UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Departamento de Morfologia Programa de Pós-graduação em Biologia Celular A dinâmica transitória do nicho de macrófagos hepáticos durante a lesão hepática aguda torna o organismo susceptível a infecções sistêmicas Mateus Eustáquio de Moura Lopes Belo Horizonte 2022 Mateus Eustáquio de Moura Lopes A dinâmica transitória do nicho de macrófagos hepáticos durante a lesão hepática aguda torna o organismo susceptível a infecções sistêmicas Tese apresentada ao Programa de Pós- graduação em Biologia Celular do Departamento de Morfologia, do Instituto de Ciências Biológicas, da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Ciências Área de concentração: Biologia Celular. Orientador: Prof. Dr. Gustavo Batista de Menezes Instituto de Ciências Biológicas Universidade Federal de Minas Gerais Belo Horizonte 2022 Este trabalho foi realizado no Centro de Biologia Gastrointestinal, do Departamento de Morfologia, localizado no Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Também foram utilizados o laboratório de Biologia de Macrófagos e Monócitos do Departamento de Patologia (ICB-UFMG), e o laboratório de Gnotobiologia e Imunologia do Departamento de Bioquímica e Imunologia (ICB-UFMG). Contamos com o apoio financeiro das agências CAPES, FAPEMIG, e CNPq. Agradecimentos Ao final de uma etapa é hora de reconhecer e agradecer àqueles que foram fundamentais para que tudo ocorresse da melhor maneira possível. A Brenda, muito obrigado por todos os anos juntos, por compartilhar todas as alegrias e me ajudar a superar todas as dificuldades. Além de toda contribuição desde o início do projeto até sua finalização. Aos meus pais: Maria e Márcio; aos meus irmãos: Ciro e Cássio, por todo apoio e por contribuírem para minha formação. Ao professor Gustavo pela oportunidade de desenvolver este trabalho, por toda orientação neste período, e pelo acolhimento no laboratório. A todos integrantes do Centro de Biologia Gastrointestinal pelos momentos de aprendizado. Ao professor André pela colaboração e todas as discussões científicas durante o período. Ao professor Ricardo pela colaboração e todas as discussões científicas durante o período. Também a todos integrantes do Laboratório de Biologia de Macrófagos e Monócitos pela colaboração. A todos os técnicos responsáveis pela manutenção dos laboratórios e cuidados com os animais experimentais; em especial a Dra. Cristina por todo suporte direto. Ao professor Andrew Luster e ao doutor Lucas Faustino por terem aberto as portas do Center for Immunology and Inflammatory Diseases do Massachusetts General Hospital, e pela orientação durante o período de doutorado no exterior. Aos amigos espalhados pelo mundo por todos os ensinamentos, pelos momentos, e principalmente pela amizade. As agências de fomento, CNPq, CAPES e FAPEMIG, por fornecerem os recursos para a realização deste trabalho. “How far can I go from the edge of what I know” (Monolink, 2015) Resumo As células de Kupffer são o principal componente imune do fígado, apresentado um posicionamento estratégico no interior nos capilares sinosóides fenestrados, o que permite um íntimo contato tanto com o sangue circulante quanto com o parênquima hepático. Essas células desempenham importantes funções, incluindo o metabolismo de ferro, a remoção de restos celulares e a eliminação de produtos derivados da microbiota e patógenos da circulação. Além disso, em processos inflamatórios, são responsáveis por limitar a lesão hepática e promover a resolução da inflamação. Uma diversidade de agentes pode causar processos inflamatórios no fígado, sendo a intoxicação por acetaminofeno uma das principais causas da lesão hepática aguda, que pode, em último caso, evoluir para uma falência hepática e levar o indivíduo à morte. Nesse caso, a inflamação hepática gerada afeta diretamente as células de Kupffer. Como consequência, a remoção de moléculas e microrganismos circulantes pode ficar prejudicada, causando uma janela de susceptibilidade a infecções sistêmicas, que são, justamente, responsáveis por boa parte da mortalidade dos pacientes que apresentam esse quadro. Visto a gravidade do problema, procuramos, nesse trabalho, entender a dinâmica das células de Kupffer na lesão hepática aguda induzida por sobredose de acetaminofeno. Observamos que nas fases iniciais, 12 e 24 horas após indução da lesão, há uma redução massiva na população de células de Kupffer nas áreas de necrose, decorrente da apoptose dessas células, o que promove abertura de um importante nicho. Em sequência, monócitos pró- inflamatórios infiltram o tecido, posicionando-se nas áreas de ausência de células de Kupffer. Ainda nessa fase aguda, observamos que o fígado é incapaz de remover as bactérias da circulação, tanto pela redução na população das células de Kupffer quanto pelo prejuízo funcional das células remanescentes. Além disso, os monócitos que infiltram no tecido também podem contribuir para esse fenótipo, uma vez que apresentam algumas vias de sinalização importantes para controle de patógenos suprimidas. Seguindo a cinética da lesão, os monócitos passam de pró-inflamatórios para um perfil pró-resolutivo 72 horas após a sobredose de acetaminofeno. Nesse fase, também são encontrados aglomerados de células de Kupffer em proliferação próximo às áreas de lesão, sugerindo que tanto as células remanescentes em multiplicação quanto os monócitos infiltrantes ocupam o nicho disponível. Esse período é acompanhado de uma recuperação da capacidade hepática de controle bacteriano, indicando que o retorno adequado do nicho das células de Kupffer é essencial para controle de quadros infecciosos durante a lesão hepática aguda. Assim, visando acelerar esse processo, empregamos a terapia celular com macrófagos derivados de medula óssea. Os macrófagos administrados alcançam o fígado, onde são responsáveis por promover a redução das áreas de necrose, a mudança no perfil dos monócitos já na fase aguda da lesão e aumento da capacidade hepática de remover bactérias da circulação. Em conjunto, nossos dados sugerem que a alteração no nicho ocupado pelas células de Kupffer pode explicar a susceptibilidade a infecções sistêmicas e que sua modulação através da terapia celular constitui uma abordagem terapêutica interessante para melhorar o quadro na lesão hepática aguda. Palavras chaves: Células de Kupffer; Nicho de macrófagos; Lesão hepática aguda; Inflamação; Infecção sistêmica; Terapia celular. Abstract Kupffer cells are the primary liver resident immune cell responsible for metabolic and immune functions in the organ as they are strategically positioned inside the liver sinusoid with intimate contact with the blood. In the absence of these cells, the liver injury outcome is worsened. For instance, during acute liver injury promoted by acetaminophen overdose, they are responsible for limiting the damage and promoting the resolution of inflammation. In addition, acetaminophen overdose is responsible for the majority of acute liver failure cases that can evolve to fatal outcomes, which are usually driven by an uncontrolled inflammatory response that leads to organ disfunction. The dysfunction also affects the Kupffer cells, for instance, there is a massive reduction in the Kupffer cell population along with impairment of their functioning during tissue damage. As a consequence, during acute liver injury, clearance of dangerous self/non-self-molecules and pathogens might be significantly impaired. This disruption in the tissue-resident macrophage's niche may lead to a window of susceptibility to systemic infections, which represents a significant cause of mortality in acute liver failure patients. Besides that, the knowledge about Kupffer cell niche disruption and susceptibility to systemic infections are not fully understood. Here, we sought to define the dynamic of tissue-resident macrophage niche using a mice model for acute liver injury induced by acetaminophen overdose. During the acute phase, a massive reduction of Kupffer cells occurs in the necrotic areas opening the niche for infiltration of other cells. The Kupffer cell death was followed by a significant infiltration of inflammatory monocytes in the same region, transiently occupying the niche at the peak of inflammation. Following the acute liver injury kinetics, as the injury starts to resolve, there is a transition in the monocyte subset from pro- inflammatory to a pro-resolutive phenotype. Moreover, the remaining Kupffer cells were observed forming replicating cell clusters closer to areas devoid of Kupffer cells. So, the niche is occupied by dual input of proliferating Kupffer cells and monocytes. However, mice were still susceptible to infections despite the monocytic infiltration and the remaining Kupffer cells in the liver. The systemic infections were not blocked in the acute stage due to inefficient internalization and the elimination of circulating bacteria by the professional phagocytes. That stands out as a necessity to restore the niche in terms of functioning. Thus, cell therapy with bone marrow-derived macrophages (BMDM) was used as a relevant approach to occupy the niche opened after Kupffer cell demise with mature macrophages. BMDM rapidly reach the organ and are precisely positioned within necrotic areas, eliciting the reduction in necrotic areas and earlier transition to a resolutive environment. Likewise, the liver firewall function was restored after the cell therapy, as the BMDM-treated mice presented an improved bacterial removal from blood. Expanding our understanding of the dynamics of the Kupffer cell niche during liver inflammation is vital for the development of new therapeutic approaches such as cell therapy with bone marrow-derived macrophages. Therefore, we showed that the disruption in the Kupffer cell niche and its functioning during acute liver injury is a key element for secondary infections. We propose that the modulation of the macrophage niche is a promising therapeutic strategy for liver injuries that promote Kupffer Cell depletion. Keywords: Kupffer cells; Macrophage niche; Acute liver injury; Inflammation; Systemic infection; Cell therapy. Lista de Ilustrações Ilustração 1. Organização do fígado, aporte sanguíneo e funções de cada componente. ..................................................................................................... 23 Ilustração 2. Diversidade de células imunes que compões o nicho imune hepático. ........................................................................................................... 24 Ilustração 3. As células de Kupffer se encontram estrategicamente posicionadas sobre as LSECs, dentro dos capilares sinusoides. .......................................... 26 Ilustração 4. O processo de biotransformação do APAP pelos hepatócitos. .... 31 Lista de Figuras Figura 1. A lesão hepática aguda induzida pela overdose de acetaminofeno promove extensa lesão tecidual com perda de parênquima e formação de extensas áreas de necrose. ............................................................................. 47 Figura 2. A LHA gera uma inflamação predominantemente neutrofílica e com alterações significativas nas células mieloides mononucleares. ...................... 49 Figura 3. Definição dos aspectos morfológicos das células de Kupffer por MIV. ......................................................................................................................... 51 Figura 4. A lesão hepática aguda promove redução na população de células de Kupffer. ............................................................................................................. 54 Figura 5. A redução na população de células de Kupffer ocorre predominantemente por apoptose. ................................................................... 56 Figura 6. As células de Kupffer remanescentes contribuem para reposição do nicho através de proliferação celular. ............................................................... 58 Figura 7. Os diferentes subtipos de monócitos recrutados posicionam-se estrategicamente nas áreas de necrose durante o curso da LHA. ................... 60 Figura 8. A LHA induzida por sobredose de APAP promovem uma susceptibilidade a infecções. ............................................................................ 62 Figura 9. O fígado perde a capacidade de reter as bactérias circulantes na fase aguda da LHA. ................................................................................................. 65 Figura 10. As células de Kupffer são essenciais para a remoção de bactérias do sangue. ............................................................................................................ 67 Figura 11. A capacidade fagocítica das células de Kupffer está prejudicada na fase aguda da overdose por APAP. ................................................................. 70 Figura 12. O perfil transcricional dos monócitos recrutados é tempo-dependente e diferente do perfil das células de Kupffer. ..................................................... 72 Figura 13. Os monócitos pró-inflamatórios apresentam uma expressão reduzida de vias que participam da fagocitose e eliminação patógenos comparados às células de Kupffer. ............................................................................................ 75 Figura 14. Os monócitos pró-resolutivos apresentam um aumento na expressão de vias que participam da eliminação patógenos intracelulares em relação aos monócitos pró-inflamatórios. ............................................................................ 76 Figura 15. Os monócitos pró-resolutivos apresentam uma reduzida na expressão da via de complemento e cascata de coagulação em comparação com as células Kupffer. ............................................................................................................. 77 Figura 16. A deficiência na capacidade hepática de remover bactérias circulantes não ocorre devido a problemas na opsonização. ............................................. 79 Figura 17. Macrófagos derivados de medula óssea utilizados como terapia celular alcançam o fígado. ............................................................................... 81 Figura 18. A terapia celular com MDMO recupera os níveis dos monócitos pró- resolutivos no fígado. ....................................................................................... 83 Figura 19. Os MDMO promovem a regeneração hepática e ocupam o nicho disponibilizado pela morte das células de Kupffer durante a LHA.................... 85 Figura 20. Terapia celular com MDMO melhora a capacidade do fígado em remover bactérias da circulação. ...................................................................... 87 Lista de Tabelas Tabela 1. Sequência de primers ................................................................................. 43 Lista de Abreviaturas e Símbolos ϕ – Não ativado A.A – Alternativamente ativado actb – Actina beta ACK – Solução de Cloreto de Amônio ALT – Alanina aminotransferase ANOVA – Analysis of Variance APAP – Acetaminofeno; Paracetamol arg1 – Arginase 1 CCR2 – C-C chemokine receptor type 2 cDNA – Ácido desoxirribonucleico complementar CEBIO – Centro de Bioterismo da UFMG CEUA – Comitê de ética de uso animal da UFMG chil3 – chitinase-like 3 CLL – Lipossomos clodronato CSF-1 – Colony stimulation factor 1 CRIg – Complement receptor immunoglobulin Ct - Threshold cycle CX3CR1 – C-X3-C motif chemokine receptor 1 DAMPS – Padrões moleculares associados a dano DAPI - 4,6-diamidino-2-phenylindole DILI – Drug-induced liver injury DNA – Ácido desoxirribonucleico FcγR – Receptores do tipo Fcγ FDR – False discovery rate FHA – Falência Hepática Aguda FSC – Forward scatter GFP – Green Fluorescent Protein GSH – Glutationa reduzida HMGB1 – High-motility group box 1 ICG – Indocyanine green KCs – Células de Kupffer LAMP – Lysosomal-associated membrane protein LDH – Desidrogenase láctica LHA – Lesão hepática aguda LPS – Lipopolissacarídeo LSECs – Células endoteliais sinusoidais do fígado Ly6C – Lymphocyte antigen complex 6, locus C1 Ly6G – Lymphocyte antigen complex 6, locus G MARCO – Macrophage receptor with collagenous structure M-CSF – Fator estimulador de colônias de macrófagos MDMO – Macrófago derivado de medula óssea MERTK – c-MER tyrosine kinase MIV – Microscopia intravital Confocal mRNA – Ácido ribonucleico mensageiro NAC – N-acetilcisteína NADH – Dinucleotídeo de nicotinamida e adenina NAPQI – N-acetil-para-benzoquinonaimina NK – Célula natural killer NLR – Receptor tipo NOD NPCs – Células não-parenquimais PAMPs – Padrões moleculares associados a patógeno PBS – Solução salina tamponada com fosfato PCA – Análise de componente principal PCR – Reação em Cadeia de Polimerase PI – Iodeto de propídeo PI3K – Fosfatidilinositol 3 quinase PLCγ – Fosfolipase C γ PRR – Receptores de reconhecimento de padrões retnla – resistin like alpha RMA – Robust multichip average RNA – Ácido ribonucleico SD – Desvio padrão SEM – Erro padrão da média SSC – Side scatter TGF-β – Transforming growth factor beta Tim-4 – T-cell immunoglobulin and mucin domain containing 4 TLR – Toll-like receptor TNF – Fator de necrose tumoral UFC – Unidades formadores de colônia VEGF – Vascular endothelial growth factor Sumário 1. Introdução ............................................................................................................................ 22 2. Objetivos .............................................................................................................................. 34 2.1. Objetivo geral: Determinar a dinâmica do nicho hepático ocupado pelos macrófagos hepáticas e sua importância no controle de patógenos circulantes e durante a lesão hepática aguda induzida por sobredose de medicamento .................... 34 2.2. Objetivos específicos: ................................................................................................... 34 2.2.1. Estabelecer o modelo de lesão hepática aguda por sobredose de acetaminofeno. ......................................................................................................................... 34 2.2.2. Avaliar a dinâmica populacional das células de Kupffer durante todo o processo inflamatório da LHA. ................................................................................................................. 34 2.2.3. Determinar a dinâmica, posicionamento e o perfil transcricional dos monócitos recrutados durante nosso modelos de LHA ......................................................................... 34 2.2.4. Caracterizar a susceptibilidade a infecções durante a cinética da LHA. .............. 34 2.2.5. Avaliar o papel das células de Kupffer na remoção de bactérias circulantes durante a cinética da lesão. .................................................................................................... 34 2.2.6. Acelerar o processo de resolução da lesão, restabelecendo o controle de patógenos pelo fígado durante a LHA .................................................................................. 34 3. Materiais e Métodos .......................................................................................................... 35 3.1. Animais .............................................................................................................................. 35 3.2. Modelo murino para lesão hepática aguda induzida por sobredose de acetaminofeno ......................................................................................................................... 35 3.3. Análise histológica do fígado ...................................................................................... 36 3.4. Atividade da enzima alanina aminotransferase ..................................................... 36 3.5. Ensaio de depuração do verde de indocianina ...................................................... 36 3.6. Isolamento das células não parenquimais hepáticas ........................................... 37 3.7. Citometria de Fluxo ........................................................................................................ 37 3.8. Cultivo de Escherichia coli .......................................................................................... 38 3.9. Opsonização in vitro de Escherichia coli................................................................. 38 3.10. Desafio bacteriano e ensaio de Unidades Formadores de Colônia ................ 39 3.11. Ensaio de remoção de bactérias circulantes do sangue ................................... 39 3.12. Monitoramento das bactérias no fígado em tempo real .................................... 39 3.13. Depleção farmacológica das Células de Kupffer ................................................. 39 3.14. Microscopia Intravital Confocal ................................................................................ 40 3.15. Ensaio de imunofluorescência ................................................................................. 41 3.16. Derivação de macrófagos a partir de precursores da medula óssea ............ 41 3.17. Análise de expressão de mRNA por PCR em tempo real .................................. 42 3.18. Terapia celular com MDMO ........................................................................................ 43 3.19. Mineração de dados .................................................................................................... 43 3.20. Análise de dados e estatística .................................................................................. 44 4. Resultados ........................................................................................................................... 45 4.1. A lesão hepática aguda induzida pela sobredose de APAP promove dano ao parênquima e disfunção hepática ...................................................................................... 45 4.2. A inflamação gerada pela LHA é predominantemente neutrofílica, com alterações significativas em outras populações de células mieloides mononucleares ....................................................................................................................... 45 4.3. A redução populacional das células de Kupffer abre um importante nicho hepático .................................................................................................................................... 50 4.4. A redução na população de KCs durante a fase aguda ocorre predominantemente por apoptose .................................................................................... 55 4.5. O nicho disponibilizado pela morte das KCs durante a fase aguda é ocupado pela entrada de dois tipos celulares diferentes ............................................................. 56 4.6. A LHA provoca uma janela de susceptibilidade a infecções ............................. 61 4.7. A capacidade hepática de filtrar o sangue se encontra reduzida na fase aguda da LHA .......................................................................................................................... 63 4.8. As células de Kupffer são essenciais para o fígado exercer sua função imunológica primária ............................................................................................................ 66 4.9. A fagocitose de bactérias pelas células de Kupffer é prejudicada durante a LHA…. ....................................................................................................................................... 68 4.10. O perfil transcricional dos monócitos presentes nas áreas de necrose indica uma incapacidade de responder a patógenos circulantes ............................ 71 4.11. A deficiência na captura de bactérias não ocorre por falta de opsonização das bactérias circulantes por anticorpo ou moléculas do sistema do complemento ........................................................................................................................... 78 4.12. A terapia celular com macrófagos derivados de medula óssea melhora o quadro histopatológico e a capacidade hepática de filtrar o sangue ...................... 80 5. Discussão............................................................................................................................. 88 6. Conclusão .......................................................................................................................... 100 7. Referências Bibliográficas ............................................................................................ 101 8. Anexos ................................................................................................................................ 118 8.1. Artigo submetido - Primeiro autor .......................................................................... 118 8.2. Artigo publicado – Coautor ...................................................................................... 120 8.3. Doutorado Sanduíche no Exterior ........................................................................... 121 8.4. Produções bibliográficas durante período de doutorado ................................. 124 22 1. Introdução O fígado é um órgão complexo e importante na manutenção da homeostase do organismo. A estrutura hepática é formada pela repetição de unidades anatômicas hexagonais denominadas lóbulos hepáticos (Ilustração 1), sendo que cada um apresenta aproximadamente 0,5 mm de diâmetro em camundongos e 1 mm em humanos (Teutsch, 2005). Devido a sua localização, o fígado recebe sangue proveniente de duas fontes diferentes: ele recebe um grande volume sanguíneo através da veia porta, cerca de 80%, com pouco oxigênio e rico em nutrientes, provenientes do intestino; já pela artéria hepática, recebe, em menor volume, sangue oxigenado (Vollmar and Menger, 2009). Em adição, a estrutura lobular faz com que o sangue chegue no lóbulo hepático pela tríade portal e em seguida percorra os capilares sinusoides até alcançarem o centro do lóbulo e por fim, seja drenado pela veia centro-lobular após passar pelos capilares sinusoides. Nos capilares o sangue circula em baixa pressão e tensão de oxigênio e possibilitando, dessa forma, um contato íntimo e prolongado com os componentes células hepáticos (Ilustração 1). Em termos funcionais, o órgão desempenha funções metabólicas como a manutenção dos níveis séricos de glicose; o metabolismo e detoxificação de medicamentos; a síntese e transporte de colesterol; e também metabolismo de ferro (Ben-Moshe and Itzkovitz, 2019). Além disso, também desempenha funções imunológicas, sendo responsável pela produção de proteínas de fase aguda e do sistema do complemento; e pela remoção de moléculas e microrganismos derivados do intestino (Kubes and Jenne, 2018). Além de tudo, essa heterogeneidade funcional é dividida ao longo das diferente zonas que constituem os lóbulos hepáticos e exercida pelo diversos componentes celulares (Ilustração 1) (Ben- Moshe and Itzkovitz, 2019; Jenne and Kubes, 2013). O parênquima hepático é majoritariamente composto pelos hepatócitos, representando cerca de 60% de todas as células do fígado. Essas células se organizam em cordões margeados por capilares sinusoides, distribuídos ao longo das unidades lobulares hepáticas que compõe o órgão (Hoehme et al., 2010). Suas funções incluem a produção de diversas moléculas, entre elas, angiotensina, trombopoietina, albumina, bile, proteínas de fase aguda e do complemento. Além disso, possuem papel importante na detoxificação de 23 substâncias endógenas, como amônia e hormônios esteroides, e substâncias exógenas, como fármacos, toxinas e álcool (Ilustração 1) (Rossaint and Zarbock, 2013). Já os capilares sinosóides são compostos por células endoteliais sinusoidais (LSECs), tipo este que possui características particulares quando comparadas ao endotélio convencional. Elas são finas e não possuem lâmina basal, e apresentam, junto à célula adjacente, um espaço denominado fenestra, tornando, portanto, a unidade dos capilares fenestrada (Ilustração 1). Essa disposição e morfologia permitem um contato mais íntimo entre o conteúdo que está presente na circulação e os hepatócitos, assim, maximizando a funcionalidade dessas células (Ben-Moshe and Itzkovitz, 2019). Além das células endoteliais, outras células não parenquimais compõe o órgão, sendo as células imunes a maior parte delas. O nicho imune hepático é composto por células do sistema imune inato, incluindo macrófagos, monócitos, células dendríticas e células natural killer e células do sistema imune adaptativo, que incluem linfócitos T e B (Ilustração 2) (Kubes and Jenne, 2018). O pleno funcionamento do órgão é crítico na defesa contra infecção por via sanguínea, com papel na detecção e remoção de patógenos (Jenne and Kubes, 2013). A Ilustração 1. Organização do fígado, aporte sanguíneo e funções de cada componente. O fígado é formado pela repetição de unidades hexagonais denominadas lóbulos hepáticos que são compostos por cordões de hepatócitos delimitados pelos capilares sinusoides, formadas pelas LSECs (LEC), e subdividido em espaço periportal e espaço centro-lobular. O sangue chega pela região periportal, através da artéria hepática (artéria portal, portal artery) e da veia porta (portal vein) carregando uma diversidade de moléculas – específicas para cada origem-, em seguida, flui pelos sinusoides, em taxa lenta e baia pressão, até chegar a veia centro-lobular (central vein) no espaço pericentral. Cada componente hepático realiza funções altamente especializadas, dessa forma, contribuem para heterogeneidade função do fígado. Adaptado de Itzkovitz S., Nature Reviews, 2019; e Kubes, P., Annual Review of Immunology, 2018 24 capacidade do fígado de detectar e responder aos organismos infecciosos e moléculas agressoras deve-se à sua anatomia, localização e às populações de células que residem no órgão, projetado especificamente para maximizar a vigilância imunológica, uma vez que é continuamente exposto a compostos, derivados tanto da circulação sistêmica quanto do intestino. Ilustração 2. Diversidade de células imunes que compões o nicho imune hepático. Imagem ilustrativa de microscopia intravital confocal do fígado de camundongos adultos, mostrando: os cordões de hepatócitos (autofluorescência em verde); células iNKT (verde, iNKT cells); células T CD8+ (azul claro, CD8+ T cells); células T CD4+ (azul escuro, CD4+ T cells); neutrófilos (roxo, neutrophils); monócitos (amarelo, monocytes); e células de Kupffer (vermelho, Kupffer cells). Adaptado de Kubes, P., Annual Review of Immunology, 2018. Um componente essencial, tanto para as funções metabólicas quanto imunológicas hepáticas, consiste na população de macrófagos residentes presentes no órgão. Descritos pela primeira vez por Karl von Kupffer em 1876 como células estreladas integrantes do endotélio sinusoidal (Kupffer, 1876), receberam o nome de células de Kupffer após a descrição dos macrófagos por Élie Metchnikoff (Metschnikoff, 1891) e a identificação dessas células hepáticas como macrófagos por Browicz (Browicz, 1899). As células de Kupffer (KCs) representam o maior componente do nicho imune hepático (Bonnardel et al., 2019; Guilliams et al., 2022). O desenvolvimento dessas células se inicia durante a embriogênese através de progenitores eritro-mieloides presentes no saco vitelínico que migram para o fígado fetal, onde diferenciam-se em pré- macrófagos e macrófagos e passam por um processo de maturação até a primeira semana de vida, quando adquirem características de células de Kupffer. Elas se mantêm no órgão, desde o nascimento até a idade adulta, em virtude da 25 sua capacidade de auto renovação, sendo apenas uma pequena parcela derivada de monócitos da medula (Ginhoux and Guilliams, 2016; Liu et al., 2019; Mass et al., 2016). Em um indivíduo adulto, fatores teciduais, como fator estimulador de colônia 1 (CSF-1), TGF-β e desmosterol mantêm as características celulares das KCs e estimulam a manutenção do nicho (Bonnardel et al., 2019; Sakai et al., 2019). As células de Kupffer estão localizadas dentro dos sinosóides hepáticos, sobre as LSECs (Ilustração 3). Além disso, elas apresentam prolongamentos para o espaço de Dissé, possibilitando um íntimo contato com outras células, principalmente com os hepatócitos. Tal localização estratégica deixa as KCs diretamente expostas ao fluxo sanguíneo, permitindo a fagocitose de conteúdo direto da microcirculação hepática, e tornando-as responsáveis pela reciclagem de ferro, remoção de restos celulares e controle de microrganismos, metabólitos microbianos e partículas associadas à patógenos (Ilustração 3) (Krenkel and Tacke, 2017; Kubes and Jenne, 2018). Por meio da microscopia confocal intravital, foi reportado que as bactérias presentes no sangue, ao chegarem ao fígado, são rapidamente fagocitadas pelas KCs (David et al., 2016). Portanto, as KCs são as principais células responsáveis pela filtragem do sangue e controle de patógenos circulantes. Essa função de filtro é constante ao longo do dia (Gonzalez et al., 2017), impedindo que grandes quantidades de lipopolissacarídeo (LPS), restos celulares e microrganismos da microbiota atinjam a circulação sistêmica, prevenindo a disseminação de patógenos em condições homeostáticas e de doença, evitando assim quadros inflamatórios sistêmicos (Balmer et al., 2014; Seki et al., 2000; Thomson and Knolle, 2010; Toth and Thomas, 1992). 26 O processo de fagocitose foi descrito pela primeira vez na década de 1880 por Élie Metchnikoff. O próprio pesquisador expandiu esses conhecimentos para as áreas de patologia comparada e imunologia celular e foi, em 1908, coroado com o prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina, prêmio este divido com Paul Ehrlich – considerado o pai da resposta imune humoral. Desta forma, foi estabelecido que os fagócitos constituem a primeira linha de defesa contra infecções agudas para uma diversidade de organismos. Anos depois, a rede de fagócitos foi definida como sistema retículo-endotelial, responsável pela função de filtro ou limpeza da circulação (Yona and Gordon, 2015). Na década de 70, a nomenclatura foi alterada para sistema de fagócitos mononucleares (van and Cohn, 1968; van Furth et al., 1972). Após a década de 90, um segundo termo foi cunhado, essas células foram designadas como fagócitos profissionais (Rabinovitch, 1995), grupo esse que compreende tanto os fagócitos mononucleares (macrófagos, monócitos e células dendríticas), quanto as células polimorfonucleares (neutrófilos e eosinófilos) (Gordon, 2016). Atualmente, o enfoque tem sido a análise individualizada de cada tipo celular, devido a melhor descrição e classificação baseando-se na origem, posicionamento, fenótipo e função (Guilliams et al., 2014; Yona and Gordon, 2015). Ilustração 3. As células de Kupffer se encontram estrategicamente posicionadas sobre as LSECs, dentro dos capilares sinusoides. A localização das KCs permite um íntimo contato com o sangue e todo material circulante, fazendo com que desempenhem uma gama de funções tanto metabólicas quanto imunológicas. Adaptado de Mowat A., Nature Medicine, 2017. 27 Independentemente da nomenclatura adotada, os macrófagos residentes de cada tecido são os que apresentam a maior capacidade fagocítica durante a homeostase, em comparação as demais células imunes (Gonzalez et al., 2017; Gordon, 2016). Para cumprir essa função no ambiente hepático, as células de Kupffer apresentam em sua superfície receptores responsáveis para internalização de partículas e microrganismos, entre eles o FcγR (receptores do tipo Fcγ), CRIg (receptor do complemento da superfamília das imunoglobulinas; Complement receptor of the immunoglobulin superfamily), utilizados, inclusive, como marcadores para identificação das KCs (Bleriot et al., 2020; Guilliams et al., 2022). Como dito anteriormente, os monócitos e neutrófilos também são relevantes para o grupo de fagócitos profissionais. Essa células são encontradas em movimento dentro dos capilares sinusoides, dando a ideia de estarem patrulhando o tecido e serem transitórias no fígado (Kubes and Jenne, 2018). Durante estado estacionário, a quantidade de neutrófilos circulantes é muito pequena. Porém durante insultos ao tecido hepático, principalmente nos processos inflamatórios de caráter agudo, eles são rapidamente recrutados ao tecido (Jenne and Kubes, 2013; McDonald et al., 2010). Ao chegarem ao local, atuam de forma tempo dependente, sendo que inicialmente eles são responsáveis por amplificar a lesão hepática (Alvarenga et al., 2018; Marques et al., 2012), por outro lado, na fase resolutiva, contribuem no processo de resolução da lesão (Mattos et al., 2020). Os monócitos também são encontrados em baixos números no tecido hepático durante a homeostase. Assim como os neutrófilos, o recrutamento dos monócitos ocorre durante processos inflamatórios teciduais e suas funções são tempo-dependentes (Shi and Pamer, 2011). Porém, ao contrário deles, as populações de monócitos tem maior plasticidade, podendo ser subdividas em conjuntos distintos com base em marcadores de superfície e em suas funções (Shi and Pamer, 2011). Nos estágios iniciais da inflamação hepática, gerados por diferentes insultos, são recrutados monócitos denominados pró- inflamatórios, caracterizados pela expressão dos marcadores Ly6C em altos níveis (Ly6Chi), CD11b+, CCR2+, e baixa ou nenhuma expressão de CX3CR1 (CX3CR1-/lo) (Dal-Secco et al., 2015; Shi and Pamer, 2011; Triantafyllou et al., 2018b). Os marcadores não são importantes somente para imunofenotipagem, 28 o CCR2, por exemplo, é essencial para saída dessas células da medula óssea e chegada ao tecido (Serbina and Pamer, 2006). Uma vez no tecido, os monócitos pró-inflamatórios, assim como os neutrófilos, promovem dano tecidual ao liberaram enzimas para degradação de matriz extracelular, e também citocinas inflamatórias (Dal-Secco et al., 2015; Shan and Ju, 2020). Durante a fase resolutiva, outro subtipo de monócito está presente de forma dominante no fígado, os chamados monócitos pró-resolutivos, caracterizados por Ly6C em baixa expressão (Ly6Clo), CD11b+, CX3CR1+, e baixa ou nenhuma expressão de CCR2 (CCR2-/lo) (Dal-Secco et al., 2015; Shi and Pamer, 2011; Triantafyllou et al., 2018b). O CX3CR1 é crucial tanto para a sobrevivência desses monócitos quanto pelo posicionamento deles no tecido (Auffray et al., 2007; David et al., 2016; Hanna et al., 2011). Essa células são importantes no retorno à homeostase e são as grandes responsáveis pela produção de VEGF, TGF-β e IL-10, fatores que reduzem a inflamação e induzem a proliferação de componentes perdidos durante a inflamação (Dal-Secco et al., 2015; Zigmond et al., 2014). Um ponto ainda em discussão na literatura é se o recrutamento do monócitos ocorre em 2 ondas, uma em cada fase da inflamação hepática (Shi and Pamer, 2011; Zigmond et al., 2014) ou se há a conversão dos monócitos inflamatórios em monócitos pró-resolutivos no fígado (Dal-Secco et al., 2015; David et al., 2016; Kratofil et al., 2017). Os processos inflamatórios hepáticos podem originar-se de diversas formas. Como falado anteriormente o fígado está estrategicamente posicionado na interface entre o trato gastrointestinal e a circulação sistêmica, recebendo, por tanto, via circulação uma variedades de moléculas ou organismos com potencial de causar injúrias ao tecido (Ben-Moshe and Itzkovitz, 2019). Assim, o órgão atua na captura, metabolização e eliminação dessas moléculas. Porém, em certas situações, esses processos estão suscetíveis a falhas o que pode promover lesões hepáticas (Asrani et al., 2019). As lesões podem ocorrer em decorrência de processos infecciosos (Kubes and Jenne, 2018), ou podem ser lesões estéreis, quando não há um agente infeccioso – como por exemplo a lesão hepática causada pelo consumo excessivo de álcool (Kubes and Mehal, 2012). Outra forma de classificar as lesões é de acordo com sua progressão e duração, sendo divididas em injúrias agudas, com rápido desenvolvimento e 29 duração curta, e lesões crônicas, quando há um estabelecimento mais lento e uma duração longa (Asrani et al., 2019). O processo de lesão tecidual faz com que o microambiente hepático acumule mediadores, liberados por células ativadas, e partes de células mortas que, em conjunto, são capazes de modular o fenótipo das KCs. A plasticidade fenotípica das KCs faz com que elas possam atuar tanto promovendo quanto restringido a inflamação, além de contribuírem paro o retorno à homeostase. (Shan and Ju, 2020). Entretanto, um acontecimento em comum em diversos processos inflamatórios hepáticos, sejam eles gerados por infecções virais (Borst et al., 2017), protozoários (Beattie et al., 2016; Lai et al., 2018), ou infecções bacterianas (Bleriot et al., 2021), é a redução significativa na população de KCs. Esse fenômeno não está restrito somente a quadros infecciosos, mas também ocorre na esteatose hepática não alcoólica (Devisscher et al., 2017; Tran et al., 2020) e na doença alcoólica hepática (Wang et al., 2014). Em todos esses casos, a redução da população leva a uma abertura do nicho ocupado pelas KCs. Os monócitos, após infiltrarem no tecido, podem ocupar esse nicho de forma transitória ou até mesmo se diferenciarem em macrófagos (Beattie et al., 2016; Scott et al., 2016). Ainda, dependendo do status do nicho, podem se diferenciar em KCs, adquirindo seu perfil transcricional e sua funcionalidade (David et al., 2016; Scott et al., 2016). Além dos monócitos, as próprias KCs remanescentes podem, por auto renovação, dar origem a novas KCs durante processos inflamatórios (Bleriot et al., 2015), assim como ocorre no estado estacionário (Bonnardel et al., 2019; Liu et al., 2019). Dessa forma, infere-se que pode haver uma contribuição por duas vias para reposição desse nicho ou uma competição para ocupação do mesmo (Guilliams and Scott, 2017), e que os fatores teciduais contribuem fortemente para determinar os rumos dessa ocupação (Bleriot et al., 2020; Bonnardel et al., 2019; Guilliams and Scott, 2017). Entre as lesões hepáticas, as que manifestam-se de forma aguda são as de pior prognóstico, devido às limitações no diagnóstico, necessidade de tratamento rápido e escassez de terapias (Stravitz and Lee, 2019). As lesões hepáticas agudas (LHA) possuem uma variedade de causas, que vão desde infecções virais ou bacterianas, condições genéticas hereditárias – doença de 30 Wilson – e até mesmo induzida por consumo excessivo de medicamentos (Asrani et al., 2019). Essa última, denominada lesão hepática induzida por medicamentos (DILI, do inglês Drug induced liver injury) compreende uma das principais causas e apresenta pior prognóstico (Fisher et al., 2015), sendo o acetaminofeno (APAP, Paracetamol) um dos principais causadores e o mais estudado (Asrani et al., 2019; Fisher et al., 2015; Lee, 2017). O APAP, quando consumido, será internalizado pelos hepatócitos e biotransformado no retículo endoplasmático liso. Quando administrado em doses terapêuticas, até 4g por dia para um indivíduo adulto, a maior parte é convertida em glucuronídeos inativos pela enzima glucuronil transferase. O restante será: I) conjugado à grupos sulfato pela enzima sulfotransferase; II) metabolizado via citocromo P450 gerando um composto intermediário que será conjugado à glutationa para excreção (Ilustração 4) (Means and Ho, 2019). Por outro lado, quando há uma sobredose, a principal via que é a de glucoronidação, fica saturada, e o excesso é deslocado para se metabolizado via citocromo P450. Em condições normais, o produto da reação, o N-acetil-p- amino-benzoquinonaimina (NAPQI), é conjugado à glutationa, e posteriormente eliminado (Means and Ho, 2019). Porém, em situações de sobredose ocorre o esgotamento dos estoques de glutationa dentro dos hepatócitos, o que leva ao acúmulo do composto intermediário NAPQI nos hepatócitos. Esse composto acumulado liga-se a grupamentos de cisteína de diversas proteínas (Ilustração 4)., entre elas proteínas mitocondriais, gerando um estresse oxidativo no interior dessas células (Jaeschke and Ramachandran, 2020b), que leva, por fim, à necrose dos hepatócitos. A morte dos hepatócitos, que ocorre principalmente nas áreas centro-lobulares, onde o APAP é metabolizado (Ben-Moshe and Itzkovitz, 2019; Means and Ho, 2019), promove a liberação de padrões moleculares associados a danos (DAMPs), o aumento dos níveis séricos das aminotransferases e a destruição da vasculatura hepática (Jaeschke and Ramachandran, 2020a; Yang et al., 2017), levando, consequentemente, à perda 31 das funções hepáticas, como por exemplo a capacidade de depuração de moléculas exógenas (Alvarenga et al., 2018). A LHA induzida por sobredose de APAP é uma doença que necessita de diagnóstico precoce para que o tratamento seja eficaz. Quando o diagnóstico ocorre em um estágio inicial, a terapia com N-acetilcisteína (NAC) é eficiente – se aplicada nas primeiras 12 horas após sobredose. Por outro lado, em casos de diagnóstico tardio ou com diagnóstico inconclusivo/ausente, tal terapia apresenta menor eficácia (Lee, 2017). Nesses situações, de atraso na apresentação a uma unidade de terapia, ou de ineficiência do tratamento, o paciente pode evoluir apara um caso de falência hepática aguda. Esse extremo gera a necessidade de um transplante hepático, uma terapia que, nas últimas décadas, elevou de 20% para aproximadamente 70% a taxa de sobrevivência dos pacientes – porém, ainda assim, a taxa de óbito é considerável, ocorrendo em 28% dos casos de FLH promovida por sobredose de APAP (Stravitz and Lee, 2019). Ainda, um problema recorrente, que agrava ainda mais o quadro dos pacientes com FHA, é o desenvolvimento de quadros infecciosos, o que impede Ilustração 4. O processo de biotransformação do APAP pelos hepatócitos. Preferencialmente, em doses terapêuticas, o APAP passa pela reação de glucoronidação (UGT, APAP-G) e a de sulfatação (PAPS, APAP-S), outra pequena parte é metabolizada via citocromo P450 (CYP), formando o NAPQI, que será conjugado a glutationa (GSH, glutathione) e, por fim, detoxificado (detoxification). Porém, em sobredosagem, há um excesso de NAPQI que forma conjugados tóxicos (toxic adducts) ao se ligarem a grupos cisteína (cysteine) de proteínas celulares. Adaptado de Means, A., Drug Metab. and Pharmaco., 2019. 32 que os pacientes recebam o transplante hepático. Cerca de 40% dos óbitos são causados por infecção bacteriana – e nem mesmo tratamentos com antibióticos conseguem reduzir a incidência de infecções sistêmicas (Karvellas et al., 2014; Karvellas et al., 2009; Rolando et al., 1990; Rolando et al., 1996; Wyke et al., 1982). Como abordado anteriormente, a morte necrótica dos hepatócitos durante a fase aguda da lesão promove a liberação de DAMPs que são chaves para o recrutamento de células imunes. Inicialmente há infiltrado de neutrófilos, que atuam no estabelecimento da lesão (Marques et al., 2012; Marques et al., 2015b; Mattos et al., 2020; McDonald et al., 2010), e, em seguida, há recrutamento de monócitos pró-inflamatórios (Ly6ChiCCR2+), que também atuam no processo lesivo (Mossanen et al., 2016). Esse recrutamento de diversos fagócitos na fase aguda da lesão é simultâneo à redução de células de Kupffer (Zigmond et al., 2014), levando, assim, à perda do principal fagócito hepático responsável pela captura e eliminação de patógenos circulantes. Dessa forma, mesmo com um infiltrado de monócitos e neutrófilos, a capacidade hepática de controle bacteriano pode estar prejudicada, promovendo os quadros infecciosos que acometem os pacientes (Karvellas et al., 2009). Nos casos em que o paciente sobrevive à LHA, a lesão é auto-remissiva, ou seja, o ambiente inflamatório torna-se resolutivo. Nesse período há uma dominância de um perfil de monócitos pró-resolutivos (Ly6CloCXCR1+), que atuam no processo de retorno à homeostase (Zigmond et al., 2014). Porém, para LHA induzida por sobredose de APAP, esse processo não está completamente estabelecido, - principalmente no que diz respeito à recuperação funcional das células de Kupffer e à origem das novas células que repõe o nicho. Essas células, independentemente de originarem-se de auto renovação (Zigmond et al., 2014) ou diferenciação de monócitos (Bleriot et al., 2015; Scott et al., 2016), necessitam de um processo de educação tecidual e maturação até o retorno completo às suas características e funções na homeostase (David et al., 2016; Sakai et al., 2019; Scott et al., 2016; Zigmond et al., 2014). Assim, é de se esperar que, durante esse período de resolução da lesão, a homeostase hepática não tenha retornado e, consequentemente estendendo a janela de susceptibilidade a infecções. 33 Considerando a escassez de terapias disponíveis para tratamento da LHA, e a incidência de infecções sistêmicas nos pacientes, entender a relação e entender a dinâmica do nicho hepático ocupado pelas células de Kupffer durante a LHA é de extrema importância. Compreender o processe, desde o desaparecimento das células, na fase aguda, até o retorno populacional, a partir da fase resolutiva, pode explicar a susceptibilidade a infecções e criar novas abordagens terapêuticas. 34 2. Objetivos 2.1. Objetivo geral: Determinar a dinâmica do nicho hepático ocupado pelos macrófagos hepáticas e sua importância no controle de patógenos circulantes e durante a lesão hepática aguda induzida por sobredose de medicamento 2.2. Objetivos específicos: 2.2.1. Estabelecer o modelo de lesão hepática aguda por sobredose de acetaminofeno. 2.2.2. Avaliar a dinâmica populacional das células de Kupffer durante todo o processo inflamatório da LHA. 2.2.3. Determinar a dinâmica, posicionamento e o perfil transcricional dos monócitos recrutados durante nosso modelos de LHA 2.2.4. Caracterizar a susceptibilidade a infecções durante a cinética da LHA. 2.2.5. Avaliar o papel das células de Kupffer na remoção de bactérias circulantes durante a cinética da lesão. 2.2.6. Acelerar o processo de resolução da lesão, restabelecendo o controle de patógenos pelo fígado durante a LHA 35 3. Materiais e Métodos 3.1. Animais Foram utilizados camundongos fêmeas da linhagem C57BL/6J entre 8-10 semanas de idade provenientes do Centro de Bioterismo do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (CEBIO/ICB). Também utilizamos camundongos fêmeas de 8-10 semanas com o genótipo CX3CR1+/gfpCCR2+/rfp obtidos a partir do cruzamento dos animais CX3CR1gfp/gfp (B6.129P(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J) com os animais CCR2rfp/rfp (B6.129S4-Ccr2tm1Ifc/J), no Biotério do Laboratório de Imunofarmacologia – ICB/UFMG. Ademais, camundongos fêmeas da linhagem LysM+/creRosa26+/tdTomato de 4-6 semanas de idade também obtidos do Biotério do Laboratório de Imunofarmacologia – ICB/UFMG, e gerados a partir do cruzamento entre as linhagens LysMcre/cre (B6.129P2-Lys2tm1(cre)lfo/J) e Rosa26tdTomato/tdTomato (B6.Cg-Gt(Rosa)26Sortm14(CAG- tdTomato)Hze/J). Os animais foram acondicionados em microisoladores de polipropileno, (Alesco®, Monte Mor, SP, BR) no Biotério de Imunofarmacologia do ICB-UFMG, com água e ração ad libitum em condições controladas de temperatura (25ºC) e luminosidade (ciclo claro/escuro de 12/12h), durante todo período com exceções a serem mencionadas posteriormente. O protocolo de anestesia dos animais é uma mistura de dois anestésicos, combinação de Ketamina 10% (60mg/kg, Syntec, Tamboré, SP, BR) e Xilazina 2% (15 mg/kg, Syntec), com administração subcutânea. A eutanásia é realizada com uma sobredose de anestésico, seguida por deslocamento cervical. Os procedimentos éticos foram aprovados pelo Comitê de Ética de Uso Animal da UFMG, protocolos 377/2016 e 076/2020. 3.2. Modelo murino para lesão hepática aguda induzida por sobredose de acetaminofeno Para indução da lesão os animais foram mantidos em jejum por um período de 15 horas antes do tratamento. Após esse tempo, receberam por via oral 600mg/kg de acetaminofeno (APAP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) em salina 0,9% estéril, ao passo que os animais controles receberam pela mesma via um volume equivalente do veículo (Liu et al., 2006; Marques et al., 2012). A sobrevivência dos animais após indução da lesão foi observada no intervalo de 6 horas em 6 horas até o décimo quinto dia. Para os demais ensaios, a cinética 36 da lesão foi avaliada nos seguintes tempos 12, 24, 48 e 72 horas, 7 e 15 dias após indução da lesão. 3.3. Análise histológica do fígado Para análise histológica, os fragmentos hepáticos foram coletados e fixados em formaldeído 4%, em seguida desidratados em álcool e embebido em parafina. Em seguida, foram realizados cortes de 4µm de espessura utilizando um micrótomo e os cortes foram marcados utilizando hematoxilina e eosina (H&E). As imagens foram adquiridas usando as lentes objetivas de 4x no microscópio Nikon Ti A1R (Nikon, Shinagawa, Tokyo, Japan). A histopatologia hepática foi realizada por análise de duplo cego e gerado um escore histopatológico baseado na integridade do parênquima, quantidade e tamanho das áreas de necrose, e presença de infiltrado inflamatório (Kleiner, 2014). 3.4. Atividade da enzima alanina aminotransferase A dosagem da atividade da enzima Alanina Aminotransferase (ALT) no soro foi utilizada para medir de forma indireta a lesão hepática. Para medir essa atividade, amostras de sangue são coletadas e centrifugadas a 1500g por 10 minutos para separar o soro do plasma, então o soro é coletado. Na sequência, a dosagem é feita através de uma cinética enzimática em microplaca de 96 poços (Corning, New York, NY, USA). Para tanto, as amostras de soro foram adicionadas junto com Tampão HEPES pH = 7,8. LDH, L-alanina, NaCl e azida sódica, compondo o substrato, e alfacetoglutarato, NADH e azida sódica, atuando como coenzimas, todos reagentes provenientes do kit (Bioclin, Belo Horizonte, MG, Brasil). Por fim, a placa contendo as amostras é mantida à 37ºC por 50 segundos e, então, lida em espectrofotômetro (Versamax, Molecular Devices, San Jose, CA, EUA) no comprimento de onda de 340nm a 37ºC em intervalos de 1 minuto durante 4 minutos. O resultado é expresso pela média obtida de todas as leituras. 3.5. Ensaio de depuração do verde de indocianina O ensaio de depuração do corante Verde de Indocianina (ICG) foi utilizado para avaliar a função hepática. O ensaio consiste em administração de ICG na concentração de 20mg/kg por via intravenosa, após 20 minutos o sangue é coletado e centrifugado à 1500g por 10 minutos para obtenção do soro. Após a 37 separação, o soro foi colocado em microplacas de 96 poços (Corning) e a concentração de ICG avaliada em espectrofotômetro no comprimento de onda de 800nm (Versamax). 3.6. Isolamento das células não parenquimais hepáticas Visando a obtenção de células não parenquimais hepáticas, os animais foram anestesiados por via subcutânea, seguido da coleta do sangue por exsanguinação via veia femoral e depois os animais foram sacrificados. Em seguida, o fígado foi processado e, então, digerido em meio de cultura RPMI 1640 (Gibco, Billings, MT, USA) suplementado com colagenase VII (1mg/ml, Sigma-Aldrich) por 1 hora a 37ºC sob agitação de 80rpm. Após a incubação, as amostram foram filtradas, em cell strainer de 70µm para a remoção de tecido não digerido, e transferidas para outro tubo. Após serem filtradas, as amostras passam por um processo de centrifugações diferenciais para obtenção das células não parenquimais hepáticas: I) 400g por 5 minutos a 4ºC seguido do descarte do sobrenadante e o material sedimentado resuspendido em meio de cultura; II) 60g por 3 minutos a 4ºC seguido da coleta do sobrenadante e III) 400g por 5 minutos a 4ºC seguido do descarte do sobrenadante, e as hemácias lisadas usando solução de cloreto de amônio (ACK) para obtenção de uma suspensão limpa e com somente células não parenquimais isoladas. Por fim, as células foram contadas utilizando azul de tripan ou cristal de violeta e 106 células usadas para citometria de fluxo. 3.7. Citometria de Fluxo Após o isolamento das NPCs, 1x106 células de cada amostra foram incubas com marcador de viabilidade celular, Fixable Viability Stain 510 (BD Biosciences, Franklin Lakes, New Jersey, USA), por 15 minutos a temperatura ambiente. Em seguida, incubação por 5 minutos a 4ºC com Fc block Fc-γ III/II CD16/32 (clone 2.4G2; BD Biosciences), e após esse tempo foi performada a marcação para moléculas de superfície por 30 minutos a 4ºC utilizando os seguintes marcadores: anti-CD45 (clone 30-F11, BD Biosciences), anti-F4/80 (clone T45-2342, BD Biosciences), anti-CD11b (clone M1/70, BD Biosciences), anti-Ly6C (clone AL-21, BD Biosciences), anti-Ly6G (clone 1A8, BD Biosciences). Para avaliação do programa de morte celular, os seguintes marcadores foram utilizados Anexina V (Biolegend, San Diego, CA, USA) e 38 Iodeto de Propídio (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) em tampão fosfato suplementado com HEPES (10mM), NaCl (150mM) e CaCl2 (2,5mM) em pH=7,4 por 20 minutos (Crowley et al., 2016). A citometria de fluxo foi realizada usando o citômetro AccuriTM C6 (BD Biosciences) ou CytoFlex (Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA). 3.8. Cultivo de Escherichia coli As bactérias Escherichia coli (ATCC®25922GFP) foram gentilmente cedidas pelo Dr. Shirong Liu (Harvard Medical School-EUA). A bactéria foi modificada geneticamente para inserção de um plasmídeo com a Proteína Green Fluorescente – GFP, ligado a um promotor com gene de resistência à ampicilina. As bactérias foram cultivadas em caldo Luria-Bertani (Sigma-Aldrich) com adição de ampicilina (100 µg/ml, Sigma-Aldrich) por 12 horas em agitação à 37ºC. Após esse tempo, as bactérias foram lavadas em uma centrifugação à 1500g por 15 minutos. Por fim, a quantidade de bactérias foi determinada por densidade óptica (OD) em 600nm em espectrofotômetro (Versamax), sendo que uma OD igual a 1 corresponde a 8x108 células/ml. 3.9. Opsonização in vitro de Escherichia coli Para realizar a opsonização in vitro, inicialmente, as bactérias foram ajustadas para 1x108 bactérias/ml, em seguida, adicionamos tampão contendo PBS com 1% de BSA e 0,05% de azida sódica. Na sequência, a suspensão foi centrifugada a 3000g por 10 min e esse passo repetido mais uma vez. Então, as bactérias foram resuspendidas em 1ml de Tampão PBS-BSA-Azida e divididas alíquotas em 50µl. Posteriormente, separadas em grupos a serem incubados com soro fresco e inativado provenientes dos animal controle e 24 horas após sobredose de APAP. O soro foi inativado a 56 ºC por 30 min. As bactérias foram incubadas com soro na diluição de 1:50 por 30 min a temperatura ambiente, posteriormente, centrifugadas a 3000g por 10 min e resuspendidas em 50µl. Por fim, quando especificado, utilizamos bactérias opsonizadas in vitro para realização do ensaio de remoção de bactérias circulantes do sangue. 39 3.10. Desafio bacteriano e ensaio de Unidades Formadores de Colônia Os camundongos receberam, por via intravenosa, uma suspensão bacteriana de 5x105 E. coli por 20g de peso do animal em 50µl. Os animais do grupo controle e 24 horas após indução da lesão foram submetidos para avaliação da taxa de sobrevivência e monitorados a cada 3 horas por um total de 30 horas. Para o ensaio de Unidades de Formadores de Colônia (UFC), 24 horas após o desafio, os animais foram anestesiados, em seguida o sangue e o fígado foram coletados, macerados, e por último, cultivados em meio ágar Luria- Bertani (Sigma-Aldrich) contendo ampicilina (100mg/ml, Sigma-Aldrich) por 24 horas à 37ºC. Ao fim do tempo de cultivo as UFC foram quantificadas e normalizadas por volume de sangue em mililitros (ml) e por peso do fígado em gramas (g). 3.11. Ensaio de remoção de bactérias circulantes do sangue A avaliação de remoção bacteriana pelo fígado foi realizada seguindo técnica já utilizada no laboratório (David et al., 2016). Os camundongos receberam, por via intravenosa, uma suspensão bacteriana de 5 x 106 E. coli por 20g de peso do animal em 50µl. Após 5 minutos, os animais são anestesiados e o sangue coletado pela veia hepática e imediatamente diluído em PBS (1:100), por fim, a amostra foi analisada no citômetro de fluxo, BD AccuriTM C6. O resultado é baseado no número de eventos GFP por volume de sangue em microlitros (µl). 3.12. Monitoramento das bactérias no fígado em tempo real O monitoramento em tempo real do deslocamento bacteriano no fígado foi realizado através da microscopia intravital confocal (MIV), descrita em seção específica. Resumidamente, com o camundongo anestesiado e posicionado na plataforma do microscópio foi administrado por via intravenosa 5x107 E. coli por 20g de peso do animal em 50µl. A filmagem se inicia antes 10 segundos antes da injeção e os eventos individuais foram captados durante os primeiros 5 minutos. O monitoramento foi avaliado utilizando o programa NIS-Elements Advanced Research com o módulo NIS.ai (Nikon Instruments). 40 3.13. Depleção farmacológica das Células de Kupffer As Células de Kupffer foram depletadas utilizando injeção intravenosa de lipossomos contendo Clodronato (5mg/ml) com doses de: 12,5mg/kg (50µl/20g), 31mg/kg (125µl/20g), 50mg/kg (200µl/20g) por animal, para obtermos um gradiente de depleção (Van Rooijen and Sanders, 1996). Os animais controles receberam os mesmos volumes de solução salina 0,9%. A depleção foi avaliada 48 horas após o tratamento por Citometria de Fluxo e Microscopia Intravital Confocal. Além disso, os animais são submetidos ao ensaio de remoção bacteriana da circulação. 3.14. Microscopia Intravital Confocal A Microscopia Intravital Confocal (IVM) para visualização in vivo do fígado de camundongos foi realizada conforme descrito anteriormente (Marques et al., 2015a), utilizando microscópio Confocal Nikon Ti A1R equipado com detector espectral e estágio motorizado XYZ (Nikon). Antes do início dos procedimentos, 20 minutos, os camundongos receberam, exceto quando especificado, por via intravenosa anti-F4/80 (clone T45-2342, BD Biosciences) e anti-CD31 (clone 390, Biolegend). Em seguida, quando descriminado, após início da cirurgia os camundongos receberam por via intravenosa Sytox Green (250nmol/Kg, Sigma- Aldrich). Resumidamente, o processo cirúrgico consiste em uma incisão na linha média seguida de laparoscopia para exposição fígados que em seguida é apoiado em um suporte de acrílico compatível com o microscópio. Para gerar os vídeos, adquirimos imagens em intervalos de um frame a cada 10 segundos por 5 minutos em posição XYZ fixada. As imagens foram adquiridas usando objetiva de 20x e definição de pixel de 512x512, e as imagens foram colocadas em sequência para gerar um vídeo por animal. Para reconstrução em 3D, a aquisição em série Z foi realizada em uma objetiva de 20x, adquirindo um intervalo de 60µm entre parte superior e inferior, sendo uma imagem a cada 0,2 µm com definição de pixel de 512x512. Por fim, a aquisição de imagens é realizada em objetiva de 10x e 20x na definição de pixel 1024x1024 sendo 10 imagens de campos por animal. Todo processo foi feito utilizando o programa NIS-Elements Advanced Research com o módulo NIS.ai (Nikon). 41 3.15. Ensaio de imunofluorescência Para os ensaios de imunofluorescência, os animais dos grupos 12, 24 e 72 horas após sobredose de APAP e grupo controle foram anestesiados e sacrificados. Em seguida, fragmentos do fígado foram coletados fixados em paraformaldeido 4% por pelo menos 12 horas. Após esse tempo, os fragmentos foram desidratados em gradiente de Sucrose 10%-30% (massa/volume, PBS) e posteriormente incluídos em Tissue-Tek ® OCT (Sakura, Torrance, CA, USA) para serem congelados a -20ºC até serem processados. O processamento foi feito por cortes congelados em secções de 15μm de espessura. Após o processamento, esperamos os cortes atingirem a temperatura ambiente para serem permeabilizados com solução de PBS contendo Triton X-100 0,5% (v/v) por 15 minutos. Em seguida, os cortes foram incubados com solução de bloqueio, contendo 5% de soro normal de cabra diluído em PBS, por 60 min a temperatura ambiente. Na sequência, realizamos a imunomarcação durante a noite a 4°C com os seguintes anticorpos primários: rato anti-F4/80 (clone T45- 2342, BD Biosciences), coelho anti-caspase 3 clivada (clone 5A1, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), coelho anti-Ki67 (Abcam, Cambridge, UK), diluídos 1:100 em PBS contendo 0.05% Triton X-100. No dia seguinte, os cortes foram lavados com PBS, depois foram incubados novamente com a solução de bloqueio por 60 min. Após o bloqueio, os cortes foram incubados por 90 minutos a temperatura ambiente com o anticorpo secundário cabra anti-coelho conjugado à Alexa Fluor 488 (policlonal, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) diluído 1:200. Seguidamente, a marcação nuclear foi realizada com uso de 4,6- diamidino-2-phenylindole staining (DAPI, Life Technologies). Por fim, as lâminas obtidas foram montadas em glicerol contendo Tris-HCl 0,1M na proporção (9:1) e seladas. A aquisição das imagens foi realizada utilizando microscópio Confocal Nikon Ti A1R e o programa NIS-Elements Advanced Research com o módulo NIS.ai (Nikon), na objetiva de 20x e com definição de 1024x1024. 3.16. Derivação de macrófagos a partir de precursores da medula óssea Os macrófagos foram obtidos a partir da diferenciação de precursores presentes na medula óssea dos animais. Para tanto, os precursores de medula óssea foram recolhidos do fêmur de animais C57BL/6J selvagens ou LysM- 42 tdTomato, lavados colocados em placas de cultura. Os precursores foram cultivados em placas de cultura contendo meio DMEM-12 (Gibco), suplementado com 10% de soro fetal bovino (Gibco), 2mM de L-glutamina (Gibco), 100µg de estreptomicina (Gibco), 100U/l de penicilina, 25mM de HEPES (Sigma-Aldrich), e 20% do sobrenadante de cultura de células L929 como descrito anteriormente (Gonçalves, 2015). Nos dias 3 e 5 após início do cultivo ouve adição e substituição do meio de cultura, respectivamente. Ao final de 7 dias em cultura 4°C na estufa com 5% de CO2, as células foram recolhidas e estimuladas, quando especificado, com IL-4 (20ng/ml, Peprotech, Rocky Hill, NJ, EUA) durante o período noturno na estufa de células para gerar o perfil alternativamente ativado (Murray et al., 2014). Ao final, as os macrófagos derivados de medula óssea (MDMO) sem ativação (ϕ) e alternativamente ativados (A.A) foram ajustados para concentração de 1x106 células/ml para análises posteriores. 3.17. Análise de expressão de mRNA por PCR em tempo real A análise de expressão do RNA mensageiro (mRNA) utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real foi feita para avaliar o perfil de ativação das células. Para isso, o mRNA total foi extraído dos macrófagos derivados de medula óssea sem ativação (MDMO ϕ) e alternativamente ativado (MDMO A.A) utilizando o kit ReliaPrep RNA Miniprep System (Promega, Madison, WI, EUA) seguindo as instruções do fabricante. Após extração, o mRNA total foi quantificado usando um aparelho Nanodrop Lite (Thermo Fisher), seguido da reação de transcrição reversa para obtenção do DNA complementar (cDNA) utilizadon o kit iScript cDNA Synthesis (Biorad, Hercules, CA, EUA) no aparelho Rotor-Gene Q (Qiagen, Hilden, Alemanha) seguindo as instruções do fabricante. Por fim, a PCR em tempo real foi feita no Rotor-Gene Q (Qiagen) e os resultados analisados utilizando 2 -ΔΔCT para determinar o aumento em relação ao gene constitutivo. A expressão de cada gene foi normalizada para a expressão de actb (β-actina) e comparadas aos MDMO A.A. Os genes avaliados e suas respectivas sequências estão na Tabela 1. 43 Tabela 1. Sequência de primers Gene Forward Reverse actinb 5’-AGGTGTGCACCTTTTATTGGTCTCAA-3’ 5’-TGTATGAAGGTTTGGTCTCCCT-3’ chil3 5’-AGAAGGGAGTTCAAACCTGGT-3’ 5’-GTCTTGCTCATGTGTGTAAGTGA-3’ retnla 5’-AATCCAGCTAACTATCCCTCCA -3’ 5’-CAGTAGCAGRCATCCCAGCA-3’ arg1 5’-CTGGCAGTTGGAAGCATCTCT-3’ 5’-CTGGCAGTTGGAAGCATCTCT-3’ 3.18. Terapia celular com MDMO A terapia celular com MDMO foi realizada durante a cinética de lesão hepática aguda induzida por APAP, exatamente 16 horas pós-indução, os camundongos receberam por via intravenosa uma suspensão de MDMO, 1x106 células ativadas ou não em 100µl, pelo plexo orbital. Os grupos, controle e APAP 24 horas, receberam o mesmo volume do veículo, PBS. A terapia foi analisada 8 horas após o tratamento, totalizando 24 horas após o começo do modelo de lesão. Nesse tempo ensaios de citometria de fluxo, histologia hepática, microscopia intravital confocal, e remoção bacteriana do sangue foram realizados conforme descritos previamente. 3.19. Mineração de dados Os dados brutos de expressão gênica foram gerados por ensaio de microarranjos (microarray) e depositados no banco de dados público do National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) com o identificador GSE55606 (Zigmond et al., 2014). Inicialmente, os dados de expressão de chips diferentes foram normalizados computando o RMA (Robust Multichip Average)(Irizarry et al., 2003). Em seguida, a análise de expressão diferencial foi realizada usando modelos lineares, sempre contraste entre dois grupos usando pacote “limma” para programa R (Ritchie et al., 2015). Os p-valores (p.values) foram corrigidos (p.adj) calculando o FDR (False Discovery Rate, ou Benjamini-Hochberg). Os resultados foram considerados significativos quando p.adj < 0,05. Após obtenção do p.adj utilizamos o pacote “clusterProfiler” para programa R (Wu et al., 2021) para fazer enriquecimento de vias através do banco http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ 44 de dados Kegg Pathways (http://www.kegg.jp/) (Kanehisa, 2019; Kanehisa and Goto, 2000). As vias foram consideradas diferencialmente expressa quando p.adj < 0,05 (FDR). Em seguida, a análise de componente principal (PCA) foi feito com base no padrão global de expressão de genes das amostras, para identificar se o perfil de expressão foi capaz de separar os tipos celulares. Análise essa que foi feita usando pacote básico do R e o pacote “factoextra” (Kassmbara, 2020). Por fim, a visualização da expressão gênica de cada via enriquecida foi gerada usando pacote “pathview’ do programa R. 3.20. Análise de dados e estatística Os dados de microscopia foram analisados utilizado o software NIS- Elements Advanced Research (Nikon Instruments). Os vídeos foram formatados e gerados utilizando o software Sony Vegas Pro 16 (Sony, Tokyo, Japan). Os dados de Citometria de Fluxo foram analisados com o auxílio do software FlowJo v10 (BD Biosciences). Os dados dos ensaios bioquímicos foram analisados utilizando o programa SoftMax v5.4.1 (Molecular Devices). Todos os dados quantitativos dados passaram por análise de normalidade, os paramétricos foram apresentados como média ± erro padrão da média (SEM) ou desvio padrão da média (SD) para cada grupo. Para determinar diferenças entre dois grupos, utilizamos o teste t-Student. Nos ensaios de múltiplos grupos realizamos o teste one-Way ANOVA, seguido de pós teste de Tukey para determinar diferenças entre os grupos avaliados. Por outro lado, os dados não paramétricos foram apresentados como mediana, e o teste estatístico utilizado foi o Mann- Whitney, para análises entre duas variáveis, e o Kruskal-Wallis seguido do pós teste de Dunn, para análises entre três ou mais variáveis. Todas as análises estatísticas foram realizadas pelo programa GraphPad Prism versão 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) para Windows 10 (Microsoft). Diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando p<0,05. http://www.kegg.jp/ 45 4. Resultados 4.1. A lesão hepática aguda induzida pela sobredose de APAP promove dano ao parênquima e disfunção hepática A lesão hepática aguda induzida por sobredose de APAP é bem estabelecida em modelo murino, possibilitando o estudo do início, progressão e resolução da inflamação hepática (Marques et al., 2015b; Mattos et al., 2020), e apresenta, parâmetros bem definidos para avaliação da eficácia do modelo (McGill and Jaeschke, 2019). Primeiramente, realizamos a indução da lesão pela administração de APAP (600mg/kg), por gavagem oral, 15 horas após o período de jejum, em camundongos fêmeas da linhagem C57BL/6J (Figura 1A). Observamos uma taxa de mortalidade de 25 % no grupo experimental dentro das primeiras 24 horas (Figura 1B), uma taxa similar à observada em humanos (28%) em casos de sobredose por APAP (Stravitz and Lee, 2019), mostrando assim, a robustez e relevância clínica do modelo utilizado. Em seguida, para melhor avaliarmos os aspectos hepáticos do nosso modelo, realizamos a análise histológica do órgão durante toda a cinética da LHA, uma vez que é uma inflamação tempo dependente. Observamos áreas de necrose ao redor das veias centro-lobulares nos tempos de 12 horas (setas vermelhas) e 24 horas (setas verdes) após indução da lesão – áreas essas que se conectam umas às outras, compreendendo uma grande região do parênquima (Figura 1C). Por outro lado, seguindo a cinética da lesão, no tempo de 72 horas pós-APAP observamos um aspecto resolutivo no tecido hepático (setas azuis), e nos tempos seguintes, 7 e 15 dias, um aspecto similar ao do grupo controle (Figura 1C). A seguir, esses aspectos histológicos foram analisados usando um escore histopatológico, baseado na integridade do parênquima, quantidade e tamanho das áreas de necrose, e presença de infiltrado inflamatório (Kleiner, 2014). Como resultado, observamos um escore elevado na lesão 12 e 24 horas pós-APAP – estabelecendo esses tempos como a fase aguda e o pico da lesão –, seguido da redução com 72 horas – fase resolutiva – e do retorno aos níveis basais 7 e 15 dias (Figura 1D), indicando, assim, a autorresolução da inflamação hepática. Outros aspectos, além dos histológicos, são importantes para determinação da lesão hepática, sendo eles ensaios indiretos que medem 46 biomarcadores no sangue indicativos de injúria no órgão. Na prática clínica dois testes são utilizados para esse fim (McGill and Jaeschke, 2019). Um deles é a dosagem de uma enzima intracelular hepática no soro, a alanina aminotransferase (ALT), indicando a presença de lesão hepática – em situações normais, essa enzima é encontrada apenas no interior os hepatócitos. Observamos um aumento de ALT sérico na fase aguda, 12 e 24 horas após a indução da lesão e, novamente, os níveis retornam ao basais na fase resolutiva, a partir de 72 horas, que se mantém até o final da cinética (Figura 1E). Outro teste baseia-se na avaliação da função hepática de depuração de moléculas. Utilizando a dosagem do verde de indocianina, um corante que, após administração, se liga a proteínas plasmáticas e é eliminado da circulação exclusivamente pelos hepatócitos, encontramos uma capacidade depurativa reduzida no fígado 24 horas pós-APAP, uma vez que maiores quantidade dessa substância foram detectadas no soro dos animais (Figura 1F). Mais uma vez, 72 horas pós-APAP, a capacidade de depuração do verde de indocianina retornou ao nível basal, mostrado pela redução nos níveis séricos do corante (Figura 1F). Concluindo, assim, que em todos os parâmetros avaliados, nas 24 horas iniciais, ocorre o pico da lesão e, a partir de 72 horas, se inicia a remissão da mesma, com a estabilização da sobrevivência, aquisição de aspectos histológicos resolutivos, e retorno dos valores séricos de ALT e ICG ao nível basal. 47 Figura 1. A lesão hepática aguda induzida pela overdose de acetaminofeno promove extensa lesão tecidual com perda de parênquima e formação de extensas áreas de necrose. (A) Esquema da indução de LHA por overdose de acetaminofeno (APAP; 600mg/kg) em camundongos C57BL/6J fêmeas com 8 a 10 semanas de idade. (B) Curva de sobrevivência (%) dos animais após indução de LHA por tempo em horas; n ≥ 9 animais por grupo. (C) Imagens representativas de histologias hepáticas da cinética da LHA coradas por Hematoxilina e Eosina (H&E); escala = 500µm. (D) Escore histopatológico das histologias H&E da cinética da LHA; n ≥ 9 animais por grupo. (E) Avaliação da lesão hepática pela dosagem dos níveis de aspartato aminotransferase (ALT) no soro dos animais; n = 5-15 animais por grupo. (F) Disfunção hepática avaliada pela dosagem do verde de indocianina no soro dos animais; n = 5-9 animais por grupo. Dados representativos de 2 ou mais experimentos. Os resultados estão apresentados como a média ± SEM. * indica diferença estatística entre o grupo indicado e o grupo controle; & indica diferença estatística entre o grupo indicado e o grupo 24h após APAP, usando análise de Mentel-Cox para sobrevivência (B) e one-way Anova seguido do pós-teste de Tukey para as demais análises (D-G). (* e & = p < 0.05). 48 4.2. A inflamação gerada pela LHA é predominantemente neutrofílica, com alterações significativas em outras populações de células mieloides mononucleares Uma vez estabelecido o modelo de LHA, decidimos avaliar o perfil celular mieloide inato no processo inflamatório desencadeado pela sobredose de APAP, já que essas células são as principais células imunes envolvidas em processos inflamatórios agudos. Para tanto, realizamos ensaio de citometria de fluxo, com foco na fase aguda (24 horas iniciais), utilizando a estratégia de gate apresentada na Figura 2A. Em termos de porcentagem, observamos uma redução significativa na proporção da população de células de Kupffer e um aumento expressivo de neutrófilos nos tempos de 12 e 24 horas pós-APAP. Além disso, essa fase é marcada por um grande infiltrado de monócitos inflamatórios (Ly6ChiCD11b+), enquanto há uma pequena redução na porcentagem de monócitos pró-resolutivos (Ly6CloCD11b+) (Figura 2B). Analisando também o número absoluto de células, o mesmo padrão é observado, confirmando que há uma redução populacional nas células de Kupffer, um massivo infiltrado de neutrófilos e altercação do perfil de monócitos para um perfil pró-inflamatório (Ly6ChiCD11b+) (Figura 2C). 49 Figura 2. A LHA gera uma inflamação predominantemente neutrofílica e com alterações significativas nas células mieloides mononucleares. (A) Estratégia de gate utilizada para analisar as células mieloides no fígado dos animais durante a lesão hepática. (B) Porcentagem (%) das diferentes populações mielóides analisadas dentro das células CD45+ vivas durante a fase aguda da injúria hepática induzida pela overdose de acetaminofeno.; n = 3-5 animais por grupo. (C) Número absoluto das subpopulações de células mieloides vivas ajustado para o número total de células hepáticas não parenquimais durante a fase aguda da LHA; n = 3-5 animais por grupo. Dados representativos de 2 ou mais experimentos. Os resultados estão apresentados como a média ± SEM. * indica diferença estatística entre o grupo indicado e o grupo controle usando análise one-way Anova seguido do pós-teste de Tukey para as demais análises (* = p < 0.05). 50 4.3. A redução populacional das células de Kupffer abre um importante nicho hepático Uma vez que observamos por citometria uma redução significativa na população de KCs durante a fase aguda do nosso modelo (Figura 2B e C), decidimos melhor avaliar a dinâmica do nicho de células de Kupffer durante a cinética da LHA. Para isso, inicialmente definimos os parâmetros morfológicos destas células através de MIV, administrando anticorpo anti-F4/80 de forma intravenosa (Figura 3A). A determinação desses parâmetros foi essencial para definir de forma precisa, quais células seria, de fato, células de Kupffer – para além da marcação apenas–, permitindo assim, uma análise mais acurada homogênea, exclusão de outras células F4/80+, como subtipos de monócitos e macrófagos presentes na cápsula que envolve o fígado (Sierro et al., 2017). Assim, foram definidos em duas dimensões os seguintes parâmetros: área das células, aproximadamente 300mm2 (Figura 3B); comprimento celular, em média 50mm (Figura 3C); extensão dos prolongamentos celulares, em torno de 2mm (Figura 3E); e, por fim, a circularidade das células (definida por uma unidade arbitrária), próxima de 0,4 (quanto mais próximo do 0 menor será a circularidade) (Figura 3E). 51 Com os parâmetros morfológicos definidos, utilizamos novamente MIV para visualizar, no tecido, o posicionamento das células de Kupffer e caracterizar sua dinâmica populacional durante a LHA. Para esse fim, utilizamos anticorpos anti-CD31, para marcação da vasculatura hepática, anti-F4/80, para marcação das KCs (David et al., 2016), o corante sytox green, para marcação do DNA extracelular presente nas áreas de necrose (Marques et al., 2015b). Como resultado, o fígado em homeostase apresenta estrutura normal do parênquima, com distribuição homogênea de grânulos de ácido retinóico, excitados utilizando o laser de 405nm e representados pela autofluorescência hepática (azul) (Figura 4A). Além disso, não há presença de DNA extracelular (verde), mas há uma população de células de Kupffer (vermelho) regularmente distribuída dentro da vasculatura hepática (branco) (Figura 4A). Nos estágios iniciais da lesão, 12 e 24 horas pós-APAP, observamos a destruição do parênquima e da vasculatura hepática, com uma massiva deposição de DNA na área de necrose e nos capilares sinusoides remanescentes. Observamos o desaparecimento das células de Kupffer especificamente na área de necrose (Figura 4A). Continuando com a cinética da LHA, a partir de 72 horas, já havíamos observado a remissão da lesão e, por MIV, observamos o retorno da vasculatura e parênquima ao Figura 3. Definição dos aspectos morfológicos das células de Kupffer por MIV. (A) Esquema do modelo murino para overdose de acetaminofeno e marcação das células de Kupffer por injeção intravenosa de anti-F4/80 PE, 20 minutos antes da cirurgia e microscopia intravital. Os seguintes parâmetros das células de Kupffer foram definidos durante a cinética da LHA: área celular (B); comprimento celular (C); prolongamentos celulares (D); circularidade celular (E). n ≥ 3 animais por grupo e 10 imagens por camundongo. Dados representativos de 2 experimentos. Os resultados estão apresentados como a média ± SEM. Análise estatística realizada usando Dados representativos de 2 experimentos. Os resultados estão apresentados como a média ± SEM. 52 estado de homeostase, sendo que somente a população de fagócitos não apresenta ainda a sua distribuição regular pelo fígado (Figura 4A). Nos tempos mais tardios, 7 e 15 dias, o fígado retorna completamente ao estado de homeostase em todos os parâmetros avaliados. Na sequência, novamente utilizamos os padrões morfométricos estabelecidos para as células de Kupffer para quantificar a perda populacional durante a LHA. Observamos que, na fase aguda, a redução populacional é significativa (Figura 4B, painel esquerdo) e gira entorno de 50% de redução em relação ao controle (Figura 4B, painel direito). Como descrito anteriormente, o tempo de 72 horas é uma fase de transição, em que os parâmetros hepáticos estão retornando à normalidade. Isso também foi observado com relação ao número das KCs, que aumenta, aproximando dos valores de homeostase. O nível populacional dessas células retorna no tempo de 7 dias e se mantém no tempo seguinte, indicando completo retorno e estabilidade. Concluímos, assim que a perda populacional ocorre especificamente nas áreas de necrose presentes na fase aguda. Todavia, é transiente e acompanha a remissão da lesão. 53 54 Figura 4. A lesão hepática aguda promove redução na população de células de Kupffer. (A) Imagens representativas de microscopia intravital (MIV) durante o processo de LHA para caracterizar a arquitetura hepática, lesão e células de Kupffer; Parênquima é representado pela autofluorescência hepática em azul; Vasculatura hepática, em branco, marcada por anticorpo anti-CD31 PE; Células de Kupffer marcadas, em vermelho, por anticorpo anti-F4/80 APC; DNA em verde, marcado por sytox green; escala= 50μm. (B) Quantificação das Células de Kupffer por área (B) e variação da população em relação ao Controle (100%) (C); n ≥ 5 animais por grupo e 10 imagens por animal. Dados representativos de 3 experimentos. Os resultados estão apresentados como a média ± SEM. * indica diferença estatística entre o grupo indicado e o grupo controle usando one-way Anova seguido do pós-teste de Tukey. (* = p < 0.05). 55 4.4. A redução na população de KCs durante a fase aguda ocorre predominantemente por apoptose A redução na população dos macrófagos residentes durante um processo inflamatório tecidual é comum a diversos órgãos (Barth et al., 1995; Bleriot et al., 2020; Ginhoux et al., 2017), incluindo o fígado (Bleriot et al., 2015; Borst et al., 2017; Remmerie et al., 2020). Essa redução também foi observada em nosso modelo, o que nos trouxe o questionamento de qual processo de morte celular estaria levando ao desaparecimento das células de Kupffer. Para tanto, decidimos avaliar, inicialmente por citometria de fluxo, utilizando os marcadores anexina V e iodeto de propídio (PI) (Figura 5A), qual o programa de morte celular predominante na fase aguda da lesão. No tempo de 12 horas após sobredose por APAP, a morte por apoptose foi predominante (Anexina V+PI-) em comparação com necroptose (Anexina V+PI+) – também conhecida como apoptose tardia –, e com morte por necrose (Anexina V-PI+) (Figura 5B). Já no tempo de 24 horas pós APAP, a porcentagem de células de Kupffer em apoptose continua significativamente elevada, ao passo que, os demais programas celulares reduzem aos níveis basais (Figura 5B). Em ambos os tempos, quando avaliamos KCs viáveis (Anexina V-PI-), observamos uma redução na porcentagem 12 e 24 horas pós-APAP. Visto a predominância do programa apoptótico nas células de Kupffer no início da LHA, utilizamos a marcação por imunofluorescência, para Caspase-3 clivada, em cortes do fígado para confirmar que a via apoptótica está, de fato, ativa nessas células. Observamos em ambos os tempos, 12 e 24 horas, a marcação para Caspase-3 clivada (verde) colocalizada com a marcação para as células de Kupffer (vermelho) (Figura 5C). Quando, quantificamos essa marcação, notamos um aumento na porcentagem (painel esquerdo) e na quantidade (painel direito) de KCs com o programa apoptótico ativo (Figura 5D), confirmando que a perda populacional desse tipo celular ocorre predominantemente por apoptose. 56 Figura 5. A redução na população de células de Kupffer ocorre predominantemente por apoptose. (A) Estratégia de gate para Anexina V e Iodeto de Propídio (PI) dentro da população de células de Kupffer (F4/80+). (B) Ensaio de citometria de fluxo mostrando o tipo de morte celular das células de Kupffer durante o processo de ALI, dividindo entre as células em apoptose (Superior esquerdo, Anexina V+PI-), células em necrose (Superior direito, Anexina V-PI+), células em necroptose (Inferior esquerdo, Anexina V+PI+), e as células que se mantêm vivas (Inferior direito, Anexina V-PI-); n ≥ 3 animais por grupo. (C) Imagens representativas de marcação por imunofluorescência motrando o núcleo (DAPI, azul), caspase-3 clivada (verde), e células de Kupffer (Vermelho); escala = 20µm. (D) Porcentagem (%, painel esquerdo) e número absoluto (painel direito) de células de Kupffer positivas para caspase 3 clivada; n ≥ 3 animais por grupo e 10 imagens por animais. Dados representativos de 2 experimentos. Os resultados estão apresentados como a média ± SEM. * indica diferença estatística entre o grupo indicado e o grupo controle usando one- way Anova seguido do pós-teste de Tukey. (* = p < 0.05). 57 4.5. O nicho disponibilizado pela morte das KCs durante a fase aguda é ocupado pela entrada de dois tipos celulares diferentes Como observamos anteriormente, a população de células de Kupffer, após sofrer redução durante a fase aguda da LHA, começa a se restabelecer na fase resolutiva e retorna por completo 7 e 15 dias após indução da lesão (Figura 4). Com isso, procuramos se o nicho aberto gerado na fase aguda é ocupado por novas células. Em nossos ensaios prévios de MIV, utilizados para avaliar a dinâmica dessa células na LHA, notamos a presença de aglomerados de células de Kupffer no grupo 72 horas pós-APAP (Figura 6A, quadrado verde). Esses aglomerados no fígado já foram descritos como KCs em multiplicação durante a resolução da inflamação hepática induzida por um quadro infeccioso, em que também há uma perda populacional (Bleriot et al., 2015). Tendo conhecimento disso, buscamos avaliar a capacidade de proliferação das células de Kupffer por meio do ensaio de imunofluorescência. Observamos que os aglomerados de KCs na fase resolutiva apresentam, marcação para Ki67 (Figura 6B, quadrado verde) indicando que eles são formados por células em replicação. A quantificação das imagens revelou um aumento significativo do número e da porcentagem das KCs em multiplicação (Figura 6C), evidenciando que as células remanescentes contribuem para reposição do nicho aberto na fase aguda da LHA. 58 Por um lado, mostramos que as células remanescentes contribuem para ocupação do nicho, por outro, estudos mostraram que em outros modelos de lesão hepática os monócitos podem ocupar o nicho e se diferenciarem em macrófagos residentes (David et al., 2016; Guilliams and Scott, 2017; Scott et al., 2016). Como vimos, na caracterização prévia, por citometria de fluxo, do perfil celular mieloide no processo inflamatório desencadeado pela LHA, há um grande infiltrado de monócitos pró-infamatórios na fase aguda da LHA (Figura 2B e C). Agora, para entender melhor a dinâmica dessas células no fígado, geramos camundongos fluorescentes para os dois principais marcadores de monócitos murinos, os receptores de quimiocinas CX3CR1 e CCR2, nos quais um dos alelos do gene em questão está substituído pelo gene que codifica, Figura 6. As células de Kupffer remanescentes contribuem para reposição do nicho através de proliferação celular. (A) Imagens representativas de MIV para ilustrar os aglomerados de células de Kupffer presentes na fase resolutiva – 72 hours após indução da lesão; escala = 50 µm; n = 4 animais por grupo e 10 imagens por camundongo. (B) Avaliação da proliferação de células de Kupffer 72 horas após overdose de acetaminofeno por imunofluorescência mostrando o núcleo (DAPI, azul), Ki67 (verde), e células de Kupffer (vermelho); escala = 50 µm. (C) Porcentagem (%, painel superior) e número (Painel inferior) de células de Kupffer ou aglomerado de células colocalizados com Ki67; n = 4 animais por grupo e 10 imagens por animal. Dados representativos de 2 experimentos. Os resultados estão apresentados como a média ± SEM. * indica diferença estatística entre o grupo indicado e o grupo controle usando one-way Anova seguido do pós-teste de Tukey. (* = p < 0.05). 59 respectivamente, as proteínas fluorescentes verde (GFP) e vermelha (RFP) - CX3CR1+/gfpCCR2+/rfp. Primeiramente induzimos a lesão nos camundongos gerados (Figura 7A), e assim como nos camundongos selvagens, confirmamos que a lesão que se estabelece e é auto remissiva, pois os níveis de ALT sérico estão aumentados 24 horas e se normalizam 72 horas pós-APAP (Figura 7B). Partimos, então, para visualização das populações de interesse por MIV e encontramos, no tempo de 24 horas, 3 populações de monócitos na extensa área de necrose – definida pelo parênquima hepático alterado (em azul). A população CX3CR1-CCR2+ (em vermelho) possui um perfil pró-inflamatório, corresponde à população de monócitos Ly6ChiCD11b+ mostrada previamente e é predominante em relação às demais. As células duplo positivas CX3CR1+CCR2+ (em amarelo) correspondem a monócitos de perfil transitório, que não identificamos na citometria de fluxo. A última população, representada pelas células CX3CR1+CCR2- (em verde), correspondem aos monócitos pró-resolutivos Ly6CloCD11b+ detectados na citometria (Figura 7C e D). Na fase resolutiva, 72 horas pós-APAP, a lesão limita-se à região perivascular e o fígado apresenta redução na população pró-inflamatória CX3CR1-CCR2+ ao mesmo tempo em que mantém as populações CX3CR1+CCR2+ e CX3CR1+CCR2-, que são pró- resolutivas. Podemos concluir, assim, que a dinâmica dos fagócitos mononucleares no fígado é tempo-dependente, com o predomínio celular variando de acordo com o estágio da lesão. Além disso, observamos que os monócitos que infiltram no tecido, independente do fenótipo, ocupam especificamente as áreas de necrose, que são as regiões desprovidas de células de Kupffer. Em conjunto, esses dados sugerem que o nicho aberto durante a fase aguda da LHA induzida por APAP, é ocupado transitoriamente tanto por monócitos circulantes (que pode posteriormente se diferenciar em macrófagos) quanto por novas KCs originadas da replicação das células remanescentes. 60 Figura 7. Os diferentes subtipos de monócitos recrutados posicionam-se estrategicamente nas áreas de necrose durante o curso da LHA. (A) Esquema da indução da LHA por overdose de acetaminofeno em camundongos fêmeas CX3CR1+/gfp CCR2+/rfp de 8-10 semanas. (B) Avaliação da lesão hepática pela dosagem dos níveis de aspartato aminotransferase (ALT) no soro dos animais; n = 3 animais por grupo. (C) Imagens representativas de MIV ao longo da LHA mostrando em o parênquima (azul, autofluorescência hepática), e as subpopulações de monócitos: CX3CR1GFP/+CCR2-/- em verde, CX3CR1GFP/+CCR2RFP/+ em amarelo e CX3CR1-/-CCR2RFP/+ em vermelho; escala = 100µm. (D) Quantificação das diferentes subpopulações de monócitos: CX3CR1-/-CCR2RFP/+ (painel superior), CX3CR1GFP/+CCR2RFP/+ (painel do meio), CX3CR1-/-CCR2RFP/+ (painel inferior); n ≥ 3 animais por grupo e 10 imagens por animal. Dados representativos de 2 experimentos. Os resultados estão apresentados como a média ± SEM. * indica diferença estatística entre o grupo indicado e o grupo controle; & indica diferença estatística entre o grupo indicado e o grupo 24h após APAP usando one-way Anova seguido do pós-teste de Tukey. (* e & = p < 0.05). 61 4.6. A LHA provoca uma janela de susceptibilidade a infecções Até agora, na caracterização do nosso modelo de LHA induzida pela sobredose de acetaminofeno, encontramos dano ao parênquima, disfunção hepática e uma inflamação robusta, com alterações significativas em populações celulares mieloides importantes, como as células de Kupffer, que sofrem redução significativa em número. Ainda, sabendo que, do ponto de vista imunológico, o fígado é um órgão crucial de defesa contra infecção por via sanguínea, com as células KCs desempenhando importante papel, e que muitas vezes os pacientes com LHA desenvolvem um quadro de infecção sistêmica (Karvellas et al., 2009; Rolando et al., 1996), buscamos determinar se a LHA afeta a capacidade de controle de patógenos circulantes. Para isso, induzimos novamente o modelo de LHA e, nos tempos pós- APAP determinados (12, 24 e 72 horas; 7 e 15 dias), submetemos os animais a um desafio intravenoso com E. coli expressando GPF (Figura 8A). Inicialmente, observamos a sobrevivência dos animais no momento mais crítico da LHA, 24 horas após indução da lesão. A infecção bacteriana resultou numa taxa de mortalidade de 40% nos animais que estavam no pico da LHA (Figura 8B). Inicialmente, escolhemos o ponto crítico da lesão (24h) para desafiar os camundongos com a bactéria e acompanhar a sobrevivência. Encontramos que a infecção bacteriana resultou numa taxa de mortalidade de 40% dos animais que estavam no pico da lesão em comparação com animais controle (Figura 8B), sugerindo uma piora na capacidade do organismo de lidar com infecções durante a LHA. Nesta linha, o próximo passo foi, então, avaliar, um dia após a infecção, a presença de bactérias no fígado e sangue dos animais desafiados durante a cinética da lesão. Utilizando contagem de unidades formadoras de colônia (UFCs), observamos uma elevada quantidade de UFCs no sangue e fígado de camundongos que receberam bactéria nos tempos de 12 e 24 horas após indução de lesão (Figura 8C). Surpreendentemente, os grupos de 72 horas e 7 dias pós-APAP, que já apresentavam retorno à normalidade, com relação aos níveis séricos de ALT, ICG e aspecto histopatológic