UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS Instituto de Ciências Biológicas Programa de Pós-graduação em Inovação Tecnológica e Propriedade Intelectual Verônica Aparecida Martins do Rosário ESTUDO PARA O DESENVOLVIMENTO DE UM BIOSSENSOR IMPEDIMÉTRICO PARA DETECÇÃO DE VENENO DE TITYUS SERRULATUS UTILIZANDO SUPERFÍCIES DE CARBONO E OURO Belo Horizonte 2022 Verônica Aparecida Martins do Rosário ESTUDO PARA O DESENVOLVIMENTO DE UM BIOSSENSOR IMPEDIMÉTRICO PARA DETECÇÃO DE VENENO DE TITYUS SERRULATUS UTILIZANDO SUPERFÍCIES DE CARBONO E OURO Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Inovação Tecnológica e Propriedade Intelectual do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais para cumprimento das exigências para obtenção do título de Mestre em Inovação Tecnológica e Propriedade Intelectual. Orientador: Prof. Dr. Tulio Matencio Coorientador: Dr. Luiz Guilherme Dias Heneine Belo Horizonte 2022 15/02/2022 11:16 SEI/UFMG - 1197337 - Ata https://sei.ufmg.br/sei/controlador.php?acao=documento_imprimir_web&acao_origem=arvore_visualizar&id_documento=1275517&infra_sistema… 1/2 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS MESTRADO PROFISSIONAL EM INOVAÇÃO TECNOLÓGICA E PROPRIEDADE INTELECTUAL ATA DA DEFESA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Nº 143 DE VERÔNICA APARECIDA MARTINS DO ROSÁRIO Às 09:00 horas do dia 17 de janeiro de 2022, em ambiente virtual, realizou-se a sessão pública para a defesa da Dissertação de VERÔNICA APARECIDA MARTINS DO ROSÁRIO. A presidência da sessão coube ao PROF. DR. TULIO MATENCIO, ICEX/UFMG – ORIENTADOR. Inicialmente o Presidente fez a apresentação da Comissão Examinadora assim constituída: PROF. DR.  FRÉDÉRIC JEAN GEORGES FRÉZARD, ICB/UFMG; PROF. DR. RODRIGO LASSAROTE LAVALL, ICEX/UFMG; PROFa. DRa. HÁLLEN DANIEL REZENDE CALADO, ICEX/UFMG - SUPLENTE; DR. LUIZ GUILHERME DIAS HENEINE, FUNDAÇÃO EZEQUIEL DIAS – COORIENTADOR e PROF. DR. TULIO MATENCIO, ICEX/UFMG – ORIENTADOR. Em seguida, a candidata fez a apresentação do trabalho que constitui sua Dissertação de Mestrado, intitulada “ESTUDO PARA O DESENVOLVIMENTO DE UM BIOSSENSOR IMPEDIMÉTRICO PARA DETECÇÃO DE VENENO DE TITYUS SERRULATUS UTILIZANDO SUPERFÍCIES DE CARBONO E OURO”. Seguiu-se a arguição pelos examinadores e, logo após, a Comissão reuniu-se, sem a presença da candidata e do público e decidiu considerar aprovada a Dissertação de Mestrado. O resultado final foi comunicado publicamente à candidata pelo Presidente da comissão. Nada mais havendo a tratar, o Presidente encerrou a sessão e lavrou a presente ata que, depois de lida, se aprovada, será assinada pela Comissão Examinadora. Belo Horizonte, 17 de janeiro de 2022. Documento assinado eletronicamente por Tulio Matencio, Membro de comissão, em 20/01/2022, às 17:33, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 5º do Decreto nº 10.543, de 13 de novembro de 2020. Documento assinado eletronicamente por Frederic Jean Georges Frezard, Professor do Magistério Superior, em 22/01/2022, às 12:43, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 5º do Decreto nº 10.543, de 13 de novembro de 2020. Documento assinado eletronicamente por Hallen Daniel Rezende Calado, Professora do Magistério Superior, em 25/01/2022, às 21:54, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 5º do Decreto nº 10.543, de 13 de novembro de 2020. Documento assinado eletronicamente por Rodrigo Lassarote Lavall, Professor do Magistério Superior, em 02/02/2022, às 14:18, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 5º do Decreto nº 10.543, de 13 de novembro de 2020. Documento assinado eletronicamente por Luiz Guilherme Dias Heneine, Usuário Externo, em 15/02/2022, às 11:11, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 5º do Decreto nº 10.543, de 13 de novembro de 2020. A autenticidade deste documento pode ser conferida no site https://sei.ufmg.br/sei/controlador_externo.php? acao=documento_conferir&id_orgao_acesso_externo=0, informando o código verificador 1197337 e o código CRC 729F145F. http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_Ato2019-2022/2020/Decreto/D10543.htm http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_Ato2019-2022/2020/Decreto/D10543.htm http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_Ato2019-2022/2020/Decreto/D10543.htm http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_Ato2019-2022/2020/Decreto/D10543.htm http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_Ato2019-2022/2020/Decreto/D10543.htm https://sei.ufmg.br/sei/controlador_externo.php?acao=documento_conferir&id_orgao_acesso_externo=0 10/02/2022 09:54 SEI/UFMG - 1197338 - Folha de Aprovação https://sei.ufmg.br/sei/controlador.php?acao=documento_imprimir_web&acao_origem=arvore_visualizar&id_documento=1275518&infra_sistema… 1/2 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS FOLHA DE APROVAÇÃO “ESTUDO PARA O DESENVOLVIMENTO DE UM BIOSSENSOR IMPEDIMÉTRICO PARA DETECÇÃO DE VENENO DE TITYUS SERRULATUS UTILIZANDO SUPERFÍCIES DE CARBONO E OURO”   VERÔNICA APARECIDA MARTINS DO ROSÁRIO   Dissertação de Mestrado defendida e aprovada, no dia 17 de janeiro de 2022, pela Banca Examinadora constituída pelos seguintes membros:   PROF. DR. RODRIGO LASSAROTE LAVALL ICEX/UFMG PROFA. DRA. HÁLLEN DANIEL REZENDE CALADO ICEX/UFMG PROF. DR. FRÉDÉRIC JEAN GEORGES FRÉZARD ICB/UFMG DR. LUIZ GUILHERME DIAS HENEINE - COORIENTADOR FUNDAÇÃO EZEQUIEL DIAS PROF. DR. TULIO MATENCIO – ORIENTADOR ICEX/UFMG       Belo Horizonte, 17 de janeiro de 2022.   Documento assinado eletronicamente por Tulio Matencio, Membro de comissão, em 20/01/2022, às 17:35, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 5º do Decreto nº 10.543, de 13 de novembro de 2020. Documento assinado eletronicamente por Frederic Jean Georges Frezard, Professor do Magistério Superior, em 22/01/2022, às 12:45, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 5º do Decreto nº 10.543, de 13 de novembro de 2020. Documento assinado eletronicamente por Hallen Daniel Rezende Calado, Professora do Magistério Superior, em 25/01/2022, às 21:54, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 5º do Decreto nº 10.543, de 13 de novembro de 2020. http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_Ato2019-2022/2020/Decreto/D10543.htm http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_Ato2019-2022/2020/Decreto/D10543.htm http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_Ato2019-2022/2020/Decreto/D10543.htm 10/02/2022 09:54 SEI/UFMG - 1197338 - Folha de Aprovação https://sei.ufmg.br/sei/controlador.php?acao=documento_imprimir_web&acao_origem=arvore_visualizar&id_documento=1275518&infra_sistema… 2/2 Documento assinado eletronicamente por Luiz Guilherme Dias Heneine, Usuário Externo, em 27/01/2022, às 19:55, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 5º do Decreto nº 10.543, de 13 de novembro de 2020. Documento assinado eletronicamente por Rodrigo Lassarote Lavall, Professor do Magistério Superior, em 02/02/2022, às 14:18, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 5º do Decreto nº 10.543, de 13 de novembro de 2020. A autenticidade deste documento pode ser conferida no site https://sei.ufmg.br/sei/controlador_externo.php? acao=documento_conferir&id_orgao_acesso_externo=0, informando o código verificador 1197338 e o código CRC FEC1419A. Referência: Processo nº 23072.202703/2022-46 SEI nº 1197338 http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_Ato2019-2022/2020/Decreto/D10543.htm http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_Ato2019-2022/2020/Decreto/D10543.htm https://sei.ufmg.br/sei/controlador_externo.php?acao=documento_conferir&id_orgao_acesso_externo=0 A todas as mulheres da ciência. AGRADECIMENTOS Agradeço inicialmente à minha Fé em Deus e à minha Mãe do céu, neste momento muito questionada, porém se manteve firme. Obrigada por me manterem no caminho certo. Agradeço a toda minha família que vem incondicionalmente me apoiando com meus sonhos. Sem vocês nada disso seria possível, desde o colégio à graduação, ao mestrado e ao futuro. Agradeço o apoio da Fundação Ezequiel Dias (FUNED), onde realizou-se toda parte técnica do projeto, aos laboratórios do Serviço de Recursos Vegetais e Ototerápicos pelas análises de microscopia eletrônica e do Serviço de Físico-Química de Produtos pelas análises de Infravermelho, em especial ao laboratório de Imunologia Aplicada, onde aprendi muito. Agradeço aos técnicos Thiago, Giancarlo por todo conhecimento compartilhado e à assistente administrativa Rejiane pelo seu apoio. Agradeço em especial, advindo da FUNED, a um amigo que me ensinou não somente procedimentos técnicos, mas sim muitos conceitos éticos que me fizeram ser um ser humano melhor. Obrigada, Robson Junior! Agradeço o apoio da startup SmartSensors por ceder os sensores para o estudo. Agradeço ao Centro de Bioengenharia de Espécies Invasoras (Cbeih) pelo apoio financeiro e pelos ensinamentos altamente colaborativos de toda equipe. Agradeço em especial à Camila Schults, que me acompanhou nessa jornada durante um bom tempo como Iniciação Científica, onde conseguimos aprender juntas uma nova metodologia. Agradeço aos meus orientadores. Ao Dr. Tulio Matencio, que vem me ensinando e orientando do primeiro até o último minuto sobre esta ciência fora da caixa que decidi aprender, que é a eletroquímica. Ao Dr. Luiz Guilherme meu “pai científico” por todos os ensinamentos e por me ensinar um pouco mais da imunologia, uma ciência de tantos caminhos e por me mostrar essas diversas possibilidades. Meus agradecimentos e apoio de todos os amigos que sempre torceram pelo meu sucesso. Em especial à Thabata e à Luana que me ouviram, que me abraçaram em um pior momento e que foram, como sempre, minhas irmãs que a Biologia me deu. Falando de amigos, agradeço o apoio de todos os amigos que o Mestrado me deu: Raquel, Xênia e principalmente a Jéssica Moreira Caetano, mais que uma colega ou parceira de aula, uma amiga da vida inteira. Obrigada por tudo, quantos conselhos, quantos puxões de orelhas, quantas sessões de terapia, quantas palavras necessárias, obrigada por ser este ser humano incrível, essa mulher fora da curva. Enfim agradeço a todos. A gratidão é a grande memória do coração. “Cada pessoa deve trabalhar para o seu aperfeiçoamento e, ao mesmo tempo, participar da responsabilidade coletiva por toda a humanidade.” Marie Curie, 1865. RESUMO Em 2007, ocorreram 37368 acidentes escorpiônicos em humanos. No ano de 2010, o número de acidentes passou para 51754 casos, e em 2017 dobrou-se o número de notificações, atingindo 123964 pessoas, correspondendo a cerca de 70% do total de acidentes por animais peçonhentos notificados no SINAN. Atualmente, um dos maiores problemas encontrados quando há um acidente escorpiônico é o atendimento no ambiente de saúde e a falta de diagnóstico rápido, principalmente em casos que não há relato da picada, registrados com maior incidência em crianças, onde encontrou-se um maior número de óbitos, a confecção de um método mais rápido e mais sensível para o diagnóstico de acidentes por picadas de escorpiões é de grande importância para tratar o acidentado de forma específica e segura. Um método que se apresenta com potencial aplicação e eficácia é a utilização de biossensores, dispositivos compostos de um sistema receptor e outro transdutor, que fornecem dados analíticos utilizando um componente biológico de reconhecimento. Ademais, ainda existe a possibilidade do uso de biopolímeros, que vêm surgindo como uma nova classe de materiais na bioengenharia com uma grande variedade de aplicações, em especial o uso em biossensores. Existem diferentes fontes de obtenção dos biopolímeros, porém uma espécie conhecida como praga e invasora no Brasil pode se tornar um potencial fonte de quitosana, essa espécie é denominada Mexilhão- dourado. A disponibilidade abundante de mexilhão possibilita uma visão de reaproveitamento das partes do animal, como as conchas, tendo impacto direto na destinação da espécie. O objetivo é estudar materiais e métodos para desenvolver um imunossensor impedimétrico para detecção de veneno de Tityus serrulatus utilizando superfícies de carbono e ouro. Para metodologia, utilizou-se a purificação de anticorpos e a purificação da quitina a partir das conchas do mexilhão-dourado. Foram utilizados dois sensores um à base de carbono e outro à base de ouro. As medidas foram realizadas com uso da técnica de Espectroscopia de Impedância Eletroquímica. Foram obtidos resultados com seletividade e sensibilidade promissoras, com limite de detecção de 1 ng/mL para ambos os sensores, com prototipação inicial utilizando a resposta do sinal em uma frequência apenas, diminuindo assim o tempo. O estudo aqui apresentado é o começo para a produção de métodos diagnósticos rápidos para acidentes escorpiônicos. A sequência deste estudo visando a maturação da tecnologia com sua validação, qualificação e estudo de mercado mais completo impactará diretamente na diminuição do número de óbitos registrados com acidentes escorpiônicos no país. Palavras-chaves: Escorpionismo. Imunossensores. Inovação biotecnológica. Impedância. Carbono. Ouro. Quitosana ABSTRACT In 2007, there were, 37368 scorpion accidents in humans. In 2010, the number of accidents rose to 51754 cases, and in 2017 the number of notifications doubled, reaching 123964 people, corresponding to about 70% of all accidents by venomous animals reported in SINAN. Currently, one of the biggest problems encountered when there is a scorpion accident is the care in the health environment and the lack of rapid diagnosis, especially in cases where there is no report of the sting, recorded with higher incidence in children, where we find a higher number of deaths, the confection of a faster and more sensitive method for the diagnosis of accidents by scorpion stings is of great importance to treat the injured person in a specific and safe way. A method that presents itself with potential application and effectiveness is the use of biosensors, devices composed of a receptor system and another transducer, which provide analytical data using a biological recognition component. Furthermore, there is also the possibility of using biopolymers, which are emerging as a new class of materials in bioengineering with a wide variety of applications. There are different sources of obtaining biopolymers, but a species known as a pest and invader in Brazil can become a potential source of chitosan, this species is called Golden Mussel. The abundant availability of mussels enables a vision of reusing parts of the animal, such as the shells, having a direct impact on the destination of the species. The objective is to study materials and methods to develop an impedimetric immunosensor for detection of Tityus serrulatus venom using carbon and gold surfaces. For methodology, the purification of antibodies and the purification of chitin from the shells of the golden mussel were used. Two sensors were used, one carbon-based and one gold-based. The measurements were performed using the Electrochemical Impedance Spectroscopy technique. Results with promising selectivity and sensitivity were obtained, with a detection limit of 1 ng/mL for both sensors, with initial prototyping using the signal response at only one frequency, thus decreasing time. The study presented here is the beginning for the production of rapid diagnostic methods for scorpion accidents. The sequence of this study aimed at the maturation of the technology with its validation, qualification and more complete market study will directly impact on reducing the number of deaths from scorpion accidents in the country. Keywords: Scorpions. Immunosensors. Biotechnological innovation. Impedance. Carbon. Gold. Chitosan. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 - Notificações de acidentes por animais peçonhentos no Brasil entre 2011 e 2020 20 Figura 2 - Morfologia externa dos escorpiões (Tityus sp.). 1. Vista dorsal. 2. Vista ventral. . 25 Figura 3 - Escorpiões do Gênero Tityus de importância médica no Brasil e suas distribuições geográficas: a: Tityus bahiensis; b: Tityus serrulatus; c: Tityus stigmurus e d: Tityus obscurus ............................................................................................................................................ 28 Figura 4 - Notificações de acidentes escorpiônicos no Brasil de 2011 a 2020 por faixa etária ............................................................................................................................................ 32 Figura 5 - Notificações de acidentes escorpiônicos no Brasil de 2011 a 2020 por região geográfica ............................................................................................................................ 33 Figura 6 - Notificações de óbitos por acidentes escorpiônicos no Brasil de 2011 a 2020 por região geográfica ................................................................................................................. 34 Figura 7 - Sensor Screen-Printed à base de tintas de carbono e prata ................................ 53 Figura 8 - Esquema de imobilização de Anticorpo Antiescorpiônico .................................... 54 Figura 9 - Sensor Screen-Printed à base de tintas de ouro e prata ...................................... 56 Figura 10 - Esquema de imobilização de anticorpo antiescorpiônico ................................... 57 Figura 11 - Circuito de Randles e sua resposta idealizada no Diagrama de Nyquist ............ 58 Figura 12 - ELISA para verificação da ação de especificidade do anticorpo antiescorpiônico purificado ............................................................................................................................. 59 Figura 13 - Western blot; a: padrão de pesos moleculares; b: veneno de Tityus serrulatus; c: veneno de Phoneutria nigriventer; d: veneno de Loxosceles similis, e: veneno pool de serpentes (Crotalus, Bothrops e Micurus) ............................................................................ 61 Figura 14 - FITR da quitina extraída das conchas do mexilhão-dourado ............................. 62 Figura 15 - FTIR da quitosana obtida do processo de desacetilação da quitina do mexilhão- dourado ............................................................................................................................... 63 Figura 16 - Micrografias da quitina extraída das conchas do mexilhão-dourado. A: 100 µm; B: 10 µm; C: 20 µm e D: 10 µm ............................................................................................... 64 Figura 17 - Micrografias da quitosana obtida por desacetilação da quitina extraída das conchas do mexilhão-dourado. A: 100 µm; B: 10 µm e C e D: 2 µm .................................................. 65 Figura 18 - Diagrama de Nyquist representando o mapeamento impedimétrico do processo de funcionalização de um eletrodo de carbono .................................................................... 66 Figura 19 - Diagrama de Nyquist representando o mapeamento impedimétrico do processo de funcionalização de eletrodos de ouro .............................................................................. 70 Figura 20 - Ensaio 1: Diagrama de Nyquist do imunossensor de carbono frente ao veneno escorpiônico nas concentrações de 0,1, 1, 10, 100, 1000, 10 000 ng/mL ............................ 71 Figura 21 - Circuito equivalente sugerido para simulação do ensaio 1 utilizando sensor de carbono................................................................................................................................ 71 Figura 22 – Ensaio 1: ΔRtc do imunossensor de carbono frente ao veneno escorpiônico nas concentrações de 0,1, 1, 10, 100, 1000, 10 000 ng/mL ........................................................ 72 Figura 23 - Ensaio 2: Diagrama de Nyquist do imunossensor de carbono frente ao veneno escorpiônico nas concentrações de 0,1, 1, 10, 100, 1000, 10 000 ng/mL ............................ 73 Figura 24 – Ensaio 2: ΔRtc no imunossensor de carbono frente ao veneno escorpiônico nas concentrações de 0,1, 1, 10, 100, 1000, 10 000 ng/mL ........................................................ 73 Figura 25 - Ensaio 3: Diagrama de Nyquist do imunossensor de carbono frente aos venenos botrópico, crotálico e escorpiônico a 1 µg/mL ...................................................................... 74 Figura 26 – Ensaio 3: ΔRtc do imunossensor de carbono frente aos venenos botrópico, crotálico e escorpiônico 1 µg/mL .......................................................................................... 74 Figura 27 - Ensaio 4: Diagrama de Nyquist do imunossensor de carbono frente aos venenos botrópico e crotálico a 1 µg/mL e escorpiônico na concentração de 1 e 10 µg/mL ............... 75 Figura 28 - Ensaio 4: ΔRtc no imunossensor de carbono frente aos venenos botrópico e crotálico a 1 µg/mL e escorpiônico na concentração de 1 e 10 µg/mL ................................. 76 Figura 29 - Ensaio 1: Diagrama de Nyquist do imunossensor de ouro frente ao veneno escorpiônico nas concentrações de 1, 10, 100, 1000 ng/mL ................................................ 78 Figura 30 - Ensaio 1: ΔRtc do imunossensor de ouro frente ao veneno escorpiônico nas concentrações de 1, 10, 100, 1000, 1000 ng/mL ................................................................. 79 Figura 31 - Ensaio 2: Diagrama de Nyquist do imunossensor de ouro frente ao veneno escorpiônico nas concentrações de 1, 10, 100, 1000, 10 000 ng/mL ................................... 80 Figura 32 – Ensaio 2: ΔRtc do imunossensor de ouro frente ao veneno escorpiônico nas concentrações de 1, 10, 100, 1000, 10 000 ng/mL .............................................................. 81 Figura 33 - Ensaio 3: Diagrama de Nyquist do imunossensor de ouro frente aos venenos botrópico, crotálico e escorpiônico a 1 ng/mL ...................................................................... 82 Figura 34 – Ensaio 3: ΔRtc do imunossensor de ouro frente aos venenos botrópico e crotálico a 1 ng/mL e escorpiônico a 1 ng/mL e 10 ng/mL .................................................................. 82 Figura 35 - Ensaio 3: ΔRtc do imunossensor de ouro frente aos venenos botrópico e crotálico a 1 ng/mL e escorpiônico a 1 ng/mL e 10 ng/mL, normalizados por meio da subtração dado branco do sistema ............................................................................................................... 83 Figura 36 - Ensaio 4: Diagrama de Nyquist do imunossensor de ouro frente aos venenos botrópico e crotálico a 1 ng/mL e escorpiônico a 1 ng/mL e 10 ng/mL ................................. 83 Figura 37 – Ensaio 4: ΔRtc do imunossensor de ouro frente aos venenos botrópico e crotálico a 1 ng/mL e escorpiônico a 1 ng/mL e 10 ng/mL .................................................................. 84 Figura 38 – Ensaio 4: ΔRtc do imunossensor de ouro frente aos venenos botrópico e crotálico a 1 ng/mL e escorpiônico a 1 ng/mL e 10 ng/mL, normalizados por meio da subtração do branco do sistema ............................................................................................................... 84 Figura 39 - Sistema Portátil: a: smartphone; b: potenciostato; c: sensor (ouro ou carbono) . 87 Figura 40 - Diagrama de Bode: evolução do ângulo de fase x frequência ............................ 87 Figura 41 - Detecção de veneno a partir da evolução do ângulo de fase na frequência de 0,1 Hz, com análise regressiva. A, B e C: sensor de carbono; D, E e F: sensor de ouro ........... 89 Figura 42 – Análise de seletividade utilizando sensores de carbono na frequência de 0,1 Hz, com retirada do branco dos controles, a e c: dados impedimétricos; b e d: dados do ângulo de fase ...................................................................................................................................... 90 Figura 43 - Análise de seletividade utilizando sensores de ouro na frequência de 0,1 Hz, com retirada do branco dos controles, a e c: dados da parte imaginária da impedância; b e d: dados do ângulo de fase ................................................................................................................ 91 Figura 44 - Análise de seletividade. Relação entre sensores diferentes com detecções de controle negativo e positivo, sendo A: dados da parte imaginária da impedância e B: dados do ângulo de fase na frequência de 0,1 Hz ............................................................................... 91 Figura 45 - Adaptação da escala de TRL ............................................................................. 92 LISTA DE TABELA Tabela 1 - Exemplos de Compostos de Venenos de Escorpião Tityus ................................ 31 Tabela 2- Classificação do acidente escorpiônico quanto à gravidade e manifestações clínicas ............................................................................................................................................ 32 Tabela 3 - Distribuição de casos de escorpionismo segundo a faixa etária e a classificação do acidente notificado no Sistema de Informação de Agravos de Notificação no Brasil de 2011 a 2021 .................................................................................................................................... 34 Tabela 4 – Caracterização por FTIR quanto aos grupos funcionais da quitina ..................... 62 Tabela 5 - Caracterização FTIR quanto aos grupos funcionais da quitosana ....................... 63 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 19 2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 23 2.1 Geral ................................................................................................................... 23 2.2 Específicos ........................................................................................................ 23 3 REFERENCIAL TEÓRICO ..................................................................................... 24 3.1 ESCORPIONISMO .............................................................................................. 24 3.1.1 Caracterização Taxonômica e Morfofuncional do Escorpião ..................... 24 3.1.2 Escorpiões de importância médica no Brasil .............................................. 26 3.1.3 Veneno Escorpiônico: mecanismo de ação ................................................. 27 3.1.4 Diagnóstico e Classificação Clínica do Caso .............................................. 29 3.1.5 Epidemiologia ................................................................................................. 30 4 BIOSSENSORES ................................................................................................... 35 4.1 Contextualização ............................................................................................... 35 4.2 Imunossensores eletroquímicos ..................................................................... 38 5 BIOPOLÍMEROS ................................................................................................... 40 5.1 Contextualização ............................................................................................... 40 5.2 Quitina e Quitosana .......................................................................................... 41 6 INOVAÇÃO ............................................................................................................ 43 6.1 Contextualização ............................................................................................... 43 6.2 Inovação em Biotecnologia .............................................................................. 45 7 METODOLOGIA .................................................................................................... 48 7.1 Obtenção e Caracterização dos Anticorpos Antiescorpiônicos ................... 48 7.2 Obtenção e Caracterização de Quitosana ....................................................... 51 7.3 Funcionalização dos Sensores ........................................................................ 53 7.3.1 Elétrodos de Carbono .................................................................................... 53 7.3.2 Elétrodos de Ouro .......................................................................................... 55 7.4 Espectroscopia de Impedância Eletroquímica ............................................... 56 7.6 Circuito Elétrico Equivalente ............................................................................ 57 8 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 59 8.1 Caracterização dos anticorpos purificados .................................................... 59 8.2 Caracterização da quitina e quitosana ............................................................ 62 8.3 Caracterização da Funcionalização ................................................................. 65 8.3.1 Sensores de Carbono ..................................................................................... 65 8.3.2 Sensores de Ouro ........................................................................................... 68 8.4 Detecção de Veneno.......................................................................................... 70 8.4.1 Detecção em sensores de carbono .............................................................. 70 8.4.2 Detecção em sensores de ouro ..................................................................... 77 8.5 Prototipagem ..................................................................................................... 86 8.6 Maturidade tecnológica .................................................................................... 92 9 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 93 9.1 Impactos e Contribuições ................................................................................. 93 REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 95 19 1 INTRODUÇÃO Os problemas de saúde pública no Brasil vêm aumentando gradativamente, como os acidentes por animais peçonhentos, que ultrapassaram a marca de 140 mil casos notificados anualmente. Além disso, a diversidade de hábitats dos países latino- americanos beneficia a presença de uma variedade de espécies de animais venenosos de importância médica (VALDERRAMA, 2009). Conforme Braga e colaboradores (2021), o desalinhamento da urbanização e do crescimento no país, levaram a um desequilíbrio ecológico, como consequência os animais peçonhentos e humanos começaram a coexistir em um mesmo espaço, o que levou a um aumento na interação entre as duas espécies, levando a um problema no sistema de saúde. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), os acidentes por animais peçonhentas têm sido considerados como um agravo negligenciado ligado às situações de pobrezas (WHO, 2007). Entre os animais de importância médica, as serpentes, as aranhas e os escorpiões são os responsáveis pela ocorrência da maioria dos acidentes (CARDOSO et al., 2009). Cheung e Machado (2017), comentaram sobre a relevância entre essas espécies de importância médica, no número de notificações, sendo os acidentes ofídicos, escorpiônicos e araneísmo com o maior índice de notificações. Nesse contexto, Sanchez-Castro e Colaboradores (2021) afirmam que os acidentes relacionados às serpentes têm uma incidência mundial de cerca 2,7 milhões de casos por ano e Feola e seus colaboradores (2020) mensuraram cerca de 1,5 milhões de acidentes escorpiônicos em todo mundo. Nesse contexto, a situação epidemiológica do país, conforme dados do Ministério da Saúde, foram registrados entre 1975 e 2020 cerca de 2434681 notificações de acidentes no país, sendo 399780 por serpentes, 398825 por aranhas, 175480 por abelhas, 1248629 por escorpiões e os demais por lagartas e outras espécies. O número de notificações indica como os acidentes são problemas atuais no Brasil, ressaltando a última década (figura 1). Conforme dados do Ministério da Saúde, os acidentes ofídicos são cerca de 15% das notificações, cerca de 16% por araneísmo e cerca de 54% por escorpiônicos, por isso os acidentes enfatizados neste estudo são os escorpiônicos. Em 2007 ocorreram 37368 acidentes escorpiônicos em humanos, no ano de 2010, o número de acidentes passou para 51754, e em 2017 dobrou-se o número de 20 notificações, atingindo 123964 pessoas, correspondendo a cerca de 70% do total de acidentes por animais peçonhentos notificados no Sistema de informações de agravos e notificações (SINAN). O risco de acidentes escorpiônicos é intrínseco às atividades rotineiras exercida pelo homem, pois a alta plasticidade ecológica apresentada por esses animais propicia uma adaptação a ambientes fora do seu nicho ecológico (CUPO et al., 2003). Corroborando com o autor anterior, Torres e colaboradores (2018) argumentam que a urbanização acelerada observada no Brasil nas últimas décadas, sem a criação adequada de infraestrutura básica (água, luz, tratamento de esgoto e coleta regular de lixo), proporcionou a proliferação de algumas espécies oportunistas e invasivas de escorpiões. Figura 1 - Notificações de acidentes por animais peçonhentos no Brasil entre 2011 e 2020 Fonte: SINAN - Ministério da Saúde/SVS Atualmente, uns dos maiores problemas encontrados quando um indivíduo é picado por um escorpião são o atendimento no ambiente de saúde e a falta de diagnóstico precoce, principalmente em casos que não há relato da picada, como ocorre com maior incidência em crianças, que são as maiores vítimas. Conforme a Funasa (2001), não existem métodos para diagnosticar de forma rápida os acidentes escorpiônicos. O diagnóstico é feito através da análise de manifestações sistêmicas, com a complementação com exames laboratoriais. Cheng (2014) argumentam que o diagnóstico é baseado inicialmente em uma suspeita clínica, a qual deve ser corroborada com exames clínicos cuidadosos e uma anamnese meticulosa, sendo 21 essencial, sempre que possível, a captura do animal. Conforme Dias-Lopes e colaboradores (2018), análises laboratoriais clínicas e bioquímicas são insuficientes para apoiar o diagnóstico, além disso, embora os sintomas gerais ocorram logo após a picada, em alguns casos, elas podem ser ocasionalmente adiadas por várias horas, o que pode complicar o diagnóstico. Nesse contexto, a confecção de um método mais rápido e sensível para o diagnóstico de acidentes por picadas de escorpiões é de grande importância para tratar o acidentado de forma específica e segura. Um método de potencial aplicação e eficácia é a utilização de biossensores. A International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC, 1999) descreve o mesmo como um sistema composto de um receptor e um transdutor, que fornece dados utilizando componentes químicos ou biológicos de reconhecimento. Segundo Goode e seus colaboradores (2015), a criação de novos dispositivos com detecção de analitos de importância biológica tem despertado cada vez mais a curiosidade e atenção de diversos pesquisadores de diferentes áreas de atuação, os quais têm focado seus esforços na criação de um dispositivo sensível, seletivos, economicamente viáveis e de alta potencialidade de aplicação em uma grande plataforma. Os biossensores eletroquímicos estão entre os mais estudados devido às suas características de miniaturização, portabilidade, rapidez de resposta e especificidade de reconhecimento do analito alvo. Ademais, ainda existe a possibilidade do uso de biopolímeros, que vêm surgindo como uma nova classe de materiais na bioengenharia com uma grande variedade de aplicações. Um dos biopolímeros mais utilizados atualmente é a quitosana, que se trata de um polissacarídeo que está despertando interesse em diversas áreas científicas e tecnológicas, utilizada como material polimérico funcional, por ser um polímero atóxico, biodegradável, biocompatível e produzido por fontes naturais renováveis, tendo aplicações em diversas áreas (TONHI; PLEPIS, 2002). Jayakumar e Prabaharan (2021) descrevem a quitosana com suas propriedades atóxicas e presença de grupos funcionais como hidroxilas e aminas, que aumentam a estabilidade mecânica na imobilização de superfície de biomoléculas bioreceptoras em biossensores, além de fornecer maior condutividade e sensibilidade na detecção. Existem diferentes fontes de obtenção dos biopolímeros, porém uma espécie conhecida como praga e invasora no Brasil pode se tornar um potencial fonte de quitina, essa espécie é denominada Mexilhão-dourado. Segundo Morton & Dinesen 22 (2010), conhecido popularmente no país como mexilhão-dourado, o Limnoperna fortunei é uma espécie de mexilhão-de-água-doce da família Mytilidae. Conforme dados do órgão responsável pela preservação e manutenção do meio ambiente brasileiro, o IBAMA, o mexilhão alastra-se com agilidade, por isso a espécie é considerada uma bioinfestação. Conforme dados literários, as bioinfestações são uma das causas de extinção de espécies, atrás apenas da destruição de hábitats. A abundância de mexilhão possibilita uma visão de reaproveitamento das partes do animal, como as conchas, tendo impacto direto na destinação do resíduo gerado pela espécie. Dessa forma, será possível transformar uma espécie invasora em um asset, isto é, quando um problema se torna um ativo ou coproduto. Para realização do estudo contou com o apoio e as instalações da Fundação Ezequiel Dias (FUNED), fundada em 1907 a instituição centenária localizada na capital mineira vem buscando soluções em saúde para o fortalecimento do Sistema Único Saúde (SUS) e é reconhecida no cenário do Estado de Minas Gerais como Instituto de Ciência e Tecnologia, mantendo seus serviços com alta qualidade. A FUNED engloba em seu escopo a busca por inovação, com isso a Smartsensors surgiu como um spin off do departamento de Pesquisa e Desenvolvimento da fundação em uma parceria entre pioneiros pesquisadores da fundação com a Universidade (UFMG), a empresa tem como principal foco a P&D em biossensores com aplicação na área de diagnósticos clínicos, veterinários e controle de alimentos (FUNED, 2019). Para a obtenção da quitina com a utilização do mexilhão-dourado como matriz, a FUNED firmou parceria com o Centro de Bioengenharia de Espécies Invasoras de Hidrelétricas (CBEIH), o centro foi criado em 2010 a partir do P&D ANEEL, tem uma interação entre áreas de conhecimento de alto nível inovador na ação contra os organismos invasores considerando o Monitoramento, Bioengenharia e Modelagem Ambiental (CBEIH). Portanto, dentre os conceitos de inovação o do Manual de Oslo (2005), que define a inovação de forma abrangente, existe a inserção de algo novo ou melhorado desde processos, serviços ou produtos nas relações externas, ou organização do local de trabalho. A necessidade de um processo ou produto de caráter inovador para o diagnóstico de acidentes escorpiônicos, pois foi mostrado um cenário com dados de incidência e prevalência com grande relevância. 23 2 OBJETIVOS 2.1 Geral Estudar materiais e métodos para desenvolver um biossensor impedimétrico para detecção de veneno de Tityus serrulatus utilizando superfícies de carbono e ouro. 2.2 Específicos • Purificar anticorpos antiescorpiônico-específicos, através da técnica de imunocromatografia de afinidade; • Purificar e caracterizar a quitosana utilizando as conchas do mexilhão dourado (Limnoperna fortunei); • Testar métodos para a funcionalização em eletrodos de carbono e ouro, utilizando anticorpos antiescorpiônicos; • Determinar a linearidade, sensibilidade e limite de detecção do dispositivo frente a diferentes concentrações de venenos de escorpião utilizando a técnica de Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIE); • Analisar a especificidade frente a venenos ofídicos, aracnídeos e escorpiônicos em diferentes concentrações; • Gerar um protótipo de campo para diagnóstico de acidentes escorpiônicos. 24 3 REFERENCIAL TEÓRICO 3.1 ESCORPIONISMO 3.1.1 Caracterização Taxonômica e Morfofuncional do Escorpião Os artrópodes, um grupo de animais com grande diversidade, pois abrangem cerca de 90% do reino, ocorrem em todos os ambientes. Existe um número estimado de 1097289 espécies de artrópodes identificadas, embora o número exato seja ainda desconhecido, dentre os espécimes desse reino estão o grupo dos queliceriformes: ácaros, aranhas, opiliões, escorpiões, carrapatos, dentre outros, que perfazem cerca de 100000 espécies (Brusca & Brusca, 2007). O escorpião, conhecido popularmente como Lacrau em algumas partes do país, é um quelicerado, que possui a classificação taxonômica: Filo Arthropoda, classe Arachnida e ordem Scorpiones. O nome escorpião é derivado do latim scorpio/scorpionis (BRAZIL & PORTO, 2010). Os escorpiões têm seu corpo dividido em duas partes (figura 2), prossoma uma espécie de carapaça, onde observa-se seus membros locomotores no caso quatro patas, suas quelíceras membros com função de triturar o alimento e um par de pedipalpos que são como pinças, a outra parte é o opistossoma, funcionalmente o abdômen subdividido em mesossoma o tronco do animal, onde encontra os apêndices sensoriais, o opérculo genital e os espiráculos que são aberturas externas dos pulmões, a outra subdivisão chamada de metassoma, que se trata da cauda do animal, onde na sua porção final apresenta uma estrutura chamada telson, onde estão localizadas um par de glândulas secretoras de veneno e o ferrão utilizado na inoculação da peçonha. (CARNEIRO et al., 2015). Segundo o Ministério da Saúde (2009), os escorpiões têm uma grande diversidade de hábitats, porém também são encontrados nas regiões urbanizadas, como regiões peridomiciliares, enquanto em ambiente natural são encontrados embaixo de cascas de árvores, rochas e sob pedras. Apresentam hábitos noturnos e elevada plasticidade ecológica, por isso algumas espécies se adaptam a ambientes antropizados, como consequência há o alto índice de notificações de acidentes registrados nos últimos anos (CUPO et al., 2003). Segundo a Fundação Oswaldo Cruz, os escorpiões se destacam de outros aracnídeos devido à duração de vida que 25 vai além de uma estação, por apresentar elevado índice de longevidade (de 2 a 6 anos) e pelo maior tempo de vida registrado até hoje, que é de oito anos. Figura 2 - Morfologia externa dos escorpiões (Tityus sp.). 1. Vista dorsal. 2. Vista ventral. Fonte: Adaptado de Cândido e colaboradores Os escorpiões possuem hábitos alimentares, consumindo principalmente outros artrópodes como aranhas, grilos e baratas, apresentam estratégia de forrageamento tipo senta-espera, mantendo as presas imóveis com a utilização das pinças, porém se as mesmas apresentarem resistência eles utilizam o artifício do envenenamento, entretanto, os escorpiões, podem passar longos períodos sem alimentação (PORTO & BRAZIL, 2011). Os escorpiões são vivíparos, a maioria das espécies apresenta a reprodução sexuada e o desenvolvimento da prole pode ser separado em embrionário e pós- embrionário. A disseminação da espécie pode variar de 3 a 18 meses, porém fatores intrínsecos como ambientais afetam diretamente a reprodução e o desenvolvimento até a fase adulta (OUTEDA-JORGE, 2010). Algumas espécies apresentam a reprodução por partenogênese, ou seja, não necessitam dos machos para o desenvolvimento da prole, essa característica é vista com um fator evolutivo no grupo, mesmo com o número de indivíduos relativamente baixo gerado com essa reprodução, o animal consegue garantir a perpetuação da espécie. Existem no Brasil cerca de cinco espécies que reproduzem por partenogênese, todas pertencentes ao mesmo gênero Tityus (LOURENÇO, 2008). 26 A taxonomia do escorpião é instável desde a virada do século, em sua revisão de classificação de escorpiões, Sissom (1990) listou 1077 espécies, 177 gêneros e nove famílias. Nos anos 90, novas famílias foram propostas e ajudaram a criar uma imagem mais clara das relações filogenéticas entre os gêneros de escorpiões. Em seu catálogo de escorpião do Mundo, Fet e seus colaboradores (2000) listaram 16 famílias, 154 gêneros e 1252 espécies de escorpiões. A estimativa mais recente da taxonomia da diversidade de escorpiões é de 19 famílias, 213 gêneros e 2363 espécies (REIN, 2017). No Brasil, até o ano de 2002, foram registradas 86 espécies, 17 gêneros e 4 famílias de escorpiões (LOURENÇO, 2002). Com as recentes descrições e revisões sistemáticas e taxonômicas, são atualmente registradas 131 espécies, 23 gêneros e 4 famílias, o que representa cerca de 9% da diversidade mundial da espécie. (BRAZIL & PORTO, 2002). 3.1.2 Escorpiões de importância médica no Brasil Estima-se que todos os escorpiões possuem veneno e capacidade de injetá- lo, mas nem toda espécie consegue causar danos graves em humanos (POLIS 1990). Conforme o Ministério da Saúde, existem no Brasil 4 espécies de escorpiões capazes de causar acidentes graves: T. serrulatus (Lutz & Mello, 1922), T. stigmurus (Thorell, 1876), T. bahiensis (Perty, 1833) e T. obscurus (Gervais, 1843). Nesse contexto, seguindo descrições de Lourenço & Eickstedt (2009), e do Manual de Controle de Escorpiões, apresentaram as seguintes características para as 4 espécies: Tityus bahiensis: um animal de coloração avermelhada ou marrom escura, apresentando algumas manchas nos membros, popularmente conhecido como escorpião-marrom. Atinge cerca de 7 cm de comprimento e tem a reprodução sexuada (figura 3a). Tityus serrulatus: o escorpião-amarelo, como é conhecido, possui uma coloração amarela, onde do tronco para os membros ocorre uma clarificação, na extremidade da cauda possui uma serrilha e se reproduz de forma partenogenética (figura 3b). Tityus stigmurus: o escorpião-amarelo-do-Nordeste, muito confundido com o Tityus serrulatus, possui algumas semelhanças como a reprodução partenogenética 27 e a coloração amarelada, mas a presença de uma macha escura no cefalotórax os diferencia (figura 3c). Tityus obscurus: popularmente conhecido como escorpião-preto-da- Amazônia, um dos maiores animais do gênero, medindo cerca de 9 cm de comprimento. Apresenta coloração negra quando adulto e quando jovem. (figura 3d). Conforme o Ministério da Saúde (2009), existe uma grande diversidade de escorpiões no país que também podem causar acidentes, porém potencialmente menos graves e com incidência de acidentes não relevantes como: T. metuendus, T. silvestris, T. brazilae, T. confluens, T. costatus, T. fasciolatus, T. neglectus, T. mattogrossensis, Ananteris balzanii, Rhopalurus agamemnon, R. rochai, dentre outros. 3.1.3 Veneno Escorpiônico: mecanismo de ação O veneno escorpiônico é uma mistura altamente complexa de peptídeos, enzimas, muco, proteínas, aminoácidos livres, nucleotídeos, lipídios, aminas, componentes heterocíclicos, sais inorgânicos e provavelmente outras substâncias, como demonstrado na tabela 1. As toxinas do veneno são amplamente estudadas. Isso é devido à sua ação farmacológica nos canais iônicos e sua relevância clínica como neurotoxinas. Elas são peptídeos com pontes de dissulfeto. As toxinas que atuam nos canais de sódio são as mais relevantes por seus efeitos em mamíferos, incluindo humanos. Outras toxinas do escorpião atuam nos canais de potássio, cloro e cálcio. Embora possam exibir ações sinérgicas que conduzem a manifestações, seu papel no envenenamento humano parece ser subsidiário. Toxinas ou componentes de veneno de escorpião relacionados a toxicidade são mais conhecidos por seus efeitos deletérios sobre células, tecidos e organismos, paradoxalmente, alguns deles demonstraram exibir atividades que possam ser relevantes para o desenvolvimento de medicamentos anticâncer, antimaláricos e antimicrobianos (RODRIGUEZ DE LA VEGA & POSSANI, 2005). 28 Figura 3 - Escorpiões do Gênero Tityus de importância médica no Brasil e suas distribuições geográficas: a: Tityus bahiensis; b: Tityus serrulatus; c: Tityus stigmurus e d: Tityus obscurus Fonte: Lourenço & Eickstedt (2009) e Manual de Controle de Escorpiões 29 O veneno escorpiônico tem capacidade de atuar em diferentes partes do organismo, pois a sua composição tem uma alta complexidade proteica (Tabela 1), além de apresentar uma quantidade relativamente baixa de aminoácidos (BARRAVIERA, 1999). Segundo Mebs (2002), a presença de neurotoxinas que possuem afinidade por estruturas nervosas, como canais de íons, consegue causar mudança na condutividade dos canais iônicos de Na+, K+ e Ca2+, na literatura científica as mais citadas são as que afetam os canais de Na+. Conforme Andrade-Filho e seus colaboradores (2013), as neurotoxinas escorpiônicas agem nas terminações nervosas pós-ganglionares. As mesmas podem induzir a liberação de neurotransmissores do sistema nervosos simpático e parassimpático, nos canais de Na+. Essa ação é uma das grandes responsáveis pelas manifestações clinicas apresentadas pelo indivíduo. Como citado, as espécies pertencentes ao gênero Tityus são responsáveis pela maioria dos acidentes, principalmente nas Américas. A sua gravidade e sinais clínicos estão ligados principalmente à ação nos neurotransmissores acetilcolinas e catecolaminas, onde os aminoácidos presentes na composição do veneno agem gerando uma sintomatologia diferente consoante as funcionabilidades de cada neurotransmissor (DÁVILA et al., 2011). 3.1.4 Diagnóstico e Classificação Clínica do Caso Conforme Dias-Lopes e seus colaboradores (2018), esses acidentes ainda são uma preocupação médica global, reconhecidos como doenças tropicais negligenciadas. Devido ao mecanismo rápido de ação das toxinas de escorpiões, a rápida detecção e quantificação de veneno são necessárias para acelerar as decisões de tratamento, terapia para racionalizar e reduzir os custos e os riscos do paciente. Foi desenvolvido um teste utilizando a técnica Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) para detecção de veneno do escorpião Tityus serrulatus, detectando a presença de toxinas circulantes nos pacientes de escorpionismo (CHÁVEZ- OLÓRTEGUI, et al., 1994). No entanto, o método imunoenzimático desenvolvido não conseguiu diferenciar acidentes moderados de amostras controle. Assim, sua aplicação na rotina clínica para o diagnóstico de picadas de escorpião em humanos 30 fica comprometida, não havendo, portanto, um método rápido e preciso (REZENDE et al., 1995). Existe também um método radioativoimunoensaio que é utilizado para detectar veneno em soro de coelhos envenenados experimentalmente. Verificou-se que as concentrações plasmáticas de toxina de escorpião determinadas pela radioatividade foram significativamente mais elevadas do que os valores determinados por ELISA . Isso pode ser devido à degradação/clivagem de toxinas que podem ocorrer in vivo, que ainda poderiam ser quantificadas por radioatividade, mas não por ELISA (KRIFI, et al., 2005). No entanto, esses testes estão ainda em níveis laboratoriais, onde nenhum ainda alcançou um estágio de point-of-care, para serem relevantes para auxiliar o médico nas suas decisões terapêuticas. Conforme a Funasa (2001), o diagnóstico para escorpionismo ainda ocorre sob a análise do quadro clínico do paciente, não havendo um método de detecção específico e rápido para tal finalidade. A suspeita do diagnóstico de escorpionismo é independente do histórico da picada, o encontro de sinais e sintomas correlacionando com alguns exames complementares (eletrocardiograma, radiografia torácica, glicemia e tomografia cerebral) são exigidos quando em casos mais graves. A classificação clínica dos acidentes escorpiônicos está descrita na literatura abundantemente, Segundo o Manual de Diagnóstico e Tratamento de Acidentes por Animais Peçonhentos escrito pelo Ministério de Saúde (2009), essa classificação é dívida entre casos leves, moderados ou graves (tabela 2). É através dessa classificação correlacionada com a sintomatologia que no atendimento de saúde é realizada a prescrição do tratamento adequado. 3.1.5 Epidemiologia A epidemiologia é uma ciência essencial com enfoque de mensurar a distribuição e fatores relacionados com as enfermidades, através da qual se pode alinhar ações de prevenção, controle e erradicação de doenças. A epidemiologia é considerada uma das principais ferramentas para administração e planejamento enquanto saúde pública (ROUQUAYROL, 1993). 31 Tabela 1 - Exemplos de Compostos de Venenos de Escorpião Tityus Composição Exemplos Espécimes Peso Molecular (kDa) Ação no Organismo Neurotoxinas Ts3, Ts5 Tityus serrulatus ~6,0-70 Ação nos canais de Na+ Tbtx5, Tb3 Tityus banhiensis Ts1 Tityus serrulatus 6890.9 Ts6, Ts7 Tityus serrulatus ~6.0-7.0 Ação nos canais de K+ Agente Hipotensor Hipotensão Tityus serrulatus 2.75 Agonista do receptor B (2) Proteinases Metaloproteinase Tityus serrulatus ~25.0 Lise da Membrana Basal Celular Serina Proteinase Tityus serrulatus e Tityus banhiensis Ação nos fatores de coagulação Enzimas Fosfolipase Tityus serrulatus Tityus stigmurus Hidrolise da Membrana Fosfolipidica Hialuronidase Tityus. ~50.0 Catalisa a Hidrólise do hialuronano da Matriz extracelular Fonte: Cordeiro e Colaboradores (2015), adaptado Para mensurar a prevalência e incidência de notificações e acidentes escorpiônicos, os dados epidemiológicos são de extrema importância. Segundo o sistema de notificações do Ministério da Saúde, os acidentes escorpiônicos vêm crescendo durante os anos. Em 2009, foram cerca de 50 mil casos notificados, Já em 2019, foram cerca de 150 mil em todo o país, um aumento perigoso. As faixas etárias com maiores prevalências de notificação de acidentes está entre 15 e 39 anos (figura 4). Porém, no mesmo período existe um expressivo aumento nas faixas etárias mais vulneráveis aos acidentes as crianças (1-14) e os idosos(65-80). 32 Tabela 2- Classificação do acidente escorpiônico quanto à gravidade e manifestações clínicas Classificaç ão Manifestações Clínicas Tratamento Específico Leve 1 Somente sintomatologia local: dor e parestesia locais. Taquicardia, agitação e vômito. ----- Moderado Apresenta forte dor local, ligada a um ou mais sintomas clínicos como: náuseas, vômitos, sudorese e sialorreia discretos, agitação, taquipneia e taquicardia. 2 a 3 ampolas de SAEsc2 ou SAA3, por via endovenosa Grave Apresenta sinais clínicos de alto volume como vômitos, sudorese, sialorreia, palidez, prostração, agitação alternada com sonolência, hipotermia, convulsões, coma, taqui ou bradicardia, taquipneia, insuficiência cardíaca, edema pulmonar agudo e choque cardiogênico. 4 a 6 ampolas de SAEsc ou SAA, por via endovenosa. 1: tempo de observação das crianças picadas: 6 a 12 horas. 2. SAEsc: soro antiescorpiônico. 3. SAA: soro antiaracnídico (Phoneutria, Loxosceles e Tityus). Fonte: Adaptado de Manual de Diagnóstico e Tratamento de Acidentes por Animais Peçonhentos Figura 4 - Notificações de acidentes escorpiônicos no Brasil de 2011 a 2020 por faixa etária Fonte: SINAN - Ministério da Saúde/SVS Quando são relacionadas as notificações com as regiões do país (figura 5), nota-se de acordo com dados do Ministério da Saúde que há duas regiões especialmente relevantes: a nordeste e a sudeste, com cerca de 70.000 notificações 33 no ano 2019. De acordo com Lourenço e Eickstedt (2009), destaca-se a distribuição geográfica do Tityus serrulatus nas duas regiões corroborando o maior número de notificações, sendo esse animal o mais expressivo em acidentes. Um índice epidemiológico observado pelo Ministério da Saúde com grande relevância para o desenvolvimento de métodos diagnóstico é, também, a relação da classificação clínica do acidente notificado com a faixa etária. Esses dados são necessários porque nas faixas etárias menores é onde há os maiores índices de gravidade. Horta e colaboradores (2007) mostraram no seu trabalho a preocupação com essa faixa etária, pois os indivíduos na faixa etária menor que 1 ano de idade, não possuem o poder de comunicação ou de identificação dos animais, tais características intensificam a gravidade, porque a falta do relato do ataque do animal e sua identificação correta dificulta o diagnóstico, causando uma demora, consequentemente a disseminação do veneno ocorre mais efetiva nesses indivíduos, devido a estatura e seu sistema imunológico está em processo de desenvolvimento, podendo gerar sequelas ou óbitos. Figura 5 - Notificações de acidentes escorpiônicos no Brasil de 2011 a 2020 por região geográfica Fonte: SINAN - Ministério da Saúde/SVS Outro fator que deve também ser considerado é o número de óbitos (figura 6), pois nele se pode encontrar o índice de mortalidade dos acidentes. Destacam-se os óbitos por região geográfica, pois é possível relacionar tais aumentos com a urbanização e a adaptação do animal a essas áreas. Nunes e colaboradores (2000) 34 acreditam que as modificações do ambiente natural pelo desmatamento e os diferentes usos do solo urbano pelo homem causam as modificações na cadeia alimentar e no hábitat dos escorpiões, implicando no aumento do índice de notificações em regiões urbanizadas como a Sudeste. Tabela 3 - Distribuição de casos de escorpionismo segundo a faixa etária e a classificação do acidente notificado no Sistema de Informação de Agravos de Notificação no Brasil de 2011 a 2021 Ignorado/ Branco Leve Moderado Grave Total <1 Ano 815 11722 1551 358 14446 1-4 2078 38135 7747 2431 50391 5-9 2569 51385 7411 1842 63207 10-14 2683 60895 56896 881 70155 15-19 3401 76087 5033 498 85019 20-39 13672 305476 21211 1714 342073 40-59 10896 259327 17758 1498 289479 60-64 1887 48142 3510 273 53812 65-69 1453 36927 2727 263 41370 70-79 1724 43726 3568 301 49319 80 e + 543 15946 1501 160 18150 Fonte: SINAN - Ministério da Saúde/SVS Figura 6 - Notificações de óbitos por acidentes escorpiônicos no Brasil de 2011 a 2020 por região geográfica Fonte: SINAN - Ministério da Saúde/SVS 35 4 BIOSSENSORES 4.1 Contextualização Uns dos primeiros autores a conceituarem os biossensores, foram Free e Free (1953), considerados os pioneiros nos procedimentos com a implementação de tiras enzimáticas. Todavia, o experimento apresentou algumas falhas, com isso Clark e Lyons (1962) buscaram inovar e, por um experimento utilizando glicose oxidase funcionalizada na superfície de um sensor de oxigênio, foi mensurada a queda nas concentrações de oxigênio proporcionalmente à de glicose. Tal artigo foi o primeiro a especificar o termo “eletrodo enzimático”. Hicks & Updike (1966) resolveram as falhas necessárias para a construção do sensor sensível à glicose. O sensor foi a base de uma grande diversidade de desenhos iniciais para outras enzimas serem imobilizadas. Arnold e Rechnitz (1987) demostraram que um sensor era uma ferramenta que traduzia a informação química, que se diferenciava com o gradiente da concentração da amostra a ser investigada, em um sinal analiticamente quantificável. Os sensores químicos apresentam elementos básicos: um receptor de reconhecimento e um transdutor. Conceitos como de Chaubey e Malhotra (2002) os biossensores (figura 7) são dispositivos com biomoléculas imobilizadas, os mesmos possuem um transdutor que emite um sinal de resposta da interação dessas biomoléculas com o analito específicos. Os biossensores são multidisciplinares, sendo assim, existe uma diversidade de conceitos e delineamentos. De forma geral, são dispositivos de detecção que agrupam tanto um organismo vivo ou produtos derivados de biomoléculas como DNA, anticorpos, enzimas, dentre outras, como um transdutor que emite um sinal de reconhecimento de uma substância específica no ambiente (PATACAS, 2007). As bases literárias abrigam uma grande diversidade de dispositivos que exploram os receptores celulares em combinação com transdutores acústicos, calorimétricos, eletroquímicos e ópticos, os sistemas de transdução. As mudanças conformacionais observadas no material biológico e/ou no sistema de transdução permitem o desenvolvimento de biossensores (SILVA, 2011). 36 Zuh e seus colaboradores (2018) definem biossensores como dispositivos para converterem um sinal físico de entrada para um de saída relacionado à sua funcionalidade, geralmente na forma de um sinal elétrico ou óptico que pode ser lido ou detectado por usuários humanos ou por instrumentos eletrônicos. As interfaces associadas a esses sensores são usadas para detectar ou mensurar diferentes propriedades físicas e químicas, incluindo temperatura, pH, força, odor, pressão, presença de produtos químicos especiais, fluxo, posição, intensidade da luz, etc. Os biossensores têm um conjunto de características essenciais para seu funcionamento. Bhalla e colaboradores (2016) descreveram cinco das principais: • Seletividade: uma das características mais relevantes do biossensor. A seletividade é a capacidade um bioreceptor reconhecer seu analito alvo em uma solução com outros contaminantes; • Reprodutibilidade: essa característica permite observar em caráter experimental a capacidade do biossensor de gerar respostas idênticas para uma configuração duplicada. A reprodutibilidade é dada pela precisão e exatidão do transdutor e da eletrônica de um biossensor. Precisão é a capacidade do sensor de fornecer resultados semelhantes e a exatidão implica na capacidade do fornecimento do valor médio próximo ao valor real quando uma amostra é medida mais de uma vez; Figura 7 - Diagrama Esquemático de um Biossensor Fonte: Ensafi, 2019 (Adaptação) • Estabilidade: essa característica permite mensurar a suscetibilidade a distúrbios ambientais dentro e ao redor do sistema de biossensibilidade. Esses distúrbios podem causar desvio na resposta dada pelo biossensor causando um erro na concentração medida e pode afetar diretamente a precisão e exatidão. A estabilidade é a particularidade mais crucial em aplicações quando se requer etapas 37 de incubação longas ou monitoramento contínuo. Outro fator que pode influenciar a estabilidade é a afinidade do bioreceptor e sua degradação; • Sensibilidade: a quantidade mínima de analito que pode ser detectada define seu limite de detecção ou sensibilidade. Em procedimentos médicos e ambientais é necessário o uso de biossensores para detecção de analitos com concentração muito baixa como nanogramas ou picogramas. Isso faz da sensibilidade uma característica essencial para os biossensores; • Linearidade: é a característica que permite mensurar a precisão da resposta medida (para um conjunto de medidas de diferentes concentrações). A linearidade do sensor pode ser associada com a resolução do mesmo e as faixas de concentrações do analito testado. A resolução de um biossensor é definida como a menor alteração na concentração de um analito necessário para gerar uma alteração na resposta. A classificação dos biossensores é segundo o transdutor utilizado para se obter o sinal de resposta, assim os mesmos podem ser eletroquímicos, ópticos, piezoelétricos, calorimétricos, e transístores de efeito de campo (CHAUBEY e MALHOTRA, 2002). De acordo Dai e Liu (2019), biossensores eletroquímicos quantificam a concentração de analitos medindo a corrente ou a impedância por vários métodos eletroquímicos. Conforme Daniels e Pourmand (2007), existe uma variedade de vantagens para utilização desses dispositivos, destacando: a rapidez e simplicidade do método, a aplicação em moléculas apolares, que apresentam certas dificuldades de respostas em outras tecnologias, o baixo custo e a possibilidade do uso de instrumentação de pequenas dimensões. Segundo Kim e colaboradores (2019), a área de biossensores aumentou continuamente, tornando-se uma das interdisciplinares mais importantes, com aplicações que vão da medicina ao monitoramento ambiental, à análise de alimentos e ao controle on-line em processos industriais, tornando-se um potencial produto inovador dentro dos parâmetros de tradução do sinal e o processo de imobilização do analito. 38 4.2 Imunossensores eletroquímicos Diferentes autores vêm discutindo sobre o uso de imunossensores. De acordo com Prodromidis (2010), o desenvolvimento de métodos que utilizam a interação anticorpos-antígenos é altamente atraente para as pesquisas que abordam conceitos de afinidades entre moléculas sem rótulos. Dentre as muitos imunossensores, um que vem ganhando espaço são os eletroquímicos, os quais, segundo o autor, permitem o monitoramento direto dessa interação, as características de baixo custo de produção e a capacidade de miniaturização, faz dessa categoria de biossensores um sistema integrado em diagnósticos de monitoramento remoto. Morgan e seus colaboradores (1996) conceituaram um imunossensor como um dispositivo que compreende um antígeno ou espécies de anticorpos acoplados a um transdutor de sinal, que detecta vinculação das espécies complementares. Furtado (2008) conceituou imunossensores como sensores cuja detecção do analito de interesse é baseada em ligações específicas entre antígenos e anticorpos, que têm demonstrado vantagens no custo das análises, sendo menor em relação aos kits comerciais. Para Cristea e colaboradores (2015), os imunossensores são dispositivos em que a reação antígeno-anticorpo ocorrida na superfície do sensor, é a resposta observada com a técnica de eletroquímica pelo transdutor, como consequência obteve-se os imunossensores eletroquímicos com uma das classes mais importantes de biossensores de afinidade. A simplificação do processo de detecção, a redução de tempo de análise e a maior sensibilidade são uns dos gargalos para a construção de um imunossensor. Dentre as técnicas de detecção final, a eletroquímica e a óptica trazem os dados mais confiáveis e de qualidade. Essas duas formas têm sido utilizadas para detecção de antígenos como citocinas, enzimas e outras substâncias, porém o método óptico requer equipamentos de alta complexidade, por isso o uso da técnica eletroquímica vem crescendo, pois fornece resultados com um processo de fácil execução (KONGSUPHOL et al., 2014). Com isso, o mercado e várias áreas, principalmente a da saúde, vêm despertando o interesse em métodos analíticos, rápidos e de baixo custo para a detecção de amostras. Com isso, houve um crescimento no desenvolvimento de 39 sensores como os potenciométricos, amperométricos e voltamétricos no meio científico (ALFAYA & KUBOTA, 2002). O desenvolvimento dos eletrodos impressos (screen-printed electrodes) possibilitou a miniaturização dos eletrodos, aliando ao sistema a redução dos custos, facilidade de manipulação e necessidade de baixo volume de amostra para análise (PUMERA et al., 2007). Segundo Thévenot e seus colaboradores (2001), um sensor amperométrico é a medida de uma corrente produzida por uma reação química entre espécies eletroativas, ocorrendo em um potencial determinado onde a corrente gerada está relacionada com a espécie da solução. As medidas são obtidas in situ e em tempo real e, mesmo não sendo tão precisas e exatas como às obtidas por outros métodos instrumentais, para uma tomada de decisão pode ser suficiente (LOWINSOHN & BERTOTTI, 2006). Corroborando com isso, Gopinath e seus colaboradores (2014), argumentam que os imunossensores têm como principal objetivo gerar produtos de caráter inovativo para utilização como point-of-care testing (POCT) que permitem diagnosticar doenças ou substâncias tóxicas por um dispositivo portátil que possa ser levado ao lugar onde o indivíduo necessita, da cabeceira da sua cama a um lugar bem distante. Os procedimentos analíticos necessitam de equipamentos complexos e pessoal especializado, no entanto, a busca por ensaios rápidos e de fácil aplicação tem sido cada vez maior. Sensores químicos são dispositivos com características que satisfazem essa necessidade e têm sido elementos essenciais na instrumentação analítica, onde se dispensa o uso de aparelhos complexos e uma grande infraestrutura (ALFAYA & KUBOTA, 2002). A eletroquímica estuda os sistemas capazes de gerar corrente elétrica a partir de reações de oxirredução ou sistemas nos quais a oxirredução ocorre pela passagem de uma corrente elétrica (eletrólise). Um sistema eletroquímico é composto por, no mínimo, dois eletrodos (condutores eletrônicos) separados por um eletrólito (condutor iônico) (TICIANELLI & GONZALEZ, 2005). Desde a última década, a técnica eletroquímica mais utilizada para gerar resultados com os imunossensores foi a EIE, pois as várias categorias de interações biomoleculares proporcionaram relevantes expectativas no meio científico (DANIELS & POURMAND, 2007). A EIE é uma técnica eletroquímica utilizada para 40 caracterização de superfícies de eletrodos em diversos campos como energia, eletrocatálise, medicina e analítica. Fundamentalmente, a EIE consiste na aplicação de uma pequena onda senoidal de potencial (ou corrente) numa faixa de frequência determinada, a resposta em corrente (ou tensão) é registrada, e a partir da razão entre os módulos de tensão e corrente e da defasagem entre sinal aplicado e sinal de resposta é determinada uma função complexa Z, a impedância, que depende da frequência (BARSOUKOV & MACDONALD, 2018). Os dispositivos imunossensores estão entre os sensores vitais para requisitos biomédicos, pois eles apresentam alta condutividade (KUMAR, et al., 2019). 5 BIOPOLÍMEROS 5.1 Contextualização Nas últimas décadas, a pesquisa e o desenvolvimento de biossensores aumentaram exponencialmente financeiramente e cientificamente, levando a um grande aumento em publicações. Os biossensores podem interagir com os ambientes físicos, químicos e biológicos. Visto isso, o que vem ganhando grande visibilidade dentro desse meio são os polímeros naturais por estarem ligados a algumas necessidades dos biossensores (ADHIKARI & MAJUMDAR, 2004). De acordo com Maia e colaboradores (2000), as variedades de aplicações de polímeros vêm sendo pesquisadas com base nas seguintes propriedades: condutividade do polímero ou de uma blenda do mesmo, nas suas propriedades eletroquímicas como oxidação e redução e em suas morfologia e microestrutura. Corroborando, Medeiros e colaboradores (2012) descreveram os polímeros como conjugados formados por uma cadeia principal contendo ligações simples e duplas alternadas, onde essa conformação fornece uma estrutura orbital estendida. Franchetti e Marconato (2006) descreveram os polímeros pela sua estrutura de cadeia de macromoléculas repetitivas interligadas covalentemente e possuindo alta massa molecular, podendo ou não ter estruturas tridimensionais, ou até mesmo cadeias lineares, essa diversidade estrutural diferencia os polímeros de sintéticos e naturais. 41 Entre os polímeros naturais existentes, a quitina e a quitosana vêm sendo as mais utilizadas cientificamente devido às suas boas propriedades para o uso em imobilização de anticorpos para aplicação em biossensores. São polímeros de fácil disponibilidade, pois são encontrados em abundância na natureza, o que diminui os custos, e por suas características peculiares como a biocompatibilidade, baixa toxicidade, boas propriedades físico-químicas e facilidade de serem processados de várias formas como membranas, filmes, esferas, entre outras (NARANG & PUNDIR, 2011). 5.2 Quitina e Quitosana A quitina foi descoberta em 1811 como uma substância presente em cogumelos, sendo altamente distribuída especialmente no reino animal e também em animais menos evoluídos como os protozoários (RUIZ-HERRERA, 1978). As concentrações mais altas de quitinas são encontradas em Artrópodes cerca de 85% dos animais são capazes de sintetizar quitina. As cascas de Gastrópode e Lamelibrânquia, no entanto, contêm apenas pequenas quantidades de quitina. Todos os anos, cerca de 100 bilhões de toneladas de quitina são produzidas por crustáceos, moluscos, insetos e fungos. Quitina é a biomassa mais explorada de recurso renovável disponível na Terra (THARANATHAN & KITTUR, 2012). De acordo com Canella e Garcia (2001), a quitina é um biopolímero linear com unidade monomérica b-(1-4)-N-acetil-D-glucosamina, é insolúvel em água, solventes orgânicos, ácidos diluídos e álcalis, é precursora da quitosana e é o segundo biopolímero mais abundante encontrado na natureza depois da celulose. A quitina existe no ambiente em três formas diferentes, distinguidas conforme o posicionamento das cadeias que constituem o polímero, onde podem assumir três conformações polifórmicas (α, β e γ) dependendo de suas estruturas cristalinas (JAWORSKA et. al, 2003). Proveniente da desacetilação da quitina , a quitosana vem sendo um biopolímero empregado para aplicações biomédicas, por ser um material alta biocompatibilidade, biodegradável, antigênico e pela não adsorção de proteínas de acordo com Peter e colaboradores (2010). Sagnella e Mai-ngam (2005) citam as propriedades físicas, químicas e mecânicas da quitosana a torna um insumo no meio 42 tecnológico nas aplicações farmacêuticas e biomédicas como hemodiálise, pele artificial, curativos e sistema de entregas de fármacos. A quitina e a quitosana (figura 8) são polissacarídeos que estão despertando interesse em diversas áreas desde a científica às tecnológicas, utilizando os ativos como materiais poliméricos funcionais, por serem polímeros biocompatíveis, atóxicos, biodegradáveis e biorrenovavéis, tendo uma diversidade de aplicações em grandes áreas como a agricultura, a farmacêutica, a biomédica, a bioengenharia dentre outras (TONHI & PLEPIS, 2002). Figura 8 - Estrutura química da quitina (A) e quitosana (copolímero) (B) Fonte: TĂNASE, et al., 2014 A quitosana com sua estrutura molecular, com grande número de grupos funcionais como amino e hidroxilas primárias e secundárias disponíveis, é considerada ideal para utilização no suporte de imobilização de anticorpo, no processo funcionalização. (OLIVEIRA & VIEIRA, 2006). Nos últimos 40 anos, o interesse comercial nas aplicações de quitosana e derivados aumentou vertiginosamente nas últimas quatro décadas, o que pode ser constatado pelo depósito de patentes no Japão, Europa, China, Coreia e, principalmente, nos EUA (USPTO, 2020). B A 43 6 INOVAÇÃO 6.1 Contextualização O conceito de inovação vem sendo esboçado diferentemente por alguns autores. Schumpeter (1988) afirmou que para existir inovação existe a necessidade de uma transação financeira gerando lucros envolvendo a invenção. No mesmo ano, Dosi (1988) propôs que a inovação está essencialmente ligada à descoberta de novos produtos, novos processos e novos arranjos organizacionais. Higgins (1995) descreveu inovação como o desenvolvimento, adaptação e geração de um novo comportamento de uma corporação. Rogers (1995) definiu inovação como uma ideia ou objetivo novo compreendido por um indivíduo. Curmming (1998) conceituou inovação como a inserção bem-sucedida no mercado de um novo produto ou processo. Conceitos como o de Hashimoto (2006) mostrou a inovação como a mudança, sendo ela grande ou pequena, que consequentemente traz uma transformação e uma quebra de paradigmas que permitam entender e visualizar o tradicional como passível de mudanças positivas e melhorias. Para Rosa e colaboradores (2013), a inovação está relacionada com a criatividade e como fazemos uso dela, utilizando a mesma para desenvolver conhecimento e habilidades, gerando uma mudança que altere o estado do produto, serviço, processo, ou ainda, na criação de um novo mercado não explorado. Rocha (2017) em sua definição de inovação por um viés também econômico, que inovação pode ser entendida como um processo social que parte ou se cria das necessidades humanas, possui legitimação social e resulta em algo novo, útil, viável, sustentável e/ou lucrativo. Niosi e McKelvey (2018) conceituaram a inovação como um processo em que a aplicação científica e industrial do conhecimento tecnológico alimenta novas rotinas e instituições, de modo a relacionar as inovações em mudança do modelo de negócios às cascatas da inovação. Conforme o Manual de Oslo (2005), existe uma classificação de diferentes tipos de inovação, dentre elas a inovação de produto, a inovação de processo, a inovação organizacional e a inovação em marketing (Figura 9). 44 Figura 9 - Classificação dos Tipos de Inovação Fonte: Manual de Oslo, 2005 A eficácia da inovação está atrelada à sua simplicidade, caso contrário poderia ser confuso ou a tornaria inútil. O processo de inovar é sistemático, pois é uma busca organizada de mudanças e oportunidades que geram uma inovação econômica e social (BHUPENDRA & SANGLE, 2015). A inovação de produtos é uma estratégia para empresas que estão começando ou expandindo seu portifólio, onde as mesmas apresentam originalidade, singularidade referente a inovações de produtos. Portanto, a novidade é contabilizada sob duas perspectivas: a do consumidor e a da empresa (SANTOS, PERIN, & SAMPAIO, 2018). A singularidade desses conceitos direciona o método diagnóstico para acidentes escorpiônicos como uma inovação de produto. Nesse contexto, destaca-se a utilidade do produto ao consumidor, que é um dos fatores essenciais para a inovação de produto (SOUZA, DELAZARI, & SEVERO, 2017). A inovação de processo representa também uma oportunidade para o desenvolvimento de novas tecnologias, conforme o Manual e Oslo (2005), essa categoria de inovação foi conceituada como a implementação de um novo método com mudanças expressivas na forma de produção, sendo essas nas técnicas, equipamentos e/ou softwares, gerando uma redução nos gastos e um aumento na qualidade. Kahn (2018) caracterizou a inovação em processo como um ciclo com três princípios: o descobrir, o desenvolver e o entregar. Cada fase desse processo envolve pesquisa experimental, mercadológica e aplicabilidade. 45 6.2 Inovação em Biotecnologia A biotecnologia inclui uma série de disciplinas científicas, bem como conhecimento tecnológico aplicado em diferentes setores. As definições incluem aspectos centrais das disciplinas científicas subjacentes que podem ser aplicadas em muitos setores (MCKELVEY & ORSENIGO, 2006). Para Jesus-Filho e colaboradores (2016), a biotecnologia é uma inovação tecnológica que está revolucionando setores distintos da economia, já que fornece novos processos, produtos e serviços mais eficientes. No entanto, para ocorrer inovação, consubstanciada em novos produtos e processos é necessário algo que transcenda o nível de pesquisa nas universidades e centros de pesquisas. Bianchi (2016) definiu biotecnologia em relação à saúde como um corpo de conhecimento e um conjunto abrangente de procedimentos e tecnologias que analisa os atributos das células permitindo que as moléculas de DNA e proteínas possam criar ou modificar produtos ou processos para usos específicos com várias aplicações. O autor também argumentou que mesmo usando uma definição geral de biotecnologia, não existe uma definição evidente da biotecnologia no setor da saúde, devido à variedade de sistemas biotecnológicos, técnicas químicas e de bioinformática introduzidos nas indústrias relacionadas com saúde. Segundo Felipe (2007), gerar uma inovação no meio biotecnológico não é fácil, demanda vencer alguns obstáculos como o modelo regulatório, captar o investimento público e privado, contar com pessoal qualificado com foco na inovação, gestão, propriedade intelectual voltado para as necessidades da bioindústria e em parceria com o setor empresarial público e privado; buscar uma estrutura empresarial produtiva na forma de uma pirâmide em que existam grandes empresas líderes na área que alimentem e viabilizem a existência de médias e pequenas empresas; e identificar o potencial do mercado brasileiro atraente para o campo. O Brasil tem uma pequena, mas significativa, quantidade de empresas dedicadas à biotecnologia na saúde humana bem como uma grande acumulação de capacidades científicas nesse campo (TORRES FREIRE 2014). De acordo com Bianchi (2016), no período de 2004 a 2014, o Brasil se destacou nos ramos da inovação e políticas produtivas especialmente na importância estratégica das biotecnologias como um instrumento para lidar com os desafios nacionais de saúde, bem como para promover novos conhecimentos e atividades. 46 A biotecnologia avança em paralelo aos avanços na área de Biologia Molecular, que permite a interação e construção com biomoléculas tão complexas como DNA, enzimas, proteínas, dentre outras que demonstram ser ferramentas valiosas no desenvolvimento de tecnologias diagnósticas, principalmente em casos de doenças que necessitam de uma resposta rápida e confiável. Entretanto, deve-se considerar a complexidade das amostras biológicas, os diferentes níveis moleculares de algumas proteínas e interferentes encontrados são fatores imprescindíveis para a eficácia de uma inovação no ambiente médico (SEZGINTURK, 2011). Segundo Gartland e Gartland (2018), as estratégias de biotecnologia devem considerar as oportunidades de pesquisa, inovação e o crescimento do negócio, considerando o progresso recente em áreas como genômica, diagnóstico em saúde, biologia sintética, edição de genes e tecnologias bi-digitais. As oportunidades de pesquisa são discutidas como investimentos inteligentes, estratégicos e especializados. Essas oportunidades geralmente envolvem tecnologias convergentes ou disruptivas, combinando, por exemplo, elementos da ciência farmacêutica, biologia molecular, bioinformática e desenvolvimento de novos dispositivos para aprimorar a biotecnologia e as ciências da vida. Conforme Natoli e colaboradores (2018), avanços recentes na biotecnologia permitiram o desenvolvimento de testes de diagnóstico sensíveis e específicos que detectam e quantificam células, proteínas e ácidos nucléicos. Tais testes são considerados como uma inovação importante no ambiente médico, considerados POCT, os mesmos fornecem benefícios aos cuidados de saúde, especialmente no diagnóstico e detecção de doenças. Verificou-se que os dispositivos POCT têm muitas vantagens, como resposta rápida e precisa, portabilidade, baixo custo e não exigência de equipamentos especializados. O principal objetivo de uma pesquisa de diagnóstico POCT é desenvolver um dispositivo miniaturizado autocontido e baseado em chip que possa ser usado para examinar diferentes analitos em amostras complexas, sendo assim uma inovação biotecnológica destinada à saúde (PANDEY, et al., 2017). O desenvolvimento de testes rápidos é relevante para o ambiente médico, pois os métodos moleculares atuais estão limitados ao uso de equipamentos de alto custo, volumosos, associados a demorados processos e operadores qualificados. Tais limitações dentro de um 47 ambiente clínico implicam na busca por ferramentas econômicas e quantitativas que possam ser implementadas nas rotinas clínicas (CAMPUZANO et al., 2018). Neste contexto, a biotecnologia voltada para o desenvolvimento de dispositivos de POCT com a utilização de biossensores vem despertando grande interesse, pois relacionam o reconhecimento de moléculas biológicas com alta sensibilidade, rapidez, menor volume de amostra, pouco gasto com energia e compatibilidade com diferentes níveis moleculares (CAMPUZANO et al., 2017). Para ocorrer a validação do método diagnóstico (figura 10), é preciso que o dispositivo apresente sensibilidade, especificidade, reprodutibilidade, exatidão e limites de detecção. Na revisão de Dias-Lopes e seus colaboradores (2018), apresentou uma breve revisão sobre a construção e validação de métodos diagnósticos visando a biotecnologia para acidentes com animais peçonhentos. Figura 10 - Roteiro de cinco fases para validação clínica do teste de diagnóstico aracnídeo Fonte: Dias-Lopes e Colaboradores (2018) 48 7 METODOLOGIA 7.1 Obtenção e Caracterização dos Anticorpos Antiescorpiônicos Todo o desenvolvimento técnico do estudo foi realizado na FUNED, no setor de Pesquisa e Desenvolvimento, no Laboratório de Imunologia Aplicada. A purificação foi adaptada da metodologia descrita por Heneine (1995), que consiste no preparo de resinas e a posterior passagem do plasma por elas de modo a obter anticorpos de alta especificidade. Inicialmente, foram confeccionadas três colunas utilizando a resina de Cyanogen bromide-activated Agarose, preparada segundo a metodologia descrita pelo fornecedor Sigma-Aldrich. A resina foi distendida com a utilização da solução de HCl 0,1 M gelada durante 30 minutos, sob agitação constante seguida de centrifugação a 3000 rpm por 5 minutos a 20°C utilizando a centrífuga refrigerada Sorvall ST40-R Thermo Scientific. A resina passou, então, por um procedimento de lavagem com a mesma água ultra pura por cinco vezes (20 mL), sendo a quinta lavagem realizada com solução de acoplamento. Paralelamente, foi realizado o preparo dos venenos, foram pesados e solubilizados em solução de acoplamento (NaHCO3 0,1 M contendo NaCl 0,5 M, pH: 8,3), a cada 1 mL de resina distendida cerca de 5 a 10 mg de veneno, nesse processo é recomendado que não se utilize soluções que tenham aminas na sua composição, pois as mesmas podem reagir com os sítios de ligação da resina. Com o processo de lavagem realizado, foram adicionados às resinas os venenos ofídicos e aracnídeos. Para a resina de serpente, foram utilizados cerca de 15 mg de cada veneno do pool (Crotalus, Bothrops e Micrurus) em uma resina de 5 mL de volume. Para a resina escorpiônica, também 15 mg de veneno de Tityus serrulatus foram utilizados para uma resina de 5 mL de volume, porém para a resina aracnídea foi feito também um pool de veneno de Loxosceles similis e Phoneutria nigriventer com 3 mg e 6 mg respectivamente em uma resina de 2,5 mL, devido à quantidade de proteína de acoplamento a resina aracnídea foi menor. As três resinas foram mantidas em agitação por 2 horas, após esse período retirou os venenos não acoplados a resina, através de centrifugação utilizando os mesmos parâmetros anteriores e os sítios não ligados foram bloqueados utilizando uma solução de Tris- HCl 0,1M pH 8,0 por duas horas. Em seguida, as resinas foram lavadas com um 49 gradiente de pH utilizando duas soluções de acetato 0,1 M pH 3,5 contendo NaCl 0,5 M e Tris-HCl 0,1 M pH 8,7 contendo NaCl 0,5 M, alternando as duas soluções. Posteriomente, as resinas foram lavadas com água ultra pura e empacotadas em sistema de empacotamente de vidro de 10 mL com auxílio de bomba peristaltica. Após o acoplamento, as três colunas foram guardadas em etanol 20%. Para a obtenção dos anticorpos escorpiônicos específicos, plasma hiperimune de cavalo cedido pela FUNED, foi diluído 1:1 em solução de Tris-HCl 0,1 M pH 8,0 e centrifugado a 3000 rpm por 5 minutos a 20°C utilizando a centrífuga refrigerada Sorvall ST40-R Thermo Scientific, primeiramente realizou a eluição do plasma na coluna ofídica, com o auxílio da bomba peristáltica, com um fluxo de 1 mL/min. A coluna foi lavada com água ultra pura utilizando 5 volumes de resina (totalizando 5 mL). Posteriormente, o mesmo volume de solução Tris-HCl 0,1 M pH 8 foi empregado para equilibrar a coluna e então adsorver o plasma diluído e centrifugado, o plasma foi eluido na coluna 3 vezes para atingir uma saturação de ligação com a mesma, em seguida lavou-se a coluna com 5 volumes de coluna com a mesma solução de equilíbrio para retirar não ligantes e depois realizou a eluição utilizando tampão de glicina 2 M pH 3,0 que permite a quebra da ligação com a proteína de acoplamento, foram utilizados 5 volumes de coluna. O procedimento foi repetido até o plasma coletado não ter mais ligantes cruzados ofídicos. Para a coluna aracnídea, foi realizado o mesmo processo apenas utilizando o volume de coluna de 2,5 mL. Para coluna escorpiônica, realizou-se o mesmo processo, porém o tampão de glicina foi coletado, pois, ele continha o anticorpo específico. Para a retirada do excesso salino da amostra de anticorpo, a amostra passou por um processo de diálise, com a utilização de membrana de celulose 33 mm da Sigma Aldrich, utilizou-se água ultra pura do sistema Merck Millipore como solução de troca. Tal processo durou 24 horas com trocas periódicas a cada três horas, após, o anticorpo foi acondicionado em tubos próprios para o processo de liofilização. Os anticorpos purificados foram testados através da técnica de ELISA, método pelo qual se verifica o grau de seletividade e especificidade dos anticorpos obtidos. O protocolo da técnica foi adaptado a partir de Clark e colaboradores (1986). Para a sensibilização da placa de 96 poços, foram utilizados os venenos ofídicos dos gêneros Crotalus, Bothrops e Micurus e venenos aracnídeos das espécies Loxosceles similis, Phoneutria nigriventer e Tityus serrulatus na concentração fixa de 2,5 µg/mL. 50 Foram adicionados à placa 100 µL de cada veneno utilizando uma linha de 12 poços e a mesma foi incubada overnight. Posteriormente, a placa foi lavada utilizando a lavadora de microplacas automática Wellwash da Thermo Scientific, utilizando o protocolo de 300 µL de solução de lavagem por cada poço repetindo 3 vezes. Esse processo foi repetido durante todo ensaio quando era necessário. Após, foram adicionados 100 µL de solução contendo albumina 1% para bloquear sítios onde o veneno não tenha aderido à placa por 1 hora a 37°C, em seguida a placa foi lavada e 100 µL de anticorpos em diluições seriadas iniciando em 12,5 µg/mL foram adicionados à placa, que foi incubada por uma hora a 37°C. Na sequência, uma nova etapa de lavagem foi conduzida e aos poços foram adicionados 100 µL de anticorpo secundário, um conjugado anti-cavalo na diluição de 1:40.000, que foi incubado por mais uma hora a 37°C. Em seguida, lavou-se a placa e adicionou 80 µL do substrato que confere a reação de cor do ELISA, contendo 10 mg de OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride) e 4 µL peróxido de hidrogênio 30% solubilizado em solução de citrato de sódio pH 4,5, normalmente a reação e o aparecimento de cor demora cerca de 30 minutos, após este período adicionou-se 40 µL de solução de ácido sulfúrico a 30 % para interromper a reação. Em seguida, a leitura foi realizada utilizando espectrofotômetro Multiskan GO de microplacas no comprimento de onda de 492 nm. Os resultados obtidos foram mapeados utilizando o Origin Lab, todo processo foi realizado em duplicatas. Contudo, identificar as proteínas com outra metodologia para verificar as reações cruzadas é essencial, para isso utilizou a técnica de Western Blot, uma técnica utilizada para separar e identificar proteínas. A ferramenta permite separar as proteínas por massa molecular com a utilização da eletroforese. O protocolo utilizado foi adaptado de Mahamood e Yang (2012), onde iniciou com o preparo do gel Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide (SDS-PAGE) de 10%, utilizando o sistema Mini- PROTEAN Tetra Cell da Bio Rad, foi adicionado ao gel amostras dos venenos sendo um do pool de serpentes, um de cada veneno aracnídeo e um do veneno escorpiônico na concentração de 1 mg/mL e um padrão molecular. Durante o processo de corrida do gel, deixou-se sob agitação e incubando 4 papeis filtro Whatman e uma membrana de nitrocelulose cortada do tamanho do gel em solução de transferência. Após o término da corrida, o gel de eletroforese também foi incubado em tampão de transferência por 15 minutos. Para a transferência para a membrana, utilizou o 51 sistema semisseco Slot de Transferência Trans-Blot Bio Rad. O aparelho foi limpo com etanol 70%, o sistema foi montado com 2 folhas de papel filtro, seguido da membrana de nitrocelulose com o gel da eletroforese por fim mais 2 folhas de filtro, retirou-se o excesso de solução e qualquer formação de bolhas. A transferência ocorreu com a aplicação de uma tensão de 15 V por 15 minutos. Após, identificou na membrana de nitrocelulose a posição dos venenos e incubou a mesma em solução de bloqueio contendo leite desnatado 5% overnight. Após 24 horas, lavou a membrana com solução de PBS + Tween 20, por 5 vezes e adicionou o anticorpo antiescorpiônico na concentração de 50 µg/mL e foi incubado por 2 horas sob agitação constante. Em seguida, a membrana passou novamente pelo processo de lavagem e adicionou o anticorpo secundário anti-cavalo na diluição de 1: 25.000 incubou-se por 1 hora sob agitação constante. Novamente a membrana foi lavada e foi adicionado o substrato contendo 5 mg DAB (3,3′-Diaminobenzidine) e 40 µL peróxido de hidrogênio solubilizados em solução de TBS (Tris Base 0,2 M + NaCl 1,3 m) com isso observou-se na membrana o aparecimento de bandas proteicas reativas onde pode encontrar ligações cruzadas e inespecificidades do anticorpo purificado. 7.2 Obtenção e Caracterização de Quitosana A matéria-prima utilizada para extração da quitina e quitosana foram os mexilhões-dourados, os quais foram cedidos pelo Centro de Bioengenharia de Espécies Invasoras de Hidrelétricas (CBEIH), coletados em pontos de bioinfestação. Para extração de quitina foram utilizadas as conchas do mexilhão empregando um protocolo de extração adaptado de Rasti e colaboradores (2017), que utilizaram conchas de Polyplacophora para a extração da quitina. O processo de obtenção de quitina iniciou com a limpeza das conchas e pulverização utilizando um moinho IKA Analítico básico A11 até a obtenção de um pó fino. Na sequência, procedeu-se com a desmineralização utilizando solução de HCl 1 M, onde para 10 g de pó das conchas se utilizou 100 mL de solução por 24 horas. Em seguida, a amostra foi centrifugada a 15000 X g por 15 minutos a 25°C, utilizando a centrífuga refrigerada Sorvall ST40-R Thermo Scientific. O pó das conchas desmineralizadas passou por um procedimento de lavagem até atingir a neutralidade e foram secos em estufa a 37°C. Posteriormente, realizou a desproteinização utilizando solução de NaOH 15%, para 52 cada 10 g de amostra desmineralizada utilizou-se 100 mL de solução, por 6 horas a 70°C após o tempo a amostra foi centrifugada nas mesmas condições do processo anterior, a solução alcalina foi trocada e a amostra foi acondicionada a 70°C e a cada 30 minutos a solução foi trocada, com o acompanhamento da clarificação do sobrenadante, que indica a eficácia do método, ou seja, a extração de todo conteúdo proteico. Em seguida lavou-se a amostra até a neutralidade e secou em estufa a 37°C e obteve a quitina. Para obter a quitosana, realizou-se um processo químico na quitina de desacetilação onde empregou uma solução de NaOH 45% a 110°C por 6 h, onde a cada 10 g de amostra utilizou-se 100 mL de solução, após a amostra foi centrifugada. O precipitado foi solubilizado em solução de ácido aceito 0,5 M por 24 horas, sob agitação, em seguida utilizou o sobrenadante para realizar a precipitação da quitosana, adicionando o peroxido de amônio 30% até atingir o pH 8,0. Por fim, a amostra foi centrifugada e o precipitado foi seco em estufa a 37°C e caracterizado como quitosana. Para caracterização das amostras obtidas foi utilizado a técnica de Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR). Confeccionou pastilhas contendo KBr em proporção de 1 mg de amostra para 100 mg do reagente. As duas substâncias foram misturadas com auxílio de almofarizes e pistilos de ágata até a mistura se tornar homogênea e com a utilização de moldes evacuáveis e a petelizadora GS15011 Specac foram produzidas pastilhas de 3 mm. Os espectros de quitina e quitosana foram obtidos utilizando o seguinte método de quatro varreduras no comprimento de onda de 4000 a 450 cm-1, posteriormente os dados obtidos com os espectros foram analisados usando o software ORIGIN 8.0 (Thermo-Nicolet, Madison, WI, EUA). A microscopia eletrônica foi utilizada como método de investigação da topografia das amostras em altas ampliações. As amostras de quitina e quitosana foram acondicionadas em porta amostras de alumínio com a utilização de fita adesiva dupla de carbono de 8 mm, posteriormente as amostras passaram por um procedimento de metalização com ouro, que permite uma maior interação com o feixe de elétrons, pois as mesmas se tornam mais condutivas. Em seguida, a morfologia das amostras foi analisada utilizando um microscópio eletrônico de varredura JEOL, modelo JSM6610LV. 53 7.3 Funcionalização dos Senso