UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PARASITOLOGIA Efeitos da infecção por Ancylostoma ceylanicum em hamster (Mesocricetus auratus): avaliação da carga parasitária e da coinfecção por Schistosoma mansoni LUCIANA RIBEIRO SERAFIM BELO HORIZONTE 2014 LUCIANA RIBEIRO SERAFIM Efeitos da infecção por Ancylostoma ceylanicum em hamster (Mesocricetus auratus): avaliação da carga parasitária e da coinfecção por Schistosoma mansoni BELO HORIZONTE 2014 Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Parasitologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial a obtenção do título de doutor em Parasitologia. Área de concentração: Imunoparasitologia Orientadora: Prof.ª Dr.ª Élida Mara Leite Rabelo Co-orientadora: Dr.ª Silvia Regina Costa Dias Projeto desenvolvido no Laboratório de Parasitologia Molecular, do Departamento de Parasitologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais em colaboração com o Laboratório de Imunopatologia , Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto. AGRADECIMENTOS À minha orientadora Élida Rabelo. Às vezes nos falta palavras para expressar nossa gratidão, mas saiba que você me ajudou muito além do que imagina. Obrigada por seus conselhos, ajuda e orientação. Obrigada por ser essa pessoa alegre e por ter esse coração imenso. À Silvia Dias minha coorientadora e amiga. Obrigada. Iniciamos como colegas de laboratório. Você no final do seu doutorado e eu começando. Sua ajuda foi fundamental. Aos meus colaboradores do Laboratório de Imunopatologia (UFOP): professora Cláudia Carneiro, os doutorandos Nívia Carolina, Bruno Roatt e a técnica Renata. Obrigada por toda a ajuda que recebi de vocês no processamento e análise das minhas infinitas amostras. Aos meus colegas do Laboratório de Parasitologia Molecular (ICB/UFMG) e agregados: Ana Flávia, Ana Cristina, Bruna, Jéssica, Lorrana, William, Carina, Fernando, Vivian e os recém-chegados Talita, Ana Maria, Nayara e Pedro. As contribuições de vocês foram além do trabalho braçal. Vocês me ajudaram tornando menos difícil os resultados negativos. Aos técnicos do departamento de Parasitologia (ICB/UFMG) Carlos Manoel, José Carlos, Hudson e Zenite obrigada pela preciosa ajuda. À Cíntia Fagundes do departamento de Bioquímica e Imunologia (ICB/UFMG) por gentilmente ceder os antígenos SEA e SWAP. Ao Centro de pesquisa René Rachou (FIOCRUZ Minas) pelo fornecimento das cercárias utilizadas nos experimentos. Aos coordenadores do Laboratório de Fisiologia dos Insetos Hematófagos e do Laboratório de Malária pelo uso de seus equipamentos. Ao Programa de Pós-Graduação em Parasitologia (ICB/UFMG) pela preciosa oportunidade. A CAPES pela concessão da bolsa de Doutorado e financiamento do projeto (Edital de Incentivo a Paraistologia Básica). Ao meu amado Matheus que teve muita, muita, muita paciência comigo. Inclusive quando eu mesma já não tinha. Obrigada por me fazer companhia nos fins de semana que tive que coletar amostras, pelas idas e vindas de Ouro Preto. A minha família que também teve paciência e acreditou junto comigo que seria possível realizar este sonho. A Deus que permitiu que tudo isso acontecesse. RESUMO Infecções por ancilostomídeos se constituem em um grave problema de saúde pública em vários locais do mundo, incluindo o Brasil. Pacientes afetados apresentam diferentes níveis de patogenia que podem estar relacionadas à carga parasitária e/ou a associações com outros parasitos, tendo em vista que as áreas endêmicas para ancilostomose apresentam sobreposição para outras parasitoses. Portanto, este trabalho teve como objetivo avaliar dois aspectos da infecção por Ancylostoma ceylanicum em hamster, o primeiro relacionado à carga parasitária e o segundo relacionado à coinfecção com o parasito Schistosoma mansoni. Na avaliação da carga parasitária foram usados inóculos crescentes de A. ceylanicum (25 L3, 75 L3, 125 L3 e 250 L3), e os animais acompanhados por 21 dias. Foi avaliado o peso, a eliminação de ovos nas fezes, hemograma, resposta humoral, análise histopatológica do intestino delgado e morfometria dos vermes adultos. A carga parasitária não alterou o estabelecimento, sobrevivência ou fecundidade dos vermes adultos, com número de ovos encontrados nas fezes proporcional a quantidade de larvas usadas no inóculo. A percentagem de vermes recuperados foi de 28,0%; 24,8%; 24,6% e 24,8%, respectivamente ao inóculo usado. Foi observada uma relação inversamente proporcional entre inóculo e o peso dos animais. Outros parâmetros que mostraram associação entre o tamanho do inóculo foram: contagem de leucócitos, eritrócitos, níveis de hemoglobina e porcentagem do hematócrito. Foi também observada alterações na histologia intestinal de acordo com o inóculo. A morfometria dos vermes adultos revelou redução significativa da largura das fêmeas na infecção realizada com 250 L3 em relação ao grupo 25 L3. Em uma segunda parte do trabalho foi avaliada a influencia da coinfecção com S. mansoni em hamsters. Foram realizados dois experimentos alternando a ordem da infecção. Foram avaliados o peso, a eliminação de ovos nas fezes, hemograma, reposta humoral (IgG), análise histopatológica do intestino delgado e morfometria dos granulomas. Foi observado que a cronologia da infecção influenciou os resultados em relação à perda de peso nos grupos coinfectados. Quando o A. ceylanicum antecedeu a infecção por S. mansoni os animais apresentaram a mesma redução de peso, que foi observada no grupo infectado apenas por A. ceylanicum, o que não ocorreu na coinfecção precedida por S. mansoni. Embora A. ceylanicum e S. mansoni sejam hematófagos não houve exacerbação da anemia no grupo coinfectado. O estabelecimento da segunda infecção não foi prejudicado pela infecção prévia, em nenhum dos experimentos realizados, entretanto, houve redução do número de adultos recuperados quando usados na segunda infecção. Não foi observada uma correlação positiva entre a quantidade de ovos de S. mansoni retidos no fígado, ou eliminados nas fezes com a produção de IgG anti- SEA. Em geral no grupo Sm+Acey houve menor produção de IgG. A coinfecção não influenciou a formação, desenvolvimento ou evolução dos granulomas no intestino delgado dos hamsters infectados. Palavras-chave: Ancylostoma ceylanicum, Schistosoma mansoni, hamster, ancilostomideos, efeito “crowding”, coinfecção. ABSTRACT Hookworm infections constitute a serious public health problem in many parts of the world, including Brazil. Patients presents different aspects of the disease burden, which may be related to the parasite load and/or associations with other parasites, as the endemic areas for this parasite are overlapping with others parasitic diseases. Therefore, this study aimed to evaluate two aspects of infection with Ancylostoma ceylanicum in hamster; the first related to the parasite load and the second related to the co-infection with the parasite Schistosoma mansoni. In the assessment of parasitic burden A. ceylanicum increasing inocula of the L3 larvae (25, 75, 125and 250) were used, and the animals followed for 21 days for the evaluations of weight, number of eggs in the faeces, blood count, humoral response, histopathological analysis of the small intestine and morphometry of adult worms. The averages of adult worms recovered were: 28, 0%; 24, 8%; 24, 6% and 24, 8% according to the number of third stage larva used to inocula size of 25, 75, 125 and 250 L3, respectively. The size of the inoculum did not affect the establishment, survival or fecundity of adult helminthes. Reductions in the red blood cell and hemoglobin levels in the infected group were correlated inversely with the number of white blood cells. Moreover, differential cell counting revealed a positive correlation between the worm load and leucocytes numbers. The humoral response against excretory-secretory antigens was more robust and sensitive compared with the response against crude extract, with no positive correlation with the number of worms. The effect of the population density was more evident in female worms with a reduction of the width of the females from the group infected with 250 L3 in comparison to the 25 L3 group. An inverse correlation relationship between inoculum and weight of the animals was observed. The second part of the study was to evaluate the influence of coinfection with S. mansoni in hamsters. Two experiments were conducted by switching the order of infection. Weight were assessed, the elimination of eggs in the feces, blood count, humoral response (IgG), histopathological analysis of the small intestine and morphology of granulomas. It was observed that the chronology of infection influenced the results in relation to weight loss in coinfected groups. When the A. ceylanicum preceded infection by S. mansoni animals showed the same weight reduction observed in the group infected only by A. ceylanicum, which did not occur in coinfection preceeded by S. mansoni. Although A. ceylanicum and S. mansoni are bloodsucking worms, no exacerbation of anemia in the coinfected groups were observed. The establishment of the second infection was not affected by prior infection in any of the experiments. It was not observed a positive correlation between the amount of S. mansoni eggs retained in the liver or eliminated in the faeces with the production of anti-SEA IgG. In general the production of IgG to the group Sm + Acey was lower in comparison to the Sm group. The co-infection did not influence the formation, development and evolution of granulomas in the small intestine of infected hamsters. Keywords: Ancylostoma ceylanicum, Schistosoma mansoni, hamster, hookworm, “crowding” effect, Coinfection. LISTA DE GRÁFICOS GRÁFICO 1: Alteração de peso semanal dos grupos experimentais em gramas. ......... 41 GRÁFICO 2: Recuperação de vermes adultos e O.P.G.. ............................................... 43 GRÁFICO 3: Parâmetros hematológicos no dia da eutanásia ........................................ 45 GRÁFICO 4: Contagem diferencial de leucócitos.. ....................................................... 46 GRÁFICO 5: Avaliação Morfométrica do intestino delgado de hamters.. .................... 48 GRÁFICO 6: Níveis de IgG total em plasma de hamsters frente ao extrato proteíco total de A.ceylanicum (A) e ES (B).. ............................................................................. 50 GRÁFICO 7- Peso médio dos grupos ao longo do experimento. .................................. 71 GRÁFICO 8- Eliminação de ovos de A. ceylanicum. ................................................... 72 GRÁFICO 9- Eliminação de ovos de Schistosoma mansoni em fezes de hamster infectados. Média de eliminação por grupo.................................................................... 73 GRÁFICO 10- A: Média de recuperação de vermes adultos de A. ceylanicum do intestino delgado de hamster. B: Média de recuperação de vermes adultos de S. mansoni dos vasos mesentéricos de hamster. ............................................................................ 74 GRÁFICO 11- Número de ovos de S. mansoni retidos no fígado. . ............................. 75 GRÁFICO 12- Hemograma realizado aos 30 dpi. . ....................................................... 77 GRÁFICO 13 - Hemograma realizado aos 60 dpi.. ....................................................... 78 GRÁFICO 14 - Hemograma realizado aos 75 dpi . ....................................................... 79 GRÁFICO 15- Leucócitos totais e contagem diferencial em sangue de hamsters aos 30 dpi.. ................................................................................................................................. 80 GRÁFICO 16- Leucócitos totais e contagem diferencial em sangue de hamsters aos 60 dpi ................................................................................................................................... 81 GRÁFICO 17- Leucócitos totais e contagem diferencial em sangue de hamsters aos 75 dpi. .................................................................................................................................. 82 GRÁFICO 18- Níveis de IgG total em plasma de hamsters aos antígenos aos 30 dpi frente aos antigenos: A: SWAP; B: SEA; C:Extrato bruto de A. ceylanicum; D: ES. .. 83 GRÁFICO 19- Níveis de IgG total em plasma de hamsters aos 64 dpi frente aos antigenos: A: SWAP; B: SEA; C: Extrato bruto de A. ceylanicum; D: ES. ................. 84 GRÁFICO 20- Níveis de IgG total em plasma de hamsters aos 75 dpi frente aos antígenos A: SWAP; B: SEA; C: Extrato bruto de A. ceylanicum; D: ES. .................... 85 GRÁFICO 21 - Avaliação Morfométrica do intestino delgado de hamters. .................. 88 GRÁFICO 22: Área média dos granulomas no fígado de hamsters............................... 89 GRÁFICO 23- Aferição de peso dos grupos experimentais. ........................................ 91 GRÁFICO 24- Exame Parasitologico de Fezes (Formol-Éter). ..................................... 92 GRÁFICO 25- Recuperação de vermes. ........................................................................ 93 GRÁFICO 26- Número de ovos de S. mansoni retidos no fígado. ............................... 94 GRÁFICO 27- Hemograma de hamster fêmeas.. .......................................................... 95 GRÁFICO 28- Hemograma aos 90 dpi. ......................................................................... 96 GRÁFICO 29- Níveis de IgG total em plasma de hamsters frente aos antígenos. A: SEA; B: SWAP; C: Extrato bruto de A. ceylanicum; D: ES.. ........................................ 98 GRÁFICO 30 - Avaliação morfométrica do intestino delgado de hamters. ................ 103 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Morfometria de fêmeas adultas de Ancylostoma ceylanicum ....................... 52 Tabela 2 - Morfometria de machos adultos de Ancylostoma ceylanicum ..................... 53 Tabela 3: Análise do estágio evolutivo nos granulomas do intestino delgado aos 75 dpi ........................................................................................................................................ 89 Tabela 4: Análise da fase evolutiva do granuloma aos 90 dpi ..................................... 102 LISTA DE FIGURAS FIGURA 1: Esquema do delineamento experimental .................................................... 33 FIGURA 2 - Fotomicrografias de cortes histológicos de intestino delgado de hamster não-infectados (NI) ou infectados com 25, 75, 125, e 250 L3 de Ancylostoma ceylanicum. ..................................................................................................................... 49 FIGURA 3 Esquema delineamento experimental das coinfecções. ............................... 63 FIGURA 4: Fotomicrografias representativas de cortes histológicos de intestino delgado de hamsters.. ................................................................................................................... 87 FIGURA 5: Fotomicrografias representativas de cortes histológicos de intestino delgado de hamsters. .................................................................................................................. 100 FIGURA 6: Fotomicrografias representativas de cortes histológicos de intestino delgado de hamsters infectados com Schistosoma mansoni e Ancylostoma ceylanicum, . ........ 101 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS %: porcentagem ≤: menor ou igual µg/ml: microgramas por mililitro µl: Microlitro µm: micrometro Acey-1: grupo infectado com A. ceylanicum do experimento 1 Acey-2: grupo infectado com A. ceylanicum do experimento 2 Acey+Sm: grupo infectado com A. ceylanicum e coinfectado com S.mansoni ANOVA: análise de variância Anti-IgG: anti- imunoglobulina gama CEUA-UFMG: Comitê de Ética em experimentação Animal da Universidade Federal de Minas Gerais. Dpi: dias pós-infecção EDTA: Ethylenediamine tetraacetic acid (ácido etilenodiamino tetra-acético). ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ES: antigeno de Excresão e secreção EUA: Estados Unidos da América g: força gravitacional h: hora HE: Hematoxilina-Eosina ICB/UFMG: Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais IFN-γ: interferon gama IgE: imunoglobulina E IgG: Imunoglobulina gama IL-2: interleucina dois IL-4: interleucina quatro IL-5: interleucina cinco IL-6: interleucina seis IL-10: interleucina 10 IL-17: interleucina 17 IL-23: interleucina 23 kDa : quilo dalto Kg: quilograma KOH: hidróxido de potássio LPM: Laboratório de Parasitologia Molecular M: molar min.: minutos mg: miligrama ml: militros mm: milímetro MWCO: Molecular Weight Cut Off n: número NaCl: cloreto de sódio NaHCO3: bicarbonato de sódio NI: não infectado ns: não significativo NUPEB-UFOP: Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto O.P.G: ovos por grama de fezes ºC: graus Celsius PBMC: peripheral blood mononuclear cel PBS: phosphate buffered salin PBST: Solução de tampão fosfato e tween 20 pH: potencial de Hidrogênio rpm: rotações por minuto SD: desvio padrão SEA: Soluble egg antigens Sm-1: grupo infectado com S. mansoni do experimento 1 Sm-2: grupo infectado com S. mansoni do experimento 2 Sm+Acey: grupo infectado com S. mansoni e coinfectado com A. ceylanicum SWAP: soluble worm antigen preparation TGF-β: Transforming growth factor beta Th1: T helper tipo 1 Th2: T helper tipo 2 TNF-α; Fator de necrose tumoral alfa TNK; Natural killer T Treg: : T regulador U/mL : unidades por mililitro v/v: volume por volume 13 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 18 1.1. Ancilostomose ........................................................................................................ 18 1.2. Esquistossomose mansoni ..................................................................................... 20 1.3. Efeitos dependentes da densidade populacional “crowding effect” .................. 23 1.4. Coinfecções ............................................................................................................. 24 1.5. Justificativa ............................................................................................................ 28 2. Objetivos .................................................................................................................... 30 2.1. Objetivo geral ......................................................................................................... 30 2.2.. Objetivos específicos ............................................................................................. 30 CAPÍTULO 1 - EFEITO “CROWDING” ................................................................. 31 3. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 33 3.1. Delineamento experimental .................................................................................. 33 3.2. Infecção experimental ........................................................................................... 34 3.2.1. Infecção por Ancylostoma ceylanicum.............................................................. 34 3.3. Coleta de sangue .................................................................................................... 34 3.4. Aferição de peso ..................................................................................................... 35 3.5. Exame parasitológico de fezes .............................................................................. 35 3.6. Necropsia e recuperação dos vermes adultos ...................................................... 35 3.6.1. Recuperação de A. ceylanicum ....................................................................... 35 3.7. Morfometria dos vermes adultos de Ancylostoma ceylanicum .......................... 35 3.8. Processamento histológico das amostras obtidas durante as necropsias ......... 36 3.9. Avaliação histopatológica ..................................................................................... 36 3.9. 1. Intestino delgado .............................................................................................. 37 3.10. Preparação de antígenos ..................................................................................... 37 3.10.1. Antígeno de Excreção e secreção de verme adulto de A. ceylanicum ............ 37 14 3.10.2. Preparação de extrato proteico total de vermes adulto de A. ceylanicum ....... 38 3.11. Dosagem de proteínas .......................................................................................... 38 3.12. ELISA ................................................................................................................... 38 3.13. Análise estatística ................................................................................................. 39 4. RESULTADOS ......................................................................................................... 41 4.1. Aferição de peso ..................................................................................................... 41 4.2. Exame parasitológico de fezes .............................................................................. 41 4.2.1. Ovos por grama de fezes (O.P.G) ..................................................................... 41 4.3. Recuperação dos vermes adultos de A. ceylanicum ............................................ 42 4.4. Exames hematológicos ........................................................................................... 44 4.4.1. Hemograma ....................................................................................................... 44 4.4.2. Contagem diferencial de leucócitos .................................................................. 46 4.5. Análise histológica ................................................................................................. 47 4.6. ELISA ..................................................................................................................... 50 4. 7.Morfometria de A. ceylanicum adultos ............................................................... 51 5. DISCUSSÃO ............................................................................................................. 54 CAPÍTULO 2 - COINFECÇÕES ............................................................................... 59 6. OBJETIVOS ............................................................................................................. 61 6.1. Objetivo geral ......................................................................................................... 61 6.2. Objetivos específicos .............................................................................................. 61 7. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 62 7.1. Delineamento experimental .................................................................................. 62 7.2. INFECÇÃO EXPERIMENTAL .......................................................................... 64 7.2.1.. Infecção por Schistosoma mansoni .................................................................. 64 7.2.2. Infecção por Ancylostoma ceylanicum.............................................................. 64 7.3. Coleta de sangue .................................................................................................... 64 7.4. Aferição de peso ..................................................................................................... 64 15 7.5. Exame parasitológico de fezes .............................................................................. 64 7.5.1. Fórmol-éter ....................................................................................................... 64 7.5.2. O.P.G. ............................................................................................................... 65 7.6. Necropsia e recuperação dos vermes adultos ...................................................... 65 7.6.1. Recuperação de S.mansoni ............................................................................. 65 7.6.2. Recuperação de A. ceylanicum ....................................................................... 66 7.7. Quantificação de ovos de S. mansoni retidos no fígado ..................................... 66 7.8. Processamento histológico das amostras obtidas durante as necropsias ......... 66 7.9. Avaliação histopatológica de intestino delgado .................................................. 66 7.10. Preparação de antígenos ..................................................................................... 67 7.10.1.. Antígeno de excreção e secreção de verme adulto de A. ceylanicum ............ 67 7.10.2. Antígeno solúvel de verme adulto (SWAP) e Antígeno de ovo de S. mansoni (SEA) .......................................................................................................................... 67 7.11. Dosagem de proteínas .......................................................................................... 68 7.12. ELISA ................................................................................................................... 68 7.13. Análise estatística ................................................................................................. 68 8. RESULTADOS EXPERIMENTO 1 ....................................................................... 71 8.1. Aferição do peso ..................................................................................................... 71 8.2. Exame parasitológico de fezes .............................................................................. 72 8.2.1. O.P.G ................................................................................................................ 72 8.2.2. Eliminação de ovos de S. mansoni .................................................................... 72 8.3. Recuperação dos vermes adultos de A. ceylanicum e S. mansoni ...................... 73 8.4. Quantificação de ovos de S. mansoni retidos no fígado ..................................... 74 8.5. Exames hematológicos ........................................................................................... 75 8.5.1. Série vermelha .................................................................................................. 75 8.5.2. Leucograma ...................................................................................................... 80 8.6. ELISA ..................................................................................................................... 82 8. 7. Análise histológica ................................................................................................ 86 9. RESULTADOS EXPERIMENTO 2 ....................................................................... 91 9.1. Aferição do peso ..................................................................................................... 91 16 9.2. Exame parasitológico de fezes .............................................................................. 91 9.2.1. Contagem de ovos de S. mansoni ..................................................................... 91 9.2.2. O.P.G ................................................................................................................ 92 9.3. Recuperação dos vermes adultos de A. ceylanicum e S. mansoni ...................... 92 9.4. Quantificação de ovos de S. mansoni retidos no fígado ..................................... 93 9.5. Exames hematológicos ........................................................................................... 94 9.5.1. Série vermelha .................................................................................................. 94 9.5.2. Leucograma ...................................................................................................... 96 9.6. ELISA ..................................................................................................................... 97 9.7. Análise histopatológica .......................................................................................... 98 10. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 104 11. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 110 13. ANEXOS ............................................................................................................... 126 17 1. INTRODUÇÃO 18 1. Introdução 1.1. Ancilostomose A ancilostomose é uma das doenças parasitárias mais prevalentes no mundo. Nos países em desenvolvimento, leva a quadros de anemia e desnutrição entre a população mais carente. A doença acomete entre 576 e 740 milhões de pessoas em regiões tropicais e subtropicais do mundo (De Silva et al., 2003; WHO 2012). Utilizando como parâmetro o índice DALYs - Disability-adjusted life years- (WHO, 2010), que analisa o número de anos vividos com incapacidade, a infecção causada por ancilostomideos é uma das doenças parasitárias mais importantes em humanos, por se tratar de uma morbidade crônica de longa duração, que afeta crianças e adultos. (De Silva et al., 2003; Loukas et al, 2005, Pullan et al 2010) . As espécies de Ancylostomatidae de interesse na medicina humana e veterinária são Necator americanus, Ancylostoma duodenale, A. ceylanicum. A. caninum e A. braziliense, sendo os dois últimos parasitos definitivos do intestino delgado de cães e gatos. A infecção do hospedeiro ocorre pela penetração ativa da larva de terceiro estádio (L3) na pele do hospedeiro. Após a migração pelos tecidos, a larva alcança os pulmões onde sofre muda. Ascende a árvore brônquica até a laringe e é deglutida. Após a passagem pelo estômago, a larva alcança o intestino delgado onde se fixa na mucosa intestinal através da cápsula bucal e inicia a hematofagia. Após o amadurecimento sexual dos vermes ocorre a cópula. As fêmeas fazem a postura de milhares de ovos embrionados que alcançam o meio externo juntamente com as fezes do hospedeiro. Em condições favoráveis de temperatura e umidade ocorre a eclosão da larva de primeiro estádio. No ambiente a larva sofre duas mudas até se tornar uma larva infectante (L3). O desenvolvimento do ovo até a larva de terceiro estádio acontece no período de cinco a oito dias, (Soulsby, 1965). Durante a penetração e migração da L3 no hospedeiro humano podem ocorrer reações assintomáticas até erupções cutâneas (Loukas e Prociv, 2001). A patogenia da ancilostomose é consequência direta da perda de sangue que ocorre durante a fixação e alimentação dos parasitos adultos no intestino delgado. A infecção por ancilostomídeos é uma importante causa de anemia ferropriva, que em infecções maciças, podem causar, devido à enteropatias por perda de proteínas, retardo físico e mental em crianças, além de óbito (Prociv e Croese, 1990; Hotez et al., 2006 a). Estima-se que A. duodenale pode 19 causar a perda de 250µl de sangue por verme/dia. A perda sanguínea associada a uma dieta inadequada de ferro pode levar a quadros graves de anemia. Quando os estoques de ferro se encontram reduzidos é observado a correlação negativa entre a intensidade da infecção, que pode ser medida pelo número de ovos nas fezes, e a redução do níveis de hemácias e hemoglobina. O desenvolvimento de anemia, portanto é o somatório de fatores como níveis do estoque de ferro, intensidade da infecção e da espécie de ancilostomídeo, visto que A. duodenale causa maiores perdas de sangue comparadas às demais espécies do gênero. Estudos mostram que a infecção por ancilostomídeos não confere proteção à reinfecções e indicam que o pico de intensidade de infecção ocorre em indivíduos adultos ou mais velhos (Gandhi et al., 2001; Bethony et al., 2002). Em regiões endêmicas observa-se que o aumento da carga parasitária está associado à idade do hospedeiro (Bethony et al., 2002, Hotez et al., 2004) diferente do que ocorre, por exemplo, na esquistossomose. Os tratamentos antihelmínticos são eficazes na eliminação de vermes adultos, no entanto as reinfecções ocorrem rapidamente (Albonico et al., 1995; Quinnell et al., 1993). Para elucidar os mecanismos de evasão da resposta do sistema imune durante a ancilostomose já foram utilizados inúmeros modelos experimentais como coelhos (Bhopale et al., 1980), galinhas (Goyal et al., 1986), cães (Dias et al. 2013a) camundongos, e hamsters (Dias et al, 2013b; Pacanaro et al., 2014). O hamster dourado (Mesocricetus auratus) frequentemente é empregado como modelo experimental, embora apresente limitações como poucos insumos para estudos imunológicos e resistência parcial a infecções sucessivas (Garside et al, 1990; Brailsford e Behnke, 1992). As infecções nesse modelo utilizando inóculos com 100 L3 de A. ceylanicum apresentam predominantemente perfil Th1, com aumento de citocinas proinflatórias IFN-γ e TNF-α. Após a patência ocorre a mudança para o perfil Th2 com aumento dos níveis de IL-4 e IL-10. (Loukas et al., 2006). A reposta Th2 está associada à proteção parcial do hospedeiro tanto na ancilostomose como em outros parasitos gastrointestinais, sendo que a IL-4 e IL-5 possuem papel fundamental na resposta. Os ancilostomideos podem promover sua sobrevivência secretando agentes imunossupressores e, possivelmente, estimulando o aparecimento de populações Treg (Pritchard et al., 2007). 20 1.2. Esquistossomose mansônica A esquistossomose é a segunda doença tropical mais importante na área de saúde pública, causando cerca de 280.000 mortes anuais (Steinmann et al., 2006; Hotez et al., 2008b;). Apesar do progresso no controle ou eliminação da esquistossomose em diversas áreas (Hotez et al., 2008a; Hotez et al., 2008b), a doença ainda permanece endêmica em 76 países em desenvolvimento (Chitsulo et al., 2000; van der Werf et al., 2003, Gryssels 2012). Em 54 países, as pessoas infectadas possuem a forma de esquistossomose intestinal (Chitsulo et al., 2000). Estima-se que a população infectada seja de 207 milhões e o número de pessoas que se encontra em risco de contrair a doença seja de 779 milhões em todo o mundo (Bethony et al., 2006; Steinmann et al., 2006; Hotez et al., 2008a; Hotez et al., 2008b;). Dentre as pessoas infectadas, 120 milhões são sintomáticos e 20 milhões sofrem as consequências graves da doença (Chitsulo et al., 2000; Engels et al., 2002). A esquistossomose manônica e a ancilostomose fazem parte das 14 doenças tropicais denominadas doenças tropicais negligenciadas, devido ao descaso das autoridades em vários países que são endêmicos para essas parasitoses, em destinar recursos para o controle e tratamento (Hotez et al., 2006b, Gray et al., 2010). Os adultos de Schistosoma mansoni habitam os vasos sanguíneo mesentéricos do sistema porta hepático, onde as fêmeas realizam a ovoposição de aproximadamente 300 ovos por dia. Uma pequena parte dos ovos consegue atravessar o epitélio intestinal e atingir a luz intestinal. Estes ovos são eliminados juntamente com as fezes do hospedeiro. As fezes despejadas em coleções de água com condições ideais de luminosidade, salinidade, temperatura e a presença do hospedeiro intermediário (Biomphalaria) permitem a continuidade do ciclo do parasito. Na água o mirácido emerge e nada ativamente a procura de seu hospedeiro intermediário. Quando o encontra penetra ativamente em seus tecidos. O miracido dá origem ao esporocisto e este, por sua vez, as cercárias. As cercárias são a forma infectante para vertebrados. Após ermergir do caramujo as cercárias nadam a procura de seu hospedeiro definitivo. Após encontrá-lo ocorre a penetração ativa na pele do hospedeiro. A cercária perde a sua cauda, se tornando o esquistossômulo que migra, via corrente sanguínea, para os pulmões e posteriormente através de vários órgãos até atingir o sistema porta hepático, onde se tornam adultos. Os adultos em cópula migram até as veias mesentéricas e as fêmeas iniciam o processo de ovoposição (Schmidt e Roberts, 2000). Os ovos que não 21 alcançam a luz intestinal são levados pela corrente sanguínea, atingindo diversos órgãos, principalmente o fígado. Embora os adultos sejam hematófagos e habitem os vasos sanguíneos, são os ovos os causadores da patologia na esquistossomose (Schramm e Hass, 2010). A esquistossomose mansônica é caracterizada pelas fases aguda e crônica. A primeira apresenta uma fase pré-postural que ocorre cerca de 10-30 dias após a infecção. Os vermes adultos se alojam nas veias mesentéricas do hospedeiro onde ocorre a liberação de antígenos secretados do tubo digestivo intestino e do tegumento do parasito. Tais antígenos provocam uma reatividade inflamatória caracterizada pelas citocinas IL-2 e IFN-γ. Observa-se um infiltrado de leucócitos polimorfonucleares ao redor dos parasitos e nas proximidades dos vasos (Pearce et al., 1991). A fase aguda propriamente dita aparece em torno de 50 dias e dura até cerca de 120 dias após a infecção. Ela é caracterizada pela dispersão dos ovos pelo corpo do hospedeiro. Eles são encontrados principalmente na parede do intestino e no fígado, provocando, então, a formação de granulomas, cujo volume pode chegar até 100 vezes o volume do ovo. O surgimento e exacerbação da reação granulomatosa marcam a fase aguda. Observa-se uma mudança importante no padrão de resposta imunológica para um perfil do tipo 2 com predomínio de citocinas como IL-4 e IL-5 embora a participação de TNF-α e IFN-γ sejam de grande importância para o processo de recrutamento primário de células (Pearce et al., 1991; Boros, 1994). O desenvolvimento do granuloma nesse estágio é predominantemente celular, principalmente formado por eosinófilos, macrófagos, linfócitos e alguns neutrófilos (Weinstock, 1992). Na segunda fase de formação do granuloma, onde o seu diâmetro apresenta-se maior, há um predomínio das citocinas IL-4 e IL-5. A fase crônica, que se inicia a partir do 4 o mês após a infecção, é caracterizada pela redução do tamanho dos granulomas em torno dos ovos. A esquistossomose pode apresentar variações clínicas que vão da forma intestinal benigna até as mais graves como a hepatoesplênica e hepatointestinal. A modulação da reatividade imunológica inflamatória resulta na redução dos granulomas e da sintomatologia. As manifestações clínicas variam dependendo principalmente da localização e intensidade do parasitismo e da capacidade de reação imunológica do hospedeiro à infecção. Em geral, ocorrem diarreia e desconforto abdominal. Nos casos mais 22 graves, ocorrem ascite e varizes esofageanas e circulação colateral. Em casos de desnutrição o quadro clínico é agravado (Andrade e Warren 1964). Ao longo dos anos foram propostos mecanismos para explicar o fenômeno de modulação na esquistossomose: a) indução da anergia de linfócitos Th1 (Stadecker, 1992); imuno- modulação por IL-10 (Flores-Villanueva, et al., 1994; Falcão et al., 1998); linfócitos T supressores (Fidel e Boros, 1990); linfócitos B ativados (Jankovic et al., 1998); apoptose de linfócitos no fígado (Carneiro-Santos et al., 2000).; participação de células T CD4 + reguladoras (Treg ) e CD8 + ( Taylor et al., 2006; Ekkens et al.,2007). Nos modelos experimentais como camundongos, o estabelecimento da doença também se dá pelo desenvolvimento de uma resposta granulomatosa caracterizada pela formação de granulomas induzidos por antígenos solúveis do ovo (SEA) compostos por linfócitos T, linfócitos B, macrófagos, eosinófilos e células epitelióides e gigantes. Ao longo do curso da infecção, na qual há a passagem da fase aguda para a fase crônica (120-140 dias) também se observa a modulação desses granulomas. Os animais apresentam alguns sintomas, tais como diarreia durante a fase aguda e, pequenas lesões na mucosa intestinal que podem levar a morte dos animais através do seu sangramento. Esse papel duplo da reatividade ao ovo é um dos fenômenos mais intrigantes na doença. Ele pode estar relacionado tanto a particularidades antigênicas dos componentes do ovo quanto aos microambientes particulares onde o granuloma ocorre, ou seja, o fígado e a mucosa intestinal. Desta maneira, o granuloma parece apresentar um papel inflamatório patogênico e um papel imunorregulador no qual há o recrutamento e supressão de linfócitos específicos para os antígenos do ovo do parasito (Rumbley et al., 1998). Se a reatividade inflamatória aos antígenos do parasito parece ser importante na imunidade adquirida e na proteção a reinfecção, o fenômeno da imunomodulação tem um papel fundamental na diminuição do dano tecidual e sua ausência está associada ao desenvolvimento das formas mais graves da doença em humanos e modelos experimentais. A larga extensão das áreas endêmicas e a constante reinfecção dos indivíduos, associadas às precárias condições sanitárias, faz com que o tratamento da esquistossomose baseado apenas em quimioterapia seja ineficiente (Bergquist, 1998). A interrupção da transmissão é o ideal a ser buscado. Não podendo ser alcançado apenas com o tratamento das populações infectadas (Katz, 1999), pois a 23 quimioterapia isoladamente não afeta a transmissão da infecção ou as altas taxas de reinfecção (Bergquist, 1998). A rápida reinfecção após o tratamento (Hotez et al., 2008a) tem atenuado a efetividade dos programas de controle baseados no tratamento com praziquantel, além disso já foram observados uma redução na susceptibilidade do parasito à droga. (Doenhoff e Pica-Mattoccia, 2006; Gryseels et al., 2006). Assim, um programa integrando tratamento quimioterápico, o qual propicia uma redução da carga parasitária em curto prazo e a vacinação que propicia uma resposta imune-protetora de longa duração seria o mais adequado para o controle da esquistossomose (Capron et al., 2002). 1.3. Efeitos dependentes da densidade populacional – ““crowding” effect” Diversos pesquisadores observaram em infecções experimentais ou naturais a diminuição do tamanho dos vermes em infecções mais intensas. Este fenômeno foi nomeado efeito “crowding” (Read, 1951; Holmes, 1961; Roberts, 2000). Read (1951) descreveu o efeito “crowding” como uma relação inversamente proporcional entre as dimensões do helminto e sua densidade populacional. Além da redução do tamanho e peso do verme há a diminuição de ovos produzidos (Roberts, 2000). O exemplo clássico desse efeito é para o cestoda Hymenolepis diminuta (Chandler, 1939; Read, 1951; Kennedy e Behnke, 2001). Os mecanismos básicos que promovem a ocorrência do efeito “crowding” no crescimento e reprodução de helmintos geram discussões e controvérsias. As hipóteses propostas estão relacionadas à competição (intraespecífica ou interespecífica) por recursos limitados e espaço; produtos inibitórios secretados, reações inflamatórias no intestino do hospedeiro em função da maior carga parasitária que poderiam, portanto, interferir com o desenvolvimento do parasito (Roberts e Insler, 1982; Bush e Lotz, 2000; Roberts, 2000; Homes, 2002;). Alguns trabalhos apontam que geralmente os nematodas são mais resilientes e os efeitos de redução de tamanho e fecundidade observados nos cestodas sãos menos intensos (Andreassen et al., 1999; Bush e Lotz, 2000; Roberts, 2000; Paterson e Viney, 2002). No entanto sabe-se que toda competição é energeticamente dispendiosa e reduz o “fitness” de todos os organismos envolvidos (Roberts, 2000). Os mecanismos 24 responsáveis por tais efeitos podem ser mais complexos e, portanto, medidas precisas do tamanho do parasito e a determinação das taxas de fecundidade podem ajudar a discriminar entre as hipóteses alternativas que levam a esse efeito. 1.4. Coinfecções O poliparasitismo é a ocorrência de duas ou mais espécies de parasitos em um mesmo organismo. Este fenômeno é comum em regiões onde distintas espécies de parasitos coexistem em alta frequência. Os indivíduos afetados geralmente fazem parte da parcela mais pobre da população (Petney e Andrews, 1998). Estudos indicam que indivíduos infectados com múltiplas espécies de helminto (poliparasitados), frequentemente apresentam infecções mais graves que indivíduos infectados com uma única espécie (Booth et al., 2004). O quadro de poliparasitismo pode resultar em deficiência física e cognitiva (Hotez et al., 2006b; Hotez et al., 2007; Hotez et al., 2008b;), sendo que já foi visto que o poliparasitismo tem um impacto substancial na saúde física da população africana (Beasley et al., 2002). As coinfecções envolvendo ancilostomideos e Schistosoma sp estão entre as mais frequentes. Em estudo epidemiológico realizado no Brasil com 500 indivíduos; 39,5% estavam infectados com S. mansoni, e 76% destes indivíduos também estavam infectados com Necator americanus (Webster et al., 1997). Em outro estudo realizado com crianças em idade escolar da região sudeste, observou-se que 41% das crianças apresentavam infecção por S. mansoni e N. americanus (Pullan et al., 2008). Existe um crescente interesse em determinar como diferentes parasitos interagem entre si e com o hospedeiro, e como este responde à coinfecção. O tema tem sido abortado em estudos epidemiológicos (Brito et al.,2006; Brooker e Clements, 2009; Pullan et al., 2010), ecológicos (Graham, 2008) e fisiológicos (Wu et al., 2009). Sob o enfoque imunológico observou-se que animais coinfectados por macroparasitos (helmintos) e microparasitos (vírus, bactérias e protozoários) apresentavam alterações em suas respostas, quando comparados aos animais com infecções únicas. Durante infecções concomitantes a reposta imune para cada parasito pode ser inferior àquela observada em infecções individuais ou contrariamente. ser potencializada (Graham, 2002). A cronologia e a ordem em que ocorrem estas infecções podem influenciar os efeitos e a gravidade da doença em seu hospedeiro (Christensen et al.,1987). Por 25 exemplo, quando Toxoplasma gondii precede S. mansoni em infecções em modelo murino, o hospedeiro apresenta uma esquistossomose branda. Inversamente, quando S. mansoni antecede T. gondii, o hospedeiro apresenta grave reação inflamatória no fígado, resultando em morte dos animais coinfectados (Marshall et al., 1999; Araújo et al., 2001). A coinfecção pode também resultar em eliminação de um dos parasitos. Animais susceptíveis (camundongos AKR) foram capazes de eliminar a infecção por Trichuris muris quando previamente infectados com S. mansoni. Os camundongos que desenvolveram resposta Th1 contra a infecção por T. muris não conseguiram eliminar o parasito, no entanto eles se tornaram resistentes depois que ocorreu a infecção por S. mansoni devido ao desenvolvimento de uma forte resposta Th2. (Curry et al, 1995). Yoshida e colaboradores (1999) observaram que resposta imune Th2 dominante induzida pelo S. mansoni foi protetora. Os roedores infectados com S. mansoni ao serem desafiados com Strongyloides venezuelesis apresentavam redução significativa dos vermes adultos recuperados de S. venezuelensis. Camundongos coinfectados com Litomosoides sigmodontis e Leishmanina major mostraram desenvolvimento tardio das lesões leishmaniosas, quando comparados aos animais infectados somente com L. major, sugerindo a existência de efeitos benéficos em coinfecções para o hospedeiro (Lamb et al.,2005). Helmintos influenciam não apenas a resistência do hospedeiro a outro patógeno como também a gravidade da doença resultante. A malária cerebral é associada com a superprodução de citocinas proinflamatórias. Infecções por helmintos são capazes de diminuir a produção destas citocinas induzindo a secreção de IL-10 e TGFβ (Specht e Hoerauf, 2007). Assim, a coexistência de parasitos em um mesmo hospedeiro pode resultar em interações sinérgicas ou antagônicas da resposta imune e as manifestações clínicas podem ser tanto exacerbadas como reprimidas (Brito et al., 2006). O desenvolvimento de uma vacina multivalente para prevenir a infecção por ancilostomídeos e a esquistossomose foi proposto (Hotez et al., 2008 a). Entretanto, muitos estudos têm demonstrado que coinfecções entre helmintos e outros parasitos podem influenciar na eficácia de vacinas ao modular a reposta imune do hospedeiro (Cooper et al.,2000, Nookala et al., 2004). Até o momento poucos trabalhos experimentais foram realizados analisando a resposta imune decorrente da associação de S. mansoni e ancilostomideos. A exemplo 26 do que ocorre em outras coinfecções, se faz necessário o conhecimento de tal interação e as consequências para o seu hospedeiro. 27 1.5. JUSTIFICATIVA 28 1.5. Justificativa As helmintíases constituem um grave problema de saúde pública em países em desenvolvimento como o Brasil. Sabe-se que a carga parasitária tem influencia direta sobre a gravidade da doença no hospedeiro, porém pouco se sabe de seu efeito sobre a população de vermes albergadas e como isso pode influenciar no curso da infecção. As coinfecções tornam este cenário ainda mais complexo. As coinfecções são frequentemente relatadas na população humana e animal em estudos epidemiológicos, no entanto poucos trabalhos reproduzem em modelos experimentais. Estudos demonstram que a coinfecção pode ter natureza antagonista ou sinergética. Ela influencia o padrão da transmissão do parasito, pode atenuar sintomas ou mesmo agravar doenças desencadeadas pelos parasitos envolvidos. Além disso, as coinfecções podem contribuir para a perda de acurácia de exames clínicos e laboratoriais, diminuir a biodisponibilidade e toxicidade de drogas utilizadas em tratamentos e diminuir a eficácia de programas de controle de doenças baseadas em imunizações. Os trabalhos direcionados para o desenvolvimento de vacinas, mesmo que não esterilizantes, para ambas as classes de parasitos continuam a ser desenvolvidos. As infecções por Ancilostomídeos e Schistosoma sp desencadeiam respostas imunológicas semelhantes em pacientes infectados naturalmente pelos dois helmintos. Existe uma proposta de desenvolver uma vacina única para o controle das duas parasitoses. Contudo existe uma carência de estudos em modelo experimental da associação entre as duas infecções. Assim, o presente estudo visa obter maiores subsídios sobre o curso da infecção, das alterações biológicas para os parasitos e da patogenia causada ao hospedeiro em resposta a diferentes cargas parasitárias e da coinfecção entre dois helmintos, que possuem sobreposição de endemicidade em várias partes do mundo. Por questões didáticas esse trabalho será apresentado em dois capítulos. O primeiro é relativo ao efeito da superpopulação na infecção experimental de A. ceylanicum em hamster e o segundo relativo à coinfecção desse parasito com o trematoda S. mansoni. 29 2. OBJETIVOS 30 2. Objetivos 2.1. Objetivo geral Analisar os efeitos da infecção por Ancylostoma ceylanicum em modelo experimental em função da carga parasitária analisando parâmetros parasitológicos, hematológicos e imunológicos. 2.2.. Objetivos específicos 2.1.1. Avaliar a influência da carga parasitária no curso da infecção por A. ceylanicum. 2.1.2. Realizar morfometria dos vermes adultos provenientes de grupos infectados com diferentes inóculos de A. ceylanicum; 2.1.3. Avaliar os níveis de IgG total produzido frente ao extrato bruto de A. ceylanicum e antígenos ES, para os diferentes grupos experimentais; 2.1.4. Avaliar parâmetros hematológicos em hamster infectados com diferentes cargas de A. ceylanicum; 2.1.5 Realizar análises histopatológicas qualitativas e quantitativas do intestino delgado de animais infectados por A. ceylanicum, para os diferentes grupos experimentais 31 CAPÍTULO 1 - EFEITO “CROWDING” 32 3. MATERIAL E MÉTODOS 33 3. Material e Métodos 3.1. Delineamento experimental A infecção por Ancylostoma ceylanicum foi avaliada utilizando hamster (Mesocricetus auratus), fêmeas, como modelo experimental. Eles foram divididos aleatoriamente nos grupos Não infectado (NI) e grupos infectados com quatro diferentes inóculos (25, 75, 125 e 250 L3) de A. ceylanicum. Foram avaliados os efeitos da carga parasitária tanto para o hospedeiro (parâmetros parasitológicos, clínicos, hematológicos, histopatológicos) quanto para os helmintos (efeito “crowding” ou efeito dependente da densidade). Os animais foram identificados e acompanhados individualmente. Este projeto foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de Minas Gerais (CEUA-UFMG) sob o número 73/2012 (Anexo I). FIGURA 1: Esquema do delineamento experimental Hamster (fêmeas, 8 a 10 semanas) Grupo: NI (n=6) Grupo: 25 L3 (n=6) Grupo: 75 L3 (n=6) Grupo: 125 L3 (n=6) Grupo: 250 L3 (n=6) 34 3.2. Infecção experimental 3.2.1. Infecção por Ancylostoma ceylanicum As coproculturas de hamsters infectados foram incubadas por 7 dias a 27ºC (Roberts & O’Sullivan 1950). As larvas infectantes foram recuperadas das coproculturas pelo Método de Baermann-Moraes modificado (Barçante et al. 2003). Após a visualização da motilidade das L3 em microscópio estereoscópio, as larvas foram contadas por estimativa e os inóculos com 25, 75, 125 e 250 L3 foram ajustados para o volume final de 200 µl/hamster. As larvas foram recontadas para certificar o número de larvas presentes no volume final utilizado. A infecção foi realizada por via oral com auxilio de agulha gavage. 3.3. Coleta de sangue O sangue dos hamsters foi coletado por punção do plexo orbital (Pansky et al, 1961). A contenção manual dos animais foi realizada pela região cervical, de modo que automaticamente provocou a estase venosa na região cefálica e a exteriorização do globo ocular. Após a exteriorização do globo instilou-se uma gota de colírio anestésico (Cloridrato de proximetacaína 0,5%), e após 3 minutos introduziu-se o tubo capilar, contendo EDTA 0,5 M, entre o glóbulo ocular exposto e o fundo da cavidade orbitária. Foi realizada uma pequena pressão acompanhada de rotação do tubo capilar. O volume total de sangue obtido por coleta foi de aproximadamente 500 µl/ hamter. Uma alíquota de 30 µl foi utilizada para realização de hemograma completo (BC- 2800 Vet Mindray) e contagem diferencial em microscópio óptico (Olympus BH2 - Japan) realizado no Laboratório de Imunopatologia-NUPEB-UFOP. O restante da amostra de sangue foi submetido à centrifugação a 14.000 g, 5 min., temperatura ambiente para a recuperação de plasma. Este foi armazenado em alíquotas a -20ºC e utilizado para ensaios imunológicos posteriores. As coletas ocorreram no dia da infecção 0 dpi (dia pós- infecção) e no dia da eutanásia (21 dpi). Os valores utilizados como parâmetro fisiológicos para hamsters no hemograma e leucograma foram obtidos de Mitruka e Rawnsley (1981). 35 3.4. Aferição de peso O peso dos hamsters foi aferido no dia 0 do experimento e a cada sete dias até o término do experimento, utilizando balança semi-analítica. 3.5. Exame parasitológico de fezes Após dez dias da infecção por A. ceylanicum foi iniciada a coleta de fezes dos grupos experimentais para o exame parasitológico de fezes, que consistiu na contagem de ovos por grama de fezes (O.P.G), utilizando câmara de McMaster de acordo com Gordon e Whitlock (1939). Os exames parasitológicos de fezes foram realizados a cada dois dias até o dia anterior a eutanásia dos animais dos grupos experimentais. 3.6. Necropsia e recuperação dos vermes adultos 3.6.1. Recuperação de A. ceylanicum A eutanásia dos animais foi realizada por sobredose de sedativo/anestésico (45mg/kg de solução de cloridrato de xilazina e 240mg/kg de ketamina, via intraperitoneal). Os hamsters foram colocados em decúbito dorsal e a cavidade abdominal aberta. O intestino delgado foi retirado, individualmente colocado em placa de Petri, contendo solução de PBS 0,15M; pH 7,4 e aberto longitudinalmente para a recuperação dos vermes adultos que posteriormente foram separados por sexo e contados. Os vermes recuperados dos grupos experimentais foram mortos em água a 80ºC e transferidos para tubos identificados de poliestireno de 1,5 ml contendo solução de formaldeído 3,7% para posterior morfometria. 3.7. Morfometria dos vermes adultos de Ancylostoma ceylanicum Os vermes fixados e armazenados em formaldeído 3,7% foram diafanizados em solução de lactofenol de Amann (10 g de ácido fênico, 83 ml de ácido lático, 160 ml de glicerina e 100 ml de água destilada), por aproximadamente 72 horas. Os vermes foram pinçados desta solução e posicionados em lâmina de vidro com a cavidade bucal voltada para cima. Sobreposta uma lamínula (18 X 18 mm) e o espaço preenchido com solução de lactofenol. Os vermes foram observados em microscópio de luz (Olympus BH2 - Japan), e fotografados para posterior morfometria. 36 Foram avaliados os seguintes parâmetros morfológicos nos dois sexos: comprimento total, largura total e da cavidade bucal, comprimento da cabeça até a papila cervical e comprimento do esôfago, comprimento do dente. Além destas medidas, nas fêmeas foi medida a distância entre a extremidade anterior a vulva, distância entre a vulva e a extremidade posterior. Comprimento dos órgãos reprodutivos. Nos machos foram medidos o comprimento e largura do gubernáculo e espículo. 3.8. Processamento histológico das amostras obtidas durante as necropsias O intestino delgado foi fixado aberto, sobre um papel filtro, com solução de formaldeído 3,7% tamponado e, depois de 24 horas, foi enrolado a partir da extremidade posterior sobre ele mesmo. As demais amostras também foram acondicionadas em solução de formaldeído 3,7% tamponado. Após 24 h as amostras foram transferidas para cassetes histológicos identificados, acondicionados em uma solução de formaldeído 3,7% tamponado nova e transportados para Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas – Universidade Federal de Ouro Preto (NUPEB – UFOP), onde foram realizadas todas as análises histológicas. Os cassetes contendo as amostras foram colocados em cestas de inox e processados em equipamento automatizado (EASYPATH-LEICA). Resumidamente , o tecido foi imerso em água por 10 minutos para a retirada do excesso de formaldeído. Em seguida as amostras foram desidratadas em banhos de álcool 70%, 80%, 90% e álcool absoluto (Synth, Brasil) por 30 minutos. Posteriormente as amostras foram diafanizadas em xilol (Synth, Brasil) em dois banhos de 15 minutos cada. Por fim o processo foi encerrado em banho de parafina histológica (Synth, Brasil), por 15 min. As amostras desidratadas e diafanizadas foram transferidas para cassetes de inclusão e seu conteúdo preenchido com a solução de parafina histológica e cera de abelha 2% (Synth, Brasil) (LEICA EG 1150 H). 3.9. Avaliação histopatológica Os cortes foram realizados em micrótomo com aproximadamente quatro μm de espessura e submetidos à coloração com hematoxilina e eosina (HE). As imagens visualizadas em microscópio de luz com aumento de 400 vezes foram digitalizadas através da microcâmera Leica DFC340FX associada ao microscópio Leica DM5000B. 37 As imagens obtidas analisadas com auxílio do software ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). 3.9. 1. Intestino delgado Os cortes histológicos de intestino delgado foram corados por HE e avaliados qualitativamente quanto às alterações da mucosa (hipercelularidade da lâmina própria e hipersecreção das células de Paneth, hiperplasia de células caliciformes e erosão), da submucosa e muscular, e, Morfométricamente, para obtenção de medidas das vilosidades (altura e espessura) e criptas (altura). Foram analisados 10 vilosidades com estrutura intacta por hamster/grupo. 3.10. Preparação de antígenos 3.10.1. Antígeno de excreção e secreção de verme adulto de A. ceylanicum Para a obtenção dos produtos excretados/secretados (ES) de adultos de A. ceylanicum recuperados vivos da mucosa intestinal de hamsters infectados foram lavados três vezes com solução salina tamponada estéril (PBS, pH 7,4). Em capela de fluxo laminar, as lavagens com PBS se repetiram mais duas vezes e, em seguida, foram lavados três vezes com meio RPMI 1640 (Sigma, EUA) suplementado com antibiótico/antimicótico 1% (Sigma, EUA) e 1,6% de l-glutamina (Synth, Brasil). Após a lavagem, os vermes foram transferidos para tubos de 15 ml contendo meio de cultura RPMI 1640 em uma proporção de 10 vermes por mililitro de meio e, no máximo 5 ml por tubo. A cultura foi incubada em estufa a 37ºC e 5% de gás carbônico durante 48 h. A cada 12 h, o meio de cultura era renovado, sendo que o sobrenadante contendo os produtos ES foi retirado e armazenado a -20ºC. Ao final da incubação, os sobrenadantes coletados foram agrupados em tubos de 50 ml e os parasitos armazenados a -20ºC para a produção do extrato proteico total. Todos os procedimentos feitos durante a cultura ocorreram em capela de fluxo laminar em condições de esterilidade. O meio de cultura coletado contendo os produtos ES dos parasitos foi centrifugado por 10 min., 1500 g, 4ºC, para retirada de ovos, restos celulares ou outras partículas em suspensão. Em seguida, o sobrenadante foi transferido para um tubo Vivaspin 20 5kDa MWCO (GE Healthcare) para concentração dos produtos ES, 38 seguindo instruções do fabricante, até redução para 1-5% do volume inicial. Os produtos ES concentrados foram aliquotados em tubos de 1,5 ml e armazenados a -80ºC até sua utilização. 3.10.2. Preparação de extrato proteico total de vermes adulto de A. ceylanicum Os vermes adultos utilizados para a produção de antígeno ES foram utilizados também para a produção de antígeno bruto. O extrato proteico total de vermes adultos foi obtido através da maceração manual dos parasitos, com auxílio de pistilo de vidro e volume mínimo de PBS (pH 7,4). O homogenato foi transferido para tubos de microcentrífuga (1,5 ml). Em seguida, o extrato bruto foi sonicado utilizando aparelho de ultrassom (Branson Sonc Power – Sonofer Cell Disruptor 450), sendo realizados cinco ciclos de 30 segundos, com intervalos de 30 segundos em banho de gelo, com amplitude de 40%. Posteriormente, o extrato foi centrifugado a 3000 g, 4°C, por 15 minutos. O sedimento foi descartado e o extrato bruto solúvel foi aliquotado e armazenado a -80°C até o seu uso. 3.11. Dosagem de proteínas As concentrações de proteínas presentes nas amostras de ES e de extrato proteico total de vermes adulto de A. ceylanicum foram estimadas conforme método descrito por Bradford (1976). A cada poço de uma placa de microtitulação (BD) foi adicionado 20 µl da amostra a ser dosada e 180 µl de reagente de Bradford [Coomassie brilliant blue R-250 0,1% (m/v) em solução aquosa com etanol 5% (v/v) e ácido fosfórico 10% (v/v), filtrado em papel filtro número 1)] (BioAgency). Sobre os poços foi acrescentado solução padrão contendo 0,5-2 µg de albumina sérica bovina - fração VI (Sigma) em 20 µl de água Mili-Q. A leitura realizada em um leitor de ELISA (Versamax Microplate Reader Tunable – Molecular Devices) com o comprimento de onda de 595 nm. A equação da curva padrão foi calculada pelo programa Excel (Microsoft Office). 3.12. ELISA Placas de microtitulação de poliestireno (BD Falcon) foram sensibilizadas com 100 µl/poço da solução de extrato proteico total (1µg/ml ) ou de ES (5µg/ml) de A. ceylanicum em tampão carbonato/bicarbonato (0,05M NaHCO3 pH 9,6). Após três 39 lavagens com PBS 0,15 M contendo Tween 20 a 0,05% (PBST 0,05%) foi realizado o bloqueio de sítios inespecíficos com solução de PBST 0,05% e caseína 3% (Molico, Nestlé) a temperatura ambiente por 90 minutos. Após nova lavagem o plasma dos hamsters foi utilizado diluído 1:100 (v/v), em duplicata e incubado por 18h, a 4° C . Repetida a lavagem com PBST 0,05% foi adicionado o conjugado biotinilado anti-IgG total de hamster (BD) na diluição de 1:5000 (v/v), incubado por 2h a 4° C. Após nova lavagem com PBST 0,05% foi adicionada a solução contendo estreptavidina (Sigma) diluída 1:3000 (v/v), em PBST 0,05% e Incubado a temperatura ambiente por 20 minutos. Após três lavagens com PBST 0,05%, a revelação da reação foi feita utilizando o cromógeno TMB (BD OptEIA®) e após 10 min. a reação foi interrompida utilizando solução de ácido sulfúrico 2M. A placa lida em espectrofotômetro (Versamax Microplate Reader Tunable – Molecular Devices) a 492 nm. Os valores de absorbância obtidos foram expressos pela média aritmética entre a duplicata de cada amostra. O cut- off foi determinado pela média das amostras negativas mais três vezes o desvio padrão. 3.13. Análise estatística Para a análise estatisticamente significativa dos dados gerados foi utilizado o software Graph Pad Prism 5. Para verificar a distribuição dos dados, foi utilizado o teste Kolmogorov-Smirnov. As análises entre dois grupos foram feitas com os métodos estatísticos teste T pareado ou não pareado (dados paramétricos) e Wilcoxon Matched Pairs ou Mann e Whitney (dados não paramétricos). Para análise de três ou mais grupos, os dados foram submetidos aos testes ANOVA ou Reapeated Measures ANOVA seguido do de Tukey (dados paramétricos) e Kruskal-Wallis ou Friedman seguido do teste de Dunns (dados não paramétricos). Foi utilizado o teste de Grubbs para detectar outliers (http://www.graphpad.com/quickcalcs/Grubbs1.cfm). Todos os resultados analisados foram considerados significativos quando apresentaram um valor de p < 0,05. 40 4. RESULTADOS 41 4. Resultados 4.1. Aferição de peso Os animais foram pesados no inicio do experimento e posteriormente a cada sete dias (Gráfico 1). Aos 7 dpi não houve diferença no ganho de peso na comparação dos grupos infectados entre si ou com o grupo NI. A partir de 14 dpi observa-se ganho de peso do grupo NI e perda de peso nos grupos 25 L3, 75 L3 e 125 L3. Houve diferença estatisticamente significativa significativa na comparação dos grupos NI com os grupos 25 L3 (p < 0,01); 75 L3 (p < 0,01); 125 L3 (p< 0,05) e 250 L3 (p < 0,01). Não houve diferença estatisticamente significativa na comparação entre os grupos infectados. Aos 21 dpi foi observado ganho de peso nos grupos NI e 25 L3. Houve perda acentuada de peso nos grupos infectados. Na comparação entre os grupos foi observada diferença estatisticamente significativa entre 125 L3 (p< 0,05), 250 L3 (p < 0,01) e NI, mostrando uma relação direta entre aumento de carga e danos causados ao hospedeiro. 0 7 14 21 70 80 90 100 110 120 130 25 L3 75 L3 125 L3 250 L3 NI Dias pós-infecção P e s o e m g ra m a s GRÁFICO 1: Alteração de peso semanal dos grupos experimentais em gramas. Não infectado (NI); infectados com A. ceylanicum, por via oral 25 L3, 75 L3, 125 L3 e 250 L3. Dados apresentados em média. 4.2. Exame parasitológico de fezes 4.2.1. Ovos por grama de fezes (O.P.G) A cinética de eliminação de ovos nas fezes dos grupos infectados com diferentes inóculos de A. ceylanicum está representada no gráfico 2B . A patência para todos os grupos foi observada aos 14 dpi. Os valores de O.P. G foram compatíveis com os 42 inóculos, ou seja o número de ovos eliminados pelo grupo 25 L3 foi menor que no grupo 75 L3 e este menor que o grupo 125 L. O grupo 250 L3 apresentou os maiores valores no exame. 4.3. Recuperação dos vermes adultos de A. ceylanicum Após 20 dias de experimento os animais foram eutanasiados para a recuperação dos vermes adultos. Dos animais do grupo infectado com 25 L3 foram recuperados ao todo do intestino delgado 42 vermes adultos de A. ceylanicum. Destes 24 machos e 18 fêmeas. A recuperação média do grupo foi de 28% em relação ao inóculo. Dos animais do grupo infectado com 75 L3 foram recuperados ao todo 112 adultos, destes 60 machos e 52 fêmeas. A média de recuperação foi 24,88 %. Dos animais do grupo infectado com 125 L3 foram recuperados ao todo 154 vermes adultos, sendo 72 machos e 82 fêmeas. A média de recuperação foi de 24, 64 %. Para o grupo infectado com 250 L3 a média de recuperação foi de 24,85% e o total de vermes obtidos do grupo foi 435, sendo 214 machos e 221 fêmeas. A proporção de machos em relação às fêmeas foi similar em todos os grupos, resultado ilustrado no gráfico 2A. 43 25 L3 75 L3 125 L3 250 L3 0 20 40 60 80 100 Machos Fêmeas 28% 24,88% 24,64% 24,85% M é d ia d e v e rm e s/ h am st e r 10 12 14 16 18 20 0 500 1000 1500 2000 6000 10000 20000 35000 AUC = AUC AUC AUC 3350 = 9250 =15050 =28150 Dias após a infecção O .P .G . A B GRÁFICO 2: Recuperação de vermes adultos e O.P.G. A) Recuperação de vermes adultos de Ancylostoma ceylanicum em intestino delgado de hamsters. Em porcentagem a taxa de recuperação em relação ao inóculo. Barra escura e branca, machos e fêmeas, respectivamente. (B) O.P.G obtido de fezes coletada nas gaiolas a cada dois dias (início 10 dpi) . Grupos infectados via oral com 25 L3 ( ), 75 L3 ( ), 125 L3 ( ) e 250 L3 ( ). AUC: área abaixo do gráfico. 44 4.4. Exames hematológicos 4.4.1. Hemograma Os grupos infectados com os inóculos de 25, 75, 125 e 250 L3 apresentaram redução gradativa dos níveis de hemácias (Gráfico 3A), hemoglobina (Gráfico 3B) e hematócrito (Gráfico 3C), quando comparados aos valores fisiológicos para hamsters e também com o grupo NI. Esta redução foi significativa na comparação do grupo NI com o grupo 125 L3 (p < 0,05) e 250 L3 (p< 0,001). Comparando os grupos infectados entre si é observado diferença significativa entre os grupos 25 L3 e 250 L3 (p < 0,01) e 75 L3 e 250 L3 (p < 0,05). Na avaliação dos níveis de hemoglobina observa-se a redução nos grupos infectados com diferença estatisticamente significativasignificativa para o grupo 250 L3 (p < 0,01) e entre os grupos 25 L3 e 250 L3 (p < 0,05). As mesmas diferenças estatisticamente significativas são observadas quando avaliamos o hematócrito dos animais. 45 NI 25 L3 75 L3 125 L3 250 L3 0 5 10 15 a* a*** a*** b*** c** H e m á c ia s ( x 1 0 6 ) m m 3 NI 25 L3 75 L3 125 L3 250 L3 0 20 40 60 80 100 a** b* H e m a tó c ri to % NI 25 L3 75 L3 125 L3 250 L3 0 5 10 15 20 25 a** b* H e m o g lo b in a ( g /d L ) A B C GRÁFICO 3: Parâmetros hematológicos no dia da eutanásia. Hemácias valores por milímetro cúbico (A), Hematócrito valores em porcentagem (B) e Hemoglobina em gramas por decilitro (C). Grupos: não infectado (NI); infectado com 25 larvas de terceiro estádio por via oral (25 L3), 75 L3, 125 L3 e 250 L3. Linha pontilhada: valores fisiológicos para hamsters fêmeas de acordo com Mitruka e Rawnsley (1981). a Estatisticamente significante comparado ao grupo NI. b Estatisticamente significante comparado ao grupo 25 L3, c Estatisticamente significante comparado ao grupo 75 L3, d Estatisticamente significante comparado ao grupo 125 L3. *= p < 0,05; **= p < 0,01;***= p < 0,001. Dados mostrados como média+ desvio padrão. 46 4.4.2. Contagem diferencial de leucócitos Os resultados da contagem diferencial de leucócitos estão no gráfico 4. Foi observado aumento do número de linfócitos com diferença estatisticamente significativa nos grupos 125 L3 (p <0.01) e 250 L3 (p <0.001) quando comparados ao grupo NI. As comparações entre os grupos infectados também mostram diferença estatisticamente significativa no número de linfócitos e eosinófilos nos grupos 75 L3 (p <0.01), 125 L3 (p <0.01) e 250 L3 (p <0.001). O grupo 250 L3 mostrou os valores mais elevados de leucócitos, neutrófilos e eosionófilos com diferença estatisticamente significativa quando comparado a todos os grupos. NI 25 L3 75 L3 125 L3 250 L3 0 20 40 60 80 a***a* b*** a*** c*** d*** L e u c ó c it o s ( X 1 0 6 ) m m 3 NI 25 L3 75 L3 125 L3 250 L3 0 10000 20000 30000 40000 a*** b*** c*** d** a** b**b** L in fó c it o s m m 3 NI 25 L3 75 L3 125 L3 250 L3 0 10000 20000 30000 a*** b*** c** d** N e u tr ó fi lo s m m 3 A C NI 25 L3 75 L3 125 L3 250 L3 0 1000 2000 3000 4000 5000 a** b** c** d** a** b** a** b** E o s in ó fi lo s m m 3 B D GRÁFICO 4: Contagem diferencial de leucócitos. (A) Leucócitos, (B) Linfócitos, (C) Neutrófilos totais e (D) eosinófilos por milímetros cúbico de sangue. Valores individuais. Grupos: não infectado (NI); infectado com 25 larvas de terceiro estágio por via oral (25 L3), 75 L3, 125 L3 e 250 L3. Linha pontilhada: valores fisiológicos para hamsters fêmeas de acordo com Mitruka e Rawnsley (1981). a Estatisticamente significante comparado ao grupo NI. b Estatisticamente significante comparado ao grupo 25 L3, c Estatisticamente significante comparado ao grupo 75 L3, d Estatisticamente significante comparado ao grupo 125 L3. *= p < 0,05; **= p < 0,01;***= p < 0,001. Dados mostrados como média+ desvio padrão. 47 4.5. Análise histológica Os cortes histológicos de intestino delgado corados por HE (Figura 2) foram avaliados qualitativamente para análise das alterações da mucosa (hipercelularidade da lâmina própria e hipersecreção das células de Paneth, hiperplasia de células caliciformes e erosão), da submucosa e muscular, e, Morfométricamente, para obtenção de medidas das vilosidades (altura e espessura) e criptas (altura), os resultados estão representados no gráfico 5. Os hamsters do grupo NI apresentaram aspecto histológico normal na mucosa, com estruturas íntegras e razão vilosidade-cripta, média de 3:1. As células de Paneth e caliciformes se apresentaram em número reduzido. O grupo 25 L3 apresentou leve perda de arquitetura intestinal com redução da altura das vilosidades e aumento do número de células caliciformes. Houve redução na relação vilosidade-cripta para 2:1, embora considerado como padrão borderline, ainda permanece dentro da normalidade. Quando comparado ao grupo NI não foram observadas lesões entéricas significativas. O grupo 75 L3 apresentou leve perda de arquitetura intestinal com redução significativa da altura das vilosidades (p< 0,05) e aumento do número de células caliciformes. Houve redução na relação vilosidade-cripta para 1:1. O grupo 125 L3 apresentou a perda de arquitetura intestinal, aumento de células caliciformes, redução da altura das vilosidades e significativa hipertrofia das criptas de Lieberkün (p< 0,05). Houve redução na relação vilosidade-cripta para 1:1. O grupo 250 L3 apresentou perda de arquitetura intestinal, aumento de células caliciformes, redução significativa na altura das vilosidades (p< 0,01) e hipertrofia das criptas de Lieberkün no intestino delgado em relação ao grupo NI., Houve redução na relação vilosidade-cripta para 1:1 Nos grupos infectados com 75, 125 e 250 L3 foi observados redução da razão vilosidade:cripta para 1:1, demonstrando que o aumento da carga parasitária teve influencia direta sobre as alterações na arquitetura da camada mucosa desse órgão. 48 NI 25 L3 75 L3 125 L3 250 L3 0 100 200 300 400 a**a* A lt u ra d a s V ilo s id a d e s (  m ) NI 25 L3 75 L3 125 L3 250 L3 0 50 100 150 200 a* A lt u ra d a s C ri p ta s d e L ie b e rk ü n (  m ) NI 25 L3 75 L3 125 L3 250 L3 0 50 100 150 E s p e s s u ra d a s V il o s id a d e s (  m ) NI 25 L3 75 L3 125 L3 250 L3 0 1 2 3 4 a* a* a* R a z ã o V ilo s id a d e :C ri p ta A B C D GRÁFICO 5: Avaliação Morfométrica do intestino delgado de antes. A- Altura das vilosidade. B- Altura das criptas de Lieberkün. C- Espessura das vilosidades. Valores em micrômetros. D- Razão vilosidade:cripta. Não infectado (NI); Infectados com A. ceylanicum, por via oral 25 larvas de terceiro estádio (25 L3), 75 L3 , 125 L3 e 250 L3. a Estatisticamente significante comparado ao grupo NI. Barra= média e erro padrão. *= p < 0,05 49 FIGURA 2 - Fotomicrografias de cortes histológicos de intestino delgado de hamster não- infectados (NI) ou infectados com 25, 75, 125, e 250 L3 de Ancylostoma ceylanicum. Aspecto histológico normal das vilosidades e criptas de Lieberkün na mucosa intestinal de hamsters grupo NI; lâmina própria hipercelular com discreta a moderada alteração da arquitetura intestinal em hamsters infectados com 25 L3 e 75 L3 ; Redução na razão vilosidade-cripta com alteração moderada à intensa da arquitetura intestinal em hamster pertencentes aos grupos 125 L3 e 250 L3. Hematoxilina-Eosina. Barra=50µm. 50 4.6. ELISA Os plasmas dos hamsters infectados com diferentes inóculos de A. ceylanicum foram testados para avaliar os níveis de IgG total frente aos antígenos de extrato bruto e ES. Todos os grupos infectados apresentaram valores de absorbâncias superior ao cut- off determinado para o ensaio, usando plasmas de animais não infectados (Gráfico 6). Foi observado diferença estatisticamente significativa na comparação entre os grupos infectados 75 L3 (p<0,01) e 250 L3 (p<0,01) com o grupo NI. Não houve diferença estatisticamente significativa ao comparar os grupos infectados entre si. Demonstrando que o aumento de anticorpos não é linear nos inóculos acima de 75 L3. NI 25 L3 75 L3 125 L3 250 L3 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 a** a** E x tr a to b ru to NI 25 L3 75 L3 125 L3 250 L3 0.0 0.5 1.0 1.5 a*** a*** a*** a*** b** b** E S A B GRÁFICO 6: Níveis de IgG total em plasma de hamsters frente ao extrato proteico total de A. ceylanicum (A) e ES (B). Grupos: não infectado (NI); infectado com 25 larvas de terceiro estádio por via oral (25 L3), 75 L3, 125 L3 e 250 L3. a Estatisticamente significante comparado ao grupo NI. b Estatisticamente significante comparado ao grupo 25 L3, *= p < 0,05; **= p < 0,01;***= p < 0,001. Dados mostrados como média+ desvio padrão. 51 4. 7.Morfometria de A. ceylanicum adultos As comparações entre as fêmeas dos grupos mostram diferenças estatisticamente significativa em diversos parâmetros. Houve redução do comprimento da cavidade bucal (p < 0,001); largura da cavidade bucal (p < 0,05); distância da vulva à extremidade posterior (p < 0,001); distância do ânus à extremidade posterior (p < 0,01); largura total (p < 0,01) e comprimento do dente (p < 0,01). Os demais parâmetros não apresentaram diferença estatisticamente significativa significativa (Tabela 1). Dos parâmetros avaliados nos machos dos grupos 25 L3 e 250 L3, somente houve diferença estatisticamente significativa para a média de largura da cavidade bucal que se apresentou maior no grupo de 250 L3 (Tabela 2) 52 Tabela 1 - Morfometria de fêmeas adultas de Ancylostoma ceylanicum (média ± desvio padrão) Parâmetros (µm) Inóculo p 25 L3 (n=15) 75 L3 (31) 125 L3 (28) 250 L3 (n=66) Comprimento da cabeça até a papila cervical 0.504±0.06 0.572±0.02 a 0.579±0.06 a 0.519±0.03 b,c < 0.0001 Distância entre a vulva e a extremidade posterior 0.144±0.01 0.162 ±0.01 a 0.162 ±0.01 a 0.133±0.01 b,c < 0.0001 Distância da vulva ao ânus 2.273±0.58 2.406±0.29 2.213±0.17 2.247±0.24 0.0676 Comprimento do esôfago 0.751±0.03 0.842±0.03 a 0.841±0.04 a 0.761±0.04 b,c < 0.0001 Comprimento do dente 0.049±0.00 0.046±0.00 0.047±0.00 0.045±0.01 0.1407 Comprimento da cavidade bucal 0.158±0.01 0.128±0.01 a 0.126±0.01 a 0.149±0.01 b,c < 0.0001 Largura da cavidade bucal 0.134±0.01 0.109±0.00 a 0.113±0.00 a 0.135±0.01 b,c < 0.0001 Largura dente 0.057±0.01 0.046±0.00 a 0.047±0.00 a 0.057±0.00 b,c < 0.0001 Comprimento total 7.423±0.49 7.363±0.55 7.248±0.55 7.103±0.54 0.1349 Largura total 0.346±0.02 0.348±0.03 0.345±0.02 0.323±0.02 b,c 0.0001 a Estatisticamente significante comparado ao grupo 25 L3. b Estatisticamente significante comparado ao grupo 75 L3. c Estatisticamente significante comparado ao grupo 125 L3. p Obtido do teste Kruskull-Wallis . 53 Tabela 2 - Morfometria de machos adultos de Ancylostoma ceylanicum (média ± desvio padrão) Parâmetros Inóculo p 25 L3 (n=10) 75 L3 (n=29) 125 L3 (n=29) 250 L3 (n=65) Comprimento da cabeça até a papila cervical 0.450±0.05 0.496±0.05 a 0.518±0.08 a 0.468±0.03 b,c < 0.0001 Comprimento do esôfago 0.698±0.06 0.726±0.11 0.775±0.04 a 0.688±0.02 b,c < 0.0001 Comprimento do espículo 0.659±0.09 0.827±0.09 a 0.831±0.09 a 0.731±0.14 b,c < 0.0001 Comprimento do dente 0.040±0.00 0.039±0.00 0.040±0.00 0.040±0.00 0.0857 Comprimento da cavidade bucal 0.137±0.01 0.125 ±0.01 a 0.122 ±0.01 a 0.139±0.00 b,c < 0.0001 Largura da cavidade bucal 0.110±0.01 0.099±0.01 0.099±0.01 0.115±0.01 b,c < 0.0001 Comprimento total 6.065±0.39 6.031±0.81 6.193±0.38 5.984±0.35 0.3217 Largura total 0.281±0.01 0.285±0.02 0.273±0.02 0.283±0.01 0.2549 Largura dente 0.055±0.00 0.032±0.00 a 0.035±0.00 a 0.053±0.00 b,c < 0.0001 a Estatisticamente significante comparado ao grupo 25 L3. b Estatisticamente significante comparado ao grupo 75 L3. c Estatisticamente significante comparado ao grupo 125 L3. p Obtido do teste Kruskull-Wallis . 54 5. Discussão Os hamsters são hospedeiros permissivos ao parasito A. ceylanicum e a sua infecção por ancilostomideos está bem estabelecida na literatura (Garside e Behnke 1989; Bungiro et al., 2001, 2008; Dondji et al., 2008; Dias et al., 2013b). Animais infectados apresentam alteração no crescimento e anemia, semelhante ao hospedeiro humano. A espoliação sanguínea dos ancilostomideos foi estimada em 200 µl por verme/dia (Roche e Patrzed, 1966), que em infecções maciças associadas a uma nutrição deficiente podem causar anemia ferropriva, perda de proteínas e dano tecidual (Bundy et al., 1995; Hotez e Pritchard, 1995; Stoltzfus et al., 1997). A gravidade da doença em humanos está diretamente associada ao número de vermes albergados no intestino. Por exemplo, enquanto a infecção por 50 vermes adultos de A. ceylanicum causaria apenas sintomas brandos, a infecção por 1000 vermes poderia causar uma doença mais grave (Behnke, 1987). No presente trabalho observamos que os hamsters infectados com apenas 25 L3 não apresentaram alterações nos parâmetros hematológicos. Neste caso, provavelmente os mecanismos fisiológicos foram suficientes para compensar a espoliação sanguínea. Os hamster infectados com os maiores inóculos apresentaram redução significativa nos níveis de hemoglobinas e contagem de eritrócitos em comparação ao grupo NI. O grupo 250 L3 foi o que apresentou os valores hematológicos mais reduzidos em comparação ao grupo NI. Como a espoliação sanguínea é a principal consequência do parasitismo dos ancilostomideos este resultado não foi inesperado. O trato gastrointestinal não é apenas um conjunto de órgãos para a digestão, absorção e excreção, é também o habitat de vários microrganismos, incluindo os ancilostomideos. A resposta imune do trato gastrointestinal atua como a primeira linha de defesa contra antígenos administrados e patógenos intestinais (Hooper e Gordon, 2001; Hooper et al., 2012). Em estudos com hamsters experimentalmente infectados com A. ceylanicum foram observados em cortes histológicos do intestino delgado alterações na arquitetura da mucosa intestinal, como redução na altura das vilosidades, diminuição da profundidade das criptas de Lieberküm, aumento no número de mastócitos, células caliciformes e eosinófilos (Alkazmi et al., 2006, 2008; Alkazmi e Behnke, 2013). Estas mudanças observadas estão associadas com a carga parasitária e duração da infecção. No presente trabalho foi observado uma correlação positiva entre carga parasitária e os 55 danos causados ao hospedeiro. Houve redução na altura das vilosidades nos grupos infectados e a destruição das vilosidades no grupo 250 L3. Outro efeito do parasitismo gastrointestinal é a redução da ingestão voluntária de comida pelo hospedeiro (Sykes, 1987). Desta forma, as infecções agudas provocadas por uma grande carga de vermes pode resultar numa diminuição significativa da taxa de ingestão de alimentos e uma diminuição na absorção de nutrientes. Este fenômeno pôde ser confirmado pela perda de peso durante o experimento dos grupos infectados. A quantidade de peso perdido foi mais proeminente no grupo 250 L3, provavelmente devido à associação entre carga parasitária e dano tecidual causado pelo verme e inflamação local. Com base no dano tecidual, a distribuição dos vermes no inóculo mais baixo (25 L3 e 75 L3) foi restrita ao duodeno e jejuno. Somente observamos danos na porção do íleo no grupo 250 L3. Não observamos, mesmo no maior inóculo, erosão ou lesão transmural. A proporção de fêmeas e machos recuperados foi similar em todos os grupos, o que poderia ser explicado pelo fato dos animais terem sido eutanasiados aos 21 DPI, durante a fase aguda da ancilostomose. Estes dados corroboram os achados de Roche e Patrzed (1966), que demonstraram uma relação direta entre o tempo de infecção e a proporção de fêmeas:machos. Visto que os machos são eliminados mais prematuramente que as fêmeas devido a uma migração mais rápida pelo intestino, em infecções crônicas a proporção fêmeas e machos seriam diferentes (Roche e Patrzed 1966). Foi observado também que a quantidade de ovos liberados nas fezes foi proporcional ao inóculo recebido, demonstrando que o tamanho do inóculo utilizado não afetou o estabelecimento, sobrevivência ou a fecundidade dos vermes. Em relação ao estabelecimento das larvas de A. ceylanicum nossos resultados corroboram os de Norozian-Amiri e Behnke (1993). Estes autores observaram uma correlação negativa o número de larvas que conseguem se estabelecer e o inóculo administrado, quando esse é superior a 250 L3. Neste trabalho foram utilizados inóculos de 10, 25, 50, 100, 250, 500 e 1000 L3 e os hamsters (machos e fêmeas) foram sacrificados aos 7 dpi. O sucesso de recuperação foi de 56% no grupo infectado com 1000 L3 a 84% no grupo infectado com 100 L3. 56 No presente trabalho as fêmeas do grupo 250 L3 apresentaram redução significativa em diversos parâmetros morfométricos avaliados, provavelmente um mecanismo de compensação frente à redução de recursos disponíveis. Tompkins e Hudson (1999) identificaram uma correlação negativa entre o tamanho das fêmeas de nematódeos (Heterakis gallinarum) e a carga parasitária em infecções naturais, onde observaram um menor número de ovos postos por estas fêmeas. Estes autores sugeriram que o tamanho dos vermes é um bom preditor da fecundidade das fêmeas. Fecundidade reduzida em vermes com alteração de tamanho tem sido relatada em vários modelos de hospedeiros e nematódeos (Michael e Bundy, 1989; Goater, 1992; Gulland, 1992; Stear, et al., 1996). Marcogliese (1997) observou uma relação direta entre comprimento e fecundidade em Pseudoterranova decipiens que infectavam focas cinzentas. Um possível mecanismo para explicar a deficiência no crescimento dos vermes foi detalhado por Stear e colaboradores (1995), que encontraram uma correlação negativa entre carga parasitária e fecundidade causada pela inibição do crescimento dos vermes devido à produção local de IgA contra Ostertagia circumcincta infectando ovelhas. Uma das funções preditas para IgA na mucosa intestinal seria atingir o parasito através de mecanismos, como neutralização de moléculas secretadas e indução da degranulação de eosinófilos, interferindo com a alimentação do parasito e sobrevivência (Bungiro et al. 2008). Além disso, Davey e colaboradores (2013) demonstraram que a resposta IgG, IgM e IgA frente a antígenos de ancilóstomos adultos parece ser mais robusta em comparação às respostas a antígenos de larvas e que os padrões de expressão de anticorpos estão associados com a magnitude do inóculo e com o intervalo de tempo de exposição às larvas. Além disso, em cães, sem raça definida, infectados com A. caninum e A. braziliense, Dias e colaboradores (2013) viram que a resposta humoral contra antígenos excretados e secretados por vermes adultos foi mais sensível e específica do que a resposta induzida pelo antígeno bruto. No presente trabalho, foi demonstrado que mesmo um baixo inóculo (25 L3) foi suficiente para estimular a produção de anticorpos. No entanto, não houve uma correlação com o número de vermes, pois o inóculo mais elevado não causou uma maior produção de IgG quando comparado com os grupos 125 L3 e 75 L3. Não foi observado redução da fecundidade das fêmeas nos grupos analisados. Este resultado é diferente do encontrado por Yazima e Machida (1958), e Sowemimo e Asaolu (2008), cujos trabalhos demonstraram que a carga parasitária foi inversamente 57 proporcional ao número de ovos produzidos pelas fêmeas de A. caninum em cães infectados experimentalmente. O presente trabalho teve como fator limitante o reduzido volume fecal produzido por hamster, consequentemente os exames de fezes tiveram que ser realizados em pool, perdendo os dados em relação às variações individuais. Desta forma impedindo as análises estatisticamente significativas. A competição interespecífica é muito comum, considerando que os hospedeiros podem estar coinfectados naturalmente por diversos parasitos ao mesmo tempo (Petney e Andrews, 1998; Cox, 2001; Fenton et al, 2014.). A associação entre espécies diferentes no mesmo hospedeiro pode resultar em efeitos sinérgicos ou antagonistas para os parasitos envolvidos. Blackwell e colaboradores (2013) observaram a inibição da população de Giardia lamblia quando ancilostomideos estavam coinfectando o mesmo hospedeiro. Eles analisaram amostras de fezes de 3.275 pessoas durante seis anos. Após o tratamento com mebendazol os ancilostomideos foram eliminados. Como consequência houve o aumento da população de G. lamblia. Uma associação negativa entre Eimeria sp e nematodas (Heligmosomoides polygyrus, Syphacia stroma, Capillaria americana, Aonchotheca murissylvatici e Aspiculuris sp) foi observada por Fenton e colaboradores (2014) em roedores das espécies Apodemus sylvaticus, Peromyscus leucopus e Peromyscus maniculatus infectados naturalmente. No estudo os animais foram capturados, identificados e em seguida libertados. Os animais foram subdividos em dois grupos: tratados com ivermectina e não tratados. Uma amostra de fezes foi coletada para identificar quais espécies infectavam esses roedores. Após a recaptura dos animais foi observado que as populações de Eimeria sp aumentaram após o tratamento com o anti-helmínticos. Os autores consideraram que o estudo forneceu uma clara evidência de interações antagonistas entre os nematodas e Eimeria sp. Considerando-se o comprimento total e largura dos vermes, os machos de A. ceylanicum não apresentaram reduções significativas no tamanho, apesar de viver no mesmo ambiente das fêmeas e receber a mesma pressão do sistema imune do hospedeiro. Em comparação, o efeito da densidade da população foi mais evidente nas fêmeas, que apresentaram reduções em vários parâmetros avaliados. Nossa hipótese é que devido às demandas energéticas mais elevadas nas fêmeas, especialmente relacionadas ao processo de produção de ovos e como não observamos alteração na fertilidade, assumimos que o metabolismo energético das fêmeas foi direcionado para a produção de ovos, à custa do desenvolvimento do corpo 58 6. Conclusões 1) O aumento na carga parasitária de A. ceylanicum afeta o hospedeiro e o parasito. As alterações de peso, hematológicas e histopatológicas são causadas diretamente pelo verme durante espoliação sanguínea e agravadas com o aumento da carga parasitária. 2) O elevado número de vermes, parasitando o intestino delgado de hamsters também afeta o seu próprio desenvolvimento, principalmente nas fêmeas devido à competição intraespecífica. . 59 CAPÍTULO 2 - COINFECÇÕES 60 6. OBJETIVOS 61 6. Objetivos 6.1. Objetivo geral Analisar os efeitos da coinfecção, de hamster por Ancylostoma ceylanicum e Schistosoma mansoni analisando parâmetros parasitológicos, hematológicos e imunológicos. 6.2. Objetivos específicos 6.2.1. Avaliar parâmetros hematológicos em hamster infectados por A. ceylanicum e S. mansoni individualmente e coinfectados pelas duas espécies; 6.2. 2. Avaliar a influência da coinfecção por A. ceylanicum no curso da infecção por S. mansoni; 6.2.3. Avaliar a influência da coinfecção por S. mansoni no curso da infecção por A. ceylanicum, 6.2.4. Avaliar os níveis de IgG total produzidas frente ao extrato bruto de A. ceylanicum, e antígenos ES de A. ceylanicum, SWAP e SEA de S. mansoni, nos grupos infectados por A. ceylanicum, S. mansoni, e coinfectados pelas duas espécies. 6.2.5. Analisar histologicamente granulomas no intestino delgado de hamsters infectados com S. mansoni, coinfectados com A. ceylanicum e previamente infectados por A. ceylanicum com posterior infecção por S. mansoni; 6.2.6. Realizar análises histopatológicas do intestino delgado de animais infectados por A. ceylanicum, por S. mansoni, e coinfectados pelas duas espécies. 62 7. Material e Métodos 7.1. Delineamento experimental Para a avaliação dos efeitos da coinfecção por A. ceylanicum e S. mansoni foram realizados dois experimentos, alternando a sequencia de infecção. Experimento 1: hamsters foram subdivididos em grupos: não infectados (NI-1), infectados com 50 L3 de A. ceylanicum (Acey-1), infectados com 30 cercárias de S. mansoni (Sm-1), infectados inicialmente com 50 L3 de A. ceylanicum e após 20 dias coinfectados com 30 cercárias de S. mansoni (Acey+Sm). Os grupos infectados e controle negativo foram acompanhados por 75 dias. Experimento 2: hamsters foram subdivididos em grupos: não infectados (NI-2), infectados com 50 L3 de ceylanicum (Acey-2), infectados com 30 cercárias de S. mansoni (Sm-2), infectados inicialmente por S. mansoni e após 65 dias coinfectados com A. ceylanicum (Sm+Acey). Os grupos infectados e controle foram acompanhados por 90 dias. Foram avaliados os efeitos da infecção e da coinfecção utilizando parâmetros parasitológicos, clínicos hematológicos, histopatológicos. Este projeto foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética em experimentação Animal da Universidade Federal de Minas Gerais (CEUA-UFMG) sob o número 52/2011 (Anexo II). 63 FIGURA 3: Esquema delineamento experimental das coinfecções. Hamster (fêmeas, 8-10 semanas) Experimento 1 Grupo:NI-1 (n=14) Grupo: Acey- 1(n=14) Grupo: Sm-1 (n=14) Grupo: Acey+Sm (n=14) Experimento 2 Grupo: NI-2 (n=16) Grupo: Acey-2 (n=21) Grupo:Sm-2 (n=21) Grupo: Sm+Acey (n=21) Eutanásia aos 90 dpi Coinfecção aos 65 dpi Eutanásia aos 75 dpi Coinfecção aos 20 dpi 64 7.2. Infecção experimental 7.2.1.. Infecção por Schistosoma mansoni Os hamsters dos grupos Sm-1, Sm-2, Acey+Sm e Sm+Acey foram infectados com cercárias da cepa LE, cedidas pelo Moluscário Lobato Paraense/CpqRR/FIOCRUZ/René Rachou. As cercárias foram trazidas para o LPM e visualizadas em microscópio estereoscópico quanto a sua integridade (cabeça e cauda) e motilidade. A e a contagem foi feita por estimativa. Os hamsters foram infectados via subcutânea, no pescoço, com 30 cercárias, em um volume máximo de 100 µl (Peters e Warren, 1969). 7.2.2. Infecção por Ancylostoma ceylanicum O inóculo foi preparado com 50 L3 e a infecção foi realizada como descrito no item 3.2.1 (capítulo 1). 7.3. Coleta de sangue As coletas de sangue foram realizadas conforme descrito no Tópico 3.3 (capítulo 1). As coletas do experimento 1 ocorreram nos dias 0, 30, 60, e 75 dpi (eutanásia). No experimento 2 as datas de coleta foram 0, 30, 60 e 90 dpi (eutanásia). 7.4. Aferição de peso Os animais foram pesados a cada 7 dias em balança semi-analítica até o término do experimento. 7.5. Exame parasitológico de fezes 7.5.1. Fórmol-éter As fezes dos animais infectados com S. mansoni foram coletadas a partir de 30 dpi e realizado a técnica de formol-éter (Ritchie, 1948). Foram coletados dois gramas de fezes por grupo. As fezes foram homogeneizadas em 15 ml de salina 0,85%. A solução fecal obtida foi filtrada em gaze dobrada sobre um cálice e o conteúdo transferido para um tubo de 15 ml. Este foi centrifugado a 2400 g, 3 min., temperatura ambiente. O 65 sobrenadante descartado. O pellet foi ressuspendido em 10 ml de salina e adicionado 5 ml de éter etílico (Synth). O tubo foi agitado vigorosamente em vórtex por 1 min. e centrifugado novamente a 2400 g, por 3 min. O sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspendido em 1 ml de solução de formaldeído 3,7% tamponado. Foram retiradas alíquotas de 50 µl e a leitura realizada em quadruplicatas. Para facilitar a contagem foi acrescentada solução de lugol. A quantidade total de ovos foi estimada a partir da média de ovos obtidos nas leituras e o valor estimado para o volume de 1 ml. 7.5.2. O.P.G. Realizado conforme descrito no item 3.5. (capítulo 1). Para os animais coinfectados (Acey+Sm e Sm+Acey) foram realizados as duas técnicas já citadas. Os exames parasitológicos de fezes foram realizados até o dia anterior a eutanásia dos grupos experimentais. 7.6. Necropsia e recuperação dos vermes adultos 7.6.1. Recuperação de S.mansoni Após a eutanásia os hamsters infectados com S. mansoni tiveram a cavidade abdominal e torácica abertas e as vísceras expostas para a visualização do sistema porta. Após ligadura do reto, a veia porta foi seccionada na região de fusão de seus aferentes mesentéricos. Uma agulha acoplada a uma bomba de perfusão (Automatic Pippeting Brewer Machine, modelo 60453, B.D.) foi introduzida na aorta torácica para a realização da perfusão com solução salina contendo EDTA (NaCl a 0,85% e EDTA 5M 0,05% ). O líquido contendo os vermes que extravasaram pela veia porta rompida de cada animal foi recolhido em cálices individuais. A perfusão foi repetida introduzindo a agulha no seio hepático. O material recolhido de cada animal foi decantado por 30 minutos. O sobrenadante aspirado, descartado e, ao cálice, foi adicionado mais solução salina. O procedimento foi repetido até que o sobrenadante apresentou-se límpido. Os vermes presentes em cada cálice foram vertidos em placas de Petri e observados em microscópio estereoscópico, separados por sexo e contados (Pellegrino e Siqueira, 1956 e Valadares et al., 1981). 66 7.6.2. Recuperação de A. ceylanicum Realizado conforme descrito no item 3.6. (capítulo 1). 7.7. Quantificação de ovos de S. mansoni retidos no fígado A quantificação de ovos retidos no fígado foi determinada de acordo com a técnica descrita por Cheever (1968). Após a perfusão foi retirado o lóbulo maior do fígado dos animais infectados por S. mansoni. Estes foram pesados em balança analítica e transferidos para tubos individuais de poliestireno de 50 ml contendo solução de hidróxido de potássio (KOH) a 5%. A digestão ocorreu à temperatura de 50 ºC por 90 minutos ou até que não se observasse a presença de fragmentos de tecido. O conteúdo dos frascos foi transferido para tubos de 15 ml e centrifugados por 1 min. a 200 g. O sobrenadante foi retirado por sucção e desprezado, permanecendo 1ml do produto da digestão. Foram adicionados 14 ml de solução salina 0,85% e o tubo agitado manualmente, seguido da repetição da centrifugação. O procedimento de lavagem foi repetido por cinco vezes. Após a última lavagem foi adicionado 5 ml de formaldeído 3,7% tamponado. A contagem dos ovos foi realizada em duplicata e a contagem total dos ovos estimada. 7.8. Processamento histológico das amostras obtidas durante as necropsias Realizado conforme descrito no item 3.8. (capítulo 1). 7.9. Avaliação histopatológica de intestino delgado As imagens das lâminas foram visualizadas em microscópio de luz com aumento de 400 vezes e digitalizadas através da microcâmera Leica DFC340FX associada ao microscópio Leica DM5000B. As imagens obtidas foram analisadas com auxílio do software ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Os cortes de intestino delgado foram avaliados qualitativamente quanto às alterações da mucosa (hipercelularidade da lâmina própria e hipersecreção das células de Paneth, hiperplasia de células caliciformes e erosão), da submucosa e muscular, e, 67 Morfométricamente, para obtenção de medidas das vilosidades (altura e espessura) e criptas (altura). Foram analisados 10 vilosidades hamster/grupo. Os granulomas presentes nos cortes foram avaliados qualitativas e morfométricas quanto ao processo inflamatório, à área média dos granulomas e o seu estágio evolutivo de acordo com o seu componente predominante: Necrótico-exudativa, produtiva, produtiva a cura por fibrose e cura por fibrose (Raso et al. 2012). 7.10. Preparação de antígenos 7.10.1.. Antígeno de Excreção e secreção de verme adulto de A. ceylanicum Preparado conforme descrito no item 3.11. (capítulo 1). 7.10.2. Antígeno solúvel de verme adulto (SWAP) e Antígeno de ovo de S. mansoni (SEA) Os antígenos SWAP e SEA foram gentilmente cedidos pela Dra. Cíntia Fagundes, Departamento de Bioquímica e Imunologia, ICB-UFMG e foram preparados segundo protocolo abaixo. Camundongos C57BL/6 foram infectados por via subcutânea com 120 cercárias do S. mansoni. Após 45 dias de infecção, os animais foram eutanasiados e seu sistema porta-hepática perfundido usando solução NaCl 1,7% (solução salina) contendo heparina 0,05 U/mL (Smithers e Terry, 1965). Os vermes recuperados foram lavados exaustivamente em solução salina tamponada com fosfato, PBS, sendo então estocados a -20 o C em volume mínimo de tampão (Goes et al., 1989). Após a perfusão, os fígados e intestinos foram coletados. Para a preparação de SWAP cerca de 20 mL de vermes congelados foram triturados em Potter e ultracentrifugados a 37.000 rpm, por 1 hora, a 4 o C (Ultracentrífuga Sorvall OTD5B). No sobrenadante obtido foi feita a dosagem de proteína, segundo Bradford (1976). Alíquotas foram armazenadas a -70 o C, até o uso. O sedimento da primeira centrifugação foi levado a uma segunda extração, seguindo o mesmo procedimento. A luz intestinal foi lavada com solução salina 1,7% e os dois órgãos foram incubados separadamente por 48 horas, a 4 o C, em salina 1,7% e, nova incubação a 37 o C 68 foi realizada. Fígados e intestinos foram triturados, separadamente, em liquidificador, a fim de liberar os ovos do parasito dos tecidos do animal. Os ovos, lavados em solução salina 1,7%; Os ovos foram concentrados em cálices de decantação e o sobrenadante aspirado e descartado. Este procedimento foi repetido até que os ovos se encontrassem límpidos. Os ovos foram filtrados em tela de Kato (poro de 0,09 mm) e lavados em PBS 0,15 M. Essa suspensão de ovos, em volume mínimo de tampão, foi processada segundo técnica modificada a partir de Carter e Colley (1978). Após ser triturada em Potter, em banho de gelo, o macerado resultante foi incubado por 18 horas a 4 o C, antes de ser centrifugado a 37.000 rpm, por 1 hora, a 4 o C (ultracentrífuga Sorvall OTD5B). No sobrenadante obtido foi feita a dosagem de proteína, segundo Bradford (1976). Alíquotas foram armazenadas a -70 o C, até o uso. 7.11. Dosagem de proteínas As concentrações de proteínas presentes nas amostras de extrato proteico total de vermes adulto de A. ceylanicum, SWAP e SEA foram estimadas conforme descrito no Tópico 3.12. 7.12. ELISA Placas de microtitulação de poliestireno (BD Falcon) foram sensibilizadas com 100 µl/poço da solução de extrato proteico total de A. ceylanicum (1µg/ml ) ou de ES (5µg/ml) ou SWAP (1 µg /ml) ou SEA (3 µg /ml) em tampão carbonato/bicarbonato (0,05M NaHCO3 pH 9,6). A metodologia para ELISA foi feita conforme descrito no Tópico 3.13. 7.13. Análise estatisticamente significativa Para a análise estatisticamente significativa dos dados gerados foi utilizado o software Graph Pad Prism 5. Para verificar a distribuição dos dados, foi utilizado o teste Kolmogorov-Smirnov. As análises entre dois grupos foram feitas com os métodos estatísticos teste T pareado ou não pareado (dados paramétricos) e Wilcoxon Matched Pairs ou Mann e Whitney (dados não paramétricos). Para análise de três ou mais grupos, os dados foram 69 submetidos aos testes ANOVA ou Reapeated Measures ANOVA seguido do de Tukey (dados paramétricos) e Kruskal-Wallis ou Friedman seguido do teste de Dunns (dados não paramétricos). Foi utilizado o teste de Grubbs para detectar outliers (http://www.graphpad.com/quickcalcs/Grubbs1.cfm). Todos os resultados analisados testes foram considerados significativos quando apresentaram um valor de p < 0,05. 70 8. RESULTADOS EXPERIMENTO 1 71 8. Resultados experimento 1 8.1. Aferição do peso Os animais foram pesados no dia 0 dpi e posteriormente a cada sete dias até o término dos experimentos. Os grupos NI-1 e Sm-1 apresentaram ganho de peso em todas as datas de aferição. Os animais do grupo Acey-1 e Acey + Sm apresentaram oscilação de peso durante o experimento, alternando períodos de ganho e perda de peso (Gráfico 7). Foi observada diferença estatisticamente significativa a partir de 28 dpi entre os grupos NI-1 e Acey-1 (p < 0,05); NI-1 e Acey+Sm (p < 0,01) ; Sm e Acey- 1 (p < 0,01) ; Sm-1 e Acey+ Sm (p < 0,01), mantendo esta diferença em todas as datas analisadas. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativa na comparação dos grupos NI-1 e Sm-1 ou Acey-1 e Acey+Sm durante o experimento. 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 75 70 80 90 100 110 120 130 140 NI-1 Acey-1 Acey+Sm Sm-1 Dias pós infecção coinfecção P e s o c o rp o ra l (g ) GRÁFICO 7- Peso médio dos grupos ao longo do experimento. Não infectado (NI- 1), Infectado com 50 L3 de A. ceylanicum (Acey-1), Infectado com 30 cercárias de S. mansoni (Sm-1). Infecção por A. ceylanicum e posteriormente por S. mansoni (Acey+Sm). 72 8.2. Exame parasitológico de fezes 8.2.1. O.P.G A cinética de eliminação de ovos de A. ceylanicum nas fezes dos grupos Acey-1 e Acey+Sm está representada no gráfico 8. A patência observada foi de 16 dias. O pico de eliminação ocorreu aos 26 dpi para o grupo Acey-1 e 32 dpi para Acey+Sm. 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 44 46 48 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 73 75 0 1000 2000 3000 4000 5000 Acey-1 Acey +Sm Dias pós-infecção AUC= 41000 AUC= 32570 Coinfecção O .P .G GRÁFICO 8- Eliminação de ovos de A. ceylanicum. Ovos por grama de fezes (O.P.G.). Infectado com 50 L3 de A. ceylanicum (Acey-1). Infectado com 50 L3 de A. ceylanicum e aos 20 dpi coinfectado com 30 cercárias de S. mansoni (Acey+Sm). AUC= Area abaixo do gráfico. 8.2.2. Eliminação de ovos de S. mansoni Foram observados ovos de S. mansoni nas fezes do grupo Sm-1 e Acey+Sm aos 42 dpi. O pico de eliminação ocorreu aos 46 dpi para ambos os grupos (Gráfico 9) 73 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 0 5 10 15 20 Sm-1 Acey+Sm AUC= 17.50 AUC= 25,00 Dias pós coinfecção O v o s S . m a n s o n i GRÁFICO 9- Eliminação de ovos de Schistosoma mansoni em fezes de hamster infectados. Média de eliminação por grupo. Infectado com 50 L3 de A. ceylanicum e coinfectados após 20 dias com 30 cercárias de S. mansoni (Acey+Sm). Infectado com 30 cercárias de S. mansoni (Sm-1). 8.3. Recuperação dos vermes adultos de A. ceylanicum e S. mansoni Após 75 dias de acompanhamento os animais foram eutanasiados para a recuperação dos vermes adultos. Do grupo Acey-1 (7 animais) foram recuperados do intestino delgado o total de 49 vermes adultos de A. ceylanicum. Destes 23 machos e 26 fêmeas. Do grupo Sm-1 (10 animais) foram recuperados 35 vermes, sendo 18 machos e 13 fêmeas de S. mansoni. No grupo Acey+Sm (6 animais) foram recuperados no intestino delgado 47 vermes, sendo 21 machos e 26 fêmeas de A. ceylanicum. Dos vasos mesentérios, após a realização da perfusão, foram recuperados 11 vermes adultos de S. mansoni. Destes 7 eram machos e 4 fêmeas. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos comparados. A média de recuperação de vermes adultos por grupo está ilustrada no gráfico 10. 74 Acey-1 Acey+Sm 0 5 10 15 Machos Fêmeas 12,85% 11,75% M é d ia d e A . c e yl a ni cu m / h am st er Sm-1 Acey+Sm 0 2 4 6 Machos Fêmeas 10,60% 4,58% * M é d ia d e S. m an so ni / h am st er A B GRÁFICO 10- A: Média de recuperação de vermes adultos de A. ceylanicum do intestino delgado de hamster. B: Média de recuperação de vermes adultos de S. mansoni dos vasos mesentéricos de hamster. Eutanásia realizada aos 75 dias de experimento. Infectado com 50 L3 de A. ceylanicum (Acey-1)( n=7). Infectado com 30 cercárias de S. mansoni (Sm-1) ( n=10). Infectado por 50 L3 de A. ceylanicum e aos 20 dpi coinfectado por 30 cercárias de S. mansoni (Acey+Sm) ( n= 6), porcentagem de recuperação média dos vermes adultos em relação ao inóculo p > 0,05. 8.4. Quantificação de ovos de S. mansoni retidos no fígado O número de ovos retidos no fígado de animais infectados e coinfectados estão apresentados no gráfico 11. O peso médio do lóbulo do fígado do grupo Sm-1 foi 2,66 ± 0,64 g e do grupo Acey+Sm foi 2,15±0,29 g. Na comparação entre os grupo Sm-1 e Acey+Sm não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas. 75 Sm-1 Acey+Sm 0 2000 4000 6000 O v o s r e ti d o s n o f íg a d o GRÁFICO 11- Ovos de S. mansoni retidos no fígado. Necropsia realizada aos 75 dias de experimento. Infectado com 30 cercárias , Sm-1 ( n=10). Infectado com 50 L3 de A. ceylanicum e posteriormente por com 30 cercárias de S. mansoni aos 20 dpi, Acey+Sm ( n= 6). Dados mostrados como média+ desvio padrão. p > 0,05. 8.5. Exames hematológicos 8.5.1. Série vermelha O hemograma realizado aos 30 dpi (Gráfico 12A-C) apresentou alteração dos níveis de hemácias, hemoglobina e hematócrito nos grupos Acey-1 e Acey+Sm. Houve redução significativa do número de hemácias para os grupos Acey-1 (p<0,01) e Acey+Sm (p<0,001) quando comparados com o grupo NI-1. Os níveis de hemoglobina e hematócrito também se apresentaram reduzidos, com diferença significativa para os grupos Acey-1 (p<0,001) e Acey+Sm (p<0,01) quando comparados com o grupo NI-1. Na comparação entre os grupos Acey-1 e Acey+Sm não foi observada diferença estatisticamente significativa. O grupo Sm-1 não apresentou alteração significativa em relação ao grupo NI-1 em nenhum dos parâmetros avaliados. Entretanto, todos os grupos apresentaram as médias abaixo dos valores fisiológicos para hamster fêmeas. O gráfico 13 mostra as alterações observadas para os grupos Acey-1 e Acey+Sm dos níveis de hemácias, hemoglobina e hematócrito aos 60 dpi. O número de hemácias circulantes está reduzido para os grupos Acey-1 (p < 0,05) e Acey+Sm (p < 0,05) em relação ao NI-1. Os valores destes grupos estão abaixo do fisiológico determinado para hamsters fêmeas. O grupo Sm-1 não apresentou alteração nos níveis de hemácias, hemoglobina ou hematócrito em relação ao grupo NI-1. Os níveis de hemoglobina apresentaram alteração significativa para os grupos Acey-1 (p < 0,05) e Acey+Sm (p < 0,05) em relação ao NI-1. Na avaliação dos níveis de hemoglobina todos os grupos 76 apresentam valores abaixo do fisiológico. Em relação ao hematócrito não é observada diferença estatisticamente significativa entre os grupos NI-1 e infectados. Aos 75 dpi (gráfico14, A-C) foi observado aumento dos níveis de hemácias, hemoglobina e hematócrito em todos os grupos em comparação aos hemogramas realizados aos 30 e 60 dpi. Em relação ao número de hemácias o grupo Acey-1 (p < 0,01) apresenta valores mais baixos que os demais grupos, com diferença estatiticamente significativa em relação o NI-1. Também se observa diferença entre o grupo Acey+Sm (p < 0,05) e o NI-1. Vale resaltar que todos os grupos apresentaram valores compatíveis com os fisiológicos. Em relação aos níveis de hemoglobina foi observada diferença significativa ao comparar o grupo NI-1 com o grupo Acey-1 (p < 0,001) e Sm-1 (p < 0,01). Para os valores de hematócrito houve diferença entre os grupos na comparação dos grupos NI-1 e Acey-1 (p < 0,01); Acey-1 e Acey+Sm (p < 0,05). 77 A NI-1 Acey-1 Sm-1 Acey+Sm 0 2 4 6 8 10 a*** c** a*** c** H e m á c ia s ( x 1 0 6 ) m m 3 NI-1 Acey-1 Sm-1 Acey+Sm 0 5 10 15 20 a*** c*** a*** c*** H e m o g lo b in a ( g /d L ) NI-1 Acey-1 Sm-1 Acey+Sm 0 20 40 60 80 100 a***a*** c** c* H e m a tó c ri to % E F B C GRÁFICO 12- Hemograma realizado aos 30 dpi. Contagem global de hemácias em milímetros cúbicos (A); Níveis de hemoglobina em grama por decilitro (B); Hematócrito em porcentagem (C). Não infectado (NI-1)(n=12). Infectados com A. ceylanicum, por via oral 50 L3 (Acey-1)(n=12); Infectados com 30 cercárias de S. mansoni (Sm-1)(n=8). Infectado previamente com A. ceylanicum e aos 20 dpi infectado com S. mansoni (Acey+Sm)(n=14). Linha pontilhada: valores fisiológicos para hamster de acordo com Mitruka e Rawnsley (1981). ). a Estatisticamente significante comparado ao grupo NI-1. b Estatisticamente significante comparado ao grupo Acey-1, c Estatisticamente significante comparado ao grupo Sm-1. *= p < 0,05; **= p < 0,01; ***= p < 0,001. 78 A NI-1 Acey-1 Sm-1 Acey+Sm 0 2 4 6 8 10 a*** c*** a*** c*** H e m á c ia s ( x 1 0 6 ) m m 3 NI-1 Acey-1 Sm-1 Acey+Sm 0 5 10 15 20 c*** a* c*** H e m o g lo b in a ( g /d L ) NI-1 Acey-1 Sm-1 Acey+Sm 0 20 40 60 80 100 c* c** H e m a tó c ri to % F B C GRÁFICO 13 - Hemograma realizado aos 60 dpi. Contagem global de hemácias em milímetros cúbicos (A); Níveis de hemoglobina em grama por decilitro (B); Hematócrito em porcentagem (C). Não infectado (NI-1)(n=9); infectados com A. ceylanicum, por via oral 50 L3 (Acey-1)(n=8); Infectados com 30 cercárias de S. mansoni (Sm-1)(n=10). Infectado previamente com A. ceylanicum e aos 20 dpi infectado com S. mansoni (Acey+Sm)(n=11). Linha pontilhada: valores fisiológicos para hamster de acordo com Mitruka e Rawnsley (1981). ). a Estatisticamente significante comparado ao grupo NI-1. b Estatisticamente significante comparado ao grupo Acey-1, c Estatisticamente significante comparado ao grupo Sm-1. *= p < 0,05; **= p < 0,01; ***= p < 0,001. 79 A NI-1 Acey-1 Sm-1 Acey+Sm 0 2 4 6 8 10 a*** c** d* a*** a*** H e m á c ia s ( x 1 0 6 ) m m 3 NI-1 Acey-1 Sm-1 Acey+Sm 0 5 10 15 20 a*** a** H e m o g lo b in a ( g /d L ) NI-1 Acey-1 Sm-1 Acey+Sm 0 20 40 60 80 100 a*** H e m a tó c ri to % F B C GRÁFICO 14 - Hemograma realizado aos 75 dpi (A-C). Contagem global de hemácias em milímetros cúbicos (A); Níveis de hemoglobina em grama por decilitro (B); Hematócrito em porcentagem (C). Não infectado (NI-1)(n=10); infectados com A. ceylanicum, por via oral 50 L3 (Acey-1)(n=7); Infectados com 30 cercárias de S. mansoni (Sm-1)(n=11). Infectado previamente com A. ceylanicum e aos 20 dpi infectado com S. mansoni (Acey+Sm)(n=7). Linha pontilhada: valores 80 fisiológicos para hamster de acordo com Mitruka e Rawnsley (1981). ). a Estatisticamente significante comparado ao grupo NI-1. b Estatisticamente significante comparado ao grupo Acey-1, c Estatisticamente significante comparado ao grupo Sm- 1. *= p < 0,05; **= p < 0,01; ***= p < 0,001. 8.5.2. Leucograma No leucograma realizado aos 30 dpi (gráfico 15) não foi observado alteração de leucócitos totais, linfócitos, neutrófilos totais ou eosinófilos na comparação realizada entre os grupos infectados e NI-1. O mesmo é observado aos 60 dpi (gráfico 16). Aos 75 dpi (gráfico 17) o leucograma realizado apresenta alteração na contagem de linfócitos com diferença estatisticamente significativa na comparação entre os grupos NI-1 e Sm-1 (p < 0,01) e entre os grupos infectados Sm-1 e Acey+Sm (p < 0,01), onde o grupo Sm-1 apresenta valores mais elevados. Os demais parâmetros avaliados não apresentam alteração com diferença estatisticamente significativa. N I-1 A ce y- 1 Sm -1 A ce y+ Sm 0 2000 4000 6000 8000 L in fó c it o s / m m 3 N I-1 A ce y- 1 S m -1 A ce y+ S m -1 0 2000 4000 6000 8000 N e u tr o fi lo s t o ta is / m m 3 N I-1 A ce y- 1 Sm -1 A ce y+ S m -1 0 200 400 600 E o s in ó fi lo s /m m 3 N I-1 A ce y- 1 S m -1 A ce y+ S m -1 0 5000 10000 15000 20000 L e u c ó c it o s / m m ³ A B C D GRÁFICO 15- Leucócitos totais e contagem diferencial em sangue de hamsters aos 30 dpi. A: Leucócitos totais. B: Linfócitos totais. C: Neutrófilos totais. D: Eosinófilos. Valores em milímetro cúbico. Não infectado (NI-1)(n=12); grupo infectado com A. ceylanicum, via oral com 50 L3 (Acey-1)(n=12), grupo infectados com 30 cercárias de S. mansoni (Sm-1)(n=8). Infectado primariamente com A. ceylanicum e após 20 dias foram infectados com 30 cercárias de S. mansoni (Acey+Sm)(n=14). Linha pontilhada: valores fisiológicos para hamster fêmeas de acordo com Mitruka e Rawnsley (1981). 81 N I-1 A ce y- 1 S m -1 A ce y+ S m 0 5000 10000 15000 20000 L e u c ó c it o s / m m ³ N I-1 A ce y- 1 S m -1 A ce y+ S m 0 2000 4000 6000 8000 L in fó c it o s / m m 3 N I-1 A ce y- 1 S m -1 A ce y+ S m 0 2000 4000 6000 8000 N e u tr ó fi lo s t o ta is / m m ³ N I-1 A ce y- 1 Sm -1 A ce y+ Sm 0 100 200 300 400 500 E o s in ó fi lo s /m m 3 A B C D GRÁFICO 16- Leucócitos totais e contagem diferencial em sangue de hamsters aos 60 dpi A: Leucócitos totais. B: Linfócitos totais. C: Neutrófilos totais. D: Eosinófilos. Valores em milímetro cúbico. Não infectado (NI-1)(n=9); grupo infectado com A. ceylanicum, via oral com 50 L3 (Acey-1)(n=8), grupo infectados com 30 cercárias de S. mansoni (Sm-1)(n=10). Infectado primariamente com A. ceylanicum e após 20 dias foram infectados com 30 cercárias de S. mansoni (Acey+Sm)(n=11). Linha pontilhada: valores fisiológicos para hamster fêmeas de acordo com Mitruka e Rawnsley (1981). 82 N I-1 A ce y- 1 Sm -1 A ce y+ S m 0 2000 4000 6000 8000 10000 a** c** L in fó c it o s / m m 3 N I-1 A ce y- 1 S m -1 A ce y+ S m 0 2000 4000 6000 8000 N e u tr o fi lo s t o ta is / m m 3 N I-1 A ce y- 1 S m -1 A ce y+ S m 0 100 200 300 400 500 E o s in ó fi lo s /m m 3 N I-1 A ce y- 1 S m -1 A ce y+ S m 0 5000 10000 15000 20000 L e u c ó c it o s / m m ³ A B C D GRÁFICO 17- Leucócitos totais e contagem diferencial em sangue de hamsters aos 75 dpi. A: Leucócitos totais. B: Linfócitos totais. C: Neutrófilos totais. D: Eosinófilos. Valores em milímetro cúbico. Não infectado (NI-1)(n=7); grupo infectado com A. ceylanicum, via oral com 50 L3 (Acey-1)(n=6), grupo infectados com 30 cercárias de S. mansoni (Sm-1)(n=10). Infectado primariamente com A. ceylanicum e após 20 dias foram infectados com 30 cercárias de S. mansoni(Acey+Sm)(n=8). Linha pontilhada: valores fisiológicos para hamster fêmeas de acordo com Mitruka e Rawnsley (1981). a Estatisticamente significante comparado ao grupo NI-1. c Estatisticamente significante comparado ao grupo Sm-1. **= p < 0,01 8.6. ELISA Os plasmas dos hamsters obtidos aos 30, 60 e 75 dpi foram testados para avaliar os níveis de IgG total frente aos antígenos SEA, SWAP, Extrato bruto de A. ceylanicum e ES. Aos 30 dpi (Gráfico 18) o grupo Sm-1 e Acey+Sm apresentaram a média de absorbância abaixo do valor de cut-off frente ao antígeno SWAP e sem diferença estatisticamente significativa na comparação com o grupo NI-1. Embora o grupo Acey+Sm tenha apresentado animais positivos no teste, quando comparados ao grupos 83 Sm, também não apresentaram diferença estatisticamente significativa. Não foi observado reação dos grupos Sm-1 e Acey+Sm frente ao antígeno SEA. Os grupos Acey-1 e Acey+ Sm apresentaram valores de absorbância acima do cut-off frente aos antígenos Extrato bruto de A. ceylanicum e ES, com diferença estatisticamente significativa na comparação com o grupo NI-1 (p < 0,01). Não houve diferença significativa na comparação entre os grupos Acey-1 e Acey+Sm. Demonstrando que a coinfecção por S. mansoni não interferiu não resposta imune humoral contra a infecção por A. ceylanicum. N I-1 A ce y- 1 S m -1 A ce y+ S m 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 A b s o rb â n c ia ( 4 5 0 n m ) S W A P N I-1 A ce y- 1 S m -1 A ce y+ S m 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 A b s o rb â n c ia ( 4 5 0 n m ) S E A N I-1 A ce y- 1 S m -1 A ce y+ S m 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 a**a** A b s o rb â n c ia ( 4 5 0 n m ) E x tr a to b ru to N I-1 A ce y- 1 S m -1 A ce y+ S m 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 a**a** A b s o rb â n c ia ( 4 5 0 n m ) E S A B C D GRÁFICO 18- Níveis de IgG total em plasma de hamsters aos antígenos aos 30 dpi frente aos antígenos: A: SWAP; B: SEA; C:Extrato bruto de A. ceylanicum; D: ES. Não infectado (NI-1)(n=6); infectados com A. ceylanicum, por via oral 50 L3 (Acey-1)(n=11); infectado com 30 cercárias de S. mansoni (Sm-1)(n=11) Infectado com 50 L3 de A. ceylanicum e posteriormente infectado com 30 cercárias de S. mansoni aos 20 dpi (Acey+ Sm)(n=13). Linha pontilhada: cut-off. hamsters por grupo, respectivamente. a Estatisticamente significante comparado ao grupo NI-1. **= p < 0,01. Aos 65 dpi (Gráfico 19) o grupo Sm-1 e Acey+Sm apresentaram a média de absorbância abaixo do valor de cut-off frente ao antígeno SWAP e sem diferença estatisticamente significativa na comparação com o grupo NI-1. Também não foi 84 observado reação dos grupos Sm-1 e Acey+Sm frente ao antígeno SEA, com exceção de um animal. Os grupos Acey-1 e Acey+ Sm apresentaram valores de absorbância acima do cut-off frente aos antígenos Extrato bruto de A. ceylanicum e ES, com diferença estatisticamente significativa na comparação com o grupo NI-1 (p < 0,01 e p < 0,001, respectivamente ). Não houve diferença significativa na comparação entre os grupos Acey-1 e Acey+Sm N I-1 A ce y- 1 Sm -1 A ce y+ S m 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 A b s o rb â n c ia ( 4 5 0 n m ) S W A P N I-1 I A ce y- 1 Sm -1 A ce y+ S m 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 A b s o rb â n c ia ( 4 5 0 n m ) S E A N I-1 A ce y- 1 Sm -1 A ce y+ S m 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 a***a** A b s o rb â n c ia ( 4 5 0 n m ) E x tr a to b ru to N I-1 A ce y- 1 Sm -1 A ce y+ S m 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 a**a** A b s o rb â n c ia ( 4 5 0 n m ) E S A B C D GRÁFICO 19- Níveis de IgG total em plasma de hamsters aos 60 dpi frente aos antígenos: A: SWAP; B: SEA; C: Extrato bruto de A. ceylanicum; D: ES. Não infectado (NI-1) (n=10); infectados com 50 L3 de A. ceylanicum, via oral (Acey-1) (n=10); Infectado com 50 L3 de A. ceylanicum; infectado com 30 cercárias de S. mansoni, via subcutânea (Sm-1) (n=10) e infectado aos 20 dpi com 30 cercárias de S. mansoni, via subcutânea (Acey+ Sm) (n= 11). Linha pontilhada: cut-off. hamsters por grupo, respectivamente. a Estatisticamente significante comparado ao grupo NI-1. **= p < 0,01. Aos 75 dpi (gráfico 20) todos os plasmas dos grupos Sm-1 e Acey+Sm apresentavam absorbância acima do valor de cut-off frente ao SWAP. Foi observado 85 diferença estatisticamente significativa na comparação entre os grupos infectados Sm-1 (p<0,01), Acey +Sm (p<0,05) e o grupo NI-1. Também observamos diferença na comparação entre os grupos Sm-1 e Acey+Sm (p<0,05). Embora todos os animais infectados com S.mansoni tenham reconhecido SWAP, o mesmo não ocorreu para o SEA (gráfico 20B). Observamos diferença estatisticamente significativa na comparação do grupo NI-1 com os grupos infectados Sm-1 (p < 0,01) e Acey+Sm (p <0,05). Não houve diferença significativa na comparação entre Sm-1 e Acey+Sm na resposta a antígenos de SEA. . Os valores de absorbância dos grupos Acey-1 e Acey+ Sm persistiram elevados frente aos antígenos Extrato bruto de A. ceylanicum e ES gráfico 20C e 20D), com diferença estatisticamente significativa na comparação com o grupo NI-1 (p < 0,01). Não houve diferença significativa na comparação entre os grupos Acey-1 e Acey+Sm na resposta a esses antígenos. Estes dados sugerem que a resposta humoral frente à infecção por A. ceylanicum não sofreu alteração pela coinfecção por S. mansoni. Já em animais infectados inicialmente por A. ceylanicum e coinfectados por S. mansoni, a resposta frente ao antígeno SWAP se mostrou alterada, com redução significativa dos níveis de IgG anti-SWAP. NI-1 Acey-1 Sm-1 Acey+Sm 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 c* a** a** A b s o rb â n c ia ( 4 5 0 n m ) S W A P NI-1 Acey-1 Sm-1 Acey+Sm 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 a** a** A b s o rb â n c ia ( 4 5 0 n m ) S E A NI-1 Acey-1 Sm-1 Acey+Sm 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 a** a** A b s o rb â n c ia ( 4 5 0 n m ) E x tr a to b ru to NI-1 Acey-1 Sm-1 Acey+Sm 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 a*** a*** A b s o rb â n c ia ( 4 5 0 n m ) E S A B C D GRÁFICO 20- Níveis de IgG total em plasma de hamsters aos 75 dpi frente aos antígenos A: SWAP; B: SEA; C: Extrato bruto de A. ceylanicum; D: ES. Não 86 infectado (NI-1) (n=6); infectados com 50 L3 de A. ceylanicum, via oral (Acey-1) (n=6); Infectado com 50 L3 de A. ceylanicum; infectado com 30 cercárias de S. mansoni (n=10), infectado aos 20 dpi com 30 cercárias de S. mansoni, via subcutânea (Acey+ Sm). Linha pontilhada: cut-off. a Estatisticamente significante comparado ao grupo NI- 1. C Estatisticamente significante comparado ao grupo Sm-1. *= p < 0,05; **= p < 0,01. 8. 7. Análise histológica Os resultados das análises histopatológicas e morfométricas dos cortes de intestino delgado corados por HE estão representados na figura 4 e no gráfico 21. Os cortes foram avaliados qualitativamente para análise das alterações da mucosa (hipercelularidade da lâmina própria e hipersecreção das células de Paneth, hiperplasia de células caliciforme e erosão), da submucosa e muscular, e, Morfométricamente, para obtenção de medidas das vilosidades (altura e espessura), criptas (altura) e razão vilosidade-cripta. A mucosa dos hamsters do grupo NI-1 apresentou aspecto histológico normal, com estruturas íntegras, e razão vilosidade-cripta média de 3:1. As células de Paneth e caliciformes se apresentaram em quantidade normal. Em todos os grupos infectados foram observadas alterações na arquitetura do intestino delgado como perda do epitélio intestinal, redução da altura das vilosidades intestinais e hipertrofia das criptas de Lieberkün. Foram observadas reduções na altura das vilosidades nos grupos Acey-1 (p< 0,05), e Sm-1 (p<0,05) na comparação com o grupo NI-1. Não foram observadas alterações significativas na comparação entre o grupo Acey+Sm com o grupo NI-1 ou os demais infectados. Em relação à hipertrofia das criptas ela somente foi significativa no grupo Acey+Sm. A razão vilosidade/cripta dos grupos infectados apresentou redução significativa quando comparadas ao NI-1. As análises dos granulomas foi realizada somente para o intestino delgado, em função de ser o sítio de localização do A. ceylanicum. O número de granulomas formados no intestino delgado foi semelhante nos grupos Sm-1 e Acey+Sm. A coinfecção não alterou a composição do granuloma ou tamanho (gráfico 17). e o resultado pode ser visualizado no tabela 3. Não foram observados granulomas na fase de cura por fibrose devido ao tempo de infecção. 87 Figura 3: Fotomicrografias representativas de cortes histológicos de intestino delgado de hamsters. Grupo não infectado (NI-1), infectados com 50 L3 de Ancylostoma ceylanicum (Acey-1), infectados com 30 cercárias de Schistosoma mansoni (Sm-1) e infectados por 50 L3, após 20 dpi coinfectados com 30 cercárias de S. mansoni ( Acey+Sm). A: Aspecto histológico normal evidenciando vilosidades (seta) e criptas de Lieberkün íntegras (asterisco); B, C: comprometimento da arquitetura tecidual evidenciando áreas com redução na altura das vilosidades e (D): hipertrofia das criptas de Lieberkün . Hematoxilina-Eosina. Barra = 50mm. NI-1 Acey-1 Sm-1 Acey+Sm 88 NI-1 Acey-1 Sm-1 Acey+Sm 0 100 200 300 a* a* A lt u ra d a v ilo s id a d e NI-1 Acey-1 Sm-1 Acey+Sm 0 50 100 150 200 250 a** A lt u ra d a c ri p ta NI-1 Acey-1 Sm-1 Acey+Sm 0 20 40 60 80 100 E s p e s s u ra d a v il o s id a d e NI-1 Acey-1 Sm-1 Acey+Sm 0 5 10 15 20 E s p e s s u ra d o e p it é li o d a v il o s id a d e NI-1 Acey-1 Sm-1 Acey+Sm 0 20 40 60 80 100 E s p e s s u ra d a l â m in a p ró p ri a NI-1 Acey-1 Sm-1 Acey+Sm 0 2 4 6 8 a** a** a** R a z ã o v ilo s id a d e -c ri p ta A B C D E F GRÁFICO 21 - Avaliação Morfométrica da mucosa do intestino delgado de hamsters. A- Altura vilosidade. B- Altura das criptas de Lieberkün. C- Espessura das vilosidades. D- Espessura do epitélio da vilosidade. E- Espessura da lâmina própria. F- Razão vilosidade:cripta. Valores em micrometros. Não infectado (NI-1); infectados com 50 L3 de A. ceylanicum, via oral (Acey-1); infectado com 30 cercárias de S. mansoni, via subcutânea ( Sm-1). Infectado com 50 L3 de A. ceylanicum e coinfectado aos 20 dpi com 30 cercárias de S. mansoni, via subcutânea (Acey+ Sm). a Estatisticamente significante comparado ao grupo NI. *= p < 0,05; **= p < 0,01. Dados mostrados como média+ erro padrão. 89 Tabela 3: Análise do estágio evolutivo nos granulomas do intestino delgado Sm-1 Acey+Sm 0 20000 40000 60000 Á re a G ra n u lo m a (  m 2 ) GRÁFICO 22: Área média dos granulomas no intestino delgado de hamsters. Infectados com 30 cercárias de S. mansoni, via subcutânea (Sm-1). Infectados inicialmente com 50 L3 de A. ceylanicum e coinfectado aos 20 dpi com 30 cercárias de S. mansoni, via subcutânea (Acey+ Sm). Grupo Granuloma necrótico-exsudativa produtiva produtiva a cura por fibrose cura por fibrose total Sm-1 3 5 0 0 8 Acey+Sm 3 4 0 0 7 90 9. RESULTADOS EXPERIMENTO 2 91 9. Resultados experimento 2 9.1. Aferição do peso Os animais foram acompanhados com pesagens semanais até o término do experimento aos 90 dpi. Nas comparações realizadas entre os grupos NI-2 e infectados (Acey-2, Sm-2 e Sm+Acey) e dos infectados entre si, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas, em todas as datas analisadas (gráfico 23). 0 8 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 90 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 NI-2 Acey-2 Sm-2 Sm+Acey Dias pós-infecção (S. mansoni) Coinfecção p e s o ( g ) GRÁFICO 23- Aferição de peso dos grupos experimentais. Valores em gramas. Não infectado (NI-2), infectado com 50 L3 de A. ceylanicum (Acey-2), Infectado com 30 cercárias de S. mansoni (Sm-2). Infectado com 30 cercárias de S. mansoni e após 60 dias infectado com A. ceylanicum (Sm+Acey). p > 0,05. 9.2. Exame parasitológico de fezes 9.2.1. Contagem de ovos de S. mansoni Foram observados ovos de S. mansoni nos grupos Sm-2 e Sm+Acey a partir dos 43 dpi. O pico de eliminação ocorreu aos 71 dpi (Sm-2), e aos 82 dpi no grupo (Sm+Acey) (gráfico 24), demonstrando, como no experimento anterior, que a coinfecção por A. ceylanicum, mesmo que posterior à infecção por S. mansoni alterou o pico de eliminação de ovos. 92 43 47 54 57 61 64 68 71 75 78 82 85 90 0 50 100 150 200 250 300 Sm-2 Sm+Acey AUC=520,0 AUC= 158,3 Dias pós-infecção Coinfecção O v o s S . m a n s o n i GRÁFICO 24- Exame Parasitológico de Fezes (Formol-Éter). Média de eliminação por grupo. Infectado com 30 cercárias de S. mansoni, via subcutânea (Sm-2). Infectado com 30 cercárias de S. mansoni e coinfectado aos 60 dpi com 50 L3 de A. ceylanicum, via oral. AUC= Area abaixo do gráfico. 9.2.2. O.P.G A coleta de fezes foi iniciada aos 10 dpi. A patência dos grupos Acey-2 e Sm+Acey ocorreu aos 17 dpi. 9.3. Recuperação dos vermes adultos de A. ceylanicum e S. mansoni Foram recuperados 227 vermes adultos de A.ceylanicum do intestino delgado do grupo Acey-2 (21 animais). Destes 115 machos e 112 fêmeas. A recuperação média do grupo foi de aproximadamente 22% em relação ao inóculo de 50 L3 utilizado. Do grupo Sm-2 (7 animais) foram recuperados 80 vermes adultos de S. mansoni após a perfusão. Destes 52 eram machos e 28 eram fêmeas. A recuperação média do grupo foi de 40% em relação ao inóculo de 30 cercárias. No grupo Sm+Acey (7 animais) foram recuperados no intestino delgado 52 vermes adultos de A.ceylanicum, sendo 30 machos e 22 fêmeas. A recuperação média foi de 12%. Dos vasos mesentéricos foram recuperados 65 vermes adultos, destes 42 machos e 23 fêmeas, apresentando uma média de recuperação de 24 %. Ao comparar os grupos Acey-2 e Sm+Acey não houve diferença estatisticamente significativa na recuperação dos vermes adultos de A. ceylanicum ou S. mansoni . O mesmo foi observado ao comparar Sm e Sm+Acey. 93 Sm-2 Sm+Acey 0 5 10 15 20 25 Machos Fêmeas 38,05% 30% M é d ia S. m a n so ni / h am st er Acey-2 Sm+Acey 0 5 10 15 20 Machos Fêmeas21,61% 11,81% ** M é d ia A . c e yl a ni cu m / h am st er A B GRÁFICO 25- Recuperação de vermes. A: Média de recuperação de vermes adultos de S. mansoni dos vasos mesentéricos de hamster. B: Média de recuperação de vermes adultos de A. ceylanicum do intestino delgado de hamster. Infectado com 50 L3 de A. ceylanicum (Acey-2) (n=21). Infectado com 30 cercárias de S. mansoni (Sm-2) (n= 7). Infectado por 30 cercárias de S. mansoni e após 60 dias por 50 L3 de A. ceylanicum (Acey+Sm). Em porcentagem a recuperação total de vermes em relação ao inóculo. p > 0,05. 9.4. Quantificação de ovos de S. mansoni retidos no fígado Após o sacrifício dos hamsters, o lóbulo maior do fígado foi pesado e colocado em solução de KOH 5% para realizar a digestão do tecido. A contagem dos ovos foi realizada em quadruplicatas em microscópio óptico em alíquotas de 50 µl. O valor obtido pode ser visto no gráfico 26. O peso médio do lóbulo escolhido foi de 3,9 ± 1,36 g para o grupo Sm+Acey (n=11) e 3,9 ± 1,29 g para o grupo Sm-2 (n=10). O grupo Sm- 94 2 apresentou maior número de ovos retidos no fígado em comparação ao grupo coinfectado Sm+Acey (p < 0,05), demonstrando que a coinfecção pode ter ativado a resposta imunológica do hospedeiro, fazendo com que menos ovos fossem colocados pelas fêmeas ou que menos ovos fossem retidos no fígado do hospedeiro. Sm-2 Sm+Acey 0 20000 40000 60000 * N º d e o v o s r e ti d o s n o f íg a d o GRÁFICO 26- Número de ovos de S. mansoni retidos no fígado. Infectado com 30 cercárias de S. mansoni (Sm-2)( n= 8). Infectado com 30 cercárias de S. mansoni e posteriormente infectado com 50 L3 de A. ceylanicum aos 65 dpi ,Sm+Acey (n=10).Média e Desvio padrão. * = p < 0,05. 9.5. Exames hematológicos 9.5.1. Série vermelha O hemograma realizado aos 90 dpi (gráfico 27) apresentou alteração dos níveis de hemácias, hemoglobina, hematócrito. Houve redução significativa do número de hemácias para os grupos Acey-2 (p<0,001) e Sm+ Acey (p<0,05) em relação ao grupo NI-2. Esta redução também pode ser observada nos níveis de hemoglobina e valores de hematócrito. Não há diferença estatisticamente significativa na comparação dos grupos infectados Acey-2 e Sm+Acey nos parâmetros já mencionados. Também não é observada diferença na comparação entre o grupo Sm-2 e o grupo NI-2. Todos os grupos apresentam valores abaixo do fisiológico. 95 N I-2 A ce y- 2 Sm -2 Sm +A ce y 0 2 4 6 8 10 H e m á c ia s ( x 1 0 6 ) m m 3 a*** a* c*** c*** N I-2 A ce y- 2 Sm -2 Sm +A ce y 0 5 10 15 20 H e m o g lo b in a ( g /d L ) a*** c** a* N I-2 A ce y- 2 Sm -2 Sm +A ce y 0 20 40 60 H e m a tó c ri to % a*** c** a* A B C GRÁFICO 27- Hemograma de hamster fêmeas. A: Contagem global de hemácias em milímetros cúbicos; B: Níveis de hemoglobina em grama por decilitro; C: Hematócrito em porcentagem. Não infectado (NI-2)(n= 15); grupo infectado com A.ceylanicum, via oral com 50 larvas de terceiro estádio (Acey-2)(n= 21), grupo infectados com 30 cercárias de Schistosoma mansoni (Sm-2)(n= 8). Grupo infectado primariamente com S. mansoni e após 65 dias foram infectados com A. ceylanicum. Coleta de sangue realizada aos 90 dias após primoinfecção (Sm+Acey)(n= 10). Linha pontilhada: valores fisiológicos para hamster de acordo com Mitruka e Rawnsley (1981). a Estatisticamente significante comparado ao grupo NI-2, c Estatisticamente significante comparado ao grupo Sm-2. *= p < 0,05; **= p < 0,01; ***= p < 0,001. 96 9.5.2. Leucograma Aos 90 dpi (gráfico 28) o leucograma realizado apresentou alteração na contagem de linfócitos com diferença estatisticamente significativa na comparação entre os grupos NI-2 e Sm+Acey (p < 0,01). Os demais parâmetros avaliados não apresentam alteração com diferença estatisticamente significativa. N I-2 A ce y- 2 Sm -2 Sm +A ce y 0 5000 10000 15000 20000 L e u c ó c it o s / m m 3 N I-2 A ce y- 2 S m -2 S m +A ce y 0 2000 4000 6000 8000 10000 L in fó c it o s /m m 3 a** N I-2 A ce y- 2 S m -2 S m +A ce y 0 2000 4000 6000 8000 N e u tr o fi lo s t o ta is / m m 3 N I-2 A ce y- 2 S m -2 S m +A ce y 0 100 200 300 400 500 E o s in ó fi lo s /m m 3 A B C D GRÁFICO 28- Hemograma. A: Contagem global de leucócitos ; B: Linfócitos; C: Neutrófilos totais; D: Eosinófilos por milímetro cúbico de sangue de hamsters aos 90 dpi. Não infectado (NI-2) (n= 9); infectados com A. ceylanicum, por via oral 50 L3 (Acey-2) (n= 6); Infectados com 30 cercárias de S. mansoni (Sm-2) (n=11). Infectado previamente com S. mansoni e aos 65 dpi infectado com A. ceylanicum (Acey+Sm) (n= 8). Linha pontilhada: valores fisiológicos para hamster de acordo com Mitruka e Rawnsley (1981). a Estatisticamente significante comparado ao grupo NI-2. **= p < 0,01. 97 9.6. ELISA Os plasmas dos hamsters, infectados e Não infectado, obtidos aos 90 dpi foram testados para avaliar os níveis de IgG total frente aos antígenos SEA, SWAP, Extrato bruto de A. ceylanicum e ES. Os valores de absorbância obtidos podem ser visualizados no gráfico 29. O grupo Acey-2 apresentou reação para os antígenos de Extrato bruto e ES de A. ceylanicum, com diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo NI (p <0,001) e grupo Sm-2 (p <0,001). Não houve diferença significativa entre o grupo Acey-2 e Sm+Acey frente aos antígenos Extrato bruto e ES de A. ceylanicum. Não houve reação cruzada. O grupo Sm-2 apresentou reação para os antígenos de SEA e SWAP de S. mansoni. Foi observada diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo NI- 2 (p <0,01) e grupo Acey-2 (p <0,001). Não houve diferença significativa entre o grupo Sm-2 e Sm+Acey frente aos antígenos de SEA e SWAP de S. mansoni. Não houve reação cruzada. O grupo Sm+Acey apresentou reação para todos os antígenos testados. Foi observada diferença estatisticamente significativa somente entre o grupo Sm+Acey e o NI-2 (p <0,01). Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos monoinfectados (Acey-2 ou Sm-2) e o grupo coinfectado (Sm+Acey) frente aos antígenos SEA, SWAP, Extrato bruto de A. ceylanicum e ES. 98 NI-2 Acey-2 Sm-2 Sm+Acey 0 1 2 3 4 a** a** A b s o rb â n c ia ( 4 5 0 n m ) S E A NI-2 Acey-2 Sm-2 Sm+Acey 0 1 2 3 4 a** a** A b s o rb â n c ia ( 4 5 0 n m ) S W A P NI-2 Acey-2 Sm-2 Sm+Acey 0 1 2 3 4 a** a** A b s o rb â n c ia ( 4 5 0 n m ) E x tr a to b ru to NI-2 Acey-2 Sm-2 Sm+Acey 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 a** a** A b s o rb â n c ia ( 4 5 0 n m ) E S A B C D GRÁFICO 29- Níveis de IgG total em plasma de hamsters frente aos antígenos. A: SEA; B: SWAP; C: Extrato bruto de A. ceylanicum; D: ES. Não infectado (NI) (n=6); infectados com A. ceylanicum, por via oral 50 L3 (Acey-2) (n= 20); Infectado com 30 cercárias de S. mansoni (Sm-2) (n= 7). Infectado com 30 cercárias de S. mansoni e posteriormente infectado com 50 L3 de A. ceylanicum aos 65 dpi (Sm+Acey) (n= 11). Linha pontilhada: cut-off. Plasma obtido aos 90 dpi. a Estatisticamente significante comparado ao grupo NI-2. *= p < 0,05; **= p < 0,01; ***= p < 0,001. 9.7. Análise histopatológica Os hamsters do grupo NI-2 apresentaram aspecto histológico normal da mucosa, com estruturas íntegras e razão vilosidade-cripta média de 3:1. As células de Paneth e caliciformes se apresentaram quantitativa e qualitativamente normais. Nas avaliações morfométricas não foram observadas alterações significativas em relação à altura da vilosidade na comparação entre os grupos infectados com o grupo NI-2 ou entre si. Observamos hipertrofia nas criptas de Liberkün significativa somente na comparação entre o grupo coinfectado Sm+Acey (P<0,01) e o grupo NI-2. 99 Em todos os grupos infectados foram observados alterações na arquitetura do intestino delgado como perda do epitélio intestinal, redução da altura das vilosidades intestinais e hipertrofia das criptas de Lieberkün. Não foram observadas alterações significativas na comparação entre o grupo Sm+Acey com o grupo NI-2 ou os demais grupos infectados. Todos os grupos infectados apresentaram alteração da razão vilosidade-cripta para 1:1. O número de granulomas formados no intestino delgado foram semelhantes nos grupos Sm-2 e Sm+Acey. O resultado pode ser observado na tabela 4. A coinfecção não alterou a composição do granuloma, evolução ou tamanho. 100 Figura 4: Fotomicrografias representativas de cortes histológicos de intestino delgado de hamsters. Grupo não infectado (NI-2), infectados com 50 L3 de Ancylostoma ceylanicum (Acey-2), infectados com 30 cercárias de Schistosoma mansoni (Sm-2), infectados com 30 cercárias de S. mansoni e após 65 dpi coinfectados com 50 L3 de A. ceylanicum ( Acey+Sm). A: Aspecto histológico normal evidenciando vilosidades (seta) e criptas de Lieberkün íntegras (asterisco); B, C e D: comprometimento da arquitetura tecidual evidenciando áreas com redução na altura das vilosidades e hipertrofia das criptas de Lieberkün. Hematoxilina-Eosina. Barra = 50µm. Sm+Acey NI-2 Acey-2 Sm-2 101 FIGURA 5: Fotomicrografias representativas de cortes histológicos de intestino delgado de hamsters infectados com Schistosoma mansoni e Ancylostoma ceylanicum, evidenciando granulomas epitelióides em diferentes fases evolutivas: granuloma em fase exsudativa ao redor de ovo de S. mansoni embrionado, com presença de células epitelióides (seta) (A); granuloma em fase exsudativa ao redor de ovos de S. mansoni em diferentes estádios (B); granulomas em fase produtiva ao redor de ovos necróticos (asterisco) evidenciando células gigantes (seta) (C e D); granulomas em fase de cura por fibrose em processo inicial da periferia para o centro (E) ou mais tardia (F). Hematoxilina-Eosina. Barra = 50µm. 102 Tabela 4: Análise da fase evolutiva do granuloma Grupo Granuloma necrótico- exsudativa produtiva produtiva a cura por fibrose cura por fibrose total Sm-2 22 26 5 3 56 Sm+Acey 20 29 13 3 65 103 NI-2 Acey-2 Sm-2 Sm+Acey 0 100 200 300 A lt u ra d a v il o s id a d e NI-2 Acey-2 Sm-2 Sm+Acey 0 50 100 150 200 250 a** A lt u ra d a c ri p ta NI-2 Acey-2 Sm-2 Sm+Acey 0 50 100 150 a* b* E s p e s s u ra d a v il o s id a d e NI-2 Acey-2 Sm-2 Sm+Acey 0 5 10 15 a* E s p e s s u ra d o e p it é li o d a v il o s id a d e NI-2 Acey-2 Sm-2 Sm+Acey 0 20 40 60 80 100 E s p e s s u ra d a l â m in a p ró p ri a NI-2 Acey-2 Sm-2 Sm+Acey 0 2 4 6 a* a* a** R a z ã o v il o s id a d e -c ri p ta A B C D E F GRÁFICO 30 - Avaliação Morfométrica do intestino delgado de hamsters. A- Altura vilosidade. B- Altura das criptas de Lieberkün. C- Espessura das vilosidades. D- Espessura do epitélio da vilosidade. E- Espessura da lâmina própria. F- Razão vilosidade:cripta. Valores em micrometros. Não infectado (NI-2); infectados com 50 L3 de A. ceylanicum, via oral (Acey-2); Infectado com 50 L3 de A. ceylanicum e infectado aos 20 dpi com 30 cercárias de S. mansoni, via subcutânea ( Sm+Acey). a Estatisticamente significante comparado ao grupo NI-2. . b Estatisticamente significante comparado ao grupo Acey-2. *= p < 0,05; **= p < 0,01. Dados mostrados como média+ erro padrão. 104 10. Discussão O resultado das interações entre as espécies de parasitas que coinfectam o mesmo hospedeiro determinam o fitness de seu hospedeiro, a gravidade da doença acarretada, a contaminação do ambiente e por último a epidemiologia de cada parasito dentro da população dos hospedeiros. Desta forma a compreensão dos mecanismos que interferem na interação dos parasitos é fundamental para a concepção de programas de controle da doença e tratamentos mais eficazes (Feton et al 2014). Trabalhos usando modelos experimentais de coinfecção apontam evidencias de imunidade cruzada, imunossupressão, competição intraespecífica e interespecífica durante as coinfecções (Clark, 2001; Carmo et al, 2009; Fenton et al. 2014) Nas infecções por ancilostomideos são relatados quadros de anemia ferropriva, hipoprotenemia, diarreia e a perda de peso tanto em humanos como no hamster (Bundy et al., 1995; Hotez and Pritchard, 1995; Stoltzfus et al., 1997). Além disso, a hipofagia e a perda de peso são comumente observadas nas infecções gastrointestinais (Sykes, 1987; Worthington et al. 2013). Em nosso trabalho observamos que animais infectados com A. ceylanicum apresentam diminuição da sua atividade, aumento da prostração e redução da ingestão de ração. Nas análises histopatológicas os animais infectados com A. ceylanicum apresentaram redução no tamanho da vilosidade intestinal, o que é compatível com o que já foi descrito na literatura, inclusive do nosso grupo (Alkazmi et al., 2006, 2008; Alkazmi and Behnke, 2013; Dias et al, 2013). e também observados em nosso experimento com diferentes cargas parasitárias. Naturalmente associamos a perda de peso observada à diminuição da ingestão da ração e de sua absorção devido aos danos no intestino delgado já mencionado. Para Worthington e colaboradores (2013) a hipofagia e a perda de peso comum às infecções gastrointestinais têm papel importante na resolução da infecção. Os autores avaliaram a influência da hipofagia e perda de peso em camundongos infectados com Trichinella spiralis e deficientes em colecistocinina, receptores de TNF-α, células T e B. Esse nematoda apresenta uma parte do seu desenvolvimento na luz do intestino delgado e posteriormente migra para o músculo esquelético. Nesse modelo os autores puderam estudar os mecanismos que controlam a alimentação do hospedeiro, durante a inflamação intestinal e periférica. Eles observaram que a hipofagia ocorre devido a dois mecanismos imunes distintos. A hipofagia inicial ocorre pelo mediador colecistocinina, sendo induzida por linfócitos T CD4 + durante as enterites. O segundo responsável seria a citocina TNF-α que atuaria durante a inflamação extra-intestinal. Após uma cascata de 105 eventos iniciada pelos linfócitos T CD4 + ocorre a hiperplasia das células intestinais com indução da hipofagia que leva a perda de peso e consequentemente leva a redução dos níveis de leptina (uma adipocina pró-inflamatória) que por sua vez aumenta a influencia da resposta Th2, elevando a mastocitose, auxiliando na expulsão do parasito. Observamos em nosso trabalho que a cronologia da infecção influenciou os resultados em relação à perda de peso nos grupos coinfectados. Quando o A. ceylanicum antecede a infecção por S. mansoni os animais do grupo Acey+Sm apresentam a mesma redução de peso observada no grupo Acey-2. No entanto não foram observadas alterações significativas de peso quando a infecção por A. ceylanicum é precedida por S. mansoni. O A. ceylanicum se prende às vilosidades do intestino delgado através da cápsula bucal e se alimenta de sangue. Indivíduos que apresentam ingestão inadequada de ferro ou que apresentam uma demanda fisiológica maior são os mais afetados pela hematófaga do verme (Brooker et al., 2004; Hotez et al. 2004). A carga parasitária, presença de outros fatores clínicos e reservas de ferro podem determinar a ocorrência ou não de anemia durante a ancilostomose (Stoltzfus et al. 1997; Fleming 2000). Estudos sugerem que a anemia causada pela infecção das principais espécies do gênero Schistosoma (S. mansoni, S. haematobium e S. japonicum) pode ocorrer por quatro possíveis mecanismos: deficiência de ferro, retenção de eritrócitos pelo baço, hemólise autoimune e anemia em decorrência da inflamação (Friedman et al. 2005). Butler e colaboradores (2012) realizaram um estudo epidemiológico no Kênia com 2750 crianças de nove a doze anos. Os autores concluíram neste estudo que o principal mecanismo causador de anemia na esquistossomose está associado à inflamação desencadeada pela infecção. Foram analisados os níveis de hemoglobina, associados aos níveis séricos de ferritina e o seu receptor na célula. Desta forma puderam ser excluídos os mecanismos ligados a anemias por ingestão ou absorção inadequada de ferro. Para que não ocorresse influencia de outros parasitos no resultado foram também excluídos do estudo todos os participantes coinfectados por Plasmodium sp e Ancilostomideos (Butler et al 2012). Inicialmente levantamos a hipótese de que a presença simultânea de dois vermes hematófagos levaria a uma maior espoliação do hospedeiro, pois ocorreria um sinergismo e consequentemente um agravamento no quadro de anemia nos animais dos grupos coinfectados (Acey+Sm e Sm+Acey). Em nossos resultados observamos a redução no número de eritrócitos, níveis séricos de hemoglobina e hematócrito nos grupos Acey-1 e Acey-2 em todos os períodos da infecção analisados com diferença 106 estatisticamente significativa na comparação com o grupo controle. Somente observamos redução no número de eritrócitos no grupo Sm em relação ao controle aos 75 dpi do experimento 1 (capítulo 2). Holtfreter e colaboradores (2010) determinaram em experimentos in vitro que a principal fonte nutricional para os esquistossômulos é a albumina, enquanto os vermes adultos alimentam-se de eritrócitos e suplementam sua nutrição com albumina do hospedeiro. De acordo com Clegg (1965) o verme inicia a ingestão de eritrócitos a partir da segunda semana de infecção. Ao analisar o consumo de hemácias pelos machos e fêmeas de S. mansoni, ele observou que o consumo diário dessas células pelas fêmeas é maior que o observado em machos, sendo também mais rápido. Das alterações hematologicas observadas, no presente trabalho, todas estariam relacionadas à hematofagia exercida pelo A. ceylanicum uma vez que os valores obtidos foram semelhantes ao grupo Acey. Não foram observados agravamentos do quadro de anemia durante a coinfecção. Evidências das interações interespecíficas em coinfecções foram apresentadas por Lello e colaboradores (2004). Eles coletaram amostras de coelhos selvagens (Oryctolagus cuniculus). As espécies de helmintos mais frequentes por órgão foram nematodas Graphidium strigosum (estômago); Trichostrongylus retortaeformis (intestino delgado); Passalurus ambiguus (intestino grosso e cólon) cestoda Mosgovoyia pectinata (intestino delgado) e Cittotaenia denticulata (intestino delgado). Análises destes autores identificaram uma rede de interação entre estes helmintos. Baseado em sua biologia os autores postularam que a interação poderia ser devido a uma ação direta dos parasitos, através de produtos secretados no meio, por manipulação da fisiologia do intestino e/ou por competição ou efeito “crowding”. Enquanto que outras interações estariam provavelmente estariam relacionadas com o sistema imunitário do hospedeiro. Embora o habitat dos vermes adultos de A. ceylanicum seja a luz intestinal e dos vermes adultos S. mansoni seja os vasos mesentéricos do sistema porta, observamos interações entre as duas espécies. Observamos também que a cronologia e a ordem das infecções influenciaram nos resultados obtidos. Quando os hamsters foram previamente infectados por A. ceylanicum (experimento 1) este não interferiu no estabelecimento da segunda infecção por S. mansoni uma vez que a patência da segunda infecção ocorreu simultaneamente com o seu respectivo controle. Durante o acompanhamento da eliminação dos ovos de A. ceylanicum observamos oscilações similares nos grupos Acey e Acey+Sm. A média de eliminação de ovos de S. mansoni foi maior aos 46 dpi no grupo Acey+Sm (Experimento 1). Como os exames de fezes foram realizados em 107 pool as análises estatisticamente significativas não puderam ser realizadas, limitando as análises de variação de fertilidade individual das fêmeas. A recuperação de vermes adultos de A. ceylanicum foi similar no grupo Acey-1 e Acey+Sm. Não foram observadas alterações na proporção fêmeas e machos ou interações sinérgicas que prolongariam o período de permanecia destes helmintos no intestino delgado. A baixa porcentagem de recuperação estaria associada ao prolongado tempo de infecção, uma vez que os hamsters podem eliminar espontaneamente vermes adultos de A. ceylanicum na fase crônica. No experimento para determinar a influência da carga parasitária (efeito “crowding”) observamos que a proporção de machos e fêmeas foi similar, contrariamente aos achados de Roche e Patrzed (1966), que observaram que vermes machos são eliminados mais rapidamente em cães. A possível explicação para os nossos achados, seria que a eutanásia ocorreu com apenas 21 dias de infecção, durante a fase aguda. No entanto nos grupos Acey e Acey+Sm acompanhamos os animais por 75 dias (fase crônica) e a proporção fêmea e macho permaneceu similar nos dois grupos avaliados. A eliminação foi proporcional nos dois gêneros avaliados. Diferente do que foi encontrado por Roche e Patrzed (1966). Provavelmente os mecanismos que levam a eliminação do verme adulto no hamter sejam diferentes daquele encontrado em cães. Apenas a migração mais rápida do macho não seria o suficiente para explicar as diferenças observadas. Com relação à recuperação de S. mansoni após a coinfecção foi observado uma redução estatisticamente significativa no número de vermes adultos recuperados durante a perfusão do grupo Acey+Sm. Quando S. mansoni precedeu o A. ceylanicum observamos o mesmo tipo de alteração com redução do número de adultos recuperados da segunda infecção no grupo Sm+Acey. Resultado similar foi encontrado por Yoshida e colaboradores (1999). No modelo de coinfecção utilizado, a infecção prévia por S. mansoni levou a redução significativa do número de vermes adultos de S. venezuelensis recuperados do intestino delgado. Segundo os autores a ação protetiva da infecção prévia ocorreu pela destruição das larvas em migração de S. venezuelensis. Nas coinfecções envolvendo S. mansoni e protozoários os resultados são variados. A infecção prévia por S. mansoni em camundongos C57BL/6 e BALB/c não teve efeito sobre Leishmania major (Yoshida et al.,1999), enquanto La Flamme e colaboradores (2002) demonstraram que ocorre a exacerbação da leishmaniose na coinfecção com S. mansoni. No presente trabalho observamos que a patência ocorreu simultaneamente nos grupos monoinfectados e nos coinfectados. 108 Em relação à resposta humoral não foram observadas reações cruzadas entre os antígenos de A. ceylanicum e S. mansoni. Nos grupos infectados com S. mansoni todos os hamsters apresentaram IgG contra SWAP, mesmo os animais que não conseguimos recuperar vermes adultos de S. mansoni. Acreditamos que a redução da população da segunda infecção ocorreu após os vermes se tornarem adultos, e não na fase de larvas como proposto por Yoshida e colaboradores (1999). Não observamos também uma correlação linear entre a quantidade de ovos retidos no fígado e a produção de IgG anti- SEA nem foi possível correlacionar essa resposta com a eliminação de ovos nas fezes. Entretanto, No grupo Sm+Acey houve menor produção de IgG, podendo indicar que a coinfecção diminuiu a resposta ao S. mansoni. Barros e Coelho (1995) classificaram morfológica o granuloma em três fases de acordo com os tipos celulares observados. O granuloma de primeira fase apresenta histólise focal e fenômenos exudativos da inflamação. O de segunda fase apresenta um estágio produtivo ou reação histiocitária encistante. O estágio de reparação ou de cicatrização e substituição fibrosa do granuloma com formação do nódulo colágeno é a terceira fase no estágio de evolução dos granulomas. Essa classificação considera os tipos celulares. Já a classificação de Raso e Neves (1965) considera a morfologia e o tempo de infecção para definir a fase evolutiva do granuloma. Avaliamos os granulomas formados no intestino delgado por ser uma região onde as duas espécies apresentariam maior interação. No entanto não observamos qualquer influência da infecção por A. ceylanicum sobre a formação, evolução ou desenvolvimento dos granulomas no intestino delgado. Desta forma a coinfecção não atuou como fator protetivo ou de exarcebação considerando como parâmetro o diâmetro do granuloma e sua classificação evolutiva. Na coinfecção entre H. poligirus e S. mansoni, Bazzone e colaboradores (2008) observaram uma redução significativa da imunopatologia desencadeada pelo ovo no fígado de camundongos CBA. A redução na gravidade da doença foi acompanhada pela redução dos níveis de IL-17, IFN-γ e TNF-α e aumento de IL-4, IL-5, IL-10 e TGF-β, assim como a expressão de CCL11. Indicando que houve uma modificação da resposta Th1/Th17 para Th2. No entanto os autores não observaram alteração do número de ovos ou fecundidades dos vermes adultos. Além das coinfecções a dieta também pode influenciar a formação dos granulomas como observados por Alencar e colaboradores (2012). Os autores avaliaram a influencia de uma dieta hiperlipidica sobre a morfologia do intestino e delgado em camundongos infectados com S. mansoni. Após seis meses da indução da dieta os 109 animais foram infectados. Os animais foram eutanasiados na fase aguda da esquistossomose (9 semanas) e crônica (17 semanas de infecção). Os animais submetidos à dieta hiperlipidica apresentaram granulomas em diferentes estágios, enquanto o grupo controle possuía apenas granulomas na fase exudativa. O número de ovos retidos no fígado e o tamanho do granuloma foram maiores na fase crônica no grupo submetido à dieta hiperlipidica em comparação a fase aguda. Embora os hamsters sejam excelentes hospedeiros para inúmeros patógenos sua utilização em estudos imunológicos enfrentam sérias restrições. Para estes animais não existe a mesma abundancia de kits, imunoglobulinas e citocinas disponíveis comercialmente como observado para outros roedores (camundongos e ratos). Alguns autores, baseados na conservação dos genes entre os mamíferos recorrem ao uso de imunoglobulinas de outras espécies. No entanto, os resultados destes trabalhos devem ser analisados com cautela como demonstrado por Zivcec e colaboradores (2011). Eles testaram kits para ELISA e painéis Luminex® disponíveis comercialmente com o objetivo de sua validação em ensaios imunológicos em hamster dourado (M. auratus). Considerando que vários genes são conservados entre as diferentes espécies de roedores, os autores utilizaram anticorpos de camundongos e ratos para testar sua reação cruzada com antígenos de hamsters. O estudo foi expandido usando anticorpos de outros mamíferos como suínos e canídeos. Dos 64 anticorpos testados, apenas 14 apresentaram uma reatividade cruzada limitada, no entanto de baixa confiabilidade. Os autores concluíram que os kits para ELISA utilizando anticorpos heterólogos de outras espécies não seriam confiáveis para o monitoramente de respostas imunes em hamsters Em nosso laboratório tentamos utilizar a técnica de PCR em tempo real quantitativa (qPCR) para analisar as citocinas dos hamster, uma vez que as sequencias já estão disponíveis. No entanto até o presente momento não obtivemos sucesso. 110 11. Conclusões 1) A coinfecção não alterou alterou o estabelecimento ou patência da infecção. No entanto, a recuperação dos helmintos da segunda infecção é menor. 2) Embora ambos os helmintos sejam hematófagos, utilizando como parâmetros o número de eritrócitos, níveis de hemoglobina e porcentagem do hematócrito, não foi observado agravamento de anemia. Portanto a coinfecção entre A. ceylanicum e S. mansoni não exarceba o quadro de anemia. 3) O número de granulomas e o seu desenvolvimento também não foram alterados durante a coinfecção. 111 12. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 112 12. Referências Bibliográficas ALBONICO, M.; SMITH, P.G.; ERCOLE, E. Rate of reinfection with intestinal nematodes after treatment of children with mebendazole or albendazole in a highly endemic area. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. v.89, p.538-541, 1995. ALBONICO, M.; STOLTZFUS, R.J.; SAVIOLI, L.; TIELSCH, J.M.; CHWAYA, H.M.; ERCOLE, E.; CANCRINI, G.; Epidemiological evidence for a differential effect of hookworm species, Ancylostoma duodenale or Necator americanus, on iron status of children. Int. J. 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