seu impacto na regulação da própria experiência sensorial e subjetiva do mundo. A ideia da percepção como um processo ativo é relativamente recente dentro das neurociências. Entender a dinâmica de interação de redes entre processos mnemônicos e sensoriais passa a ser crucial para a compreensão do próprio funcionamento do cérebro e de sua regulação sobre o comportamento. Os processos de memória, pelo menos de um ponto de vista adaptativo, talvez tenham mais a ver com uma antecipação probabilística do futuro imediato do que com uma lembrança do passado remoto. Entre essas duas frentes de processamento do fluxo de informação neural, o mnemônico e o sensorial, existe um componente modulatório que chamamos de emoções que se torna indispensável ao processo na medida em que possui a capacidade de atribuir valência aos estímulos, ou seja, definir se com eles devemos criar vínculos ou nos afastar. Compreender os mecanismos básicos de integração sensório-motora emocionalmente modulados pode ajudar a lançar luz não apenas sobre a própria fisiologia do próprio comportamento mas também sobre seus aspectos clínicos e potencial impacto sobre distúrbios cognitivos e/ou emocionais. A relevância deste trabalho está na consolidação e ampliação do uso de respostas evocadas em regime permanente como uma ferramenta que entendemos ser adequada a este tipo de análise prospectiva da dinâmica de integração e conectividade de circuitos neuronais na formação de memórias e na regulação do comportamento. Uma vez estabelecida, uma ampla linha de investigação se abre adiante. 33 3. OBJETIVOS O objetivo deste trabalho é investigar a participação do núcleo basolateral da amígdala na dinâmica de alterações dos parâmetros de fase e amplitude das respostas evocadas em regime permanente no colículo inferior durante uma tarefa de condicionamento clássico ao medo e avaliar a interação entre as vias sensoriais ascendentes e associativas descendentes na modulação dessas alterações. 3.1 Objetivos específicos 1. Confirmar as alterações na fase e na amplitude das REARPs medidas no CI em decorrência de aprendizado associativo; 2. Analisar a dinâmica temporal dessas alterações sob efeito da inibição da BLA para verificar sua participação na geração desses fenômenos; 3. Confirmar a geração de oscilações na banda teta na BLA decorrentes do processo de condicionamento clássico ao medo; 4. Investigar a existência de mecanismos de acoplamento entre a banda teta na BLA e o envelope da moduladora das REARPs no CI como forma de modulação ​top-down do processamento sensorial e formação de memórias associativas. 34 4. MATERIAIS E MÉTODOS “O diabo na rua, no meio do redemunho...” (Riobaldo Tatarana) 4.1 Diretrizes éticas Todos os procedimentos foram avaliados e aprovados pelo Comitê de Experimentação e Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Minas Gerais, sob o protocolo nº 360/2015. Os experimentadores se mantiveram atentos ao maior cuidado possível no manejo dos animais durante os experimentos e buscaram sempre e por todos os meios disponíveis evitar submetê-los a dor ou sofrimento. Além disso, o desenho experimental foi feito de forma a utilizar o menor número possível de animais. As diretrizes do CEUA-UFMG estão de acordo com as recomendações da Sociedade Brasileira de Neurociências e da ​Behavior Guidelines for Animal Experimentation​ para o cuidado e uso de animais em pesquisa. 4.2 Animais experimentais Os experimentos foram realizados com 14 ratos Wistar machos, com peso entre 290 - 320 g, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Minas Gerais (CEBIO2) e mantidos em ambiente controlado, com ciclos de 12 por 12 horas de claro e escuro, acesso livre a ração e água e à temperatura de 22 ± 2 ° C. 4.3 Cirurgia de implante de eletrodos e cânulas Os animais foram anestesiados com uma solução de ketamina (80 mg / Kg) e xilazina (15 mg / Kg) por via intraperitoneal (i.p.). Após a confirmação do efeito pela ausência de reflexos de dor, a superfície da cabeça foi tricotomizada e os animais foram posicionados em aparelho estereotáxico (Stoelting, Wood Dale, IL). Os reflexos da dor foram monitorados durante a cirurgia e doses suplementares de ketamina (20 mg/kg) foram administradas sempre 35 que necessário. Após assepsia com solução de povidona-iodo (7,5%, tópica) e anestesia local com cloridrato de lidocaína + epinefrina [1% (p/vol), 7 mg/kg], foi feita uma incisão no couro cabeludo para expor o crânio. Eletrodos monopolares para registro eletrofisiológico foram feitos de fios de aço inoxidável revestidos de teflon (0,005 pol., Modelo 791400, AM Systems Inc., Carlsborg, WA, Estados Unidos). Dois deles foram passados ​​e fixados através de um tubo de sílica (0,008 pol. DI x 0,014 pol. DE), para fornecer estabilidade mecânica (FIGURA 11A). Os eletrodos foram defasados de 0,5 mm no sentido DV. Os eletrodos foram posicionados nas coordenadas mediolaterais do CI esquerdo (AP: 9,0 mm, ML: -1,4 mm) ​(PAXINOS; WATSON, 2006) e descido lentamente, através de um orifício previamente perfurado no crânio por craniotomia buscando como alvo (DV: -4,0 mm) a porção do núcleo central do IC que apresenta as melhores respostas a sons de alta frequência, incluindo a frequência portadora escolhida do estímulo condicionado (10 kHz) ​(CLOPTON; WINFIELD, 1973; HUANG; FEX, 1986; MALMIERCA et al., 2008)​. O arranjo foi descido até que a ponta do eletrodo mais dorsal atingisse -3,5 mm e a partir daí era avançado de 0,5 em 0,5 mm e a cada parada o potencial transitório evocado por palmas era monitorado para buscar a melhor relação sinal-ruído. Para as injeções de muscimol e salina e registro da atividade da BLA, foram construídos arranjos de cânulas-guia (22 G, 13 mm) por dentro das quais foram passados fios iguais aos dos eletrodos para o CI. Pelo lado externo, o fio foi dobrado e fixado à cânula por uma luva de silicone (FIGURA 11A). Na outra extremidade, a ponta de registro do eletrodos extrapolou em 1 mm a da cânula. Os arranjos foram inseridas bilateralmente por orifícios previamente perfurados no crânio por craniotomia nas coordenadas da BLA (AP: 2,8 mm, ML: 5,0 e -5,0 mm) e descidos lentamente até a coordenada dorsoventral (DV: 8,4 mm). Os arranjos de eletrodos e cânulas foram fixados ao crânio com cimento de zinco (FIGURA 11B). Parafusos de aço inoxidável foram implantados nos ossos nasais como eletrodos de referência (0 V) e terra com fios de aço inoxidável soldados a eles. Os fios dos eletrodos e parafusos foram soldados às vias de um terminal RJ-12 de 6 vias (FIGURA 11C). Um terceiro parafuso foi fixado no osso parietal direito para auxiliar na estabilidade do capacete de 36 https://paperpile.com/c/PbugT0/GMk1y https://paperpile.com/c/PbugT0/GMk1y https://paperpile.com/c/PbugT0/gwTVi+vX4aG+Fiksu https://paperpile.com/c/PbugT0/gwTVi+vX4aG+Fiksu acrílico dental, que foi aplicado sobre o crânio para fixar todo o conjunto (FIGURA 11B, direita). Figura 11 - Cirurgia de implante de eletrodos e ​setup ​de registros eletrofisiológicos (A) Esquema do arranjo cânula-eletros para microinjeção e registros na BLA (direita) e de eletrodos para registro no CI (esquerda). (B) Animal experimental com cânulas e eletrodos implantados durante a cirurgia (esquerda) e após, com o capacete já pronto (direita). © Esquema dos pontos de implante e fixação de parafusos sobre um crânio de rato, soldas no terminal RJ-12, conexão com RJ-12 fêmea acoplado ao ​headstage e conectados ao amplificador de sinais bioelétricos. (D) Esquema de animal na caixa de comportamento sendo registrado com sinal eletrofisiológico apresentando arrasto por uma REARP. 37 Após a cirurgia, os animais foram tratados profilaticamente com coquetel antibiótico de amplo espectro (Pentabiótico® Zoetis Fort Dodge; 19 mg / kg im) e anti-inflamatório (Banamine®, 2,5 mg / kg sc) e foram mantidos em recuperação por um período de sete dias. 4.4 Histologia Depois de cumprido todo o protocolo experimental, os animais foram anestesiados (uretana 14% p/v; 10 mL/kg) e uma corrente elétrica (2mA durante 2 segundos) foi aplicada em cada eletrodo de registro para gerar uma pequena lesão eletrolítica no entorno de suas pontas para facilitar a localização nas lâminas histológicas. Em seguida, os animais foram submetidos à perfusão transcardíaca com solução salina tamponada de fosfato (PBS) seguida de paraformaldeído em PBS (PFA, 4% p/v). Os cérebros foram removidos, pós-fixados em PFA, transferidos para uma solução de sacarose-PBS (30% p/v) e mantidos a 4° C. As seções coronais e parassagitais (50 µm) foram feitas em criostato (Leica Biosystems) e as fatias do cérebro foram coradas com uma solução de vermelho neutro. As posições de colocação dos eletrodos e cânulas foram verificados por fotomicrografias das fatias histológicas (aumento de 0,8x). 4.5 Condicionamento Auditivo Clássico ao Medo (CACM) O CS consistiu de um tom puro de 10 kHz, com duração de 30 s, modulado em amplitude por uma onda senoidal de 53,71 Hz (100% de profundidade de modulação) (LOCKMANN; MOURÃO; MORAES, 2017; PINTO et al., 2017, 2019) e ajustado a 85 dB SPL no centro superior da caixa (decibelímetro Brüel & Kjaer tipo 2238) ​(MALMIERCA et al., 2008; MEEREN et al., 2001)​. O CS foi gerado por uma caixa de condicionamento personalizada ​(AMARAL-JÚNIOR and MOURÃO et al., 2019)​, amplificado por um aparelho comercial (AB100, 100 WRMS, 4 Ω, NCA) e reproduzido por um alto-falante (ST304, 40 WRMS, 8 Ω, Selenium Super Tweeter) posicionado no topo da caixa. 38 https://paperpile.com/c/PbugT0/1E5YE+ylMiS+5J14D https://paperpile.com/c/PbugT0/vX4aG+l6AFw https://paperpile.com/c/PbugT0/vX4aG+l6AFw https://paperpile.com/c/PbugT0/9QH3H 4.5.1 Parte I: Estímulo Condicionado (CS) O CACM foi realizada com 10 animais em três dias consecutivos em dois contextos diferentes para evitar uma possível contaminação por condicionamento contextual. No primeiro dia (pré-condicionamento), os animais foram expostos a uma sequência de 5 apresentações do CS (intervalos pseudo-aleatórios não superiores a 120 s) no contexto A, que consistia em uma caixa de acrílico preto de 30 x 20 x 25 cm, com uma face transparente e odorizado com uma solução de álcool a 10% (FIGURA 12). Figura 12 - Protocolo experimental de condicionamento clássico ao medo associado do tratamento com muscimol e salina. No segundo dia (condicionamento), os animais foram expostos à mesma sequência de 5 estímulos de CS do primeiro dia, mas no contexto B, uma caixa de acrílico transparente de 23 x 23 x 23 cm, odorizada com uma solução de ácido acético a 1%. Durante a sessão de condicionamento, cada apresentação do CS foi pareada com o estímulo não condicionado (US), que consistia em uma corrente de 0,4 mA aplicada através de barras de metal no chão da caixa durante os últimos 2 s de apresentação do CS ​(LOCKMANN; MOURÃO; MORAES, 2017) ​ (FIGURA 12). 39 https://paperpile.com/c/PbugT0/1E5YE https://paperpile.com/c/PbugT0/1E5YE No terceiro dia (teste), 24 horas após a sessão de condicionamento, os animais foram aleatoriamente designados para serem tratados com 0,5 µL de muscimol (5 mg/mL) ou 0,5 µL de solução veicular (solução salina, 0,9% p/v) injetados na BLA. Eles foram contidos com cuidado e uma cânula de infusão (30 G, 8 mm) foi inserida na cânula guia até atingir 1 mm abaixo de sua extremidade inferior. As drogas foram infundidas com uma seringa de 10 μL (Hamilton, EUA) conectada a uma bomba de microinfusão ajustada a uma vazão de 15 mL/h. Após a infusão, a cânula de injeção foi deixada no local por mais 1 minuto para evitar o refluxo da droga. Após 40 minutos, os animais foram submetidos novamente a um procedimento idêntico ao de pré-condicionamento no contexto A para verificar a retenção da memória associativa entre o CS e o US (FIGURA 12). Após o término da primeira sessão de teste, os animais foram deixados em repouso por mais 4 horas (portanto, mais de 5 horas após a primeira injeção) para aguardar a recuperação da atividade suprimida pela ação do muscimol ​(ARIKAN et al., 2002)​. Os animais foram então novamente submetidos ao protocolo de injeção de drogas e teste de comportamento, com os animais previamente tratados com muscimol sendo agora tratados com solução salina e vice-versa (FIGURA 12). As sessões foram gravadas por uma câmera montada em frente à caixa e os vídeos foram analisados por um examinador cego às condições experimentais. O comportamento de congelamento foi definido como a completa ausência de movimentos, com exceção da respiração, por no mínimo 2 s. Os resultados foram expressos como a porcentagem de congelamento em relação ao tempo total de cada apresentação do estímulo sonoro ​(CURZON; RUSTAY; BROWMAN, 2009)​. Períodos fora da apresentação do estímulo não foram considerados. 4.5.2 Parte II: Estímulo Neutro Para o teste do NS, cinco animais foram submetidos ao mesmo protocolo descrito acima, mas sem passar pela sessão de condicionamento. Ou seja, no primeiro dia foram submetidos às sessões de pré-condicionamento e, no segundo, foram diretamente submetidos às sessões de reapresentação do som com injeção das drogas (FIGURA 13). 40 https://paperpile.com/c/PbugT0/8sCGu https://paperpile.com/c/PbugT0/1agoH https://paperpile.com/c/PbugT0/1agoH Figura 13 - Protocolo experimental de apresentação do estímulo neutro (NS) associado do tratamento com muscimol e salina. 4.6 Registros eletrofisiológicos e análise de dados Antes das sessões de registro, o terminal RJ-12 implantado no crânio do animal experimental era conectado a um conjunto previamente construído formado por um terminal RJ-12 fêmea acoplado a um estágio de ganho unitário pré-amplificado (1x ganho. Adaptador ZCA-AMN16. Omnetics®. Tucker-Davis Technologies), que por sua vez era ligado a um cabo de registro (ZC16 - ​headstage digital ZIF-CLIP® de 16 canais ZC16 - Tucker-Davis Technologies). Os sinais foram filtrados entre 1 e 300 Hz, amplificados em 24.000 V/V e amostrados a aproximadamente 3 kHz por um bioamplificador (Tucker-Davis Technologies RZ2) (FIGURA 11C). Os ​timestamps foram atrelados aos picos e vales da frequência de modulação do CS e foram registrados por uma porta de entrada digital do bioamplificador RZ2. Através de uma interpolação linear, esses valores temporais foram utilizados para obter uma série temporal instantânea de fase, que por sua vez foi utilizada para reconstruir o envelope de modulação do 41 CS ​(AMARAL-JÚNIOR and MOURÃO et al., 2019)​. Assim, a análise tempo-frequência poderia permanecer sincronizada com a apresentação do estímulo. Os dados foram analisados ​off-line com códigos MATLAB personalizados e embutidos (MATLAB R2017a. EEGlab toobox - https://sccn.ucsd.edu/eeglab/index.php). A potência de tempo-frequência dos SSEPs (faixa de 53,71 ± 0,3 Hz) foi calculada ao longo de cada apresentação pela função espectrograma padrão (transformada de Fourier de curta duração-STFT; janela Hamming de 32.768 pontos sem sobreposição, de 32.768 pontos) e normalizada pelos respectivos valores de linha de base (30 s antes do início do som). Para calcular a fase Δ entre o envelope de modulação da amplitude de CS e as REARPs, os dados foram inicialmente filtrados na faixa de frequência de 53,71 ± 2 Hz e os coeficientes foram extraídos pela função padrão de Hilbert. A fase Δ foi calculada nas janelas de tempo médio de 3 s com sobreposição de 90% e definida como a diferença entre os componentes imaginários das REARPs e o envelope do CS: édia Δ fase arg ⁡ M = 1 N [ ∑ N n = 1 ei(ϕREARP − ϕCS)] Média Δ fase: argumento da soma dos vetores de fase, em que N é o número de amostras no eixo d