Universidade Federal de Minas Gerais Instituto de Ciências Biológicas Departamento de Fisiologia e Biofísica Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas – Fisiologia e Farmacologia EFEITO DAS SAPONINAS TRITERPÊNICAS ISOLADAS DE RAÍZES DA Ampelozizyphus amazonicus DUCKE SOBRE A FUNÇÃO RENAL LÚCIO RICARDO LEITE DINIZ BELO HORIZONTE 2006 2 LÚCIO RICARDO LEITE DINIZ EFEITO DAS SAPONINAS TRITERPÊNICAS ISOLADAS DE RAÍZES DA Ampelozizyphus amazonicus DUCKE SOBRE A FUNÇÃO RENAL Dissertação apresentada ao programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas - Fisiologia e Farmacologia, Departamento de Fisiologia e Biofísica, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para obtenção do grau de mestre. Orientadora: Profa. Dra. Maria Aparecida Ribeiro Vieira Belo Horizonte 2006 3 O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Fisiologia Renal “Professor Fernando Alzamora”, do Departamento de Fisiologia e Biofísica do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, sob a orientação da Profa Maria Aparecida Ribeiro Vieira, na vigência de auxílios concedidos pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG). 4 Dedico este trabalho aos meus pais Nádja e Ernesto. 5 AGRADECIMENTOS À Profa. Maria Aparecida Ribeiro Vieira, pela confiança, apoio e por compartilhar seus conhecimentos científicos. À Profa. Maria das Graças Lins Brandão e aos membros de seu Laboratório (Laboratório de Farmacognosia, Faculdade de Farmácia, UFMG), em especial, à Kênia Klausing, pela disponibilização do material fitoquímico utilizado nesse trabalho. Ao programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas – Fisiologia e Farmacologia, Depto. de Fisiologia e Biofísica, ICB, UFMG, pela acolhida durante os anos de Mestrado. À Adelaide, pelo esforço para disponibilizar quantidades suficientes de ratos (sempre em grande número) utilizadas neste trabalho. Ao Prof. Celso Caruso Neves e aos membros de seu Laboratório (Laboratório de Bioquímica Renal, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Centro de Ciências da Saúde, UFRJ), pela prontidão em colaborar na determinação de atividades ATPásicas e pela recepção na UFRJ. Agradecimento muito especial para a Aloa que, inclusive, veio ao nosso Laboratório para auxiliar na coleta e tratamento das amostras. À Profa. Adelina Martha dos Reis e aos membros de seu Laboratório (Laboratório de Endocrinologia e Metabolismo, Depto. de Fisiologia e Biofísica, ICB, UFMG), em especial, ao André, pela presteza ao colaborar na dosagem de peptídeos natriuréticos. Ao Prof. Geovanni Dantas Cassali e aos membros de seu Laboratório (Laboratório de Patologia Comparada, Depto. de Patologia Geral, ICB, UFMG), pela 6 disposição constante em colaborar na avaliação morfológica realizada nesse trabalho. Aos Profs. Robson Augusto Sousa dos Santos (Laboratório de Hipertensão, Departamento de Fisiologia e Biofísica, ICB, UFMG) e Anderson José Ferreira (Laboratório de Biologia do Desenvolvimento, Departamento de Morfologia, ICB, UFMG), pelo colaboração na dosagem de HAD. A todos os Profs. do Departamento de Fisiologia e Biofísica, ICB, UFMG, pelos ensinamentos adquiridos. À Luiza e Ana Rosa, peças fundamentais na minha vinda para a UFMG. Minha eterna gratidão. À Roseli, pelos auxílios fundamentais prestados neste trabalho e, principalmente, pela amizade e apoio constante. Aos amigos do Laboratório, Ana Paula Araújo, Kátia, Kênia, Lílian, Viviane, Thiago, Anna Paula e Magno pela amizade, carinho e cooperação. Isto proporcionou um ambiente agradável, facilitando a execução desse trabalho. Aos colegas do Laboratório Eletrocel, em especial, ao Éder, Priscila, Ricardo, Anita e Flaviana. Aos colegas da Pós-Graduação, pela agradável convivência. Aos Técnicos e Secretárias do Departamento de Fisiologia e Biofísica, em especial, à Celinha, Jânua, Vanessa, Zezé e Darcy, pelos auxílios prestados. Aos meus irmãos Tatiana e Alexandre, pelo imenso carinho. À Paula, que muito me ajudou nessa etapa de minha vida, com carinho, incentivo e companheirismo. 7 LISTA DE ABREVIATURAS AaD – Ampelozizyphus amazonicus Ducke AMPc – 3’ 5’ monofosfato cíclico de adenosina AQP – Aquaporina ATP – Trifosfato de adenosina COsm – Clearance osmolar CH2O – Clearance de água livre CTL – Controle , “control” EBAaD, CEAaD – Extrato bruto das raízes da Ampelozizyphus amazonicus Ducke; “crude extract” Fig – Figura FU, UF – Fluxo urinário, “Urinary flow HAD – Hormônio Antidiurético. GMPc – 3’5’ monofosfato cíclico de guanosina IP3 – 1, 4, 5- trifosfato inositol NPr-A – Receptor para peptídeo natriurético tipo A NPr-C – Receptor para peptídeo natriurético tipo C PKA – Proteína quinase A PKC – Proteína quinase C PNA – Pptídeo natriurético atrial PNB – Peptídeo natriurético tipo -B PNC – Peptídeo natriurético tipo – C RFG – Ritmo de filtração glomerular 8 RIE – Radioimunoensaio SAPAaD – Saponinas triterpênicas isoladas das raízes da Ampelozizyphus amazonicus Ducke VS – Versus WHO - World Health Organization 9 RESUMO Objetivo: Nesse trabalho, foram investigados os efeitos do extrato bruto das raízes da Ampelozizyphus amazonicus Ducke (EBAaD), bem como das saponinas dele isoladas (SAPAaD), sobre a função renal em ratos e os possíveis mecanismos envolvidos nesses efeitos. Materiais e métodos: A volemia de ratos Wistar (250-350g) foi expandida com NaCl 0,9% (4% do peso corporal) na ausência ou presença de doses variáveis de EBAaD ou SAPAaD administradas por gavagem. Os ratos foram individualmente colocados em gaiolas metabólicas e o fluxo urinário (FU) foi medido a cada 30 min, durante 3 h. O efeito das SAPAaD (50 mg/kg), 90 ou 60 min após a gavagem, também foi investigado sobre os seguintes parâmetros: RFG (“clearance” de creatinina), Na+ e K+ (fotometria de chama), osmolalidade (osmometria de congelamento), conteúdos plasmático e atrial de PNA e de urodilatina urinária (RIE). Além disso, após tratamento com SAPAaD, os rins foram removidos para posterior análise morfológica e determinação de atividades de ATPases (Na+ ATPase e (Na++ K+)- ATPase). Resultados: Ao contrário do EAaD, que aumentou a diurese, as SAPAaD reduziram o FU de forma dose-dependente. As SAPAaD (50 mg/kg) reduziram, o FU, de 371,3 (CTL) para 155,6 ml.min (área sob a curva) (p< 0,05). As SAPAaD ainda tornaram o CH2O mais negativo (-5,56 ± 0,45 vs -3,21 ± 0,73 ml/min, no CTL) (p=0,025), aumentaram as frações de excreção de Na+ (2,17± 0,43 vs 1,01 ± 0,27%, no CTL) (p=0,048) e de K+ (131,5 ± 17,5 vs 60,1 ± 20,0%, no CTL) (p=0,028), aumentaram a atividade da Na+ ATPase (25,0 ± 5,9, CTL, vs 52,7 ± 8,9 nmolPi x mg-1x min-1, p=0,049) e diminuíram a urodilatina na urina (792 ± 132, CTL, vs 299 ± 88 ρg/mL, p=0,01). Conclusão: As SAPAaD reduzem o fluxo urinário, provavelmente por aumentar a reabsorção de água nos túbulos renais. Esse efeito antidiurético das SAPAaD pode ser devido a um aumento na atividade renal das ATPases renais e/ou a uma diminuição na síntese de urodilatina renal. 10 ABSTRACT Objective: In this study, we have investigated the effect of crude extract of roots of Ampelozizyphus amazonicus Ducke (CEAaD) and of saponins isolated from CEAaD (SAPAaD), on renal function in rats as well as possible mechanisms SAPAaD effects occur. Materials and Methods: Wistar rats (250-350g) were volume expanded with 0.9% NaCl (4% of body weight) in the absence and presence of CEAaD or SAPAaD given by gavage. Rats were individually housed in metabolic cages and urine flow (UF) was measured every 30 min throughout the experiment (3 h). SAPAaD (50 mg/kg) effect, 90 or 60 min after gavage, also was investigated on the following parameters: GFR (creatinin clearance), Na+ e K+ (flame photometer), osmolality (freezer point osmometry), plasma and atrial content of ANP and urinary urodilatin (RIA). In addition, after SAPAaD treatment, kidneys were removed for further morphological analysis and determination of ATPases (Na+ ATPase e (Na++ K+)-ATPase) activities. Results: Contrarily to CEAaD, which increased diuresis, SAPAaD reduced UF in a dose-dependent manner. SAPAaD (50 mg/kg) reduced UF from 371.3 (CTL) to 155.6 ml.min (area under curve) (p< 0.05). SAPAaD also became CH2O more negative (-5.56 ± 0.45 vs -3.21 ± 0.73 ml/min, CTL) (p = 0.025), increased fractional excretion of Na+ (2.17± 0.43 vs 1.01 ± 0.27%, CTL) (p=0.048) and of K+ (131.5 ± 17.5 vs 60.1 ± 20.0%, CTL) (p=0.028), increased Na+ ATPase activity (25.0 ± 5.9, CTL, vs 52.7 ± 8.9 nmolPi x mg-1x min-1, p=0.049) and decreased urinary urodilatin (792 ± 132, CTL, vs 299 ± 88 ρg/ml, p=0.01). Conclusion: SAPAaD may reduce UF by increasing water reabsorption in renal tubules. Antidiuretic effect of SAPAaD may be due to an increase in renal activities of ATPases and/or a decrease in renal urodilatin. 11 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ......................................................................................... 1 1.1 Formação de urina I: Transporte de Na+ e K+ ......................................... 2 1.2 Formação de urina II: Peptídeo Natriurético Atrial, urodilatina e vasopressina ........................................................................................ 5 1.3 Breve histórico sobre o uso de plantas medicinais ................................. 8 1.4 Função renal e plantas medicinais .......................................................... 12 1.5 Ampelozizyphus amazonicus Ducke ....................................................... 14 1.5.1 Saponinas esteroidais ..................................................................... 16 1.5.2 Saponinas triterpênicas .................................................................... 16 1.5.3 Propriedades biológicas e farmacológicas das saponinas .............. 21 2 OBJETIVOS .............................................................................................. 23 3 MATERIAIS ............................................................................................... 25 4 MÉTODOS ................................................................................................ 29 4.1 Preparação do EBAaD e das SAPAaD ...................................................... 30 4.2 Protocolos Experimentais ...................................................................... 30 4.2.1 Protocolo I ..................................................................................... 30 4.2.2 Protocolo II .................................................................................... 31 4.2.3 Protocolo III ................................................................................... 32 4.2.4 Protocolo IV ................................................................................... 32 4.2.5 Protocolo V .................................................................................... 33 4.2.6 Protocolo VI ................................................................................... 34 4.3 Dosagens bioquímicas ........................................................................... 35 4.3.1 Clearance de creatinina ................................................................. 35 4.3.2 Dosagem de sódio e potássio ........................................................ 37 4.3.3 Determinação da osmolalidade plasmática e urinária ................... 37 4.3.4 Dosagem de PNA e Urodilatina ..................................................... 38 12 a) Extração dos peptídeos .............................................................. 38 b) Iodação do PNA ......................................................................... 39 c) Radioimunoensaio para PNA e urodilatina ................................ 39 4.3.5 Dosagem de HAD .......................................................................... 40 4.3.6 Atividade da Na+ ATPase e da (Na+ + K+) – ATPase .................... 41 4.3.7 Avaliação morfológica .................................................................... 42 4.4 Atividade hemolítica das SAPAaD .......................................................... 42 4.5 Análise estatística ................................................................................. 43 5 RESULTADOS ........................................................................................... 45 5.1 Atividade hemolítica das SAPAaD ........................................................... 46 5.2 Efeito das SAPAaD sobre a morfologia renal .......................................... 49 5.3 Considerações sobre os protocolos experimentais ............................... 52 5.4 Efeito do EBAaD e das SAPAaD sobre a diurese ...................................... 53 5.5 Efeito das SAPAaD sobre a diurese induzida por expansão hiposmótica de volume .......................................................................... 58 5.6 Efeito das SAPAaD sobre a reabsorção e excreção de água e eletrólitos .................................................................................... 60 5.7 Mecanismo de ação antidiurética das SAPAaD ....................................... 64 5.7.1 SAPAaD e peptídeos natriuréticos ................................................... 64 5.7.2 SAPAaD e atividade ATPásica do córtex renal ................................. 66 5.7.3 SAPAaD e diurese induzida por furosemida ..................................... 68 6 DISCUSSÃO ................................................................................................... 70 7 CONCLUSÃO ................................................................................................. 83 8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 85 13 1 INTRODUCÃO 14 1. INTRODUÇÃO 1.1 FORMAÇÃO DE URINA I: TRANSPORTE DE Na+ E K+ O processo de formação de urina inicia-se com a filtração glomerular de cerca de 25% do plasma que atinge o rim. Esse processo, que promove a passagem de um ultrafiltrado dos capilares glomerulares para o interior dos túbulos renais, é dependente de propriedades glomerulares como coeficiente de permeabilidade, área filtrante, diferença de pressão hidrostática entre capilar glomerular e cápsula de Bowman e da pressão oncótica intracapilar. Assim, qualquer fator que afete alguma dessas propriedades irá interferir na filtração glomerular e, conseqüentemente, na produção de urina (Eaton and Pooler, 2004).. Entre esses fatores incluem-se alteração na perfusão renal, alteração morfológica do glomérulo, redução da massa renal, isquemia renal, feedback justaglomerular, agentes diuréticos, hormônios, hiperfiltração após administração de substâncias osmoticamente ativa, entre outros (FLECK, 1999). O processo de formação de urina ainda envolve a reabsorção do ultrafiltrado da luz tubular para o espaço peritubular e a secreção de substâncias do espaço peritubular para luz tubular. Esses dois processos são fundamentais na determinação da composição e volume finais da urina. A reabsorção e secreção ao longo dos diferentes segmentos do néfron podem ser feitas através de transporte passivo ou ativo. No transporte passivo não há gasto de energia e o movimento das substâncias, através das células epiteliais do néfron, obedece a forças físicas como gradiente eletroquímico, pressão hidrostática e diferença de potencial elétrico. O transporte ativo de uma substância se faz contra um gradiente elétrico, químico ou ainda eletroquímico e, assim, requer gasto de energia. Nas células epiteliais dos túbulos renais, essa energia é suprida por enzimas ou bombas, denominadas ATPases, que utilizam diretamente a energia liberada pela hidrólise do ATP para promover o transporte (transporte ativo primário). Além disso, a energia liberada pelas ATPases, para o transporte de um íon, pode induzir um gradiente eletroquímico que facilita o movimento desse íon a favor do gradiente gerado (transporte ativo secundário). Assim, essas bombas são fundamentais para o 15 transporte de íons e moléculas através do túbulo e, qualquer alteração na atividade ou expressão dessas bombas influenciam diretamente o transporte dessas substâncias. Isto resulta em alteração da composição e do volume de urina. Essas ATPases estão localizadas principalmente na membrana basolateral do túbulo renal, que está em contato direto com o espaço intercelular e os capilares peritubulares (VALTIN & SCHAFFER, 1995; SEGURO et al., 2003). As principais ATPases localizadas na membrana basolateral são a (Na+ + K+) ATPase e a Na+ ATPase. A (Na+ + K+) ATPase é uma enzima pertencente à classe das ATPases do Tipo – P, que utilizam da energia gerada pela hidrólise de uma molécula de ATP para transportar, contra um potencial eletroquímico, três íons Na+ para fora da célula e dois íons K+ para o interior celular, estabelecendo e mantendo um meio intracelular com altas concentrações de K+ e baixa de Na+. A (Na+ + K+) ATPase é um heterodímero composto por subunidades α e ß. A subunidade α é uma proteína transmembrana que contém, aproximadamente, 1000 resíduos de aminoácidos e é responsável pelas propriedades catalíticas e transportadoras da enzima. Nessa subunidade estão localizados os sítios de ligação dos cátions, ATP e ouabaína (LINGREL & KUNTZWELLER, 1994; MERCER, 1993). A (Na+ + K+) ATPase é, especificamente, inibida por glicosídeos cardiotônicos sendo, a ouabaína, o glicosídeo mais utilizado. No rim, a (Na+ + K+) ATPase está localizada na membrana basolateral das células dos túbulos renais e tem um papel importante na reabsorção de Na+ e água (BLANCO & MERCER, 1998). A subunidade ß é um polipeptídio glicosilado, que possui cerca de 310 resíduos de aminoácidos e atravessa a membrana plasmática apenas uma vez. Acredita–se que essa subunidade seja importante para a afinidade da enzima pelo K+ e Na+ e pela ouabaína, além de servir como molécula de adesão em células nervosas (EAKLE et al., 1994; EAKLE et al., 1995). Há ainda uma terceira subunidade, denominada γ, que é um polipeptídeo de pequeno peso molecular (8000 – 14000 Da). Estudos demonstraram que essa subunidade pode estar envolvida na estabilização da conformação E1 da (Na+ + K+) ATPase (THERIEN et al., 1997). Assim como outras proteínas, a (Na+ + K+) ATPase é expressa em diferentes células e tecidos de diferentes organismos, sob a forma de diferentes isoenzimas 16 (proteínas que catalisam a mesma reação). A expressão de isoenzimas da (Na+ + K+) ATPase está estritamente ligada às diferentes condições fisiológicas e/ou patológicas do organismo. Por exemplo, durante o desenvolvimento, há uma mudança relativa nas quantidades de isoformas nos tecidos. Hormônios podem modular a expressão de uma determinada isoforma ou afetarem diretamente a atividade da (Na+ + K+) ATPase (EWART & KLIP, 1995). A regulação da atividade da (Na+ + K+) ATPase pode ser feita pela variação na quantidade de enzima na membrana celular, pela mudança no ritmo de sua síntese ou degradação assim como pela mobilização de vesículas, contendo as enzimas, para a superfície celular. A regulação ainda pode ser feita por alteração direta da bomba, quando esta já está presente na membrana celular, através de fatores como concentração intracelular de Na+, ouabaína ou fatores que levem a um aumento na atividade de proteínas quinases (PKA, PKC ou PKG) (BLANCO et al., 1998). A Na+ ATPase , outra bomba presente na membrana basolateral das células tubulares renais, transporta íons Na+ acoplados a íons Cl- e água do interior das células renais para o meio intersticial, contra um gradiente químico. Para isso, utiliza a energia liberada pele hidrólise do ATP (WHITTHEMBURY & PROVÉRBIO, 1970). A Na+ ATPase é cerca de 10 vezes menos ativa que a (Na+ + K+) ATPase, o que sugere que a mesma possa estar envolvida no controle fino do transporte de Na+ nos túbulos renais (CARUSO-NEVES et al., 2002). Essa bomba foi, inicialmente, descrita nas frações microssomais da córtex renal de cobaias (PROVÉRBIO et al., 1975) e no rim de ratos (OSORE, 1979). Atualmente, a sua presença já foi relatada em diferentes tecidos de diversas espécies como rato, porco, galinha, pato, iguana, camarão, peixe e anfíbios (MORETI et al., 1991). As principais diferenças entre a Na+ ATPase e a (Na+ + K+) ATPase que as tornam independentes são: a) A Na+ ATP é estimulada somente pelo Na+ e Li + não sendo estimulada por nenhum outro cátion, inclusive o K+, (PROVÉRBIO & DEL CASTILLO, 1981; DEL CASTILO et al., 1982); b) A Na+ ATPase é insensível à ouabaína mesmo em concentrações superiores a 10 mM, diferentemente da (Na+ + K+) ATPase (PROVERBIO et al., 1986); 17 c) A atividade da Na+ ATPase é especificamente inibida pela furosemida, trioflocina, ácido etacrínico e iodeto de sódio, o que não ocorre com a (Na+ + K+) ATPase (DEL CASTILO et al., 1982; PROVÉRBIO et al., 1986); d) Diferentemente da (Na+ + K+) ATPase, a Na+ ATPase não é digerida pela tripsina (PROVÉRBIO et al., 1986); e) Possuem diferentes parâmetros cinéticos quando submetidas às mesmas condições de pH, temperatura e concentração de substratos (DEL CASTILO et al., 1982); f) A Na+ ATPase possui menor atividade ATPásica do que a (Na+ + K+) ATPase, possuindo cerca de 10 % da atividade ATPásica total (CARUSO-NEVES et al., 2002.) 1.2 FORMAÇÃO DE URINA II: PEPTÍDEO NATRIURÉTICO ATRIAL, URODILATINA E VASOPRESSINA Uma série de agentes produzidos no organismo interfere no processo de formação de urina por atuarem, tanto na regulação da filtração glomerular, como no transporte de eletrólitos e água ao longo dos túbulos renais. O hormônio antidiurético (HAD), também conhecido como vasopressina, é um hormônio fundamental na manutenção da osmolalidade plasmática e homeostase dos líquidos corporais. Um aumento na osmolaridade plasmática ou redução do volume circulatório efetivo estimula a secreção de HAD, pela hipófise posterior, levando a um aumento na reabsorção de água e concentração da urina pelos rins retornando, a osmolalidade plasmática e o volume extracelular, a níveis normais (BANKIR, 2001; VERBALIS, 2003). O ductor coletor é o principal alvo de ação desse hormônio no rim, onde o HAD se liga a receptores V2, presentes na membrana basolateral das células principais do ducto coletor, para produzir seu efeito antidiurético (INOUE et al., 2001). O receptor V2 é um receptor acoplado à proteina Gs localizada sobre a face citoplasmática da membrana das células principais dos ductos coletores. A ligação do HAD ao receptor V2 causa a ativação, pela proteina Gs, da enzima adenilato ciclase que converte o ATP intracelular em AMPc. O AMPc formado ativa a proteína 18 quinase A (PKA) intracelular que fosforila os aminoácidos serina e treonina do domínio hidrofílico dos canais de água denominados aquaporinas 2 (AQP2). Isso induz a translocação reversível das AQP2, de vesícula-estoque intracelular, para a membrana apical das células principais aumentando, assim, a permeabilidade dos ductos coletores à água (NIELSEN et al., 1995). Além da AQP2, que é diretamente regulado pela vasopressina, outras três aquaporinas, AQP1, AQP3 e AQP4 estão presentes em outros locais do néfron. A AQP1 é constitutivamente expressa nas membranas lateral e basolateral das células do ramo descendente da alça de henle enquanto a AQP3 e AQP4 são constitutivamente expressas na membrana basolateral das células principais dos ductos coletores (INOUE et al., 2001). Além do aumento da reabsorção de água promovido pela HAD através do aumento do número de AQP2 na membrana apical das células tubulares, estudos indicam que o HAD estimula canais de sódio sensíveis a amilorida, presentes na membrana apical das células principais dos ductos coletores (SCHAFER & TROUTMAN, 1990). No rim, a ação do HAD é afetada por vários fatores como endotelina, PNA, glucagon, oxitocina e adrenomedulina (INOUE et al., 2001). O peptídeo natriurético atrial (PNA) pertence à família dos peptídeos natriuréticos que ainda inclui o peptídeo natriurético tipo B (PNB), peptídeo natriurético tipo C (PNC) e urodilatina (LEVIN et al., 1998). O PNA se caracteriza por uma potente ação natriurética e diurética (de BOLD, 1981). Esses peptídeos ligam- se a receptores específicos presentes na membrana plasmática das células denominados receptor do tipo A, receptor do tipo B e receptor do tipo C. O RPN-A e o RPN-B são isoformas de receptores ligados à enzima guanilato ciclase, que após a ligação do peptído ao receptor, catalisa a conversão do GTP em guanosina 3,5- monofosfato cíclico (GMPc) (ANAND-SRIVASTAWA et TRACHTE, 1993). O RPN-C não possui o domínio para a enzima guanilato ciclase e é caracterizado como um receptor ligado ao “clearance” dos peptídeos natriuréticos (NUSSENZVEIG et al., 1990; FORSSMANN et al., 2001). Entre os peptídeos natriuréticos, o peptídeo natriurético atrial (PNA99-126) é o mais caracterizado. Esse peptídeo é uma molécula formada por uma cadeia de 28 aminoácidos, originada da clivagem enzimática da porção carboxi -terminal do seu 19 precursor, o pró-PNA, pelas enzimas carboxipeptidase ou encefalina-convertase (RUSKOAHO et al., 1986). O precursor pró-PNA é uma molécula de 126 aminoácidos (FLYNN et al., 1983), sintetizada e armazenada nos miócitos atriais (SAKAMOTO et al., 1985) e que na sua porção carboxi –terminal encontra-se a forma ativa do PNA99-126 (BELTOWSKI & WÓJCICKA., 2002). O principal local de ação do PNA99-126, no rim, são as células principais localizadas no segmento intramedular do ducto coletor. Estudos demonstram que o efeito do PNA nesse segmento é mediado por receptores RPN-A levando a um aumento nos níveis intracelulares de GMPc (KISHIMOTO et al., 1996; FORSSMANN et al., 1998). O GMPc é o principal segundo mensageiro envolvido na inibição, pelo PNA, do transporte de Na+ e água (BELTOWSKI & WÓJCICKA, 2002). Então, a propriedade natriurética e diurética do PNA é resultado da sua ação sobre diferentes componentes envolvidos na formação da urina, tais como aumento do ritmo de filtração glomerular (RFG) (COGAN, 1986), diminuição da reabsorção de Na+ através da inibição de diferentes canais e bombas enzimáticas presentes, principalmente, na membrana luminal e basolateral do segmento medular do ducto coletor (BELTOWSKI & WÓJCICKA, 2002, CARUSO-NEVES et al., 2004) e inibição da reabsorção de Na+ e água promovida pela vasopressina (NONOGUCHI et al., 1989) e angiotensina II (HARRIS et al., 1987), entre outras ações. Como resultado final, ocorre aumento na diurese e natriurese, funções pelas quais o PNA participa da manutenção do volume extracelular e da pressão arterial. A urodilatina é um peptídeo composto por 32 aminoácidos, primeiramente, isolado de urina humana (SCHULZ KNAPPE, 1988). Sua molécula possui uma seqüência de aminoácidos idêntica à do PNA (PNA99-126), porém, com quatro aminoácidos adicionais na porção amino-terminal da sua molécula. Isto sugere que ambos os peptídeos são derivados do mesmo gene e do mesmo peptídeo precursor, PNA1-126, no entanto, na síntese de urodilatina o precursor é processado de forma diferente que na síntese de PNA (FORSSMANN et al., 2001). Estudos têm mostrado que a urodilatina exógena exerce efeitos similares ao PNA nos rins, ou seja, reduz a reabsorção tubular de sódio e água aumentando, assim, a excreção renal dos mesmos (GOETZ, 1991). Doses equimolares de urodilatina e PNA produzem inibição equivalente do transporte de Na+ nos ductos coletores medulares (SCHULZ KNAPPE et al., 1990). No entanto, trabalhos realizados em humanos e cães 20 mostram que, também em doses equimolares, a urodilatina produz efeitos natriurético e diurético maiores que o PNA (BESTLE & BIE., 1993; HIDELBRANDT et al., 1992). Provavelmente, esse efeito mais acentuado decorre de uma maior exposição dos receptores RPN-A à urodilatina uma vez que, ao contrário do PNA, a urodilatina não é metabolizada pelas endopeptidases presentes no rim (GEGELMANN et al., 1988). Em resumo, a urodilatina é um peptídeo sintetizado no próprio rim, nos segmentos distais do néfron. Em seguida, ela é secretada no lúmen tubular e atua, de forma parácrina, sobre receptores RPN-A localizados na membrana de células do segmento intramedular do ducto coletor inibindo a reabsorção de sódio, provavelmente, através dos mesmos mecanismos utilizados pelo PNA (BELTOWSKI & WÓJCICKA , 2002) 1.3 BREVE HISTÓRICO SOBRE O USO DE PLANTAS MEDICINAIS Estudos no campo da antropologia, paleontologia e arqueologia mostram que o Homem, desde a época paleolítica, já fazia uso de plantas ou preparações à base de vegetais com fins de preservação da vida e tratamento de enfermidades (CASTRO, 1981). Na antiguidade, quando o Homem deixa de temer a natureza e passa a buscar igualdade entre si e a mesma, a imortalidade passa a ser o sonho almejado. Dessa forma, o homem fez nascer a alquimia. Segundo GOLDFARB (1988), a essência vital encontrada nesta era extraída das plantas e dos animais. Os chineses, hindus, hebreus e egípcios foram os povos que mais se destacaram nas práticas alquímicas durante a antiguidade. O Pentsao, obra chinesa sobre plantas medicinais, data-se de três mil anos antes do cristianismo. O documento mais antigo teria sido escrito pelo imperador Chen-Ming e continha 365 espécies vegetais, uma para cada dia do ano. O Papiro de Ebers, um documento onde se encontram relatos sobre várias enfermidades e métodos de tratamento, escrito pelos egípcios, datada de 155 a.C., possui mais de 20 metros de comprimento incluindo referências a mais de 7000 substâncias medicinais incluídas em mais de 800 fórmulas, Dentre as substâncias mencionadas nesse documento, 21 encontram-se casca de romã, óleo de oliva, maconha, ópio, canela, entre outras (AlBORNOZ, 1980). Podem ser citados ilustres personagens dessa época histórica que contribuíram para impulsionar a Fitoterapia. Por exemplo: Hipócrates (460? a 370? a. C.), ilustre médico grego, que aconselhava medicamentos vegetais; o filósofo grego Teofrasto (372 a 287 a.C.) que com a sua “História das plantas”, deixou descrições botânicas muito precisas de cerca de 455 plantas, acompanhadas de indicações sobre efeitos tóxicos e propriedades curativas; e Galeno, pai da farmácia, que no século II, publicou uma muito pormenorizada colectânea de fitopreparações medicamentosas, chamadas ainda hoje preparações "galénicas". Do ponto de vista farmacêutico, a grande linha de força do galenismo foi a transformação da patologia humoral numa teoria racional e sistemática pela qual a medicina greco-romana passou para o Ocidente cristão, dominando a medicina e a farmácia até ao Século XVII e mantendo ainda uma grande influência mesmo no século XVIII (ARBER, 1988; JONES, 1997). Destaca –se ainda no campo das plantas medicinais um grego chamado Dioscórides, que escreveu o tratado “De Materia Medica” que representa um marco histórico no conhecimento de numerosos fármacos, muitos dos quais ainda hoje são usados. Nele, se descrevem cerca de 600 produtos de origem vegetal, animal e mineral, com indicações sobre o seu uso médico (ARBER, 1988). Foi tal a projecção da obra de Dioscórides que, tendo sido escrita no ano 78 da nossa era, passa a ser usada, como guia de ensino, no mundo romano e no árabe, continuando em vigor até finais da Idade Média, pois ainda no século XV, são feitas cópias em latim dessa obra (RIDDLE, 1985). Na idade média, com a necessidade terapêutica de se curar a peste, foram publicados os primeiros Herbaria, que eram compilações sobre plantas medicinais que tinham por objetivo instruir monges sobre a importância da utilização de vegetais (ORLANDI & VERLOET, 1983). Nesse período destaca-se a figura de médico Phillipus Aureolus Theoperastus Bombastus von Hohenheim, conhecido como Paracelso. Nascido na aldeia de Einsiedeln, Suíça, em 17 de dezembro de 1493, Paracelso contestava o sistema polifarmacêutico galénico e possuía uma visão sobre a doença que ia muito além da visão tradicional vigente na época que, baseada no pensamento do filósofo Hipócrates, acreditava que as doenças eram causadas por mau funcionamento dos fluídos do corpo humano: sangue, catarro, 22 bílis preta e bílis amarela, enquanto que o médico suíço definia a saúde como equilíbrio e doença com o desequilíbrio de todas as energias presentes no ser humano, tanto no corpo físico como espiritual. E que para essas doenças do corpo existiam certos remédios que pudessem curá-las. Ou seja, procurava a cura das doenças na aplicação de substâncias químicas. Assim, Paracelso lançou uma das bases da Química Moderna e, portanto, da farmacologia e do progresso da ciência médica. Utilizava-se da alquimia, para preparo dos medicamentos, além da filosofia, astronomia e virtus como base para a cura das enfermidades. Paracelso associava as características exteriores de uma planta a sua função e atributos medicinais. Assim, por exemplo, folhas em forma de coração foram recomendadas para doenças cardíacas. Além disso, Paracelso reconhecia que a fé fortalecia a imaginação e auxiliava na cura, fato atualmente conhecido como efeito placebo, no qual uma substância sem qualquer efeito farmacológico, prescrita para levar o doente a experimentar alívio dos sintomas pelo simples fato de acreditar nas propriedades terapêuticas do produto. Paracelso faleceu em 24 de setembro de 1541 com apenas 47 anos, deixando um legado de obras escritas e ensinamentos que compõem o que atualmente é chamado de medicina experimental (RIDDLE, 1985; PARACELSO, 2005). Na idade moderna, o uso das plantas, como fonte terapêutica, pode ser dividido em três períodos distintos, conforme sugerido por YUNES & CECHINEL FILHO (2001). a) Primeiro Período (1800 a 1900): Nesse período, alguns países europeus como Inglaterra, França e Alemanha passam por uma revolução científico-tecnólogico- industrial denominada “Revolução Industrial”. Essa época se caracteriza por uma estreita relação entre a química orgânica moderna e a medicina, na qual os químicos, que estudavam plantas medicinais, se dedicavam a isolar e determinar a estrutura de compostos ativos de plantas consagradas pela medicina popular. Durante esse período, ocorreu o isolamento de princípios ativos de várias plantas e muito deles ainda são usados na terapêutica atual. Entre esses, encontram-se a morfina, extraída da Papaver somniferum por Seturner (1803), a efedrina, extraída da Ephedra sinicaI por Nagai (1887) e a atropina, extraída da Atropa belladona por Geiger e Hess (1833) (YUNES & CECHINEL FILHO, 2001). Cabe ressaltar que na 23 América Latina, a quinina foi isolada da Cinchona calisaya por Pelletier e Canentau (1877), uma planta usada no tratamento da malária no Peru (YUNES & CECHINEL FILHO, 2001). Assim, o surgimento e expansão de sociedades industriais promoveram um avanço na utilização de moléculas ativas contidas nas plantas. b) Segundo Período (1901 a 1970/80): É um período de decadência do uso de plantas com finalidades terapêuticas decorrente de um avanço no desenvolvimento de fármacos de origem sintética. Diversos fármacos sintéticos foram desenvolvidos nessa época, principalmente, após a Segunda Guerra Mundial sendo que, muito deles, se encontram no mercado e ainda são de grande importância para a Humanidade. Exemplo desses são os anti-histamínicos (antergan), antipsicóticos (clorprozamina), antidepressivos (iproniacida), ansiolíticos pertencentes à classe das benzodiazepinas, antipiréticos e antiinflamatórios (indometacina). Nesse período, o uso de produtos naturais, de importância terapêutica, limitava–se a antibióticos obtidos de fungos. As plantas medicinais eram consideradas sem valor científico sendo usadas, apenas, na medicina popular. c) Terceiro Período (1970/80 até o presente): O processo de síntese orgânica apresentou alguns problemas, tais como alto custo na obtenção de novos fármacos, dificuldade na descoberta de novos fármacos e incapacidade de produzir fármacos com complexidade estrutural semelhante às moléculas produzidas pelas plantas. Assim, há um retorno ao interesse pelas plantas como fonte de novas substâncias biologicamente ativas e de matérias primas (moléculas puras) que, mesmo não tendo atividade farmacológica ativa intrínseca, podem ser transformadas, por síntese parcial, em derivados farmacologicamente ativos. Uma resolução (WHO 3133) da Organização Mundial de Saúde (OMS) alerta para a importância das plantas medicinais nos sistemas de saúde dos países em desenvolvimento (AKERELE, 1985). O programa de Medicina Tradicional da OMS ressalta a importância do estudo das plantas usadas na medicina popular com o objetivo de verificar, tanto seu possível efeito terapêutico, como também a possível presença de substâncias tóxicas que podem existir nestas plantas. Estes fatos enfatizam a necessidade de metodologia científica adequada para caracterizar os 24 efeitos fisiológicos, farmacológicos e toxicológicos das plantas medicinais. Soma-se a isto, a necessidade de isolamento e purificação dos eventuais compostos que apresentem as atividades biológicas atribuídas a tais plantas, o que poderia levar ao desenvolvimento de compostos mais seguros e potentes no tratamento de diversas alterações fisiopatológicas. O Brasil, com mais de 120.000 variedades de plantas, possui uma enorme diversidade biológica sendo considerado, portanto, um dos últimos celeiros da flora e fauna do Planeta. Nos últimos anos, numerosas pesquisas com plantas medicinais usadas como remédio ou veneno, na medicina popular, têm sido desenvolvidas no Brasil. 1.4 FUNÇÃO RENAL E PLANTAS MEDICINAIS Muitas plantas medicinais são utilizadas na medicina popular brasileira com o intuito de melhorar algum distúrbio renal ou mesmo por apresentarem apenas efeito diurético (CRUZ, 1965; PINHEIRO SOBRINHO, 1977). Entre estas, podemos citar: Cordia Salicifolia (chá de bugre), Jacarandá caroba DC (caroba), Imperata exaltata Brogniard (sapé), Leonotis nepetaefolia R. Brown (cordão de frade) e Ampelozizyphus amazonicus Ducke (cerveja de índio). No entanto, existem poucos estudos, utilizando metodologia científica adequada, que validem a utilização das mesmas e, muito menos, a respeito dos seus mecanismos de ação. Por exemplo, em um levantamento bibliográfico (Scirus) recente foram encontrados os seguintes resultados de acordo com o cruzamento das palavras-chaves: Medicinal plants versus renal function – 129 trabalhos; Medicinal plants versus nephrotoxicity – 19 trabalhos e Medicinal plantas versus renal apoptosis – 13 trabalhos. Este número de trabalhos é surpreendentemente pequeno considerando o tamanho da comunidade científica mundial. Além do mais, chama a atenção o fato da maioria destes trabalhos não terem sido desenvolvidos nos países que detêm tecnologia científica avançada. Daí o nosso interesse em investigar plantas medicinais, popularmente usadas no Brasil, às quais são atribuídas algum efeito renal. Estudo preliminar, realizado em nosso laboratório, mostrou que o extrato etanólico das raízes de Ampelozizyphus amazonicus Ducke aumenta, de forma dose-dependente, o fluxo urinário sem, no entanto, afetar o volume de água ingerido 25 em ratos mantidos em gaiolas metabólicas (MEYER et al., 2002). Esta observação sugere que esta planta possui substâncias com atividade diurética. Observação semelhante foi relatada por HALOUI et al. (2000) ao verficarem que ratos Wistar normotensos tratados, por sete dias, com o extrato aquoso da Rosamarinus officinalis e da Centaurium erythraea aumentou significativamente a diurese, a excreção de Na+, Cl- e K+ com concomitante diminuição do ritmo de filtração glomerular. Já KREYDIYYEH et al. (2002) mostraram que extratos aquosos de Petroselinum hortense e de Petroselinum sativuem também aumentam o volume urinário, em ratos, e que esse efeito diurético é mediado por inibição da bomba (Na+ + K+) ATPase, presente no córtex e medula renais. Também o efeito diurético e natriurético do extrato metanólico de sementes de Strychnos potatorum, administrado por via oral em ratos, foi comparável ao efeito da furosemida (BISWAS et al., 2004). Em um estudo comparativo, HERRERA-ARELLANO et al. (2004) mostraram que o tratamento oral com o infuso de caule da Hibiscus sabdariffa foi capaz de reduzir as pressões sanguíneas sistólica e diastólica de pacientes hipertensos (30 - 80 anos), submetidos ao tratamento por quatro semanas. Esse efeito hipotensivo foi similar ao efeito antihipertensivo obtido com o captopril. Os autores sugeriram que o efeito antihipertensivo da H. sabdariffa era devido à atividade diurética e natriurética observada nos pacientes tratados com o extrato vegetal. Outras espécies como a Ananas cosmosus e a Carica papaya também afetam a função renal já que o tratamento de ratos, por via oral, com o extrato aquoso das raízes das mesmas aumentaram a diurese em 79 e 74%, respectivamente (SRIPANIDKULCHAI et al., 2001). Esse efeito diurético foi o mesmo obtido utilizando uma dose equivalente de hidroclorotiazida. Também, o tratamento com os extratos das duas espécies, resultou numa excreção de eletrólitos semelhante à observada nos ratos tratados com o diurético tiazídico. Paralelamente a estas observações, estudos mostram que algumas plantas exibem efeito antidiurético. Por exemplo, ratos tratados com o extrato aquoso de raízes de Imperata cilíndrica sofreram queda no fluxo de urina (SRIPANIDKULCHAI et al., 2001). De forma semelhante, ratos tratados com óleo essencial extraído de sementes de Pimpenella anisum também apresentaram antidiurese. Esse efeito antidiurético parece estar associado a um aumento na atividade da (Na+ + K+) ATPase renal (KREYDIYYEH et al., 2003). 26 1.5 Ampelozizyphus amazonicus DUCKE A Ampelozizyphus amazonicus Ducke (AaD) é uma planta nativa da região Amazônica pertencente à família das Rhamnaceas, sendo a única espécie do gênero Ampelozizyphus. É popularmente conhecida como “Cerveja de Indio” (PAULINO-FILHO et al., 1979). O infuso de suas raízes é usado popularmente no tratamento contra picada de cobra e na prevenção da malária (BRANDÃO, 1991). KRETTLI et al. (2001) mostraram que o extrato bruto das raízes da AaD é ativo contra os esporozoítas (forma infectante do agente etiológico da malária que são protozoários do gênero Plasmodium encontrados nas glândulas salivares do mosquito vetor) do Plasmodium gallinaceum e/ou contra os protozoários que se encontram nos estágios iniciais do ciclo de vida parasitário, desenvolvido nas células do parênquima hepático (esquizogonia tecidual). A AaD reduziu o parasitismo tecidual em galinhas inoculadas com o protozoário. Estas observações justificam o uso popular das raízes dessa planta na profilaxia da malária. Além disso, a AaD é popularmente usada para induzir diurese. Nesse sentido, em um estudo preliminar realizado no Laboratório de Fisiologia Renal, ICB, UFMG, foi observado que o tratamento crônico (5 dias) com o extrato etanólico das raízes de AaD aumenta o fluxo urinário em ratos mantidos em gaiolas metabólicas (MEYER, 2002), indicando que esta planta possui substâncias com atividade diurética. Das raízes da AaD, já foram isoladas saponinas triterpênicas bem como outros compostos triterpênicos como Lupeol, ácido betulínico, betulina, ácido melaleico e ácido dihidroxilup-20(29)-em-28ß – oico. Esses últimos 5 compostos também são encontrados em outras plantas. Saponinas, compostos sintetizados por enorme variedade de plantas, possuem uma estrutura anfipática formada por resíduos hidrofílicos de açúcares ligados a uma aglicona hidrofóbica. Essa aglicona é composta de átomos de carbono organizados em forma de anéis e é denominada sapogenina (CHANDEL & RASGOTI, 1980; LACAILLE-DUBOIS et al., 1996). A parte polar das saponinas é formada por açúcares como a glicose, galactose, arabinose, ramnose, xilose e ácido glicurônico, entre outros. Em geral, os açúcares estão na forma de oligossacarídeos distribuídos em cadeias lineares ou ramificadas, embora os monossacarídeos 27 também possam ocorrer. O número de moléculas de açúcares mais freqüente, nesses compostos, varia de 3 a 5. Os mono e oligossacarídeos podem se ligar às agliconas através, tanto de ligação do tipo éter, como do tipo éster (MAHATO et al, 1988). Quanto ao número de cadeias de açúcares, presente na molécula, as saponinas podem ser classificadas em monodesmosídicas e bidesmosídicas. As monodesmosídicas são saponinas que apresentam apenas uma cadeia de açúcar ligada à aglicona. Essa ligação, geralmente, do tipo éter, envolve processo de redução dos oligossacarídeos e da hidroxila secundária presente, normalmente, no carbono 3. Em raros casos, esta ligação pode ser do tipo éster. As saponinas bidesmosídicas são saponinas que apresentam, além de uma cadeia de açúcar ligada, por ligação éter, à aglicona no carbono 3, uma segunda cadeia de açúcares ligada ao carbono 28, por meio de uma ligação do tipo éster, das agliconas triterpênicas. Também existem saponinas nas quais as duas cadeias de açúcares estão ligadas às agliconas somente por meio de ligação do tipo éster (MAHATO et al, 1988). A diferença na polaridade dos elementos que compõem a molécula das saponinas é responsável pela capacidade das mesmas de reduzir a tensão superficial da água levando à formação de espuma, quando em solução aquosa. A capacidade das saponinas de interagir com esteróis, presentes na membrana plasmática de eritrócitos, aumenta a permeabilidade dessa membrana, o que permite a entrada de íons e água para o interior das células resultando na ruptura das mesmas e liberação de hemoglobina (KARABALIEV & KOCHEV, 2003). Apesar das propriedades tensoativa e hemolítica serem características marcantes das saponinas, elas não são comuns a todas às saponinas e, portanto, não podem ser usadas para definir esse grupo de compostos. Uma definição estrutural da aglicona desses compostos é a melhor maneira para defini-los (BRUNETON, 1999). De acordo com a estrutura de suas agliconas, as saponinas podem ser classificadas em esteroidais e triterpênicas. 28 1.5.1 Saponinas Esteroidais São compostos que possuem 27 átomos de carbono em seu esqueleto, geralmente distribuídos em seis anéis, e que apresentam grande semelhança estrutural com as saponinas triterpênicas. A diferença entre as mesmas é que a conformação do epoxi esqualeno, para a biossíntese das agliconas esteroidais, é de cadeira-barco-cadeira e não de cadeira-cadeira-cadeira como ocorre na biossíntese das agliconas triterpênicas (LACAILLE-DUBOIS et al., 1996) 1.5.2 SaponinasTriterpênicas As saponinas triterpênicas fazem parte da família dos terpenos que é a maior família de compostos naturais sendo constituída por mais de 40000 moléculas diferentes (MAHATO et al,1988) As vias de biossíntese das saponinas triterpênicas (BRUNETON., 1999) estão mostradas na Figura 1. Em geral, os compostos terpênicos têm como precursor o ácido mevalônico que é formado a partir da Acetil-Coenzima A (CoA). A Acetil-CoA é formada pela ativação da molécula de ácido acético, através de esterificação, pelo grupo tiol da molécula de CoA. O ácido mevalônico é ativado por fosforilação seguida por eliminação descarboxilativa, para gerar o pirofosfato de 3-isopentila (IPP). A isomerização deste último a pirofosfato de 2-isopentila (DMAPP) resulta numa molécula que pode ionizar-se facilmente e adicionar- se a cinco sucessivas unidades de IPP, gerando uma molécula triterpênica de 2,3 epoxi-esqualeno. (AHARONI et al., 2005). Esse processo de biossíntese do 2,3 epoxi-esqualeno é comum aos animais, fungos, algas e plantas superiores. No entanto, após sua formação, as rotas biossintéticas entre os organismos citados divergem bastante. Os vegetais são capazes de ciclizar o 2,3-epoxi-esqualeno (Fig. 2), que se encontra em uma conformação cadeira-cadeira-cadeira, gerando especificamente as agliconas de saponinas tetracíclicas do tipo damarano (BRUNETON., 1999). CoAS O O SCoA O (1) SCoA CO2HO OH (2) (3;4) CO2H OH OPP OH OPP OO H Acetil-CoA Malonil-CoA HMG – CoA ácido Mevalônico (5) OPP OPP IPP DMAPP DMAPP + IPP GPP O P GPP + IPP FPP O P 2 x FPP Esqueleno Figura 1. Rota biossintética dos terpenos. CoA, coenzima A, HMG, 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA, DMAPP, pirofosfato de 2- isopentila, IPP, pirofosfato de 3-isopentila, GPP, geranilpirofosfato, FPP, farnesilpirofosfato. 1- HMG-CoA sintase 2- HMG-CoA redutase 3- Mevalonato quinase 4- Fosfomemévalonatocinase 5- Mevalonato -5- difosfatidescarboxilase O Esqueleno (ciclização) 2,3 epoxi-esqualeno H H R HO H + R OH + HO + Dammarano Figura 2. Ciclização do esqualeno durante a biossíntese de agliconas tetracíclicas do tipo dammarano conforme ocorre nos vegetais. 31 HO + Dammarano HO H HO + HO H + Lupano HO H HO H H + HO H H H Oleano HO H Ursano Figura 3. Progressão do dammarano para formação de agliconas de saponinas pentacíclicas nos vegetais. 32 Assim, as saponinas triterpênicas podem ser definidas como glicosídeos que possuem uma aglicona triterpênica formada pela ciclização do (3S) – 2,3 epoxi- 2,3 – dihidroesqualeno ou, em raros casos, do próprio esqualeno. A estrutura das principais saponinas triterpênicas isoladas das raízes da AaD encontra-se ilustrada na Figura 4. Figura 4. Estrutura de três saponinas triterpênicas isoladas das raízes da AaD. O O O O O HO HO HO Me O OH HO OGlc O OH HO O CH2OH O O O OAc HO H O OHOH OH Me 3–O-[β-D-glicopiranosil(1-2)α-L-arabino- L-ampelozigenina-15α-O-acetil-3-O- piranosil]-20-O-α-ramnopiranosil- α-L-ramnopiranosil-(1-2)-β-D- jujubogenina (BRANDÃO, 1992) glicopiranosídeo (BRANDÃO, 1993) O O O O O HO HO HO Me O OH HO OGlc 3–O-[β-D-glicopiranosil-20-O-α-L- ramnopiranosiljujubogenina 33 Propriedades Biológicas e Farmacológicas das Saponinas As saponinas triterpênicas é um grupo de compostos naturais que apresentam um amplo espectro de atividades biológicas e farmacológicas. A sua atividade mais comum é a capacidade de produzir hemólise. Essa propriedade é resultado da interação das suas moléculas com colesteróis presentes na membrana de eritrócitos resultando na mudança conformacional da membrana levando a uma penetração de íons e água para dentro da célula com conseqüente rompimento celular e liberação de hemoglobina (GLAUBERT et al., 1962; HARUNA et al., 1995). Essa atividade hemolítica das saponinas, que faz parte do sistema de proteção do vegetal contra ataques de predadores (insetos, vírus, fungos e bactérias) (BRUNETON, 1999), está ligada a muitas das atividades antibacteriana, antifúngica e espermicida apresentada por uma variedade de plantas (LACAILLE-DUBOIS & WAGNER, 1996). Além das atividades antibacteriana e antifúngica, as saponinas triterpênicas apresentam atividades contra outros microorganismos como vírus (CHAKRABORTY et al., 2002) e protozoários como Leishmania infantum (GERMONPREZ et al., 2005). Estudos utilizando saponinas triterpênicas como imunomoduladores celulares e humorais em cães, camundongos, porcos e outros primatas não humanos, têm se intensificados. Além disso, esses compostos têm sido testados como adjuvantes em vacinas contra o HIV-1, citomegalovírus e toxoplasma gondii (YANG et al., 2005). As atividades antiinflamatórias e analgésicas que têm sido atribuídas às saponinas parecem se dar por mecanismos variados como inibição da degradação de corticóides, atividade corticomimética, o que interfere no metabolismo de mediadores inflamatórios (LACAILLE-DUBOIS & WAGNER, 1996), atuando no sistema complemento (KIM et al., 1997), etc. Outras propriedades farmacológicas como antiulcerogênica e sedativa são atribuídas a esses compostos (CABALLERO- GEORGE et al., 2004). No que diz respeito à função renal, alguns estudos mostram que as saponinas isoladas de plantas podem afetar a função renal. Assim, foi verificado que o extrato bruto das raízes da Bredemeyera floribunda induz aumento significativo no ritmo de filtração glomerular, fluxo urinário e fração de excreção do Na+ e K+, em ratos. Esse efeito diurético está associado à presença de saponinas triterpênicas na B. 34 floribunda (BEVEVINO et al., 1994). Similarmente, as saponinas presentes nas partes aéreas da Herniaria glabra parece também ser as responsáveis pelo efeito antihipertensivo e diurético observado em ratos espontaneamente hipertensos (RHIOUANI et al., 1999). Similarmente, estudos utilizando ratos geneticamente hipertensos tipo Dahll sensíveis a sal (DSS), mostraram que o ácido oleanólico e seu isômero, o ácido ursólico, que são compostos triterpênicos encontrados nas plantas, apresentam efeitos hipoglicêmico, antioxidante e anti-hipertensivo. Este último foi atribuído a um potente efeito diurético e natriurético desses compostos (SOMOVA et al., 2003). Esse efeito diurético e natriurético confirma os resultados obtidos em outros estudos com saponinas triterpênicas.(RHIOUANI et al., 1999; BEVEVINO et al., 1994). Assim, no contexto atual de: i) retomada do estudo de substância bioativas oriundas de plantas utilizadas na medicina popular e ii) tendência da Ciência Moderna, chamada interdisciplinaridade, na qual podem-se unir ciências correlatas como química de produtos naturais, fisiologia e farmacologia, é que o presente trabalho foi desenvolvido. Nele, os efeitos renais de saponinas triterpênicas isoladas das raízes da Ampelozizyphus amazonicus Ducke (Cerveja de Índio) foram avaliados. 35 2 OBJETIVO 36 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral Validar, experimentalmente, o possível efeito diurético da Ampelozizyphus amazonicus Ducke. 2.2 Objetivos específicos 2.2.1 Investigar experimentalmente o possível efeito do extrato bruto das raízes da Ampelozizyphus amazonicus Ducke bem como das saponinas isoladas do mesmo sobre parâmetros renais como filtração glomerular, eliminação e reabsorção de H2O e eletrólitos (Na+ e K+). 2.2.2 Estudar o(s) possível(is) mecanismo(s) pelo(s) qual(is) a Ampelozizyphus amazonicus Ducke afeta a diurese, explorando a participação de: a) transportadores: (Na+ + K+)ATPase e Na+ ATPase b) Vasopressina, peptídeo natriurético atrial e urodilatina. 37 3 MATERIAIS 38 3 MATERIAIS 3.1 Animais Ratos Wistar, machos, saudáveis, com peso entre 250 - 350g, fornecidos pelo Centro de Bioterismo da UFMG (CEBIO/UFMG), foram utilizados em todos os experimentos. 3.2 Preparação do extrato bruto das raízes de Ampelozizyphus amazonicus Ducke e isolamento de suas Saponinas A planta Ampelozizyphus amazonicus Ducke (Cerveja de Índio) foi coletada no município de Presidente Figueiredo, no estado do Amazonas, Brasil. 3.2.1 Substâncias usadas no preparo do extrato bruto de raízes da Ampelozizyphus amazonicus Ducke (EBAaD) e no isolamento de suas saponinas (SAPAaD): etanol, n-butanol e água destilada, diclorometano, metanol, reagente de Komaroswky (H2SO4 : 4-OH-Benzaldeído), sílica gel 60. 3.2.2 Equipamentos: Evaporador a vácuo 3.3 Substâncias usadas nos protocolos Experimentais 3.3.1 Drogas e reagentes comuns: NaCl a 0,9%, heparina, tiopental sódico, furosemida. 3.3.2 Equipamentos: Balança para pesagem dos ratos, gaiolas metabólicas (Nalgene), provetas, seringas de vidro e agulhas (18g), tubos Falcon de 15 mL, microcentrífuga (Eppendorf , modelo 5415D). 39 3.3.3 Substâncias usadas nas dosagens de: a) Creatinina: Kit próprio (Bioclin) para dosagem de creatinina fornecido pelo Quibasa. b) Sódio e potássio: Padrões de Na+ de 140 mEq/l de K+ de 5 mEq/l e fotômetro de chama (CELM FC-180) obtidos da CELM. c) Osmolalidade: Padrões de 100, 290 e 1000mOsm/Kg e osmômetro (µOSMETTE, Precision systems). d) ANP e urodilatina: ANP e urodilatina (Península Laboratories Inc.), inibidores de proteases EDTA, pepstatina, e PMSF (Sigma Chemical Co.), colunas Sep-Pak C18 (Waters Associates). Acetato de amônio, fosfato de sódio, cloreto de sódio, ácido acético, azida sódica, polietilenoglicol e acetronitrila foram obtidos de diversos fornecedores e apresentavam grau de pureza adequada ao ensaio. Triton X-100 e albumina sérica bovina e (Sigma Chemical Co.), 125I-sódico (New England Nuclear Co.), anticorpo anti-ANP, anticorpo soro de cabra antigama-globulina de coelho (Sigma Chemical Co. ), centrífuga refrigerada (Himac CR 21E Hitachi, Rotor n0 40), evaporador Speed-Vac (Eppendorf, modelo 5301), contador gama (LKB). e) Hormônio antidiurético: HAD (Península Laboratories Inc), inibidores de proteases pOHHg Bnz, PMSF, EDTA, O-Fenantrolina, Pepstatina e albumina sérica bovina (Sigma Chemical Co.), metanol e ácido trifluoroacético (Merck)), tampão vasopressina, colunas Sep-Pak, centrífuga refrigerada (Himac CR 21E Hitachi, Rotor n0 40), freezer – 20 °C, evaporador Speed-Vac ((Eppendorf, modelo 5301). f) Na+ ATPase e da (Na+ + K+) – ATPase: sacarose, HEPES/TRIS, EDTA, PMSF, 5 ATP-Na, ouabaína e furosemida (Sigma Chemical Co.). Cloreto de magnésio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, ácido clorídrico e carvão 40 ativado foram obtidos de diversos fornecedores e apresentavam grau de pureza adequada ao ensaio. Homogenizador do tipo potter com pistilo de teflon, centrífuga refrigerada (Himac CR 21E Hitachi, Rotor n0 46), ultracentrífuga (Sorvall Ultra Pro 80, rotores t-880 e 90Ti). g) Histologia: formol neutro, parafina, hematoxilina e eosina foram obtidos de diversos fornecedores e apresentavam grau de pureza adequada ao ensaio. h) Atividade hemolítica: tubos de ensaio, heparina, cloreto de sódio, tubos para centrífuga tipo eppendorf (1,5 mL), microcentrífuga (eppendorf 5415D), homogenizador tipo potter com pistilo de teflon, centrífuga refrigerada (Himac CR 21E Hitachi, Rotor n0 40), banho-maria, bomba de infusão (Stoelting Co.620, USA). 41 4 MÉTODOS 42 4 MÉTODOS 4.1 Preparação do extrato bruto das raízes de Ampelozizyphus amazonicus Ducke e isolamento de suas saponinas As raízes da planta foram secas em local arejado, à temperatura ambiente e, em seguida, foram trituradas. O processo extrativo foi feito por percolação, onde as raízes da Ampelozizyphus amazonicus Ducke foram colocadas em contato direto com solução de etanol 80%, em um percolador, por cerca de dois dias. Essa operação foi repetida duas vezes. Ao final desse procedimento, obteve-se uma solução hidroalcoólica que foi evaporada obtendo o extrato bruto da Ampelozizyphus amazonicus Ducke (EBAaD). Para a obtenção das saponinas, o EBAaD foi dissolvido em água e misturado a uma solução de n-butanol e água destilada (2:1). A fase n-butanólica foi retida e a fase aquosa foi descartada. Em seguida, o extrato n-butanólico foi evaporado a vácuo até a obtenção do extrato seco, que foi purificado por cromatografia em coluna de sílicagel 60 eluída com solução de diclorometano, metanol e água (64:40:8). Dessa coluna foram coletadas 60 frações. As frações contendo as saponinas foram identificadas por cromatografia em camada delgada utilizando, como revelador, o reagente de Komaroswky (H2SO4 : 4-OH-Benzaldeído, 3:2). Nas frações contendo saponinas, o solvente foi evaporado e obteve-se o extrato seco das saponinas da Ampelozizyphus amazonicus Ducke (SAPAaD) (BRANDÂO et al, 1992). Esses procedimentos foram executados no Laboratório de Farmacognosia da Faculdade de Farmácia, UFMG, pela Profa. Maria das Graças Lins Brandão. 4.2 Protocolos Experimentais Os experimentos foram executados de acordo com os 6 protocolos descritos a seguir. 4.2.1 Protocolo I: Os ratos, mantidos SOB RESTRIÇÃO de água por 12 h imediatamente anteriores ao início dos experimentos, foram pesados e receberam, por gavagem, 4 ml por cada 100 g de peso corporal, de NaCl 0,9% contendo 43 quantidades crescentes de EBAaD de tal forma que cada rato recebeu de 100 a 400 mg/Kg deste ou de SAPAaD (dose/rato = 50 a 200 mg/Kg). Em seguida, os ratos foram colocados, individualmente, em gaiolas metabólicas desprovidas de água e ração. O volume de urina foi medido a intervalos de 30 min, por um período de 3 h. 4.3.2 Protocolo II 4.3.2 Protocolo II 4.2.2 Protocolo II: Os ratos, COM LIVRE acesso à água por 12 h imediatamente anteriores ao início dos experimentos, foram pesados e receberam, por gavagem, 4 ml por cada 100 g de peso corporal, de NaCl 0,9% contendo quantidades crescentes de EBAaD de tal forma que cada rato recebeu de 50 a 200 mg/Kg deste ou de SAPAaD (dose/rato = 50 e 1000 mg/Kg). Em seguida, os ratos foram colocados, individualmente, em gaiolas metabólicas desprovidas de água e ração. O volume de urina foi medido a intervalos de 30 min, por um período de 3 h. RESTRIÇÃO DE ÁGUA -12 h 0 30 60 90 120 150 180 min Coleta de urina Expansão de volume (4% do peso corporal) com NaCl 0,9%; NaCl 0,9% + EBAaD; NaCl 0,9% + SAPAaD Gaiola metabólica Ó LIVRE ACESSO À ÁGUA -12 h 0 30 60 90 120 150 180 min Coleta de urina Expansão de volume (4% do peso corporal) com NaCl 0,9%; NaCl 0,9% + EBAaD; NaCl 0,9% + SAPAaD Gaiola metabólica 44 4.2.3 Protocolo III: Os ratos, COM LIVRE acesso à água por 12 h imediatamente anteriores ao início dos experimentos, foram pesados e receberam, por gavagem, 4 ml por cada 100 g de peso corporal, de NaCl 0,9% contendo EBAaD (100 mg/kg) ou SAPAaD (50 mg/kg). Em seguida, os ratos foram colocados, individualmente, em gaiolas metabólicas desprovidas de água e ração. O volume de urina foi medido a intervalos de 30 min, até 90 min, onde o efeito máximo da substância testada foi atingido. A urina dos últimos 30 min foi coletada para análises posteriores (dosagens de creatinina, sódio e potássio, osmolalidade e urodilatina). Ao final do experimento, os ratos foram anestesiados com tiopental (40 mg/Kg). O abdome foi aberto e cerca de 4 ml de sangue foram coletados, da veia cava inferior, em tubos heparinizados, também, para as mesmas análises posteriores já mencionadas para a urina. O sangue foi centrifugado a 3000 rpm, por 5 min, para obtenção do plasma. 4.2.4 Protocolo IV: Os ratos, COM LIVRE acesso à água por 12 h imediatamente anteriores ao início dos experimentos, foram pesados e receberam, por gavagem, 4 ml por cada 100 g de peso corporal, de NaCl 0,9% contendo SAPAaD na dose de 50 mg/Kg. Em seguida, os ratos foram colocados, individualmente, em gaiolas metabólicas desprovidas de água e ração. O volume de urina foi medido a intervalos de 30 min até 60min, tempo no qual o efeito máximo da substância testada é antecedido em 30 min. A urina dos últimos 30 min foi coletada para dosagem de urodilatina. Ao final do experimento, os ratos foram anestesiados com tiopental (40 mg/Kg). O abdome foi aberto e cerca de 4 ml de sangue foram coletados, da veia LIVRE ACESSO À ÁGUA - 12 h 0 90 min Expansão de volume (4% do peso corporal) com NaCl 0,9%; NaCl 0,9% + EBAaD; NaCl 0,9% + SAPAaD Gaiola metabólica Coleta de sangue e urina para avaliação de parâmetros renais, sacrifício 45 cava inferior, em tubos heparinizados contendo inibidores de proteases, para a dosagem de ANP e HAD. Os átrios também foram coletados para a dosagem de ANP. Os rins foram coletados para a avaliação morfológica e para determinação da atividade ATPásica. 4.2.5 Protocolo V: Os ratos, COM LIVRE acesso à água por 12 h imediatamente anteriores ao início dos experimentos, foram pesados e receberam, por gavagem, 4 ml por cada 100 g de peso corporal, de água ou água contendo SAPAaD (50 mg/kg) de tal forma que cada rato recebeu uma dose efetiva da mesma. Em seguida, os ratos foram colocados, individualmente, em gaiolas metabólicas desprovidas de água e ração. O volume de urina é medido a intervalos de 30 min, por um período de 3 h. LIVRE ACESSO À ÁGUA - 12 h 0 60 min Gaiola metabólica Expansão volumétrica (4% do peso corporal) NaCl 0,9%; NaCl 0,9% + SAPAaD Coleta de rins (avaliação morfológica e atividade ATPásica) e sangue (dosagem hormonal), sacrifício LIVRE ACESSO À ÁGUA -12 h 0 30 60 90 120 150 180 min Expansão volumétrica (4% do peso corporal) com Água; Água 9% + SAPAaD Coleta de urina Gaiola metabólica 46 4.2.6 Protocolo VI: Os ratos COM LIVRE acesso à água por 12 h imediatamente anteriores ao início dos experimentos. Este protocolo experimental foi executado em 4 grupos, como descrito a seguir. a) Grupo 1: Os ratos foram pesados e receberam, por gavagem, 0,5 ml de NaCl 0,9% apenas. Após 30 min, também por gavagem, foram administrados 4 ml por cada 100 g de peso corporal, de NaCl 0,9%. Em seguida, os ratos foram colocados, individualmente, em gaiolas metabólicas desprovidas de água e ração. O volume de urina foi medido a intervalos de 30 min, por um período de 3 h. b) Grupo 2: Os ratos foram pesados e receberam, por gavagem, 0,5 ml de NaCl 0,9% contendo SAPAaD de tal forma que cada rato recebeu uma dose efeitva de 50 mg/kg. Após 30 min, também por gavagem, foram administrados 4 ml por cada 100 g de peso corporal, de NaCl 0,9%. Em seguida, os ratos foram colocados, individualmente, em gaiolas metabólicas desprovidas de água e ração. O volume de urina foi medido a intervalos de 30 min, por um período de 3 h. c) Grupo 3 : Os ratos foram pesados e receberam, por gavagem, 0,5 ml de NaCl 0,9% apenas. Após 30 min, também por gavagem, foram administrados 4 ml por cada 100 g de peso corporal, de NaCl 0,9% contendo furosemida de tal forma que cada rato recebeu 13 mg/Kg da mesma. Em seguida, os ratos foram colocados, individualmente, em gaiolas metabólicas desprovidas de água e ração. O volume de urina foi medido a intervalos de 30 min, por um período de 3 h. d) Grupo 4: Os ratos foram pesados e receberam, por gavagem, 0,5 ml de NaCl 0,9% contendo SAPAaD de tal forma que cada rato recebeu uma dose efetiva de 50 mg/kg. Após 30 min, também por gavagem, foram administrados 4 ml por cada 100 g de peso corporal, de NaCl 0,9% contendo furosemida de tal forma que cada rato recebeu 13 mg/kg da mesma. Em seguida, os ratos foram colocados, individualmente, em gaiolas metabólicas desprovidas de água e ração. O volume de urina foi medido a intervalos de 30 min, por um período de 3 h. 47 4.4 Avaliação de alguns parâmetros renais 4.3 Dosagens bioquímicas 4.3.1 “Clearance” de Creatinina: A creatinina no plasma e na urina foi medida, colorimetricamente, de acordo com o método de Jaffé modificado utilizando kit apropriado. Esse ‘kit’ é composto por i) solução padrão de creatinina (3 mg/dl) (reagente n0 1), ii) solução de ácido pícrico (60 mmol/l) (reagente n0 2), iii) solução de NaOH (110mmol/l), Na2CO3 (75 mmol/l) e surfactante (reagente n0 3) e iv) solução de CH3COOH (12,25 mol/l) (reagente n0 4). Os meios de reação foram preparados de acordo com o quadro a seguir. Gaiola metabólica LIVRE ACESSO À ÁGUA -12 h -30 min 0 30 60 90 120 150 180 min Coleta de urina -12 h -30 min 0 30 60 90 120 150 180 min Coleta de urina Gavagem: 0,5 ml de NaCl 0,9% contendo ou não SAPAaD NaCl 0,9% (4% do peso corporal (Grupos 1 e 2) Gavagem: 0,5 ml de NaCl 0,9% contendo ou não SAPAaD NaCl 0,9% (4% do peso corporal contendo furosemida (Grupos 3 e 4) 48 Plasma Urina Água destilada Reagente 1 Reagente 2 Reagente 3 Branco -- -- 0,125 ml -- 0,250 ml 1 ml Padrão -- -- -- 0,125 ml 0,250 ml 1 ml 0,125 ml -- -- -- 0,250 ml 1 ml Amostra -- 0,125 ml -- -- 0,250 ml 1 ml As reações foram homogeneizadas e incubadas em banho-maria 37 0C, por 10 min. As absorbâncias da amostra e do padrão foram lidas a 510 nm, acertando o zero com o branco. Essa absorbância foi utilizada para a determinação da concentração de creatinina nas amostras de urina. Para as amostras de plasma, esse primeiro valor de absorbância foi denominado de A1. Após a leitura de A1, às amostras de plasma e ao branco, foram adicionados 50 ·µl do reagente n0 4. Após homogeneização, uma segunda leitura de absorbância das amostras de plasma (A2) foi feita também a 510 nm, acertando o zero com o branco. As amostras de urina foram previamente diluídas 1: 25 e não passam pela etapa de acidificação, como o plasma. A concentração de creatinina, em mg/dl, foi calculada a partir da fórmula: Creatinina(mg/dl) = A1 - A2_______ x 3 Absorbância Padrão Como a reação segue a lei de Lambert-Beer, o fator de Calibração pode ser usado. Fator de Calibração = Concentração do padrão Absbância do padrão Creatinina(mg/dl) = ( A1 - A2)x Fator de Calibração 49 O “clearance” de creatinina foi usado para medir o ritmo de filtração glomerular (RFG), que foi calculado segundo a equação: C = [Creatinina]urina x Fluxo Urinário [Creatinina]plasma Já a fração de excreção de água (FEH2O) foi calculada pela seguinte equação: FEH2O(%) = Fluxo Urinário x 100 Ritmo de Filtração Glomerular 4.3.2 Sódio e potássio no plasma e urina: As concentrações de sódio e potássio nas amostras de urina e plasma foram determinadas por fotometria de chama. As amostras foram diluídas 200 vezes em água destilada. Para isso, alíquotas (15 µl) da amostra foram diluídas em 3 ml de água destilada sendo, a dosagem em cada amostra, feita em duplicata contra o seu padrão correspondente (140 mEq/l de Na+ e 5 mEq/l de K+). Conhecendo-se as concentrações plasmática e urinária de Na+ e K+, as frações de excreção de Na+ (FENa+) e de K+ (FEK+), bem como as respectivas frações de reabsorção, FRNa+ e FRK+, foram quantitativamente determinadas conforme as equações: FENa+ ou FEK+ (%) = Quantidade Excretada de Na+ ou K+ x 100 Quantidade Filtrada de Na+ ou K+ FRNa+ ou FRK+ (%) = 100 - FENa+ ou FEK+ 4.3.3 Osmolalidades Plasmática e Urinária: A determinação das osmolalidades plasmática e urinária foi feita diretamente por osmometria de congelamento, usando padrões com osmolalidade apropriadas. 50 Para a calibração do osmômetro, foram utilizadas soluções padrão com osmolalidade de 100, 290 e 1000mOsm/Kg. Todas as amostras foram diluídas em água destilada. As amostras de urina foram diluídas 10 vezes (5 µl de urina + 45 µl de água destilada), enquanto que as amostras de plasma foram diluídas 2 vezes (25 µl de plasma + 25 µl de água destilada) sendo, a osmolalidade de cada amostra, determinada em duplicata. Conhecendo-se as osmolalidades plasmática e urinária, o “Clearance” osmolar (Cosmolar) e o “Clearance” de água livre (CH20) puderam ser quantitativamente avaliados, conforme as equações: Cosmolar = Osmolalidade urina x Fluxo Urinário Osmolalidade plasmática CH20 = Fluxo Urinário – Cosmolar 4.3.4 Dosagem de ANP e urodilatina: As dosagens de ANP e Urodilatina foram feitas por radioimunoensaio (RIE) de duplo-anticorpo. a) Extração dos peptídeos: O sangue foi coletado, de acordo com o Protocolo IV, em tubo contendo um coquetel de inibidores de proteases que consistiu de EDTA 10-5M, Pepstatina 0,5x10-5 M e PMSF 10-5 M, na proporção de 30µl para cada 1 ml de sangue. Imediatamente após a coleta, esse sangue foi centrifugado em centrífuga refrigerada (4° C), a 5000 rpm, por 20 min. O plasma foi submetido à extração dos peptídeos, usando-se colunas Sep-Pak C18. Estas colunas foram previamente ativadas com 8 ml de acetronitrila e lavadas com 8 ml de acetato de amônio a 0,2%, pH 4. A seguir, o plasma foi aplicado à coluna. Após lavagem com 5 ml de acetato de amônio, o ANP adsorvido foi eluído com 3 ml de acetronitrila 60% em acetato de amônio 40%. Após evaporação à vácuo, as amostras foram reconstituídas em 500 µl de tampão (fosfato de sódio 0,1M contendo NaCl 0,14M, albumina sérica bovina 0,1%, azida sódica 0,01% e triton X-100 0,1%, pH 7.4) e dosadas por RIE. Os átrios foram homogeneizados em 2 ml de ácido acético 0,1M, contendo 51 inibidores de proteases (EDTA 10-5M, Pepstatina 0,5x10-5 M e PMSF 10-5 M). Após centrifugação, alíquotas do sobrenadante (20 µl) foram diluídas em no mesmo tampão fosfato (acima) para determinação do ANP por RIE. As urinas utilizadas para a dosagem de urodilatina foram coletadas em tubos contendo inibidores de proteases (EDTA 10-5M, Pepstatina 0,5x10-5 M e PMSF 10-5 M). Após centrifugação, alíquotas do sobrenadante (100 µl) foram utilizadas para determinação da urodilatina por RIE. b) Iodação do ANP: a iodação do ANP de rato (Ser99- Tyr126) foi feita pelo método da Lactoperoxidase com 125I-sódico conforme descrito por Gutkowska et al. (1987). A purificação da fração monoiodinada foi feita por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC). c) Radioimunoensaio do ANP e da urodilatina: o ANP imunorreativo foi determinado por radioimunoensaio de acordo com técnica descrita por Gutkowska et al. (1987). Uma alíquota de 100 µl, em duplicata, contento o ANP extraído do plasma e reconstituído em 0,5 ml de tampão fosfato foi incubada “overnight” com 100 µl de anticorpo anti-ANP, a 4 0C. Alíquotas diluídas do tecido cardíaco também foram incubadas com o anticorpo. Duas diluições, em série, foram realizadas: 20 µl do sobrenadante do homogenato do átrio foram diluídos em 1 ml de solução tampão e 25 µl desta diluição foram novamente diluídos em 1 ml de solução tampão (diluição final de 1/2000). O RIE foi realizado com 50 µl desta segunda diluição. A esta amostra, foram adicionados 100 µl(cerca de 8000 cpm) de 125I-ANP. Esta reação foi incubada por mais de 24 h. A separação do imunocomplexo foi feita por precipitação com o segundo anticorpo. Após 2 h à temperatura ambiente, 0,5 ml de polietilenoglicol a 6,25%, em água, foi adicionado. Os tubos foram centrifugados a 1200g, a 4 0C, por 20 min, e a radioatividade do imunocomplexo foi determinada em contador gama. Uma vez que a única diferença entre as estruturas das moléculas de ANP e urodilatina é apenas quarto aminoacidos adicionais na porção amino- terminal da molécula de urodilatina (Schulz-Knappe et al., 1988) e que no rim, 52 o nível de ANP circulante é drasticamente reduzido pela ação de peptidases presentes nas membranas celulares do cortéx renal (Gegelmann et al., 1988) ou por ligação de moléculas de ANP ao receptor para peptídeo natriurético tipo C, receptores responsáveis pela depuração metabólica dos peptódeos natriuréticos, levando a quantidades muito insignificantes de ANP presente na urina (Abassi et al., 1992; Cohen, 1996), pode – se então associar que a mensuração da concentração urinária de ANP, com a utilização de anticorpo anti-ANP, seja na realidade uma determinação dos níveis urinários de urodilatina. Sendo assim, a dosagem da urodilatina foi feita de forma indireta utilizando mesmo protocolo usado na dosagem do ANP e utilizando 100 µl de urina, em duplicata A dosagem de ANP e Urodilatina foi realizada no Laboratório de Neuroendocrinologia do ICB, UFMG, sob a supervisão da Profa. Adelina Martha dos Reis. 4.3.5 Dosagem de HAD: a dosagem do HAD também foi feita por RIE. O sangue coletado de acordo com o Protocolo IV, em tubo contendo um coquetel de inibidores de proteases que consistiu de pOHHg Bnz 1mM, PMSF 1mM, EDTA 7,5%, O-Fenantrolina 30mM e Pepstatina 1mM na proporção de 140µl para 1ml de sangue. Imediatamente após a coleta, esse sangue foi centrifugado a 5.000 rpm, por 20 min, em centrífuga refrigerada a 4 °C. O plasma foi transferido para tubos lavados com BSA 0,1% e mantidos em freezer a –20 °C. O plasma foi, então, aplicado em colunas pré-ativadas por lavagem seqüencial com 10 ml de metanol 99,9% e 10 ml de ácido trifluoroacético 0,1%. Em seguida, a coluna foi lavada, seqüencialmente, com 10 ml de metanol 99,9% e 10 ml de TFA 0,1%, 3 ml de TFA 0,1% contendo 0,1% de BSA, 10 ml de metanol 10% - TFA 0,1% e 3 ml de TFA 0,1%. Os peptídeos adsorvidos na coluna foram eluídos com 3 ml de metanol 99,9% - TFA 0,1%. As amostras extraídas foram secas em centrífuga evaporadora durante aproximadamente 10 h. As amostras de plasma foram ressuspensas em 300 µl de tampão para vasopressina não diluído. Uma alíquota (100 µl) desta soluçãofoi ultilizada no RIE. Todas as dosagens foram feitas em duplicatas. 53 4.3.6 Atividade enzimática da Na+-ATPase e da (Na+ + K+)–ATPase renais: os ratos submetidos ao tratamento com SAPAaD conforme o protocolo IV foram sacrificados e os dois rins foram, imediatamente, removidos, descapsulados e mantidos em uma solução gelada contendo composta por sacarose (250 mM), HEPES/TRIS, pH 7,6 (10 mM), EDTA (2 mM) e PMSF (1 mM) (solução 1). Em seguida, os rins foram dissecados e fatias, de de cerca de 1 µm, da face externa do rim foram separadas e homogeneizadas em solução 1, utilizando um homogenizador do tipo potter com pistilo de teflon. O homogenato resultante foi centrifugado em centrífuga refrigerada, a 10000 rpm , à 4 0C, durante 10 min. O precipitado foi descartado e uma segunda centrifugação, em iguais condições da anterior, foi realizada. Ao término da centrifugação, o precipitado foi descartado e o sobrenadante foi novamente centrifugado a 60000 rpm, 4 0C por 1 h. O precipitado, contendo a fração microssomal, foi ressuspenso em uma solução de sacarose 250 mM dando uma concentração final de, aproximadamente, 3 mg de proteína por ml de solução e armazenado à –4 0C. A concentração de proteína foi determinada pelo método de Bradford (BRADFORD, 1976) usando BSA como padrão. a) Medida da atividade ATPase: a atividade ATPásica foi determinada segundo o método descrito por Grubmeyer & Penefsky (1981). A composição do meio de reação padrão foi (em mM): MgCl2, 10, HEPES-TRIS, 20 (pH 7,0), ATP-Na, 5, NaCl, 120. Para determinação da atividade da (Na++K+) ATPase, foram adicionados de KCl 30 mM. A reação foi iniciada pela adição de proteína (0,1- 0,3 mg/ml) e parada, após 30 min, pela adição de carvão ativado em HCl 0,1N. As atividades Na+-ATPásica e (Na++K+) ATPásica, expressas em nmoles Pi x mg-1 x min-1, foram calculadas pela diferença na ausência e presença de ouabaína 1 mM e de furosemida 2 mM, respectivamente (Caruso-Neves et al., 2002; Provérbio et al., 1989) sendo, a segunda, na presença de 1 mM de ouabaína. O [32P] Pi produzido foi medido por cintilação líquida em uma alíquota do sobrenadante obtido após a centrifugação a 2000 rpm, por 5min. Os ensaios para determinação da atividade ATPásica foram realizados no Laboratório de Bioquímica Renal do Centro de Ciências da Saúde, UFRJ, com a colaboração do Prof. Celso Caruso. 54 4.3.7 Avaliação morfológica: os ratos submetidos ao tratamento com SAPAaD conforme o protocolo IV foram anestesiados, a cavidade abdominal foi aberta para a retirada dos rins e, em seguida, foram sacrificados por deslocamento cervical. Os rins foram fixados em formol neutro e tamponado a 10% e processados pela técnica rotineira de inclusão em parafina (PROPHET, 1992). Secções histológicas de 4 µm foram coradas pelas técnicas da hematoxilina-eosina (LUNA, 1968) para avaliação morfológica. O procedimento acima foi realizado no Laboratório de Patologia Comparada do ICB, UFMG, com a colaboração do Prof. Geovanni Dantas Cassali. 4.4 Atividade hemolítica das Saponinas isoladas das raízes da Ampelozizyphus amazonicus Ducke. O ensaio da atividade hemolítica das SAPAaD foi feito através de adaptaçãodo método descrito por Wall et al (1952), utilizando sangue de rato. Um rato foi anestesiado com Tiopental 40 mg/Kg (ip) e cerca de 3 ml de sangue foram coletados, em tupos heparinizados, da veia cava inferior. Uma solução de SAPAaD, para uma concentração final de 50 mg/ml, foi preparada em NaCl 0,9%. A partir dessa solução, foram preparadas diluições sucessivas na proporção de 1:2, sempre usando o NaCl 0,9% como diluente, até a proporção de 1: 64. Dessa forma, ao final da diluição, foram obtidas soluções de SAPAaD com concentrações finais iguais a 25, 12,5, 6,25, 3,13, 1,56 e 0,78 mg/ml. Para o ensaio da atividade hemolíltica, 0,3 ml de cada uma dessas soluções de SAPAaD foi adicionado a 0,3 ml de sangue previamente colocado em um tubo de microcentrífuga (1,5 ml de capacidade). Essa mistura foi centrifugada a 3000 rpm, por 5 min, à temperatura ambiente. Como controle negativo (ausência de hemólise) 0,3 ml de sangue foi adicionado a 0,3 ml de NaCl 0,9% e como controle positivo (hemólise total), o mesmo volume de sangue (0,3 ml) foi adicionado a 0,3 ml de água destilada. O grau de hemólise foi avaliado, qualitativamente, pela tonalidade da cor vermelha no sobrenadante obtido após a centrifugação. Essa tonalidade foi comparada aos controles e variava de zero (controle negativo) a 6 cruzes (++++++, controle positivo). 55 A atividade hemolítica também foi ensaiada utilizando-se SAPAaD previamente incubada com homogenato de fígado e de intestino delgado. Isto foi feito na tentativa de se detectar alguma possível modificação na estrutura das SAPAaD, por enzimas presentes no fígado e no intestino delgado, que afetasse a sua ação hemolítica. Para isso, o fígado e parte do intestino delgado de rato foram coletados solução gelada de NaCl 0,9%, imediatamente homogeneizados em um homogenizador do tipo potter com pistilo de teflon e centrifugados a 10000 rpm, por 10 min, à 4 0C. O precipitado foi descartado e uma alíquota do sobrenadante (0,5 ml) foi incubada com 0,5 ml de cada uma das diluições da solução de SAPAaD 50 mg/ml, conforme descrito acima. A incubação, feita em banho-maria à 370C, teve duração de 30, 60 ou 90 min. Ao final da incubação, 0,3 ml do incubado foi adicionado a 0,3 ml de sangue sendo, essa mistura centrifugada a 3000 rpm, por 5 min, à temperatura ambiente. O grau de hemólise foi avaliado da mesma forma como já descrito acima. Para avaliar o grau de hemólise produzida pela SAPAaD intacta quando diretamente injetada na circulação, uma solução de SAPAaD 50 mg/ml foi, continuamente, infundida na veia femoral esquerda, a um fluxo de 50 µl/min durante 60 min. Amostras de sangue foram coletadas da artéria femoral direita a intervalos de 15 min. Essas amostras foram centrifugadas e o grau de hemólise foi avaliado conforme descrito anteriormente. 4.5 Análise Estatística O delineamento utilizado nos experimentos foi o inteiramente casualizado. Os animais, de mesmo sexo, espécie e peso aproximadamente igual, foram distribuídos de maneira aleatória. As condições ambientais foram uniformes e os mesmos procedimentos foram aplicados a todos os animais que eram submetidos a um determinado protocolo experimental. Existindo assim apenas as variações individuais e devido ao tratamento. Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média. Como critério de significância, foi considerado p < 0,05. 56 A variação individual ou variação do erro na comparação das médias entre os grupos estudados foi determinada através da análise de variância ANOVA one way, seguida do teste de Bonfferoni na comparação entre três ou mais grupos. A comparação de média realizada entre dois grupos apenas foi feita através do teste t de “student”. 57 5 RESULTADOS 58 5 RESULTADOS 5.1 ATIVIDADE HEMOLÍTICA DAS SAPONINAS TRITERPÊNICAS DE RAÍZES DA Ampelozizyphus amazonicus DUCKE Como as saponinas, de um modo geral, possuem reconhecida atividade hemolítica, a sua capacidade de produzir hemólise, in vitro e in vivo, foi aqui avaliada. A SAPAaD incubada diretamente com sangue de rato, provocou hemólise de maneira concentração-dependente. Nas concentrações de 50 e 25 mg/ml, a SAPAaD apresentou grau de hemólise similar ao apresentado pelo controle positivo (água destilada) (Tab. 1). Nas demais concentrações utilizadas, a SAPAaD produziu uma hemólise classificada de média a moderada, à medida que as concentrações de SAPAaD foram sendo diminuídas apresentando hemólise, visualmente detectável, até a concentração de 1,5 mg/ml (Tab. 1). TABELA 1 Atividade hemolítica de concentrações decrescentes de SAPAaD. Agente Hemolítico Hemólise Água destilada ++++++ NaCl 0,9 % - SAPAaD – 50 mg/ml ++++++ SAPAaD – 25 mg/ml ++++++ SAPAaD – 12,5 mg/ml ++++ SAPAaD – 6,25 mg/ml +++ SAPAaD – 3,13 mg/ml ++ SAPAaD – 1,5 mg/ml + SAPAaD – 0,75 mg/ml - SAPAaD – 0,38 mg/ml - ++++++, hemólise total; -, ausência de hemólise. 59 A fim de investigar se a atividade hemolítica das SAPAaD poderia ser modificada por enzimas presentes no intestino delgado e no fígado, homegenatos destes órgãos foram incubados com as mesmas. A pré-incubação de diferentes concentrações de SAPAaD com homogenatos de intestino delgado (Tab. 2) ou de fígado (Tab. 3), por 30, 60 e 90 min, não foi capaz de alterar a atividade hemolítica da SAPAaD, independentemente da concentração de SAPAaD usada ou do tempo de duração da pré-incubação. TABELA 2 Atividade hemolítica das SAPAaD pré-incubadas, por diferentes períodos, com homogenato de intestino delgado. Duração da pré-incubação com homogenato de intestino delgado [SAPAaD] na pré- incubação (mg/ml) Grau de hemólise 30 min 50 ++++++ 60 min 50 ++++++ 30 min 25 ++++++ 60 min 25 ++++++ 30 min 12,5 ++++ 60 min 12,5 ++++ ++++++, hemólise total; -, ausência de hemólise. 60 TABELA 3 Atividade hemolítica das SAPAaD pré-incubadas, por diferentes períodos, com homogenato de fígado. Duração da pré-incubação homogenato de Fígado [SAPAaD] na pré- incubação (mg/ml) Grau de hemólise 30 min 50 ++++++ 60 min 50 ++++++ 30 min 25 ++++++ 60 min 25 ++++++ 60 min 6,25 +++ 90 min 6,25 +++ 30 min 3,13 ++ 60 min 3,13 ++ 90 min 3,13 ++ ++++++, hemólise total; -, ausência de hemólise. A infusão intravenosa de SAPAaD (50 mg/ml) a um fluxo de 50µl/min, por 1h, leve e já detectável aos 30 min após o início da infusão (Tab. 6). Esta hemólise permanecia até o final do procedimento (1 h) e foi similar à hemólise observada na incubação direta de sangue com SAPAaD na concentração de 1,5 mg/ml (Tab. 3). TABELA 4 Atividade hemolítica das SAPAaD infundida intravenosamente, por 1 h, a um fluxo de 50 µl/min. Tempo de infusão com SAPAaD (50 mg/ml) Grau de hemólise 0 min _ 30 min + 45 min + 60 min + ++++++, hemólise total; -, ausência de hemólise. 61 5.2 EFEITO DAS SAPONINAS TRITERPÊNICAS DE RAÍZES DA Ampelozizyphus amazonicus DUCKE SOBRE A MORFOLOGIA RENAL. As lâminas histológicas dos rins de animais do grupo controle, que receberam expansão volumétrica (4% do peso corporal) de NaCl 0,9 % conforme o protocolo IV, apresentaram células tubulares corticais bastantes ácidófilas (corada de rosa com eosina), com núcleos íntegros arredondados e com pouca presença de vacúolos (índice de processo degenerativo), sem anormalidades nos glomérulos e na região medular, indicando assim uma integridade morfológica (Fig. 5A). As lâminas dos rins de animais submetidos à expansão volumétrica (4%) de NaCl 0,9 % contendo SAPAaD (50 mg/kg) (Fig. 5B) apresentaram um perfil morfológico similar ao observado no grupo controle, porém, observou-se um aumento no número e na frequência de vacúolos presentes nas células dos túbulos da região cortical (comparar Figs. 5A e 5B). Nos animais tratados com uma dose elevada de SAPAaD (1000 mg/kg), usando o mesmo protocolo utilizado nos grupos anteriores (protocolo IV), foi observado um aumento ainda maior no número e na frequência de vacúolos nas células tubulares do córtex renal, quando comparado aos grupos controle e SAPAaD (50 mg/kg) passando, de um evento pontual, como no caso desses grupos, a um evento mais difuso. Além disso, a presença de células com núcleos em estado de picnose e membranas danificadas foi verificada no grupo tratado com 1000 mg/kg de SAPAaD. Em nível glomerular, 1000 mg/kg de SAPAaD aumentou a rede capilar com redução do espaço de Bowman sendo que nenhuma alteração, em nível medular, foi verificada (Fig. 5C). 62 2 0 X 60X A A B B 63 FIGURA 5. Efeito das SAPAaD sobre o aspecto morfológico de rins de ratos. Os ratos com livre acesso à água durante as 12 h que antecederam o início do experimento receberam, por gavagem, SAPAaD (50 mg/Kg, n = 4) (B) ou SAPAaD (1000 mg/Kg, n = 4) (C) dissolvida em um volume de NaCl 0,9% suficiente para promover uma expansão de volume correspondente a 4% do peso corporal do rato. Os ratos foram colocados, individualmente, em gaiolas metabólicas e a coleta dos rins foi feita conforme o protocolo IV (Métodos). A setas pretas indicam vacúolos na célula tubular cortical, as setas amarelas indicam núcleos picnóticos e as setas vermelhas indicam células tubulares corticais com membrana desintegrada. Controle: NaCl 0,9% apenas, n = 4 (A). B C C 64 5.3 CONSIDERAÇÕES SOBRE PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS O primeiro protocolo experimental, por nós utilizado, consistiu em testar o extrato bruto de raízes da Ampelozizyphus amazonicus Ducke (EBAaD) em ratos colocados individualmente em gaiolas metabólicas. Após um período de adaptação (5 dias), os ratos eram tratados com diferentes doses do EBAaD administrado, por gavagem, de 24 em 24 h, por 5 dias. O volume de urina e água ingerida era medido a cada período de 24 h. Este protocolo mostrou-se inadequado, pois os animais encontrava-se sob condições normais de expansão de volume e o período de 24 h para a medida do volume urinário era muito longo e, por isso, caso o EBAaD fosse eficaz em um período de tempo mais curto, as possíveis alterações na diurese poderiam ser mascaradas pelo longo período de coleta. Além do mais, o tratamento prolongado (5 dias), com o EBAaD, pode levar a uma adaptação dos animais ao mesmo. Assim, um procedimento experimental foi desenvolvido e padronizado com o intuito de se avaliar o efeito agudo (horas) do EBAaD e/ou de substâncias dele isoladas, sobre a função renal. Porém, antes de se iniciar os estudos sobre esse possível efeito agudo, um experimento foi conduzido para se avaliar a magnitude da diurese, em curtos períodos de tempo, produzida por expansões crescentes de volume (1 a 6% do peso corporal) com NaCl 0,9%. Conforme ilustrado pela Figura 6, a administração, por gavagem, de NaCl 0,9% em volumes correspondentes a percentuais crescentes de expansão volumétrica, aumenta o volume de urina de maneira dependente da magnitude da expansão. Com 4 e 6% de NaCl 0,9% por cada 100g de peso corporal, a diurese iniciou-se mais cedo (60 – 90 min) e os volumes cumulativos de urina foram similares. A expansão de volume com 4% de NaCl 0,9%, por cada 100g de peso corporal, foi utilizada na maioria das séries experimentais subseqüentes. Em alguns experimentos, a expansão de volume foi feita com água de torneira (4% de água por cada 100g de peso corporal). 65 0 30 60 90 120 150 180 210 0 3 6 9 12 15 18 10% 6% 4% 2% 0% NaCl 0,9% Tempo após expansão (min) Vo lu m e C um ul at iv o de U rin a (m l) 0 50 100 150 200 0.00 0.05 0.10 0.15 Tempo após expansão (min) Fl ux o U rin ár io (m l/m in ) FIGURA 6. Efeito de expansões crescentes de volume extracelular sobre o volume cumulativo de urina. Os ratos com livre acesso à água receberam, por gavagem, volumes variáveis (0 a 10% do peso corporal) de NaCl a 0,9%. Em seguida, foram mantidos individualmente em gaiolas metabólicas e o volume cumulativo de urina foi medido de 30 em 30 min, durante 3 após a expansão. “Inset”: Variação do fluxo urinário (ml/min) durante as 3 h após a expansão de volume. 5.4 EFEITO DO EXTRATO BRUTO E DAS SAPONINAS TRITERPÊNICAS DE RAÍZES DA Ampelozizyphus amazonicus DUCKE SOBRE A DIURESE EM RATOS Nessa série experimental, foi investigado o efeito do EBAaD e SAPAaD sobre a diurese em ratos previamente mantidos sob 2 condições de hidratação: i) restrição de água por 12 h ou ii) livre acesso à água. A Figura 7 mostra o efeito do EBAaD (Fig. 7A) e da SAPAaD (Fig. 7B) sobre a diurese em ratos mantidos sob restrição de água durante as 12 h que antecederam o início dos experimentos (protocolo I). Nesta condição, a expansão de volume (4%) com NaCl 0,9%, por si só, praticamente, não aumentou a diurese e o EBAaD, na maioria das doses utilizadas, também não foi capaz de modificá-la (Fig. 7A). Apenas a dose de 150 mg/Kg produziu um ligeiro aumento no volume de urina quando 66 comparado, tanto com o controle (sem expansão), quanto com a expansão com NaCl 0,9% apenas. Surpreendentemente, a SAPAaD, mesmo sob restrição de água e ao contrário do EBAaD, inibiu o aumento, mesmo que discreto, no volume urinário 0 30 60 90 120 150 180 210 -1 0 1 2 3 4 5 Furosem ida 13m g/kg A 150 Sem expansão Controle 50 100 200 400 EBAaD (mg/kg) Tempo após expansão (min) Vo lu m e C um ul at iv o de U rin a (m l) 0 30 60 90 120 150 180 210 -1 0 1 2 3 4 5 B Controle 50 100 200 SAPAaD (mg/kg) Tempo após expansão (min) Vo lu m e C um ul at iv o de U rin a (m l) FIGURA 7. Efeito de diferentes doses de EBAaD e de SAPAaD sobre o volume cumulativo de urina. Os ratos sob restrição de água durante as 12 h que antecederam o início do experimento receberam, por gavagem, doses crescentes de EBAaD (A) ou SAPAaD (B) dissolvidos em um volume de NaCl a 0,9% suficiente para promover uma expansão de volume correspondente a 4% do peso corporal do rato. Os ratos foram colocados, individualmente, em gaiolas metabólicas e o volume cumulativo de urina foi medido a cada 30 min, durante 3 h (n = 5, por grupo). 67 induzido pela expansão de volume (4%) com NaCl 0,9% (Fig. 7B). Esta inibição foi dose-dependente e atingiu valor máximo com a dose de 200 mg/Kg de SAPAaD. Comparativamente, a Figura 8 mostra o efeito do EBAaD (Fig. 8) e da SAPAaD (Fig. 9) sobre a diurese em ratos com livre acesso à água durante as 12 h que antecederam o início do experimento (protocolo I). As condições de expansão de volume foram as mesmas já descritas para os experimentos com os ratos sob restrição de água (acima). Sob acesso livre à água, a diurese induzida pela simples expansão com NaCl 0,9% foi bem mais pronunciada (Figs. 8 e 9) do que quando os ratos foram mantidos sob restrição de água (Figs. 7A e 7B). A Figura 8 ainda mostra que o EBAaD aumentou, de forma mais pronunciada, a diurese produzida pela expansão com NaCl 0,9% nos ratos com livre acesso à água (comparar Figs. 7 e 8). Similarmente ao observado nos ratos sob restrição de água, a SAPAaD inibiu a diurese, produzida pela expansão com NaCl 0,9% (Fig. 9), nos ratos com livre acesso à água. Conforme mostra a Figura 9, a redução do volume urinário, em relação à diurese produzida pela expansão com NaCl 0,9% apenas, pela SAPAaD foi dose-dependente. Aos 60 min após a expansão de volume, foi observado uma queda no volume urinário de 1,23 ± 0,156 ml (controle, sem SAPAaD) para 0,2 ± 0,14 e 0,0 ± 0,0 ml, na presença de 50 e 1000 mg/kg de SAPAaD, respectivamente. O efeito antidiurético máximo foi observado aos 90 min de expansão na presença de 50 e 1000 mg/kg de SAPAaD (0,513 ± 0,271 e 0,125± 0,125 ml vs 2,28 ± 0,17 ml). 68 0 30 60 90 120 150 180 210 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 Controle 50 100 200 A EBAaD (mg/kg) Tempo após expansão (min) Vo lu m e C um ul at iv o de U rin a (m l) 0 50 100 150 200 100 200 300 EB Aa D (mg/kg) Á re a So b a C ur va (m g/ kg ).m in 0 30 60 90 120 150 180 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 B Tempo após expansão (min) Fl ux o U rin ár io (m l/3 0m in ) FIGURA 8. Efeito de diferentes doses de EBAaD sobre a diurese em ratos. Os ratos com livre acesso à água durante as 12 h que antecederam o início do experimento receberam, por gavagem, doses crescentes de EBAaD dissolvido em um volume de NaCl 0,9% suficiente para promover uma expansão de volume correspondente a 4% do peso corporal. Os ratos foram colocados, individualmente, em gaiolas metabólicas e o volume cumulativo de urina (A) foi medido a cada 30 min, durante 3 h (n = 5, por grupo). “ Inset” em A, área sob a curva (ml.min); B, fluxo urinário (ml/30 min) vs tempo após a expansão. 69 0 30 60 90 120 150 180 210 -1.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 Controle 12,5 50 1000 A SAPAaD (mg/kg) Tempo após expansão (min) Vo lu m e C um ul at iv o de U rin a (m l) 0 50 0 100 200 300 400 900 1000 SAPAaD (mg/kg) Ár ea s ob a c ur va (m g/ kg ).m in 0 30 60 90 120 150 180 210 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 B Tempo após expansão (min) Fl ux o U rin ár io (m l/3 0m in ) FIGURA 9. Efeito de diferentes doses de SAPAaD sobre a diurese em ratos. Os ratos com livre acesso à água durante as 12 h que antecederam o início do experimento receberam, por gavagem, doses crescentes de SAPAaD dissolvidas em um volume de NaCl 0,9% suficiente para promover uma expansão de volume correspondente a 4% do peso corporal. Os ratos foram colocados, individualmente, em gaiolas metabólicas e o volume cumulativo de urina (A) foi medido a cada 30 min, durante 3 h (n = 5, por grupo). “ Inset” em A, área sob a curva (ml.min); B, fluxo urinário (ml/30 min) vs tempo após a expansão. 70 5.5 EFEITO DAS SAPONINAS TRITERPÊNICAS DE RAÍZES DA Ampelozizyphus amazonicus DUCKE SOBRE A DIURESE INDUZIDA POR EXPANSÃO HIPOSMÓTICA DE VOLUME De forma similar ao observado na expansão com NaCl 0,9%, quantidades variáveis de SAPAaD reduziram, de maneira dose-dependente, o volume urinário em relação à diurese produzida pela expansão de volume com água comum (4% do peso corporal) (Fig. 10). 0 30 60 90 120 150 180 210 0 2 4 6 8 10 12 H20 50 100 200 SAPAaD (mg/kg) Tempo após expansão (min) Vo lu m e C um ul at iv o de U rin a (m l) 0 50 100 150 200 700 800 900 1000 1100 1200 1300 SAPAaD (mg/kg) Á re a So b a C ur va (m g/ kg ).m in FIGURA 10. Efeito de doses variáveis de SAPAaD sobre a diurese em ratos após expansão hiposmótica de volume. Os ratos com livre acesso à água durante as 12 h que antecederam o início do experimento receberam, por gavagem, doses crescentes de SAPAaD dissolvidas em um volume de água comum suficiente para promover uma expansão de volume correspondente a 4% do peso corporal. Os ratos foram colocados, individualmente, em gaiolas metabólicas e o volume cumulativo de urina foi medido a cada 30 min, durante 3 h (n = 5, por grupo). “ Inset” , área sob a curva (ml.min). 71 Embora a diurese induzida pela expansão com água (protocolo V) seja mais intensa do que aquela induzida pela expansão com NaCl 0,9% (Figs. 8 e 9), o efeito inibidor da SAPAaD sobre a diurese induzida pela expansão com água foi similar ao efeito observado na expansão com NaCl 0,9%, conforme mostrado nas Figuras 10 e 11. 0 30 60 90 120 150 180 210 0 2 4 6 8 10 12 14 H2O NaCl 0,9% H2O + SAPAaD NaCl 0,9% + SAPAaD TmT ASC % NaCl 0,9% 880 100 NaCl 0,9% + SAPAaD 565 75 H20 1406 100 H2O + SAPAaD 1054 64 Tempo após expansão (min) Vo lu m e C um ul at iv o de U rin a (m l) FIGURA 11. Efeito das SAPAaD sobre a diurese em ratos submetidos a expansões iso e hiposmótica de volume. Os ratos com livre acesso à água durante as 12 h que antecederam o início dos experimentos receberam, por gavagem, 100 mg/Kg de SAPAaD dissolvidas em um volume, de NaCl 0,9% ou água comum, suficiente para promover uma expansão de volume correspondente a 4% do peso corporal. Os ratos foram colocados, individualmente, em gaiolas metabólicas e o volume cumulativo de urina foi medido a cada 30 min, durante 3 h (n = 5, por grupo). “Inset”, área sob a curva (ASC, ml.min); 100% representa a diurese produzida pela expansão com água ou NaCl 0,9% na ausência SAPAaD. 72 Em face dessa similaridade de efeitos sobre a diurese e considerando que a expansão isosmótica não afeta parâmetros como liberação de HAD, nas próximas etapas experimentais, a expansão de volume foi feita com NaCl 0,9%. 5.6 EFEITO DE SAPONINAS TRITERPÊNICAS DE RAÍZES DA Ampelozizyphus amazonicus DUCKE SOBRE A REABSORÇÃO E EXCREÇÃO DE ÁGUA E ELETROLITOS A Figura 12 mostra o efeito da SAPAaD sobre o RFG e a FEH20 aos 90 min após o tratamento. Embora a SAPAaD não tenha afetado, significativamente (p = 0,112), o RFG, pôde-se observar que houve uma tendência de redução do mesmo (Fig. 12A). Os valores de RFG foram de 248,5 ± 68,8 e 104,6 ± 16,9 ml/90 min nos ratos não tratados (controle) e tratados com SAPAaD (50 mg/kg), respectivamente. A FEH20 também não foi, significativamente (p = 0,082), modificada pela SAPAaD, muito embora tenha sido elevada de 1,35 ± 0,42 (controle) para 2,46 ± 0,38% (Fig. 12B). A Tabela 5 mostra os valores médios de osmolalidade e das concentrações plasmática e urinária de Na+ e K+ nos ratos tratados com SAPAaD (50 mg/kg). À exceção da nenhum desses parâmetros foi, significativamente, alterado pela SAPAaD. Já a urina dos ratos tratados apresentou-se mais concentrada com uma osmolalidade de 1033,7 ± 66,9 mOsm/l contra 694,2 ± 58,3 mOsm/l na urina dos ratos não tratados (controle). TABELA 5 Efeito das SAPAaD (50 mg/kg) sobre a osmolalidade e concentrações plasmática e urinária de Na+ e K+ . Parâmetro Controle SAPAaD [Na+] Plasma, mEq/l (n = 7) 137 ± 2,1 126,7 ± 6,4 [Na+] Urina, mEq/l (n = 7) 99,2 ± 12,7 111,9 ± 11,2 [K+] Plasma, mEq/l (n = 7) 2,6 ± 0,08 2,5± 0,14 [K+] Urina, mEq/l (n = 7) 119,7 ± 11,9 194,8 ± 38,4 Osm Plasmática, mOsm/l (n = 6) 298,9 ± 1,7 299,1 ± 2,2 Osm Urina, mOsm/l (n = 6) 694,2 ± 58,3 1033,7 ± 66,9* Osm, osmolalidade; *p = 0,004 73 Controle SAPAaD 0 50 100 150 200 250 300 350 A R itm o de F ilt ra çã o G lo m er ul ar (m l/9 0m in ) Controle SAPAaD 0 1 2 3 B FE H 2 O (% ) FIGURA 12. Efeito da SAPAaD sobre o ritmo de filtração glomerular (A) e a fração de excreção de H20 (B). Os ratos com livre acesso à água durante as 12 h que antecederam o início do experimento receberam, por gavagem, SAPAaD (50 mg/Kg, n = 7) dissolvida em um volume de NaCl 0,9% suficiente para promover uma expansão de volume correspondente a 4% do peso corporal do rato. Os ratos foram colocados, individualmente, em gaiolas metabólicas e a coleta de urina e sangue foi feita conforme o protocolo III (Métodos). Controle: NaCl 0,9% apenas, n = 5. 74 As SAPAaD (50 mg/kg) não apresentou efeito significativo (p = 0,232) sobre o “clearance” osmolar que foi de 7,90 ± 0,55 ml/min (vs 5,84 ± 1,45 ml/min, no controle) (Fig. 13A). Já o “clearance” de água livre foi tornou-se mais negativo nos ratos tratados com as SAPAaD, passando de –3,21 ± 0,73 ml/mmin, no controle, para 5,56 ± 0,45 ml/min (Fig. 13B). Isto representa um aumento de, aproximadamente, 70% na reabsorção de água. Controle SAPAaD 0 2 4 6 8 10 A C O sm ol ar (m l/9 0m in ) -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 Controle SAPAaD * B C H 2 O (m l/9 0m in ) FIGURA 13. Efeito da SAPAaD sobre o “clearance” osmolar (A) e “clearance” de água livre (B). Os ratos com livre acesso à água durante as 12 h que antecederam o início do experimento receberam, por gavagem, SAPAaD (50 mg/Kg, n = 6) dissolvida em um volume de NaCl 0,9% suficiente para promover uma expansão de volume correspondente a 4% do peso corporal do rato. Os ratos foram colocados, individualmente, em gaiolas metabólicas e a coleta de urina e sangue foi feita conforme o protocolo III (Métodos). Controle: NaCl 0,9% apenas, n = 6. *p = 0,025. 75 A Figura 14 mostra que a FENa+ e a FEK+ foram, significativamente, elevadas pelo tratamento com SAPAaD (50 mg/Kg). A FENa+ (Fig. 14A) foi aumentada de 1,01 ± 0,27% (controle) para 2,17 ± 0,43%, enquanto que a FEK+ (Fig. 14B) passou de 60,1 ± 20,0% para 131,5 ± 17,5%. Esses valores representam um aumento de cerca de 2 vezes em ambas as frações. Para efeito de informação, as quantidades filtradas e excretadas de Na+ e de K+ estão mostradas na Tabela 6. Controle SAPAaD 0 1 2 3 * A FE N a+ (% ) Controle SAPAaD 0 50 100 150 * B FE K + (% ) FIGURA 14. Efeito da SAPAaD sobre as frações de excreção de sódio (A) e de potássio (B). Os ratos com livre acesso à água durante as 12 h que antecederam o início do experimento receberam, por gavagem, SAPAaD (50 mg/Kg, n = 6) dissolvida em um volume de NaCl 0,9% suficiente para promover uma expansão de volume correspondente a 4% do peso corporal do rato. Os ratos foram colocados, individualmente, em gaiolas metabólicas e a coleta de urina e sangue foi feita conforme o protocolo III (Métodos). Controle: NaCl 0,9% apenas, n = 6. Em A, *p = 0,048 e em B, *p = 0,028. 76 TABELA 6 Efeito das SAPAaD (50 mg/kg) sobre as quantidades filtrada e excretada de Na+ e K+ . Quantidades Controle SAPAaD QFNa+, mmol/90 min 45,25 ± 19,43 (n = 5) 13,37 ± 2,36 (n = 7) QENa+, mmol/90 min 0,30 ± 0,07 (n = 5) 0,25 ± 0,03 (n = 7) QFK+, mmol/90 min 0,84 ± 0,36 (n = 5) 0,3 ± 0,08 (n = 6) QENa+, mmol/90 min 0,29 ± 0,06 (n = 5) 0,36 ± 0,06 (n = 6) QF, quantidade filtrada; QE, quantidade excretada 5.7 INVESTIGAÇÃO DO POSSÍVEL MECANISMO PELO QUAL AS SAPONINAS TRITERPÊNICAS DE RAÍZES DA Ampelozizyphus amazonicus DUCKE INDUZEM ANTIDIURESE EM RATOS 5.7.1 Saponinas Triterpênicas e peptídeos natriuréticos A Figura 15 mostra que o tratamento com SAPAaD (50 mg/kg) não afetou os níveis plasmáticos (79,0 ± 12,7 .vs 72,0 ± 12,2 ρg/ml, controle) nem o conteúdo atrial de ANP (.4,5 ± 0,6 vs 3,9 ± 0,4.µg/átrio, controle). 77 Controle SAPAaD 0 25 50 75 100 A A N P pl as m át ic o (p g/ m l) Controle SAPAaD 0 2 4 6 8 10 12 14 16 B C on te úd o de A N P ( µ g/ át ri o) FIGURA 15. Efeito das SAPAaD sobre o peptídeo natriurético atrial no plasma (A) e nos átrios (B). Os ratos com livre acesso à água durante as 12 h que antecederam o início do experimento receberam, por gavagem, SAPAaD (50 mg/Kg, n = 6) dissolvida em um volume de NaCl 0,9% suficiente para promover uma expansão de volume correspondente a 4% do peso corporal do rato. Os ratos foram colocados, individualmente, em gaiolas metabólicas e a coleta de sangue e átrios foi feita conforme o protocolo IV (Métodos). Controle: NaCl 0,9% apenas, n = 12. 78 Contrariamente ao observado para o ANP, as SAPAaD (50 mg/kg) reduziram, de forma significativa, o conteúdo urinário de urodilatina, o qual diminuiu de 792 ± 132 pg/ml para 299 ± 88 (Controle) (Fig. 16). Controle SAPAaD 0 250 500 750 1000 * U ro di la tin a ( ρg /m l) FIGURA 16. Efeito das SAPAaD sobre o conteúdo urinário de urodilatina. Os ratos com livre acesso à água durante as 12 h que antecederam o início do experimento receberam, por gavagem, SAPAaD (50 mg/Kg = 7) dissolvida em um volume de NaCl 0,9% suficiente para promover uma expansão de volume correspondente a 4% do peso corporal do rato. Os ratos foram colocados, individualmente, em gaiolas metabólicas e a coleta de sangue e átrios foi feita conforme o protocolo IV (Métodos). Controle: NaCl 0,9% apenas, n = 7. *p = 0,011 5.7.2 Saponinas Triterpênicas e Atividade ATPásica do Córtex Renal A Figura 17 mostra o efeito das SAPAaD (50 mg/kg) sobre a atividade da Na+ - ATPase e da (Na+ + K+) ATPase. Enquanto que a atividade da Na+ -ATPase foi elevada de 25,0 ± 5,9 (controle) (Fig. 17A) para 52,7 ± 8,9 nmol Pi x mg-1x min-1, atividade da (Na+ + K+) ATPase aumentou de 47,8 ± 13,3. para 69,7 ± 11,2 nmol Pi x mg-1x min-1. 79 Controle SAPAaD 0 10 20 30 40 50 60 70 * A N a + A TP as e (n m ol Pi x m g- 1 x m in -1 ) Controle SAPAaD 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 B (N a+ + K + ) A TP as e (n m ol Pi x m g- 1 x m in -1 ) FIGURA 17. Efeito das SAPAaD sobre a atividade da Na+ -ATPase (A) e da (Na+ + k+) ATPase (B). Os ratos com livre acesso à água durante as 12 h que antecederam o início do experimento receberam, por gavagem, SAPAaD (50 mg/Kg = 4) dissolvida em um volume de NaCl 0,9% suficiente para promover uma expansão de volume correspondente a 4% do peso corporal do rato. Os ratos foram colocados, individualmente, em gaiolas metabólicas e a coleta de sangue e átrios foi feita conforme o protocolo IV (Métodos). Controle: NaCl 0,9% apenas, n = 4. *p = 0,049. 80 5.7.3 Saponinas Triterpênicas e diurese induzida por furosemida Nesta série experimental (protocolo VI) foi investigado o efeito das SAPAaD sobre a diurese induzida pela furosemida. Conforme pode ser observado na Figura 18A, o pré-tratamento com SAPAaD (50 mg/Kg) , 30 min antes da expansão de volume (4%) com NaCl 0,9% apenas, não teve qualquer efeito sobre a diurese provocada pela simples expansão. Por exemplo, aos 60 min após a expansão, o volume de urina foi de 3,5 ± 0,44 e 4 ± 0,5 nos animais tratados e não tratados com SAPAaD, respectivamente. Já nos animais expandidos com NaCl 0,9% contendo furosemida (13 mg/Kg), a SAPAaD, administrada 30 min antes da expansão de volume (4%) reduziu, significativamente (p< 0,02), o efeito diurético da furosemida (Fig. 18B). Aos 60 min após a expansão, o volume de urina foi reduzido de 8,13. ± 0,7 ml para 5.25 ± 0,4 ml. 81 0 30 60 90 120 150 180 210 0 2 4 6 8 10 12 14 Controle SAPAaD 50 A Tempo após expansão (min) Vo lu m e C um ul at iv o de U rin a (m l) 0 30 60 90 120 150 180 210 0 2 4 6 8 10 12 14 Controle (Furosemida) SAPAaD 50 (Furosemida) B Tempo após expansão (min) Vo lu m e C um ul at iv o de U rin a (m l) FIGURA 18. Efeito das SAPAaD sobre a diurese em ratos submetidos à expansão de volume com NaCl 0,9% apenas (A) ou com NaCl 0,9% contendo furosemida (B). Os ratos com livre acesso à água durante as 12 h que antecederam o início dos experimentos receberam, por gavagem, 0,5 ml de NaCl 0,9% contendo ou não 50 mg/kg de SAPAaD. Após 30 min, os ratos receberam, também por gavagem, NaCl 0,9% apenas ou NaCl 0,9% contendo furosemida (13mg/kg) em volume suficiente para promover uma expansão de volume correspondente a 4% do peso corporal do rato (protocolo VI, Métodos). Os ratos foram colocados, individualmente, em gaiolas metabólicas e o volume cumulativo de urina foi medido a cada 30 min, durante 3 h (n = 5, por grupo). 82 6 DISCUSSÃO 83 6 DISCUSSÃO Este estudo mostra que enquanto o extrato bruto das raízes da Ampelozizyphus amazonicus Ducke (EBAaD) aumenta a diurese em ratos, as saponinas (SAPAaD) dele extraídas produzem antidiurese. Porém, para se estudar os efeitos de tais substâncias sobre a função renal, o grau de toxicidade das SAPAaD foi avaliado pela análise da morfologia renal e pela sua atividade hemolítica. Como esperado, as SAPAaD apresentaram atividade hemolítica in vitro, em concentrações que variaram de 50 a 0,78 mg/ml. Essa atividade foi dependente da concentração de SAPAaD utilizada, ou seja, a atividade hemolítica foi máxima com SAPAaD na concentração de 50 mg/ml e mínima na concentração de 0,78 mg/ml. Esse resultado está de acordo com o observado por outros autores, uma vez que a grande maioria das saponinas presentes em outras plantas apresenta atividade hemolítica, sobretudo quando as saponinas apresentam apenas uma única cadeia de açúcares ligados a sua aglicona (CHANDEL et al.,1980; PRINCE et al.,1987; OLESKEZ, 1990; OLESKEZ et al.,, 1992). Esse efeito é resultante da capacidade das saponinas de interagir com os componentes da membrana celular dos eritrócitos, principalmente as moléculas de colesterol, induzindo uma deformação na membrana com conseqüente extravasamento do conteúdo intracelular (GLAUERT et al., 1967; KARABALIEV et al., 2003). A SAPAaD, ao ser infundida intravenosamente a uma taxa de 2,5 mg/min (SAPAaD 50 mg/ml, fluxo na infusão = 50 µl/min, durante da infusão = 90 min), apresentou uma atividade hemolítica leve comparável à hemólise produzida pela SAPAaD na concentração de 0,78 mg/ml, no experimento in vitro. A dose intravenosa de 2,5 mg/min equivaleu a uma dose média de 750 mg/kg. Essa baixa atividade hemolítica das SAPAaD, in vivo, está de acordo com o relatado por BRUNETON (1999) ao ressaltar que muitas das características biológicas e farmacológicas das saponinas, observadas in vitro, não são reproduzíveis in vivo. Isto se dá, principalmente, quando administradas oralmente, uma vez que muito pouco das saponinas intactas, na forma de glicosídeos, é absorvido no intestino (GESTETNER et al., 1968). A baixa absorção intestinal pode ser responsável pela baixa toxicidade apresentada pelas saponinas, quando administradas oralmente. O baixo grau de toxicidade pôde ser comprovado pela análise histológica de rins de 84 ratos tratados, oralmente, com SAPAaD (50 e 1000 mg/kg). Os rins dos animais tratados com SAPAaD 50 mg/kg apresentaram apenas um pequeno aumento no número vacúolos nos túbulos renais, ao passo que nos rins dos ratos tratados com SAPAaD 1000 mg/kg houve um aumento ainda maior no número de vacúolos e aparecimento de focos pontuais de degeneração da membrana celular e de núcleos picnóticos. Alguns relatos da literatura mostram que derivados de plantas, inclusive saponinas triterpênicas, podem atuar sobre a função renal exibindo tanto efeitos benéficos, como maléficos. Por exemplo, saponinas triterpênicas (saiksaponina-d) extraídas de raízes da Bupleurum falcatum L. apresentaram atividade nefroprotetora ao prevenir o desenvolvimento de proteinúria induzido por aminonucleosídeos, em ratos (ABE et al., 1986). De forma similar, a hiperplasia mesangial glomerular e a espessura da membrana basal glomerular, em ratos Spragle-Dawley com nefropatia diabética induzida por streptozotocina, foram reduzidas por saponinas extraídas da Astragalus membranaceus BUNGE (YIN et al., 2004). Enfim, um grande número de plantas, muitas delas ricas em saponinas triterpênicas, possui atividade nefrotóxica, quer seja pela propriedades inerentes aos compostos vegetais, quer seja pelo uso inadequado das mesmas como, por exemplo, interações com outras drogas e utilização de altas doses (WOJCIKOWSKI et al., 2004). Efeitos como necrose e infiltração celular no glomérulo e no epitélio dos túbulos renais têm sido atribuídos às saponinas presentes em plantas como a Rinbacina, relatados (AFONNE et al., 2002) e Argania spinosa e Citrullus colocynthis (ALAOUI et al., 1998; DIWAN et al., 2000). SOKAR et al. (2003) também atribuem às saponinas triterpênicas, presentes na Herniaria cinerea DC, a grande necrose tubular e a hemorragia observadas em lâminas histológicas de rins de ratos tratados, por via oral, por 2 semanas, com o extrato butanólico da Herniaria cinerea DC, em doses superiores a 1g/kg. Em nosso estudo, a dose de 1g/Kg, foi a dose mais elevada de SAPAaD utilizada. Isto pode explicar a não observação de grandes alterações na morfologia renal. Além do mais, nesse trabalho, examinamos o efeito agudo (horas) de uma única dose de SAPAaD, ao contrário dos protocolos usados nos trabalhos acima relatados, onde foram analisados os efeitos crônicos (dias a semanas) com doses repetidas dos extratos das plantas. Embora questionável, está estabelecido que em um estudo de toxicidade aguda, via oral, um produto só é considerado não tóxico quando, em 85 doses inferiores a 5g/kg, não provoca morte e nenhum sinal clínico é observado em conseqüência da adiministração do mesmo (BROCK et al., 1995). Diante disso, as SAPAaD podem ser consideradas não tóxicas ou, pelo menos, com toxicidade leve. A fim de se investigar o efeito agudo do EBAaD e das SAPAaD, uma expansão de volume (4% do peso corporal) foi feita na maioria dos protocolos experimentais. A opção pelos 4% foi feita com base no fato de que a diurese promovida por essa magnitude de expansão não é mínima nem máxima, o que permite o estudo de efeitos de substâncias que tanto estimula como inibe a diurese. Experimentos sob condições normais de expansão de volume requer um período longo de coleta de urina (24 h) e assim, caso tais substâncias tenham efeito mais imediato, as possíveis alterações na diurese poderiam não ser detectadas pelo longo período de coleta. Estudo prévio em nosso Laboratório (MEYER, 2002) mostrou que o tratamento prolongado (5 dias) com o EBAaD aumenta a diurese em ratos com livre acesso à água. Em um protocolo experimental inicialmente utilizado, nesse estudo, foi observado que o EBAaD aumentava, apenas discretamente, a diurese induzida pela expansão de volume (4% do peso corporal) com NaCl 0,9% em animais que haviam sido mantidos sob restrição de água durante as 12 h que antecediam o início do experimento. A razão para a minimização do efeito do EBAaD pode ser que, sob a condição de restrição de água, mecanismos que promovem antidiurese como, por exemplo, a liberação de HAD, devem estar estimulados. Já nos animais com livre acesso à água nas 12 h que antecediam o início do experimento, o EBAaD produziu um aumento mais pronunciado na diurese sendo, esse efeito, dose-dependente. A fim de identificar qual(is) composto(s) presente(s) no EBAaD seria(am) responsável(eis) pelo aumento na diurese, o mesmo foi submetido a processos de fracionamento. Uma fração daí obtida e composta por saponinas triterpênicas (SAPAaD) foi usada na maioria das etapas deste trabalho. A forma de isolamento e a elucidação estrutural de saponinas triterpênicas das raízes de Ampelozizyphus amazonicus Ducke já havia sido descrita, em 1991, por LINS BRANDÃO et al. Para a nossa surpresa e contrariamente ao esperado, as SAPAaD extraídas do EBAaD produziram antidiurese. Este efeito, embora mais acentuado em animais com livre acesso à água nas 12 h que antecederam o início dos experimentos, também foi observado nos ratos mantidos sob restrição de água durante esse mesmo período. O efeito antidiurético das SAPAaD foi observado tanto na expansão de 86 volume com NaCl 0,9% (expansão isosmótica), quanto na expansão com água (expansão hiposmótica). Embora a diurese produzida pela expansão hiposmótica seja maior do que aquela induzida pela expansão isosmótica, a inibição da diurese pela SAPAaD foi, proporcionalmente, semelhantes sendo, esta inibição, igual a 75 e 64% nas expansões isso e hiposmótica, respectivamente. Assim, uma maior inibição da liberação de HAD, em decorrência da baixa osmolalidade plasmática (BANKIR, 2001; VERBALIS, 2003) provocada pela expansão hiposmótica, não interferiu com o efeito antidiurético das SAPAaD. A ação diurética de plantas tem sido relatada por alguns autores. Por exemplo, BEVEVINO et al. (1994) verificaram que o extrato bruto das raízes de Bredemeyera floribunda induz aumento significativo no fluxo urinário, em ratos e que esse efeito era devido às saponinas triterpênicas presentes na planta. De forma semelhante, o efeito antihipertensivo exibido pelas saponinas encontradas nas partes aéreas da Herniaria glabra parece ser devido ao efeito diurético das mesmas, em ratos espontaneamente hipertensos (RHIOUANI et al., 1999). Além disso, estudos utilizando ratos geneticamente hipertensos tipo Dahll sensíveis a sal (DSS), mostraram que o efeito anti-hipertensivo do ácido oleanólico e do ácido ursólico era devido ao potente efeito diurético desses compostos triterpênicos (SOMOVA et al., 2003). Em nosso trabalho mostramos, pela primeira vez, que as saponinas extraídas da Ampelozizyphus amazonicus Ducke possui efeito antidiurético, já que nenhum trabalho relatando efeito semelhante foi encontrado na literatura. Além do efeito antidiurético, as SAPAaD não afetaram, significativamente, o RFG, embora tenha sido observado uma tendência de redução do mesmo (Fig. 12). Igualmente, a fração de excreção de água não foi afetada, de forma significativa. Novamente, os nossos dados estão em desacordo com dados encontrados na literatura. Segundo BEVEVINO et al., (1994), além de aumentar o fluxo urinário, o extrato bruto das raízes da Bredemeyera floribunda também aumenta o RFG. Nenhum estudo relatando que algum tipo de planta é inefetivo ou mesmo capaz de promover queda no RFG foi, por nós localizado. Com relação às discrepâncias entre os nossos resultados com a Ampelozizyphus amazonicus Ducke e aqueles relatados para a Bredemeyera floribunda, diversas hipóteses para explicá- las podem ser levantadas como, por exemplo, a própria diferença de espécie e o 87 protocolo experimental utilizado nos dois estudos. Um aumento no número de experimentos bem como o delineamento de experimentos que mostrem um efeito mais direto das SAPAaD sobre o RFG, sem dúvida, fazem-se necessários. As SAPAaD aumentou, de forma significativa, a osmolalidade urinária, embora não tenha afetado as concentrações plasmática e urinária de Na+ e de K+ e também da osmolalidade plasmática. Pela análise da excreção de Na+ e de K+ observa-se que a SAPAaD aumentou a fração de excreção de ambos os íons. Esses dados estão em consonância com a observação de BEVEVINO et al. (1994) que relataram um aumento na fração de excreção de Na+ e K+ produzido pelo extrato bruto de raízes da Bredemeyera floribunda. O aumento na excreção de K+, promovida pelo tratamento com SAPAaD, pode estar relacionado com um aumento nos níveis plasmáticos do HAD. Vários estudos mostram que o HAD estimula a secreção de íons K+ no túbulo distal e no ducto coletor cortical (FIELD et al., 1984; TOMITA et al., 1987; SCHAFER et al., 1986; WANG et al.,1991; AMORIM et al., 2000). Em um outro estudo, ELALOUF et al. (1973), usando ratos Brattleboro, que são animais que não produzem HAD, verificaram que o tratamento com HAD exógeno promovia um aumento na secreção de tubular de íons potássio nos túbulos distais. Esse aumento era independente de um aumento do fluxo no túbulo distal ou do aporte de íons sódio neste segmento do néfron, fatores conhecidos por influenciarem na secreção de íons K+ (GOOD et al., 1979). A dosagem de HAD no plasma de ratos tratados com SAPAaD foi objetivo desse trabalho. Durante o processo de dosagem, por motivos técnicos (escassez de anticorpo) tais medidas não se mostraram, quantitativamente, fidedignas. Apesar disso, os níveis de HAD foram, qualitativamente, mais elevados no plasma de animais tratados com as SAPAaD, quando comparados ao HAD plasmático de ratos não tratados. Para a comprovação desse dado, a dosagem de HAD necessita ser repetida para. De qualquer forma, um possível aumento no HAD circulante, induzido pelas SAPAaD, poderia ser o responsável pela elevação da fração de excreção de K+. Diversos fatores endógenos podem ser os responsáveis por um aumento na excreção de Na+ e K+. A filtração glomerular é um dos principais mecanismos que regulam a excreção renal de Na+. Uma vez que grandes quantidades de Na+ são filtradas nos rins, pequenas mudanças no RFG podem ter grandes efeitos no Na+ 88 excretado, apesar de que mudanças na quantidade de Na+ filtrado serem compensadas com concomitantes mudanças na reabsorção de Na+ nos túbulos proximais, via “feedback” tubuloglomerular (EATON & POOLER, 2006). Outro fator determinante na excreção renal de sódio é a secreção de aldosterona, hormônio que aumenta a reabsorção de Na+ nos segmentos distais do néfron. Esse efeito se dá por i) indução da síntese de canais iônicos que afetam a reabsorção de Na+ e K+, nas células epiteliais tubulares, principalmente, os canais de Na+ localizados no lúmen das células tubulares e ii) ativação da Na+-K+-ATPase presente no ducto coletor cortical (VERBALIS, 2003; BLOT-CHABAUD et al., 1990). Uma redução na síntese e/ou liberação de aldosterona, estimulada pelas SAPAaD, poderia ser a responsável pelo aumento na fração de excreção de Na+ observado em nosso estudo. Uma queda nos níveis plasmáticos de aldosterona poderia diminuir a síntese daqueles canais de Na+ localizados no lúmen das células tubulares medulares reduzindo, então, a sua reabsorção. Nesse sentido, encontra-se na literatura alguns exemplos de plantas medicinais envolvidas em alterções dos níveis plasmático de aldosterona, tais como a Salvia miltiorrhiza usada, cronicamente, por 12 semanas,diminuiu os níveis plasmáticos de aldosterona em ratos espontaneamente hipertensos (HAN et al., 2002). FORSULND et al. (1989) relataram que a ingestão diária, por 8 semanas, de licorice (alcaçuz), composto vegetal extraído da Glycyrrhiza glabra L. e que possui em sua composição saponinas triterpênicas, reduziu a concentração plasmática de aldosterona. Em um outro estudo, Al-QUARAWI et al. (2002) que mostraram que a administração oral do extrato aquoso das raízes dessa mesma planta (Glycyrrhiza glabra L.), nas doses de 100, 250 e 500 mg/kg promoveu a redução dos níveis de aldosterona em ratos. Estudos mostram que a Glycyrrhiza glabra L é um inibidor competitivo da isoforma 11 β Hidroxiesteroide Desidrogenase 2 (11 β- HSD2), enzima que catalisa a reação da conversão de cortisol em cortisona, prevenindo a ativação dos receptores de mineralocorticóides pelo cortisol (STEWART et al., 1994; DRAPER et al., 2005). O cortisol é um glicorcoticóide envolvido no controle da pressão sanguínea capaz de se ligar tanto a receptores de glicorticóides como a receptores de mineralocoricóides (FUNDER et al., 1988). Assim a inibição da 11 β- HSD2 pela Glycyrrhiza glabra L, nos tecidos alvos da aldosterona, leva a um quadro de hipertensão e hipocalemia, conhecido como síndrome aparente do excesso de aldosterona, que resulta da 89 ativação dos receptores de mineralocorticóides pelo cortisol em excesso, que compete com a aldosterona pelo sítio de ligação dos receptores (CONN et al., 1968; FUNDER et al., 1988; WHITE et al., 1997). Apesar da grande influência sobre a variação da excreção de Na+, somente o RFG e a aldosterona não podem explicar completamente a natriurese que ocorre na ausência de grandes mudanças no RFG e na secreção de aldosterona observadas, por exemplo, durante expansão isotônica de volume. Isto sugere a participação de outros fatores na regulação da excreção de Na+. No presente trabalho, verficamos que as SAPAaD diminuíram o conteúdo urinário de urodilatina, embora não tenha afetado os níveis plamático e atrial de ANP. Dados da literatura têm mostrado que o ANP99-126 estimula a natriurese e diurese pela inibição da reabsorção do sódio, no ducto coletor medular interno, resultante da inibição de canais de Na+ presentes na membrana apical e da (Na+ + K+)-ATPase da membrana basolateral das células principais desse segmento do néfron (BELTOWSKI, 2002; ZEIDEL et al., 1993; KNEPPER et al., 1991). Além da inibição da reabsorção tubular de Na+, o ANP99-126 pode induzir natriurese adicional por aumento no RFG (COGAN, 1986), inibição do sistema renina-angiotensina, da atividade do sistema nervoso simpático (ESPINER et al., 1995) e do efeito do HAD (DILLINGHMAN et al., 1986). A urodilatina é um peptídeo natriurético que, em condições fisiológicas, não é detectado no plasma (DRUMMER et al, 1993). Por isso, acredita-se que o peptídeo seja sintetizado pelas próprias células tubulares renais e secretado dentro do lúmen do túbulo distal e ducto coletor onde se liga ao receptor NPR-A, atuando de forma parácrina na regulação da excreção de Na+ e da água (RITTER et al., 1991; FELLER et al., 1988). Estudos sugerem que o efeito da urodilatina sobre a função renal é semelhante ao efeito do ANP99-126, ou seja, a urodilatina diminui a reabsorção tubular de Na+ e água principalmente no ducto coletor medular (SCHULZ-KNAPPE et al., 1988; MEYER et al., 1996; BESTLE et al., 1999). Experimentos em animais e humanos têm mostrado que a urodilatina, em doses equimolares ao ANP, possui um efeito diurético e natriurético maior que o do ANP (HILDEBRANDT et al., 1992; BESTLE et al., 1993). Uma possível explicação para essa maior potência natriurética e diurética, em relação ao ANP, seria uma maior quantidade de urodilatina a atingir os seus receptores nos túbulos renais em virtude de uma menor degradação de 90 suas moléculas. Estudos mostram que, ao contrário do ANP, a urodilatina não é inativada pelas peptidases presentes na membrana de células do córtex renal em cão (GEGELMANN et al., 1988). Além do mais, a inibição da endopeptidase neutra não afetou o “clearance” metabólico da urodilatina, ao contrário do ANP99-126 que teve seu “clearance” diminuído, em ratos (ABASSI et al., 1992). Assim, em nosso estudo, a diminuição nos níveis urinários de urodilatina pode estar envolvida na redução da diurese produzida pelas SAPAaD. Poucos estudos mostram o efeito de extratos vegetais ou compostos isolados de plantas medicinais sobre peptídeos natriuréticos. No trabalho de FORSULN et al. (1989), além da redução na aldosterona plasmática, foi verificado que o licorice (alcaçuz) extraído da Glycyrrhiza glabra aumenta, em cerca de 80%, a concentração plasmática de PNA. Em um trabalho, utilizando um modelo de insuficiência cardíaca aguda induzida em ratos, a Astragalus membranaceus, planta medicinal chinesa, administrada intraperitonealmente (1g/dia) aumentou, de forma significativa, a relação PNA plasmático/GMPc (MA et al., 1998). Em nosso estudo, as SAPAaD não afetou os níveis plasmático e atrial de PNA. Isto pode ser devido ao protocolo utilizado, uma vez que apenas uma dose de SAPAaD foi administrada. Nenhum trabalho, relacionando urodilatina com plantas medicinais, foi encontrado na literatura. De modo geral, efeito dessas substâncias pode se dar de forma indireta, via estimulação da liberação de outros mediadores ou diretamente, ao atuar sobre mecanismos tubulares de transporte de eletrólitos e água. Nesse estudo, mostramos que as SAPAaD não afetam, significativamente, a atividade da (Na++K+) ATPase da fração microssomal do córtex renal, embora tenha havido uma tendência de aumento da mesma. Há muito tempo, o aumento da atividade dessa ATPase por substâncias com propriedade detergentes, assim com as SAPAaD, tem sido relatado. Assim, JORGENSEN et al. (1971) verificaram que substâncias com propriedades detergentes, assim como as SAPAaD, aumentam a atividade da (Na++K+) ATPase na fração microssomal de medula externa de rins de coelho. Os autores sugeriram que essa ativação da (Na++K+) ATPase era devido à capacidade, dessas substâncias, de promoverem uma abertura na estrutura de vesículas citoplasmáticas favorecendo, assim, migração dessa enzima para a membrana celular. Em concordância com esta observação, GONIN et al. (2001) mostraram que as saponinas são capazes de 91 aumentar a atividade da (Na++K+) ATPase localizada nas membranas de células do ducto coletor cortical de ratos e em cultura de células principais dos ductos coletores de camundongos (mpkCCDc14). Este efeito foi devido à capacidade das saponinas em aumentar a permeabilidade das membranas de organelas citoplasmáticas que possuem esse tipo de bomba, favorecendo, assim, a migração de grande número de moléculas de (Na++K+) ATPase do citoplasma para a membrana celular. Em nosso estudo a elevação da atividade da (Na+ + K+) ATPase não atingiu significância estatística, muito provavelmente, devido ao número (n=4) pequeno de amostras experimentais. Um possível aumento da atividade da (Na++K+) ATPase poderia contribuir para o efeito de redução da diurese promovidas pelas SAPAaD. Por outro lado, as SAPAaD aumentaram, significadamente, a atividade de uma segunda bomba de Na+, a Na+ ATPase. Esta enzima localiza-se na membrana basolateral das células epiteliais dos túbulos renais e transporta Na+ do meio intracelular para o meio intersticial, utilizando a energia proveniente da hidrólise do ATP. A atividade dessa enzima é inibível pela furosemida e pelo ácido etacrínico (PROVÉRBIO, 1986). Por apresentar cerca de 10% da atividade ATPásica total, acredita-se que a Na+ ATPase esteja envolvida numa pequena parcela do transporte do íon sódio ao longo do néfron, portanto, participando do controle fino do transporte de Na+ e água (CARUSO-NEVES et al., 2002). Esse aumento na atividade da Na+ ATPase pode estar diretamente relacionado com o efeito antidiurético das SAPAaD. Uma possível interação entre os efeitos da furosemida e das SAPAaD, in vivo, foi avaliada, nesse estudo. O efeito diurético da furosemida foi abolido pelo pré- tratamento dos ratos com SAPAaD. Observação semelhante foi relatada por BECKER et al. (1996), que verificou refração ao efeito diurético da furosemida em um paciente hipertenso, que fazia uso domiciliar de um suplemento nutricional à base de ginseng. O ginseng é um composto natural rico em saponinas triterpênicas do tipo dammarano, ou seja, o mesmo tipo de saponinas encontrado nas raízes da Ampelozizyphus amazonicus Ducke (BRUNETON, 1999). A atividade aumentada da Na+ ATPase pode estar envolvida na redução do efeito diurético da furosemida provocada pelas SAPAaD. Em suma, a SAPAaD pode antagonisar o efeito da furosemida sobre a Na+ ATPase diminuindo seu efeito diurético. 92 Diversos trabalhos têm relatado que derivados de plantas medicinais afetam a atividade de enzimas envolvidas no transporte renal de eletrólitos. Ao contrário do observado em nosso trabalho, Souza et al. (2004) observaram que saponinas isoladas das raízes da Costus spicatus reduzem a atividade da Na+ ATPase do túbulo proximal de rins de porco. Essa discrepância entre os dois pode ser devido a diferenças nos protocolos experimentais utilizados. O efeito das saponinas isoladas da C. spicatus sobre a atividade da bomba foi medido após contato direto das saponinas com as membranas basolaterais dos túbulos proximais (in vitro), enquanto que o efeito das SAPAaD sobre a bomba foi medido, em nosso estudo, na fração microssomal do córtex renal, 90 min após a sua administração (in vivo). Assim, no primeiro modelo experimental, pode-se observar um efeito direto das saponinas intactas sobre a Na+ ATPase, ao passo que no segundo modelo experimental, as SAPAaD podem sofrer alguma transformação metabólica, por ação de enzimas localizadas em diferentes órgãos, produzindo metabólitos que apresentam efeitos semelhantes ou completamente diferentes ao apresentado pela molécula precursora de saponina na sua forma intacta. Assim, o efeito ativador da Na+ ATPase promovido pelas SAPAaD administradas, por gavagem, pode ser devido à ação de saponinas intactas e/ou pela ação de algum metabólito formado. Além disso, as saponinas são de natureza diferentes já que as saponinas da C. spicatus são do tipo esteroidais e as saponinas da A. amazonicus Ducke são do tipo triterpênicas. Nos vários tecidos que compõem o organismo, a atividade das bombas de sódio é regulada por hormônios como aldosterona, HAD, peptídeos natriuréticos, dopamina, entre outros. Por exemplo, CARUSO-NEVES et al. (2004) verificaram que a urodilatina e o ANP não alteram a atividade da (Na+ + K+)-ATPase, porém, inibem a atividade da Na+ ATPase em membrana basolateral isoladas do túbulo proximal de rins de porcos adultos. Os autores sugeriram que essa inibição é mediada pelo GMP cíclico, uma vez que o efeito inibidor de ambos peptídeos foi revertido pela presença de um inibidor da guanilil-ciclase, MLY83583, e pela adição de GMP cíclico. Em nosso estudo, a redução no nível urinário de urodilatina, verificada 90 min após a administração de SAPAaD, pode estar correlacionada com o aumento na atividade da Na+ ATPase da fração microssomal do córtex renal. Os peptídeos natriuréticos parecem não modular a atividade da (Na+ + K+)-ATPase, a menos que haja uma estimulação prévia da enzima pela noroepinefrina (GARVIN, 93 1992) ou angiotensina II (HARIS et al., 1987). Já o HAD parece estimular sua atividade. TOMITA et al. (1987) verificaram que a administração intramuscular de HAD, por 7 dias, produz aumento da atividade da (Na+ + K+)-ATPase no ducto de coletor cortical de ratos. Assim, um eventual aumento, pelas SAPAaD, dos níveis plasmáticos de HAD poderia estar mediando o aumento da atividade da (Na+ + K+)- ATPase, o que contribuiria para um aumento na reabsorção de água nas porções finais do néfron. A Figura 19 esquematiza o(s) provável(is) mecanismo(s) pelo(s) qual (is) as SAPAaD poderiam produzir antidiurese. A redução dos níveis renais de urodilatina pelas SAPAaD implicaria em um aumento na atividade de ATPases renais, principalmente, da Na+ ATPase, o que pode levar a um aumento da reabsorção de Na+. Por sua vez, níveis de HAD plasmático elevados resultaria numa maior reabsorção de água no ducto coletor medular. Uma maior reabsorção de água associada a uma maior reabsorção cortical de Na+ poderia ser a maior responsável pela antidiurese induzida pelas SAPAaD. No entanto, não podemos deixar de considerar que a fração de excreção de Na+, em nosso estudo, foi aumentada pelas SAPAaD. Uma hipótese para explicar tal efeito, é que uma possível redução, pelas SAPAaD, nos níveis plasmáticos de aldosterona levaria a uma queda na reabsorção de Na+, pelo ducto coletor medular, com conseqüente aumento na excreção desse íon. 94 DIURESE Figura 19. Provável(is) mecanismo(s) pelo(s) qual (is) as SAPAaD podem diminuir a produzir antidiurese. FR, fração de reabsorção; FE, fração de excreção. SAPAaD Urodilatina renal HAD circulante (?) Aldosterona circulante(?) Atividade de ATPases Reabsorção de H2O FRNa+ FRK+ Reabsorção de Na+ FENa+ FEK + 95 7.CONCLUSÃO 96 7 CONCLUSÕES 7.1 O extrato bruto das raízes de Ampelozizyphus amazonicus Ducke (EBAaD) aumenta a diurese em ratos submetidos à expansão isosmótica de volume. 7.2 Ao contrário do EBAaD, as saponinas dele isoladas (SAPAaD) reduz a diurese em ratos submetidos a expansões iso e hiposmótica de volume. Além disso, na expansão isosmótica, as SAPAaD: a) aumentaram a reabsorção de água, evidenciada por um “clearance” de água livre mais negativo; b) aumentaram a excreção de Na+ e K+. 7.3 O efeito antidiurético das SAPAaD pode estar relacionado, pelo menos em parte, com: a) uma redução dos níveis renais de urodilatina; b) aumento da atividade de ATPases renais, principalmente, a Na+ ATPase. 7.4 O efeito diurético da furosemida é abolido pelas SAPAaD, provavelmente, por inibir ATPases renais. 97 8.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 98 8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABASSI, Z.A.; TATE, J.; HUNSBERGER, S.; KLEIN, H.; TRACHEWSKY, D.; KEISSER, H.R. Pharmacokinetics of ANP and urodilatin during CANF receptor blockade and neutral endopeptidase inhibition. American Journal Physiologic, v.263, p.870-876, 1992. ABE, H.; ORITA, M.; HONISHI, H.; ARICHI, S.; ODASHIMA, S. Effects of saikosaponin-d on aminonucleoside nephrosis in rats. European Journal of Pharmacology, v.120, p.171-178, 1986. 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