UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Bruno Engler Faleiros Investigação dos processos neuroinflamatórios em um modelo murino de encefalopatia hepática por falência hepática aguda Belo Horizonte 2013  Bruno Engler Faleiros Investigação dos processos neuroinflamatórios em um modelo murino de encefalopatia hepática por falência hepática aguda Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Neurociências da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito para obtenção do título de Mestre em Neurociência. Orientador: Prof. Dr. Antônio Lúcio Teixeira Belo Horizonte 2013                             043 Faleiros, Bruno Engler. Investigação dos processos neuroinflamatórios em um modelo murino de encefalopatia hepática por falência hepática aguda [manuscrito] / Bruno Engler Faleiros. – 2013. 87 f.: il. ; 29,5 cm. Orientador: Antonio Lúcio Teixeira. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciências Biológicas. 1. Encefalopatia hepática – Teses. 2. Fígado – Insuficiência – Teses. 3. Falência hepática aguda. 4. Neuroinflamação. I. Teixeira, Antonio Lúcio. II. Universidade Federal de Minas Gerais. Instituto de Ciências Biológicas. III. Título. CDU: 612.8                 "Assim como a leitura, a mera experiência não pode substituir o pensamento." Arthur Schopenhauer em A Arte de Escrever "Sentia a consciência aguçada de quão estéril é toda especulação intelectual quando apartada da ação e do experimento." Oscar Wilde em O Retrato de Dorian Gray Dedico este trabalho aos professores e mestres, peças fundamentais na formação do pensamento ponderado e do senso crítico, qualidades inerentes àqueles que transformam a sociedade e o mundo.   7 AGRADECIMENTOS Aos meus pais, por me possibilitarem a conquista da liberdade através da educação. Ao professor Antônio Lúcio Teixeira, pela oportunidade, incentivo e críticas fundamentais. À Aline Miranda, pela recepção nessa caminhada, disponibilidade inesgotável e amizade inestimável. À Alline Campos, pela criteriosa instrução e orientação em passos essenciais. À professora Milena Rachid, pelo estímulo teórico e contribuição prática. A todos do grupo de neuroinflamação, pela eterna companhia no dia-a-dia, desabafos e risadas. Ao professor Gustavo Batista Menezes, pelas discussões científicas, roqueiras e divertidas. À professora Elizabeth Ribeiro da Silva, pelo acolhimento e opiniões construtivas. Aos professores Mauro Martins Teixeira e Helton José dos Reis, pelo apoio e estrutura. Ao Lucas Kangussu e a todos os membros dos grupos Imunofarmacologia, Neurofarmacologia e Imunobiofotônica, pela ajuda, paciência e gentileza, novos amigos e novos colegas. E, finalmente, mas nunca menos importante, à Ana Lúcia, inenarrável parceira, companhia essencial nessa aventura e a principal incentivadora do meu desenvolvimento e da minha auto-superação. À todos, o meu muito obrigado.   8 Esta dissertação foi realizada no Laboratório de Imunofarmacologia e no Laboratório de Neurofarmacologia, do Departamento de Bioquímica e Imunologia e de Farmacologia, respectivamente, do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, sob a orientação do Prof. Antônio Lúcio Teixeira, com o auxílio do CNPq e Capes.   9 LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ALT - Alanina aminotransferase AOM - Azoximetano APAP - Acetaminophen; Paracetamol BHE - Barreira hemáto-encefálica BSA - Bovine serum albumin; Albumina de soro bovina C57BL/6 - C57 Black 6 - linhagem de camundongo Ca2+ - Cálcio CCL2/MCP-1 - Chemokine ligand 2 / Monocyte chemotatic protein-1 CCL3/MIP-1α - Chemokine ligand 3 / Macrophage inflammatory protein 1-alpha CCL5/RANTES - Chemokine ligand 5 / Regulated and normal T cell expressed and secreted CEBIO - Centro de Bioterismo da UFMG cGMP - Monofosfato cíclico de guanosina cm - Centrímetro - unidade de medida de comprimento CsA - Ciclosporina A CXCL1/KC - Chemokine ligand 1 / Keratinocyte derived chemokine DMSO - Dimetilsulfóxido EDTA - Etilenodiamino tetracético EH - Encefalopatia hepática ELISA - Enzyme-linked imunnosorbent assay; Ensaio imunoenzimático eNOS - NOS endotelial FHA - Falência hepática aguda FHC - Falência hepática crônica Gln - Glutamina Gln-Tx - Transportador mitocondrial de glutamina Glu - Glutamato GS - Glutamina sintetase GSH-Px - Glutationa peroxidase H&E - Hematoxilina-eosina H2O2 - Peróxido de nitrogênio H2SO4 - Ácido sulfúrico   10 i.p. - Intra-peritoneal Iba-1 - Ionized calcium-binding adaptor molecule-1; Proteína adaptadora de ligação do cálcio ionizado-1 ICB - Instituto de Ciências Biológicas da UFMG IL-1β - Interleucina 1 beta IL-6 - Interleucina 6 iNOS - NOS induzível ISHEN - Sociedade Internacional da Encefalopatia Hepática e do Metabolismo do Nitrogênio KCl - Cloreto de potássio keV - quilo elétron-volt - unidade de medida de energia kg - Quilograma - unidade de medida de massa KH2PO4 - Fosfato de potássio LCF - Líquido céfalo-raquidiano LDH - Lactato desidrogenase M - Molar - unidade de medida de concentração mg - Miligrama - unidade de medida de massa ml - Mililitro - unidade de medida de volume MPO - Mieloperoxidase MPT - Mitochondrial permeability transition; Permeabilidade transitória mitocondrial N - Número de repetições ou animais Na2HPO4 - Fosfato dissódico Na3PO4 - Fosfato trissódico NAC - N-acetilcisteína NaCl - Cloreto de sódio NAD+ - Nicotinamida adenina dinucleotídeo NADH - Nicotinamida adenina dinucleótido hidreto NAG - N-acetil-β-D-glicosaminidase NaH2PO4 - Fosfato monossódico NH3 - Amônia nm - Nanômetro - unidade de medida de comprimento NMDA - N-metil D-aspartato NO - Nitric oxide; Óxido nítrico NOS - Nitric oxide synthase; Óxido nítrico sintetase   11 O2Ÿ- - Superóxido ONOO- - Peroxinitrito p.i. - Pós-indução p/v - Peso por volume - unidade de medida de concentração PAG - Phosphate-activated glutaminase; Glutaminase dependente de fosfato PBS - Phosphate buffer saline; Tampão fosfato-salina PIC - Pressão intracraniana PMSF - Phenylmethanesulfonyl fluride; Fluoreto de fenilmetanosulfonil R$ - Reais - moeda brasileira RNA - Ácido ribonucléico RNAm - RNA mensageiro RNS - Reactive nitrogen species; Espécies reativas de nitrogênio ROS - Reactive oxygen species; Espécies reativas de oxigênio rpm - Rotações por minuto s.c. - Subcutâneo SEM - Standard error mean; Erro padrão da média SIRS - Systemic inflammatory response syndrome; Síndrome da resposta inflamatória sistêmica SNC - Sistema nervoso central SOD - Superóxido dismutase sTNFR-2 - Receptor solúvel de TNF-α TAA - Tioacetamida TBARS - Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico TNF-α - Tumor necrosis factor alpha; Fator de necrose tumoral alfa U - Unidade arbitrária UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais µl - Microlitro - unidade de medidade de volume   12 LISTA DE FIGURAS FIGURA 1. Diminuição da atividade locomotora dos animais que receberam TAA por via i.p........ ........ .................................. .......................... .................. .......... .................. ......... ...........41 FIGURA 2. Evidência de lesão hepática significativa em 24 horas p.i. da EH com TAA.......43 FIGURA 3. Alterações ultraestruturais no cérebro de animais com EH..................................45 FIGURA 4. Extravasamento do corante azul de Evans em tecido cerebral 24 horas após injeção de TAA.........................................................................................................................48 FIGURA 5. Aumento dos níveis de citocinas e quimiocinas cerebrais pelo tempo.................50 FIGURA 6. Aumento dos níveis de citocinas e quimiocinas séricas pelo tempo.....................52 FIGURA 7. Diferença de concentração de TNF-α, CXCL1/KC e CCL3/MIP-1α entre cérebro e soro.........................................................................................................................................54 FIGURA 8. Redução significativa da atividade das enzimas antioxidantes no cérebro pós TAA... ...... ........................ .............. .............. ......... ................................ ............... ............ .........56 FIGURA 9. Comportamento de migração leucocitária para tecido cerebral............................58 FIGURA 10. Atividade das enzimas MPO e NAG como quantificação de leucócitos em tecido cerebral...........................................................................................................................60 FIGURA 11. Corte histológico de cérebro em 48 horas p.i. da EH por TAA..........................62 FIGURA 12. Análise morfológica por imuno-histoquímica de córtex cerebral e mensuração da densidade celular..................................................................................................................64   13 SUMÁRIO RESUMO............... ..................................... ...................... ............................... ........................16 ABSTRACT................. ................. ................................... ........................................................17 1. INTRODUÇÃO...................................................................................................................18 1.1. Aspectos gerais......................................................................................................18 1.2. Fisiopatologia.........................................................................................................19 1.3. Inflamação..............................................................................................................21 1.4. Neuroinflamação....................................................................................................22 1.5. Estresse oxidativo/nitrosativo................................................................................23 1.6. Modelos animais de encefalopatia hepática...........................................................26 1.7. Tioacetamida..........................................................................................................28 2. OBJETIVOS........................................................................................................................29 2.1. Objetivo geral.........................................................................................................29 2.2. Objetivos específicos.............................................................................................29 3. METODOLOGIA...............................................................................................................30 3.1. Animais..................................................................................................................30 3.2. Modelo experimental de encefalopatia hepática por falência hepática aguda.......30 3.3. Avaliação do comportamento locomotor por meio do teste em campo aberto......31 3.4. Mensuração da lesão hepática por quantificação da alanina aminotransferase sérica................................... ............................................... ................................................. ......31 3.5. Análise histológica de fígado e cérebro.................................................................32 3.6. Análise morfológica de tecido cerebral por microscopia eletrônica......................32 3.7. Avaliação funcional da barreira hemato-encefálica por extravazamento do corante azul de Evans em tecido cerebral..............................................................................................33 3.8. Avaliação da resposta inflamatória por dosagem de citocinas e quimiocinas em tecido cerebral e soro................................................................................................................33 3.8.1. Processamento de tecidos para quantificação de citocinas e quimiocinas..........33 3.8.2. Determinação dos níveis de citocinas e quimiocinas..........................................34 3.9. Determinação do estado redox em tecido cerebral................................................34 3.9.1. Determinação dos níveis de peroxidação lipídica no cérebro.............................35   14 3.9.2. Determinação da atividade enzimática da glutationa peroxidase no cérebro.....35 3.9.3. Determinação da atividade enzimática da superóxido dismutase no cérebro.....35 3.9.4. Determinação da atividade enzimática da catalase no cérebro...........................36 3.9.5. Determinação da concentração de proteína nas amostras...................................36 3.10. Avaliação do recrutamento leucocitário por análise de rolamento e adesão em vasos cerebrais através de microscopia intravital.....................................................................36 3.11. Estimativa da migração de neutrófilos e macrófagos para tecido cerebral através da dosagem da atividade das enzimas mieloperoxidase e N-acetil-β-D-glicosaminidase........37 3.11.1. Processamento do tecido cerebral para os ensaios de MPO e NAG.................37 3.11.2. Dosagem da atividade da MPO.........................................................................38 3.11.3. Dosagem da atividade da NAG.........................................................................38 3.12. Investigação da ativação de micróglia por marcação imuno-histoquímica da proteína adaptadora de ligação ao cálcio ionizado-1................................................................39 3.13. Análise estatística.................................................................................................39 4. RESULTADOS...................................................................................................................40 4.1. A atividade locomotora está diminuída nos animais que receberam injeção de TAA............................. .......................................... ................................................................. ..40 4.2. No momento em que os animais exibem diminuição da atividade locomotora, há intensa lesão hepática generalizada...........................................................................................41 4.3. Concomitante à lesão hepática extensa e à diminuição da atividade locomotora, há alterações ultraestruturais no cérebro........................................................................................44 4.4. Há disfunção da barreira hemato-encefálica nos animais 24 horas após injeção de TAA.............. ................................ .......................................... ..................................................47 4.5. Há aumento dos níveis de citocinas e quimiocinas em tecido cerebral principalmente em 24 horas pós-injeção de TAA.....................................................................49 4.6. Há aumento dos níveis de citocinas e quimiocinas séricas principalmente em 48 horas pós-injeção de TAA........................................................................................................51 4.7. Há um maior gradiente de TNF-α e de CCL3/MIP-1α no cérebro e de CXCL1/KC no soro.......................................................................................................................................53 4.8. Há redução da atividade de enzimas antioxidantes no cérebro dos animais 24 horas p.i. da EH por TAA.........................................................................................................55 4.9. Há aumento no rolamento de leucócitos em microvasos cerebrais em 48 horas p.i. da EH por TAA.........................................................................................................................57   15 4.10. A indução da EH por TAA leva ao aumento da atividade da N-Acetil-β-D- Glicosaminidase no cérebro......................................................................................................59 4.11. Avaliação histológica do cérebro em 48 horas p.i. da EH por TAA não revela infiltrado inflamatório compatível com macrófagos.................................................................61 4.12. Análise imuno-histoquímica de córtex cerebral não revelou maior densidade celular de micróglia...................................................................................................................63 5. DISCUSSÃO........................................................................................................................66 6. CONCLUSÕES...................................................................................................................75 7. REFERÊNCIAS..................................................................................................................76   16 RESUMO A encefalopatia hepática (EH) é uma síndrome neuropsiquiátrica que resulta da falência hepática aguda (FHA), sendo uma de suas principais complicações. O seu surgimento implica em aumento da gravidade do quadro e da chance de morte nesses pacientes. Em seu processo fisiopatológico, a EH desenvolve-se por alterações cerebrais induzidas pelo aumento da amônia e resposta neuroinflamatória com aumento de citocinas proinflamatórias e estresse oxidativo/nitrosativo. A compreensão da neuroinflamação nesse cenário é fundamental para ampliar o espectro clínico de intervenção terapêutica na EH e aumentar a sobrevida na FHA. Sendo assim, o objetivo do presente estudo foi de elucidar o envolvimento celular e o perfil de resposta inflamatória no cérebro de camundongos com EH induzida por tioacetamida, uma droga hepatotóxica. A atividade locomotora foi utilizada como parâmetro clínico para avaliar a apresentação e a intensidade de sintomas nos modelos experimentais desse estudo. Observamos que, em 24, 36 e 48 horas pós-indução da EH, houve redução significativa da movimentação desses animais. Além disso, em 24 horas, essa redução foi mais relavante se comparados ao grupo controle. Em paralalo a esse quadro sintomático precoce e intenso, também notamos aumento no nível cerebral da citocina proinflamatória IL-1β e das quimiocinas CXCL1/KC, CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α e CCL5/RANTES. Além disso, houve maior gradiente cerebral da citocina TNF-α, quando comparado ao sangue, e queda na atividade das enzimas antioxidantes SOD, GSH-Px e catalase. Ao investigarmos a participação celular nesse processo, não observamos infiltrado leucocitário ou ativação de micróglia, célula mielóide residente no sistema nervoso central, embora houve evidência de acometimento de astrócitos, célula-alvo nesse processo. Dessa maneira, descrevemos, em um momento precoce no desenvolvimento da EH, um processo neuroinflamatório provavelmente relacionado ao astrócito, em que o estresse oxidativo e a produção de citocinas e quimiocinas cerebrais contribuem para a intensidade dos sintomas. Estudos posteriores serão necessários para elucidar mecanismos da participação do astrócito e de outras células na EH além de investigar a importância ponderada da inflamação e do estresse oxidativo em seu desenvolvimento.   17 ABSTRACT Hepatic encephalopathy (HE) is a neuropsychiatric syndrome that results from acute liver failure (ALF) and one of its major complications. HE emergence implies an increase in the severity and risk of death in these patients. In its pathophysiological process, HE develops in consequence of hyperammonemia in the brain and a neuroinflammatory response with increased proinflammatory cytokines and oxidative and nitrosative stress. The understanding of neuroinflammation in this scenario is important to expand the clinical spectrum of therapeutic intervention in HE and improve survival in ALF. Therefore, the objective of this study was to elucidate the cellular profile involvement and inflammatory response in the brain of mice with HE induced by thioacetamide, a hepatotoxic drug. The locomotor activity was used as a parameter to evaluate clinical presentation and severity of symptoms in the experimental models of this study. We observed that in 24, 36 and 48 hours post-induction of HE, there was significant reduction in the movement of these animals. Furthermore, in 24 hours, this reduction was more relevant compared to the control group. In parallel with this early and intense symptomatic scenario, we also noticed an increase in the level of brain proinflammatory cytokine IL-1β and chemokines CXCL1/KC, CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α and CCL5/RANTES. Moreover, there was also a higher gradient of cytokine TNF-α in the brain when compared to blood, and a diminished activity of antioxidant enzymes SOD, GSH-Px and catalase. By investigating the cellular participation in this process, we observed no leukocyte infiltration or activation of microglia, resident myeloid cells in the central nervous system, although there was evidence of involvement of astrocytes, the target cell in the process. Thus, we describe in a moment early in the development of HE, a neuroinflammatory process that is probably related to astrocyte, wherein the oxidative stress and the production of cytokines and chemokines in the brain may contribute to the intensity of symptoms. Further studies are needed to elucidate the mechanisms of participation of astrocytes and other cells of HE in addition to investigate the weighted importance of inflammation and oxidative stress in its development.   18 1) INTRODUÇÃO 1.1. Aspectos gerais A encefalopatia hepática (EH) é uma síndrome neuropsiquiátrica, potencialmente reversível, composta por um amplo espectro de sinais e sintomas que variam desde discreto prejuízo do sono e da atenção até pronunciadas disfunções cognitivas e motoras, confusão mental e coma (SHAWCROSS & WENDON, 2011). A EH é uma das possíveis complicações clínicas decorrentes da falência hepática aguda (FHA) ou crônica (FHC), nas quais substâncias potencialmente tóxicas, como a amônia (NH3) não são metabolizadas pelo fígado (FERENCI et al., 2002). A etiologia mais comum da EH é a FHC, ou cirrose, que é listada como a 14ª causa de morte mais prevalente no mundo e a 10ª na América Latina (DÁVALOS MOSCOL & BUSTIO SANCHEZ, 2011). No contexto da FHC, a EH apresenta uma evolução indolente ao longo de meses, com períodos de exacerbações frequentes, o que gera uma enorme perda da qualidade de vida e da capacidade laborativa do paciente. Já na FHA, embora mais rara, a EH caracteriza-se por uma progressão dramática com rápida deterioração do quadro neurológico, edema cerebral, aumento da pressão intracraniana (PIC), coma e morte (VAQUERO et al., 2003a). A FHA é uma urgência médica com alta taxa de mortalidade, principalmente por hipertensão intracraniana em consequência de edema cerebral (O' GRADY et al., 1993). Sua etiologia varia geograficamente sendo que, nos países em desenvolvimento, as hepatites virais são as causas mais frequentes, enquanto que, nos países desenvolvidos, esse lugar é ocupado pela hepatite medicamentosa (ICHAI & SAMUEL, 2011). Conceitualmente, a FHA caracteriza-se pela perda da função hepática após extensa necrose celular, com surgimento de hiperbilirrubinemia, coagulopatia e EH, sendo esta um importante fator prognóstico. O período decorrente entre a lesão hepática inicial e a manifestação da EH estima a chance de sobrevivência do paciente e sua progressão para estágios mais graves aumenta o risco de morte (BERNAL et al., 2010; LEE, 2012; O' GRADY et al., 1993; STRAVITZ & KRAMER, 2009). Atualmente, o transplante hepático é o único tratamento definitivo disponível para a FHA e cerca de apenas 15% dos pacientes que apresentam critérios para o procedimento   19 sobrevivem sem o mesmo (BERNAL et al., 2010; VIANA et al., 2008). Desse modo, o suporte clínico é o cerne principal dentre as abordagens terapêuticas da FHA, com o intuito de manter a funcionalidade e viabilidade do organismo do paciente até o transplante ou até a recuperação completa e espontânea do quadro (BERNAL et al., 2010; MARQUES et al., 2012; STRAVITZ & KRAMER, 2009; VIANA et al., 2008). Entre os pontos mais importantes do suporte clínico desse tipo de paciente está o manejo da EH, crucial para uma melhor evolução do quadro. Hoje, o foco de concentração médica está em medidas suportivas que tentam retardar a sua progressão e a elevação da PIC (MPABANZI & JALAN, 2012; SHAWCROSS & WENDON, 2012). Dessa maneira, conhecer sua fisiopatologia torna-se fundamental, uma vez que possibilita explorar possíveis alvos de intervenção terapêutica específica. Ainda não totalmente elucidada, alguns poucos aspectos de sua patogenia estão bem estabelecidos enquanto a maioria permanece em discussão. 1.2. Fisiopatologia O fígado possui uma capacidade metabólica extraordinária. É o órgão responsável pela síntese, degradação e neutralização de diversas substâncias potencialmente tóxicas ou essenciais ao funcionamento geral do organismo. Entre esses processos, a metabolização da NH3 em ureia é de responsabilidade quase que exclusiva do fígado em um contexto normal (ADEVA et al., 2012). Contudo, em vigiência de uma disfunção hepática suficientemente grave, como a FHA, capaz de reduzir a metabolização da NH3 a níveis críticos, ocorre acúmulo dessa substância na corrente sanguínea. Consequentemente, outros órgãos, como o cérebro e os músculos, passam a ser os responsáveis por sua neutralização (ADEVA et al., 2012). No cérebro, a NH3 é transformada em glutamina (Gln), a partir de glutamato (Glu), pela enzima glutamina sintetase (GS), localizada no citoplasma dos astrócitos (BRUSILOW et al., 2010). Célula central no desenvolvimento da EH, o astrócito é pertencente à neuroglia - grupo de células nervosas outras que não os neurônios - e possui, entre suas principais funções, a manutenção da homeostase do meio extracelular para o funcionamento ótimo dos neurônios (PARPURA et al., 2012). Sendo a NH3 uma substância potencialmente tóxica, os astrócitos são os responsáveis pela sua neutralização em um cenário de hiperamonemia, produzindo uma quantidade excessiva de Gln e consequente hiperosmolaridade, com aumento   20 do volume aquoso intracelular e edema astrocitário, alteração patológica característica da EH (BRUSILOW et al., 2010; CHAVARRIA et al., 2010). O papel da NH3 na fisiopatologia da EH há muito é reconhecido. Seu nível arterial elevado e sua persistência por tempo prolongado está diretamente relacionado à ocorrência de aumento da PIC, herniação cerebral e morte em pacientes com FHA (BERNAL et al., 2007; BHATIA et al., 2006; CLEMMENSON et al., 1999; KUMAR et al., 2012). Em experimentos in vitro com cultura de astrócitos e tecido cerebral, foi observada a ocorrência de edema celular e tecidual na presença de NH3, em uma maneira dose-tempo dependente (BACK et al., 2011; NOREMBERG et al., 1991). Além disso, foi demonstrado que a injeção intraperitoneal de NH3 em ratos sem lesão hepática é capaz de induzir alterações neurológicas dose dependente, com coma e morte (GÖRG et al., 2008; HERMENEGILDO et al., 2000). Contudo, o efeito da NH3 na EH não parece se restringir ao estresse osmótico causado pela Gln e consideráveis evidências apontam para uma importante participação da inflamação e do estresse oxidativo (BOSOI & ROSE, 2012; BUTTERWORTH, 2011; SKOWROŃSKA & ALBRECHT, 2012). Em modelos animais sem lesão hepática, foi observado aumento dos níveis cerebrais de citocinas proinflamatórias, prostaglandinas e estresse oxidativo/nitrosativo quando administrado NH3 por via oral ou intraperitoneal (GÖRG et al., 2008; RODRIGO et al., 2010). Ademais, a NH3 também promove uma disfunção na atividade neuronal através da ativação de receptores excitatórios do tipo N-metil D-aspartato (NMDA) no cérebro, acarretando em dessincronização das redes neuronais, o que poderia explicar, em parte, a sintomatologia observada em pacientes com EH (HERMENEGILDO et al., 2000; SCHWARZ et al., 2012). Interessantemente, estudos que intencionaram avaliar os efeitos da redução plasmática e cerebral da NH3, através de medidas expoliativas ou potencializadoras do metabolismo muscular, não demonstraram evidência de eficácia dessas estratégias em pacientes com falência hepática e EH (ALBA et al., 2002; ALS-NIELSEN et al., 2004; LUO et al., 2011; PÉREZ HERNÁNDEZ et al., 2011). Nesse sentido, discute-se o conceito de sinergia na fisiopatologia da EH, na qual fatores como a inflamação e o estresse oxidativo tem seus papéis redefinidos, não como coadjuvantes, mas como personagens centrais e amplificadores da neurotoxicidade da NH3 (BUTTERWORTH, 2008). Esse novo olhar sob a EH traz uma perspectiva animadora, uma vez que abre possibilidades e caminhos a serem explorados, no intuito de ampliar e melhorar o arsenal terapêutico, para a condução clínica desses pacientes.   21 1.3. Inflamação Atualmente, é crescente o número de evidências que demonstram a inflamação como um dos pontos-chave na abordagem da EH e sua sinergia com a NH3 e a Gln (BUTTERWORTH, 2011). A presença da síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS) em pacientes com FHA, mesmo sem o desenvolvimento de infecções, é um importante fator na progressão e piora da EH, sugerindo que a magnitude da resposta inflamatória do paciente estaria diretamente relacionada ao seu prognóstico (ROLANDO et al., 2000; VAQUERO et al., 2003b). Além disso, a própria EH predispõe esse paciente a uma chance maior de infecções com consequente surgimento ou piora da SIRS (ROLANDO et al., 2000). A SIRS trata-se da manifestação clínica de uma resposta inflamatória com ativação de leucócitos e maciça produção de citocinas proinflamatórias, como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e as interleucinas 1-beta e 6 (IL-1ß e IL-6, respectivamente) (ROLANDO et al., 2000). As citocinas proinflamatórias são substâncias imunorreguladoras com a capacidade de estimular a resposta imunológica frente a vários distúrbios da homeostase. Esse aumento dos níveis de citocinas circulantes, principalmente a TNF-α, é neurotóxico e está relacionado ao surgimento de sintomas neurológicos e progressão para estágios graves de EH na FHA (BÉMEUR & BUTTERWORTH, 2012; ODEH, 2007). Em pacientes com FHA, Gupta e colaboradores (2010), através de espectroscopia de ressonância nuclear magnética, estabeleceram uma relação direta entre os níveis de NH3 e Gln no cérebro e o de TNF-α no sangue. Outro estudo, envolvendo 29 pacientes com FHA por sobredose de paracetamol (APAP), uma droga hepatóxica, Rolando e colaboradores (1995) observaram que, embora todos os pacientes apresentavam níveis semelhantes de TNF-α circulante à admissão, houve aumento desses níveis nos pacientes que desenvolveram EH e coma (n=15), enquanto que, no restante (n=14), houve queda de TNF-α circulante e nenhum sinal de EH. A TNF-α também está diretamente relacionado ao aumento de fluxo sanguíneo cerebral em pacientes com FHA, o que contribui para elevação da PIC e progressão da EH (JALAN et al., 2004). Complementarmente, em ratos com EH induzida por TAA, foi observado maior nível circulante de TNF-α em paralelo à menor movimentação ativa dos animais, critério clínico utilizado nesse estudo (CHU et al., 2001). Ademais, em um estudo recente, o uso de etanercept, um bloqueador do receptor solúvel de TNF-α (sTNFR-2), em camundongos com FHA tóxica por azoximetano (AOM), atrasou significativamente o desenvolvimento de coma   22 nesses animais, além de reduzir os níveis circulantes de TNF-α e IL-6 (CHASTRE et al., 2012). Além disso, atualmente, evidências consideráveis discutem o papel da inflamação na patogênese da EH sob outra perspectiva na qual, não só a resposta inflamatória sistêmica mas, também, a resposta neuroinflamatória participa desse processo (BÉMEUR & BUTTERWORTH, 2012; BUTTERWORTH, 2011). 1.4. Neuroinflamação Em um estudo com pacientes com FHA, Wright e colaboradores (2007), através da diferença dos níveis de TNF-α, IL-1ß e IL-6 entre a artéria carótida e a veia jugular, demonstraram uma boa correlação entre o efluxo cerebral de citocinas e o aumento da PIC, sugerindo maior produção cerebral dessas citocinas em paralelo à piora clínica do paciente. Jiang e colaboradores (2009b) demonstraram, em ratos com FHA por desvascularização hepática, significativo edema cerebral com aumento dos níveis e da expressão de RNA mensageiro (RNAm) de TNF-α, IL1-ß e IL-6 in situ, quando esses animais desenvolviam coma. Bémeur e colaboradores (2010c) também reportaram aumento na expressão de RNAm de TNF-α e IL1-ß no córtex frontal de camundongos da linhagem C57BL-6, quando em coma. Nesse mesmo trabalho, Bémeur ainda utilizou camundongos knock-out para receptores de TNF-α e IL1-ß, TNFR1 e IL-1R1, respectivamente, e observou menor edema cerebral e maior tempo para atingir o coma nesses animais. Assim, a neuroinflamação e a produção de citocinas no próprio cérebro ganham destaque e, somadas à disfunção astrocitária, a EH pode ser considerada uma gliopatia primária (BUTTERWORTH, 2012). Nesse sentido, outra célula da neuroglia, a micróglia, surge em um papel ainda em investigação. A micróglia é uma célula fagocítica e mononuclear, residente do sistema nervoso central (SNC), embora seja derivada da linhagem mielóide da medula óssea (PRINZ & MILDNER, 2011). Entre suas funções, destaca-se a vigilância do SNC com o intuito de manter a homeostase. Frente a diversos estímulos, como debris celulares, estresse oxidativo e substâncias proinflamatórias, a micróglia muda seu fenótipo do estado de repouso para o ativado, quando inicia uma resposta imunológica com produção de citocinas proinflamatórias, óxido nítrico (NO) e espécies reativas de oxigênio (ROS) (HANISCH & KETTENMANN, 2007).   23 Zemtsova e colaboradores (2011) demonstraram ativação de micróglia por aumento da expressão da proteína adaptadora de ligação do cálcio ionizado-1 (ionized calcium-binding adaptor molecule-1, Iba-1) em cultura celular exposta à NH3. Os autores reportaram também maior produção de ROS sem, contudo, haver aumento na expressão de RNAm de citocinas proinflamatórias. No mesmo estudo, perfil semelhante foi observado post mortem em amostras de cérebro de pacientes cirróticos com EH comparado aos sem EH. Em outro estudo, Jiang e colaboradores (2009a) demonstraram redução dos níveis de TNF-α, IL1-ß e IL-6 no líquido céfalo-raquidiano (LCF) após tratar um modelo experimental de EH por isquemia hepática com minociclina, um antibiótico inibidor da ativação de micróglia. Comparados aos controles, a minociclina ainda diminuiu significativamente o edema cerebral e aumentou a latência até a instalação do coma. Nesse sentido, abre-se um caminho interessante para descobertas acerca do mecanismo envolvido na fisiopatologia da EH e permite a utilização de fármacos como a minociclina. Sob o foco de se tratar de uma gliopatia primária, a relação imunológica entre astrócitos e micróglia, por meio da neuroinflamação e do estresse oxidativo/nitrosativo, deve ser aprofundada. 1.5. Estresse oxidativo/nitrosativo O estresse oxidativo/nitrosativo ocorre quando há um desbalanço entre a produção de radicais livres - espécies reativas de oxigênio (ROS) e de nitrogênio (RNS), como os superóxidos (O2Ÿ-), peróxido de hidrogênio (H2O2), peroxinitrito (ONOO-) e óxido nítrico (NO) - e sua neutralização (BOSOI & ROSE, 2012). Enzimas antioxidantes como a superóxido dismutase (SOD), a glutationa peroxidase (GSH-Px) e a catalase, além de moléculas neutralizadoras como a glutationa e a albumina, são parte do arsenal biológico de defesa contra o estresse oxidativo e a redução de sua atividade pode resultar em lesão celular (BOSOI & ROSE; 2012). O aumento dos níveis de ROS e RNS acarreta, por sua vez, em desarranjos moleculares em nível protéico, lipídico e de ácidos nucléicos, levando à disfunção e ao edema celular (BOSOI & ROSE, 2012; HÄUSSINGER & GÖRG, 2010; SCHLIESS et al., 2006). Além disso, o edema celular é capaz de promover mais produção de ROS, instalando-se assim um círculo vicioso (REINEHR et al., 2007). Murthy e colaboradores (2001) demonstraram que a adição de NH3 à cultura de astrócitos aumenta a produção de radicais livres e que esse efeito é revertido pela ação da SOD e da catalase. A exposição de astrócitos à NH3 induz a produção de ROS e RNS,   24 potencializando seus efeitos deletérios, de maneira direta, por ativação de receptores excitatórios do tipo NMDA, e indireta, através de disfunção mitocondrial causada pela Gln (NORENBERG et al., 2009; RAMA RAO et al., 2005; SKOWROŃSKA & ALBRECHT, 2012). Experimentos in vitro e in vivo descreveram ativação da via cerebral Glu-monofosfato cíclico de guanosina (cGMP)-NO, pela NH3, através da interação com receptores NMDA, acarretando em aumento de cálcio (Ca2+) intracelular e indução da produção de NO e RNS (HERMENEGILDO et al., 2000; KOSENKO et al., 2003; KRUCZEK et al., 2011). Explorando o influxo de Ca2+ gerado pela NH3, Jayakumar e colaboradores (2009) demonstraram, in vitro, que o aumento de ROS e RNS é prevenido tanto pela utilização de quelante de Ca2+ como por inibidores das enzimas produtoras de radicais livres, com redução do edema celular de astrócito. A Gln também é uma importante indutora do estresse oxidativo no astrócito (ALBRECHT & NOREMBERG, 2006; ALBRECHT et al., 2010; DESJARDINS et al., 2012). Jayakumar e colaboradores (2004) demonstraram que a exposição de astrócitos diretamente à Gln desencadeia a produção de radicais livres. Albrecht e Norenberg, publicaram em 2006, uma revisão sobre o papel da Gln na fisiopatologia da HE e chamaram- na de "Cavalo de Tróia" da neurotoxicidade da NH3. Segundo os autores, a Gln seria um veículo através do qual a NH3 atinge o interior da mitocôndria astrocitária, onde exerce sua principal toxicidade: indução da permeabilidade transitória mitocondrial (MPT) e produção de radicais livres. A Gln é conduzida ao interior da mitocôndria astrocitária por um transportador (Gln- Tx) com alta afinidade para diversos metabólitos, principalmente a histidina. No citoplasma mitocondrial, a Gln é hidrolizada novamente em NH3 e Glu, através da enzima glutaminase dependente de fosfato (PAG), induzindo, consequentemente, a MPT e a produção de ROS (ALBRECHT & NOREMBERG, 2006; RAMA RAO et al., 2003b). A MPT é um processo dependente de Ca2+, em que um influxo aumentado desse íon para o interior da mitocôndria acarreta em colapso do potencial de membrana com disfunção da cascata energética e mais produção de ROS (RAMA RAO et al., 2003b, 2005). A MPT pode ser bloqueada pela ciclosporina-A (CsA) e estudos em que foram utilizados bloqueadores da PAG ou CsA demonstraram diminuição da produção de ROS e do edema celular (ALBRECHT et al., 2000; JAYAKUMAR et al., 2004; JAYAKUMAR et al., 2006; PICHILI et al., 2007; RAMA RAO et al., 2003a).   25 O estresse nitrosativo também exerce um papel importante na fisiopatologia da EH. A inibição inespecífica da enzima produtora de NO, a óxido nítrico sintetase (NOS), em cultura de astrócitos, reduziu significativamente a indução da MPT e a produção de radicias livres (JAYAKUMAR et al., 2004; RAMA RAO et al., 2005). A NOS é expressa em diferentes isoformas e em um modelo animal de FHA por desvascularização hepática de ratos, Jiang e colaboradores (2009c) observaram aumento da expressão das isoformas NOS induzível (iNOS) e endotelial (eNOS) em cérebro e maior nível sérico de nitrito e nitrato, compostos estáveis derivados da produção de NO. Outro fenômeno observado é a nitração protéica pelo ONOO-, composto formado a partir de O2Ÿ- e NO, potencialmente bloqueada pela CsA e por inibidores da GS, da NOS, além de substâncias antioxidantes (SCHLIESS et al., 2006). A nitração protéica ocorre principalmente em astrócitos perivasculares com prejuízo da função de diversas proteínas e edema celular quando expostos à NH3 (HÄUSSINGER & GÖRG, 2010; SCHLIESS et al., 2006). Por fim, um notável desbalanço antioxidante foi demonstrado em modelos animais de EH. Kosenko e colaboradores (2003) demonstraram aumento na produção de O2Ÿ- e redução da atividade das enzimas catalase, GSH-Px e SOD no cérebro de ratos após injeção de NH3. A redução dos níveis de glutationa e da atividade das enzimas catalase e GSH, com concomitante aumento da peroxidação lipídica, também foram observados no cérebro de modelos experimentais de EH por injeção de tioacetamida (TAA), uma droga hepatotóxica (REDDY et al., 2004; SATHYASAIKUMAR et al., 2007; TÚNEZ et al., 2007). Dessa maneira, acumulam-se evidências quanto a participação do estresse oxidativo/nitrosativo e seu sinergismo com a NH3/Gln na fisiopatologia de EH, contribuindo para sua evolução e estabelecendo-se como um possível alvo terapêutico. Nesse sentido, o uso de drogas antioxidantes, como a N-acetilcisteína (NAC), são amplamente exploradas no tratamento da FHA em pacientes com resultados promissores (BERNAL et al., 2010; MARQUES et al., 2012; STRAVITZ & KRAMER, 2009). Além disso, o uso de anti- inflamatórios, como a indometacina, se mostrou capaz de reduzir a nitração de proteínas e oxidação de RNA, em ratos com EH induzida por ligadura da veia portal, com consequente melhora dos parâmetros clínicos avaliados (BRÜCK et al., 2011). Embora ainda haja poucos estudos acerca da relação da inflamação e do estresse oxidativo, já foi demonstrado in vivo e in vitro que citocinas proinflamatórias aumentam a produção de ROS, NO e a nitrosação de proteínas em astrócitos (GÖRG et al., 2006). Sob essa ótica, Alvarez e colaboradores (2011) utilizaram cultura de astrócitos para investigar essa   26 relação e, ao expôr o astrócito à uma solução de TNF-α, IL1-ß e IL-6, os autores observaram indução da MPT, semelhante à NH3, além de amplificação desse efeito quando colocadas as citocinas simultaneamente com a NH3. Mais estudos são necessários para elucidar, de maneira mais detalhada, a sinergia e a relação temporal entre a inflamação e o estresse oxidativo e, assim, mecanismos comuns entre as duas vias poderão se tornar pontos de intervenção com ampla resposta. Para isso, a utilização de modelos animais é uma ferramenta imprescindível, uma vez que o ambiente in vivo não é reproduzível fielmente in vitro, dado à complexidade dessas relações. 1.6. Modelos animais de encefalopatia hepática Em 2008, uma comissão formada por membros da Sociedade Internacional da Encefalopatia Hepática e do Metabolismo do Nitrogênio (ISHEN) organizou e discutiu, no 13º Simpósio da ISHEN, em Pádova, Itália, diretrizes para o desenvolvimento de modelos animais de EH (BUTTERWORTH et al., 2009). Já no início do documento, os autores ressaltam sobre a dificuldade de se estabelecer um modelo animal satisfatório para a EH. A diversidade etiológica da disfunção hepática e os vários fatores que influenciam no desenvolvimento do quadro neurológico, tornam a EH uma síndrome complexa para ser reproduzida fielmente em animais. Os autores ainda destacam que, hoje, não existem modelos satisfatórios para a falência hepática causada por etanol, vírus ou APAP, suas principais etiologias nos seres humanos. Quanto às espécies animais utilizadas, a EH já foi estudada em animais de médio porte (cachorros, porcos, cabras e coelhos) e em roedores (ratos e camundongos). Animais de médio porte possuem a vantagem de maior disponibilidade de tecidos e facilidade de avaliação neuropsiquiátrica. Entretanto, os custos, a logística de manutenção desses animais e as questões éticas envolvidas levaram sua utilização à raridade. Desse modo, a comissão da ISHEN ressalta as vantagens em se optar por um modelo utilizando roedores: maior conhecimento anatômico, comportamental e neurobiológico; genoma caracterizado, o que permite manipulações genéticas; maior disponibilidade de anticorpos e ferramentas de investigação; e, finalmente, mas não menos importante, baixo custo. Nesse sentido, optamos por utilizar roedores, mais especificamente camundongos da linhagem C57BL/6, pela facilidade de manejo, acomodação em biotério e disponibilidade de anticorpos e animais knock-out em nossa estrutura e realidade de trabalho, além da vasta experiência acumulada por nossa equipe.   27 Em relação ao desenvolvimento de um modelo animal de EH por FHA, as diretrizes ressaltam alguns pontos que devem ser observados durante sua padronização, muito embora, os próprios autores ratificam a dificuldade de se adequar a todos: a) quadro clínico reproduzível que permita avaliação e estagiamento neurológico; b) sintomas progressivos que culminem em edema cerebral e suas complicações; c) reversibilidade da doença; d) hiperamonemia sérica ou aumento de NH3/Gln cerebral; e) patologia cerebral e hepática bem caracterizada; f) menor exposição possível da equipe a agentes tóxicos ou infectantes. Levando esses fatores em consideração, e a indisponibilidade de modelos de EH por FHA viral, há, portanto, basicamente, dois tipos de modelos experimentais utilizados para se estudar a EH: (1) a desvascularização hepática e (2) a administração aguda de um hepatotoxina. A principal etiologia da FHA em países desenvolvidos é a hepatite medicamentosa e com a vacinação maciça e melhora das condições sanitárias, há uma tendência de que esse seja o painel etiológico também nos países em desenvolvimento. Optamos, então, pela utilização de um modelo de EH por FHA após administração de uma droga hepatotóxica. Entre as drogas utilizadas para indução de FHA em roedores, há: galactosamina, paracetamol (APAP), azoximetano (AOM) e tioacetamida (TAA). Segundo os autores, a galactosamina e o APAP causam falência hepática embora o desenvolvimento da EH seja variável, com dificuldade de reprodutibilidade e patologia cerebral pouco caracterizada, necessitando de melhores e novas técnicas para alcançar um modelo eficiente. O AOM é uma droga relativamente nova nesse contexto da EH e foi demonstrado ser útil para o desenvolvimento desse modelo, com aspectos patológicos bem caracterizados (BÉLANGER et al., 2006). Por fim, a TAA é uma droga hepatotóxica largamente utilizada em modelos de EH em ratos, demonstra boa reprodutibilidade e acometimento hepático e cerebral bem descritos (CHU et al., 2000; FARJAM et al., 2012; HILGIER et al., 1983a; HILGIER, 1983b; KRAŚNICKA et al., 1983; MLADENOVIĆ et al., 2012; PEELING et al., 1993; PLUTA & ALBRETCH, 1984; ZIMMERMANN et al., 1989). Ademais, além de sua utilização bem estabelecida e da maior disponibilidade de informações na literatura internacional, a TAA ainda é vantajosa financeiramente quando comparada ao AOM. Segundo o sítio da Sigma-Aldrich, empresa fornecedora dessas drogas, o custo por 100mg de AOM é de R$ 3.357,00, enquanto que o de TAA é de R$ 0,18, sendo   28 que na indução da EH usa-se uma dose cerca de 6 vezes maior de TAA quando comparada ao AOM. 1.7. Tioacetamida Previamente, nosso grupo desenvolveu um modelo de EH com camundongos C57BL/6 após injeção intra-peritoneal (i.p.) de TAA, dissolvida em salina, na dose de 600mg/kg (MIRANDA et al., 2010). Foi observado uma taxa de mortalidade entre 30-40% no período de 24 a 48 horas pós-injeção da droga. A partir de 48 horas, os animais apresentavam tendência a melhora e a sobrevivência, evidenciando o caráter de reversibilidade da doença. A necrose hepática foi demonstrada por meio de análise histopatológica e de marcadores séricos de lesão hepatocelular. Além disso, esses animais apresentavam franca sintomatologia ao serem submetidos a uma bateria de avaliação neuropsiquiátrica e aumento significativo na quantidade do neurotransmissor Glu em seus cérebros. A TAA (CH3CSNH2) é uma droga originalmente utilizada como fungicida e que depende da metabolização hepática, pela ação catalítica do complexo microssomal citocromo P-450, em S-dióxido de TAA, para que seu efeito seja tóxico (MANGIPUDY et al., 1995). Esse metabólito reduz a atividade antioxidante no fígado, acentuando a peroxidação lipídica e estabelecendo uma condição de estresse oxidativo que leva à necrose celular (TÚNEZ et al., 2005). A TAA pode ser administrada de diferentes formas: oral (na água ou na ração ingerida), por intubação intragástrica (gavagem), ou por injeções subcutâneas ou i.p. (FONTANA et al., 1996). Nesse ínterim, a utilização de um modelo murino de EH induzida por TAA em camundongos da linhagem C57BL/6 nos permitirá avançar no estudo dos processos inflamatórios e do estresse oxidativo acerca dessa patologia. Uma elucidação detalhada de sua fisiopatologia irá possibilitar a exploração de vias das quais poderá advir um novo alvo terapêutico para a EH.   29 2) OBJETIVOS 2.1. Objetivo geral Investigar os processos neuroinflamatórios envolvidos na fisiopatologia da encefalopatia hepática (EH) em um modelo animal de falência hepática aguda (FHA) por injeção intra-peritoneal (i.p.) de tioacetamida (TAA). 2.2. Objetivos específicos 2.2.1. Caracterizar os aspectos comportamentais do modelo animal de EH após injeção i.p. de TAA; 2.2.2. Caracterizar as alterações morfológicas dos astrócitos no cérebro do modelo animal de EH no momento inicial das alterações comportamentais; 2.2.3. Investigar o perfil inflamatório sistêmico e cerebral do modelo animal de EH através da quantificação de citocinas e quimiocinas pelo tempo; 2.2.4. Investigar a participação do estresse oxidativo/nitrosativo no modelo animal de EH através da peroxidação lipídica e consumo de reservas antioxidantes; 2.2.5. Investigar a participação de leucócitos no cérebro do modelo animal de EH; 2.2.6. Investigar se há participação da micróglia avaliando sua ativação no cérebro do modelo animal de EH.   30 3) MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. Animais No presente estudo foram utilizados camundongos da linhagem C57BL/6, fêmeas, com idade entre oito e dose semanas, obtidos no Centro de Bioterismo do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (CEBIO-ICB-UFMG). Os animais foram mantidos em condições controladas de temperatura (25˚C) e luminonisidade (ciclo claro/escuro de 12/12 horas) com água e ração ad libitum. Este projeto foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CETEA) da UFMG, sob o número de protocolo 114/2009. 3.2. Modelo experimental de encefalopatia hepática por falência hepática aguda O modelo utilizado foi o de encefalopatia hepática (EH) induzida por falência hepática aguda (FHA) causada após intoxicação por tioacetamida (TAA, CH3CSNH2, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, EUA), previamente estabelecido por nosso grupo (MIRANDA et al., 2010). A TAA foi administrada por via intra-peritoneal (i.p.), em injeção única, na dose de 600mg/kg, dissolvida em cloreto de sódio 0,9% (NaCl 0,9%) na concentração de 40mg/mL. Os animais controle recebiam NaCl 0,9% puro. Todos os volumes foram corrigidos pelo peso do animal. As injeções ocorriam às 02 ou às 14 horas, a depender do tempo pós-indução (p.i.) em que o animal fosse estudado. Os grupos controle, 24 e 48 horas p.i. receberam a TAA às 14 horas, enquanto que os grupos 12 e 36 horas p.i. receberam-na às 02 horas. Dessa maneira, todos os animais eram avaliados e seus tecidos coletados no mesmo período do dia, às 14 horas. Para evitar hipoglicemia e hipotermia, foi administrado aos animais, por injeção subcutânea (s.c.), 500µL de glicose 5% dissolvida em NaCl 0,9% e sua temperatura foi controlada por manta térmica. Antes de todos os experimentos, com exceção da avaliação comportamental, os animais foram devidamente anestesiados com uma injeção i.p. de quetamina (80mg/kg) e xilazina (15mg/kg).   31 3.3. Avaliação do comportamento locomotor por meio do teste em campo aberto O teste comportamental em campo aberto foi desenvolvido para avaliação experimental da atividade locomotora e do nível de ansiedade em roedores (HALL & BALLACHEY, 1932; WALSH & CUMMINS, 1976). Para tanto, utiliza-se uma arena circular medindo 30,0 cm de diâmetro, dividida em três círculos concêntricos, cercada por uma parede de acrílico com 30,0 cm de altura (Insight, Brasil). O animal em questão é colocado gentilmente no centro da arena, em uma sala vazia e silenciosa, e sua atividade locomotória espontânea é filmada por cinco minutos enquanto se movimenta livremente. Para gravação e análise dos vídeos, foi utilizado o programa de computador AnyMaze® (Stoelting Co., Wood Dale, EUA). Entre a avaliação de cada animal é realizada a limpeza da arena com álcool 70%. Foram avaliados cinco grupos experimentais: controle (N=8), 12 (N=7), 24 (N=7), 36 (N=9) e 48 (N=8) horas p.i. Realizamos o teste em dois dias subsequentes, ambos às 14 horas, sendo no primeiro dia os grupos 12 e 24 horas p.i., além de 4 animais do grupo controle, e no segundo dia o restante dos animais. 3.4. Mensuração da lesão hepática por quantificação da alanina aminotransferase sérica A alanina aminotransferase (ALT) é uma enzima não-específica mais comumente associada ao fígado. A elevação de seus níveis séricos correlaciona-se diretamente com a lesão hepatocelular e é usada como teste primário para triagem de dano hepático (SENIOR, 2012). Para determinar o nível da ALT sérica em camundongos, foi coletado o sangue através de secção da veia cava inferior, e sucção cuidadosa com pipeta de Pasteur, e centrifugados por 10 minutos, a 10.000 rpm, em temperatura ambiente, para separar o soro. Posteriormente, o kit Transaminase ALT Cinética (K049, Bioclin) foi utilizado segundo as instruções do fabricante. Resumidamente, o teste consiste em duas reações químicas com consequente oxidação de NADH em NAD+ na presença de ALT e lactato desidrogenase (LDH). São feitas quatro leituras por espectrofotometria, em intervalos de um minuto, e a magnitude da variação da absorbância reflete a quantidade de ALT no soro. As leituras são realizadas no comprimento de onda de 340 nm.   32 3.5. Análise histológica de fígado e cérebro Após os animais serem devidamente anestesiados, foi realizada perfusão transcardíaca com uma solução de NaCl 0,9%. Os lobos hepáticos médio e esquerdo foram retirados de grupos controle e 24 horas p.i., enquanto que o lobo cerebral frontal foi retirado de grupos controle e 48 horas p.i. Todos os tecidos foram fixados em uma solução de formaldeído 10%, diluído em PBS, para análise histológica. Em seguida, os tecidos foram desidratados em soluções de álcool etílico em concentrações crescentes (70%, 80%, 90% e absoluto), sendo que os fragmentos permaneceram imersos por um período de 30 minutos em cada solução. Após a desidratação, foi realizado o processo de diafanização, que tem como objetivo tornar o tecido translúcido, submetendo os fragmentos a dois banhos de xilol, com duração de 20 minutos cada. Posteriormente, os tecidos foram impregnados e incluídos em parafina. Os blocos de parafina, contendo o fragmento do órgão, foram submetidos à microtomia, sendo obtidos cortes seriados com 4 µm de espessura. Esses cortes foram, então, corados pela técnica de hematoxilina-eosina (H&E). As lâminas histológicas foram examinadas em microscópico óptico (BX41, Olympus) e as imagens obtidas utilizando uma câmera acoplada (Moticam 2500, Motic) e o programa de computador Motic Image Plus 2.0ML (Ted Pella Inc., EUA). 3.6. Análise morfológica de tecido cerebral por microscopia eletrônica Após os animais serem devidamente anestesiados, foi realizada perfusão transcardíaca com uma solução de glutaraldeído 2,5% para fixação in situ do tecido. O córtex cerebral frontal foi retirado de grupos controle e 24 horas p.i. Em seguida, os tecidos foram desidratados em soluções de álcool etílico em concentrações crescentes (35%, 50%, 70%, 85%, 95% e absoluto) por um período de 10 minutos e em solução de acetona por 20 minutos. Posteriormente, foram imersos em Epon. O tecido foi cortado em secções de 0,5-1,0 µm de espessura. Esses cortes foram, então, corados por Azul de Toluidina e contrastados com citrato de chumbo. As lâminas histológicas foram examinadas em microscópico eletrônico de transmissão (Tecnai G2-12 FEI Company) em 80keV.   33 3.7. Avaliação funcional da barreira hemato-encefálica por extravazamento do corante azul de Evans em tecido cerebral A barreira hemato-encefálica (BHE) é uma interface dinâmica que separa o cérebro do sangue periférico. Possui, entre suas propriedades, permeabilidade seletiva, impedindo que moléculas indesejáveis cheguem ao SNC. Moléculas de grande peso molecular, como a albumina, são incapazes de atravessar a BHE em decorrência dessa permeabilidade seletiva (WILLIS, 2011). Para a avaliação funcional da BHE através de sua permeabilidade seletiva, utilizou-se o corante azul de Evans como marcador, uma vez que ele se combina de maneira reversível com a albumina, podendo ser avaliado o extravasamento plasmático, como descrito por Saria & Lundberg (1983). Os animais foram devidamente anestesiados, sua veia caudal foi canulada, por onde administrou-se 100 µL de azul de Evans 0,5% diluído em PBS. Ao final de trinta minutos, foi realizada perfusão transcardíaca dos animais com PBS. O cérebro foi retirado e colocado em placa de Petri para secagem por 24 horas em estufa a 40°C. Em seguida, as amostras foram pesadas e foi acrescentado ao tecido 1 mL de formamida, para extração do corante, que permaneceu por 24 horas em temperatura ambiente. O corante extraído do tecido foi quantificado por espectrofotometria utilizando-se o comprimento de onda de 620 nm e a concentração determinada através de uma curva-padrão variando de 0,375 a 10 µg/mL de azul de Evans. Os resultados foram normalizados pelo peso do tecido e expressos como quantidade (em µg) de azul de Evans por 100 mg de tecido. 3.8. Avaliação da resposta inflamatória por dosagem de citocinas e quimiocinas em tecido cerebral e soro A avaliação do perfil de citocinas e quimiocinas produzidas após a indução da EH por TAA foi determinada através de ensaio imunoenzimático (Enzyme linked immunosorbent assay - ELISA) conforme previamente descrito (ENGVALL, 1977; VOLLER et al., 1978). 3.8.1. Processamento de tecidos para quantificação de citocinas e quimiocinas Adicionou-se 100 mg de cérebro, região frontal direita, em 1 mL de solução de extração de citocinas [NaCl 0,4 mol/L, Na2HPO4 10 mmol/L, PMSF 0,1 mmol/L, cloreto de   34 benzalcônio 0,1 mmol/L, EDTA 10 mmol/L, Tween 20 0,05% (p/v), albumina bovina (BSA) 0,5% (p/v), aprotinina 20 UI] para o processamento em homogeneizador de tecidos (Power Gen 125 - Fisher Scientific Pennsylvania, EUA). Logo após, as amostras foram centrifugadas (10.000 rpm; 4˚C; 10 minutos), o sobrenadante foi recolhido e congelado a -80°C para a detecção de citocinas e quimiocinas por ELISA. O soro foi separado do sangue através de secção da veia cava inferior, e sucção cuidadosa com pipeta de Pasteur com posterior centrifugação por 10 minutos, a 10.000 rpm, em temperatura ambiente, sendo armazenado à -80˚C até análise posterior. 3.8.2. Determinação dos níveis de citocinas e quimiocinas Os níveis de IL-1β, TNF-α, CXCL1/KC, CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α e CCL5/RANTES foram quantificados no cérebro e TNF-α, CXCL1/KC e CCL3/MIP-1α no soro dos animais controle e 24, 36 e 48 horas p.i. através da técnica de ELISA, utilizando-se kits adquiridos da R&D Systems (DuoSet, Minneapolis, EUA), segundo as instruções do fabricante. Todos os protocolos foram realizados em placas de 96 poços (C96 MicroWellTM Plates, Nunc, Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA). Os anticorpos de captura foram diluídos em PBS, pH 7.4, sendo que a sensibilização da placa ocorreu durante 18 horas à 4˚C. A reação foi bloqueada com PBS acrescido de 1% (p/v) de BSA (Sigma) por 1 hora. As amostras em diluição 1:3 em PBS, o padrão e o branco foram acrescentados aos seus respectivos poços. As placas foram incubadas a 4˚C por mais 18 horas. O anticorpo de detecção foi adicionado aos poços por 2 horas. A reação foi incubada com estreptavidina conjugada com peroxidase (“HRP-Streptavidin Pharmingem” - 1:4000) e revelada com dihidrocloreto de o-fenilenodiamina (Sigma). Após 30 minutos a reação foi interrompida com H2SO4 1M. A leitura foi realizada em leitor de ELISA (Status-labsystems, Multiskan RC, Uniscience do Brasil) com filtro para um comprimento de onda de 492 nm. 3.9. Determinação do estado redox em tecido cerebral O estado redox foi mensurado através da quantificação da peroxidação lipídica e da atividade das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase (GSH-Px), superóxido dismutase (SOD) e catalase. Para tanto, 100 mg de cérebro, região frontal esquerda, foi homogeneizado   35 em 900 µL de solução tampão fosfato-PBS mmol/L: (137 NaCl, 1,5 NaH2PO4, 8,1 Na2HPO4, pH 7,4) e separado em alíquotas para posterior análise. 3.9.1. Determinação dos níveis de peroxidação lipídica no cérebro A peroxidação lipídica foi determinada usando o ácido tiobarbitúrico que reage com o malonaldeído, um produto da peroxidação lipídica, formando as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). A determinação dos níveis de TBARS foi realizada pelo método descrito por Ohkawa e colaboradores (1979). Alíquotas do homogeneizado (0,2 mL) foram adicionadas em 8,1% (p/v) de duodecil sulfato de sódio, 2,5 mol/L de ácido acético (pH 3,4), 0,8% de ácido tiobarbitúrico. A mistura foi incubada por 60 minutos a 95°C. A leitura das amostras foi realizada em espectrofotômetro a 532 nm. 3.9.2. Determinação da atividade enzimática da glutationa peroxidase no cérebro A determinação da atividade da GSH-Px foi realizada pelo monitoramento da oxidação do NADPH (PAGLIA & VALENTINE, 1967). A reação consiste na adição de 1300 µL de água destilada, 200 µL de tampão Tris/HCl (EDTA 1 mol/L; pH 8,0; 5 mmol/L), 200 µL de 10 U/mL de glutationa redutase, 200 µL de NADPH (2,0 mmol/L), 40 µL de glutationa (0,1mol/L) e 40 µL da amostra. A mistura foi agitada em vórtex durante 10 segundos. Em seguida, foi adicionado 20 µL de T-butil hidroperóxido (7 mmol/L) e a mistura foi mantida a 37˚C durante 10 minutos. A absorbância foi determinada em espectrofotômetro com comprimento de onda de 340 nm. A atividade da GSH-Px foi expressa em unidades de atividade enzimática por mg de proteína (U/mg proteína). 3.9.3. Determinação da atividade enzimática da superóxido dismutase no cérebro A atividade da SOD foi avaliada conforme previamente descrito (GAO et al., 1998). Após a homogeneização do tecido, foi adicionado 1,0 mL de tampão fosfato de sódio (50 mmol/L, pH 7,8) contendo 1 mmol/L de ácido dietilenotriaminopentacético. Alíquotas de 40 µL da amostra foram utilizadas e a reação foi iniciada com a adição de pirogalol (0,2 mmol/L). A leitura no espectrofotômetro foi realizada durante 3 minutos a 37˚C a 420 nm. A   36 determinação da atividade da enzima, dada em U/mg, foi calculada como a capacidade da SOD em inibir a auto-oxidação do pirogalol, onde 1U= 50% dessa reação. 3.9.4. Determinação da atividade enzimática da catalase no cérebro O protocolo experimental para determinação da atividade da catalase foi realizado conforme descrito por Nelson e Kiesow (1972), de forma que depois que o tecido foi homogeneizado em PBS, a atividade da enzima foi determinada em 2 mL de tampão fosfato (50 mmol/L, pH 7.0) e uma alíquota (40 µL) do homogeneizado foi adicionada. Em seguida foi adicionado 0,06 mL de substrato (H2O2 0,3 mol/L), e a leitura foi realizada durante 1 minuto a 25°C em 240 nm. A atividade da catalase foi calculada pela variação da atividade da enzima durante um minuto, e o resultado foi expresso como nmol.min-1 por mg/proteína. 3.9.5. Determinação da concentração de proteína nas amostras A determinação da concentração de proteínas de todos os ensaios foi feita pelo método de Bradford (1976) utilizando o corante Coomassie blue. A leitura da reação foi realizada em espectrofotômetro no comprimento de onda de 595 nm. Para quantificação das concentrações de proteínas nas amostras foi realizada uma curva padrão para albumina bovina. As concentrações utilizadas foram de 0,5 a 10 µg de albumina. 3.10. Avaliação do recrutamento leucocitário por análise de rolamento e adesão em vasos cerebrais através de microscopia intravital A técnica de microscopia intravital foi utilizada com o intuito de visualizar o recrutamento de leucócitos através do endotélio da microvasculatura da pia-máter em cérebro de camundongos. Os animais foram devidamente anestesiados e a veia da cauda foi canulada para administração de Rodamina-6G Sigma (0,5mg/kg), um corante fluorescente capaz de marcar leucócitos. Para a visualização dos vasos sanguíneos da pia-máter, foi realizada a ressecção da pele na região do escalpo e, em seguida, uma cranitomia utilizando uma broca cirúrgica de alta velocidade. Abriu-se uma janela óssea de, aproximadamente, 0,5 cm de diâmetro e a dura-máter foi removida, expondo assim os vasos em questão. O rolamento e adesão celular na parede desses vasos foi observada através de um microscópio óptico (Olympus BX40) com uma câmera de vídeo (Optronics) acoplada. As imagens foram gravadas para posterior análise. O rolamento foi considerado para os   37 leucócitos que migraram da região central para a margem do vaso e se moveram a uma velocidade menor que a velocidade dos eritrócitos. A adesão foi definida como leucócitos que permaneceram estacionados no endotélio vascular por um período mínimo de 30 segundos e quantificada pelo número total de células aderentes em 100µm de comprimento da vênula. Foram avaliados três a quatro vasos sanguíneos por animal e os resultados de rolamento e adesão foram expressos como número de células/min e número de células/100µm, respectivamente. 3.11. Estimativa da migração de neutrófilos e macrófagos para tecido cerebral através da dosagem da atividade das enzimas mieloperoxidase e N- acetil-β-D-glicosaminidase A mieloperoxidase (MPO) é uma enzima encontrada nos grânulos azurófilos de neutrófilos. A quantificação de MPO é uma técnica que tem sido utilizada como um marcador bioquímico de recrutamento de neutrófilos para o foco inflamatório e permite demonstrar o componente inflamatório de forma quantitativa (MULLANE et al., 1985). Já a N-acetil-β-D- glicosaminidase (NAG) é uma enzima lisossômica produzida por macrófagos ativados. A dosagem de NAG é uma técnica utilizada como índice da infiltração dessas células nos sítios inflamatórios (BAILEY, 1988). 3.11.1. Processamento do tecido cerebral para os ensaios de MPO e NAG Adicionou-se 100 mg de cérebro, lobo frontal direito, a 1mL de solução de extração de citocinas (NaCl 0,4 mol/L, Na2HPO4 10 mmol/L, PMSF 0,1 mmol/L, cloreto de benzalcônio 0,1 mmol/L, EDTA 10 mmol/L, tween 20 0,05% (p/v), BSA 0,5% (p/v), aprotinina 20 UI) para o processamento em homogeneizador de tecidos (Power Gen 125 - Fisher Scientific Pennsylvania, EUA). Logo após, as amostras foram centrifugadas (10.000 rpm; 4˚C; 10 minutos). O pellet foi homogeneizado em 1,9 mL do Tampão 1, com pH 4,7, contendo 0,1 mol/L de NaCl, 0,02 mol/L de Na2HPO4, 0,015 mol/L de EDTA e centrifugado (10.000 rpm; 4˚C; 10 minutos). O sobrenadante foi desprezado e o pellet submetido à lise celular através da adição de 1,5 mL de NaCl 0,2% (p/v) por um período de aproximadamente 30 segundos. Decorrido esse tempo, foi feita a adição de 1,5 mL de uma solução de NaCl 1,6% (p/v) com glicose 5% (p/v) e a solução final foi homogeneizada e dividida igualmente em dois eppendorfs® que foram centrifugados (10.000 rpm; 4˚C; 10 minutos). O sobrenadante foi   38 novamente desprezado, cada tubo devidamente identificado (NAG e MPO) e foram adicionados 800 µL de salina 0,9% (p/v) com triton X-100 1% (p/v), para o ensaio de NAG; ou 800 µL de tampão fosfato [0,05 mol/L de Na3PO4 e 0,5% (p/v) de hexadecil-trimetil brometo de amônia, pH 5,4] para o ensaio de MPO. Cada solução foi homogeneizada e congelada em freezer -80°C para posterior realização de ensaio enzimático. 3.11.2. Dosagem da atividade da MPO O tecido processado foi submetido a três ciclos de congelamento e descongelamento em nitrogênio líquido para liberação da enzima das vesículas citoplasmáticas e centrifugado (10.000 rpm; 4˚C; 15 minutos). O sobrenadante foi utilizado para o ensaio enzimático. A reação se inicia com a adição de 25 µL de tetrametilbenzidina (Sigma) diluída em dimetilsulfóxido (DMSO, Merck) na concentração final de 1,6 mmol/L a 25 µL da amostra em uma placa de 96 poços (C96 MicroWellTM Plates, Nunc, Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA). A placa foi levada a estufa a 37˚C por 10 minutos e depois foram adicionados 100 µL de peróxido de hidrogênio 1,2 mmol/L em tampão fosfato de sódio 80 mmol/L, pH 5,4; e em seguida foi feita uma nova incubação a 37˚C por 10 minutos. Para o término da reação, adicionou-se 100 µL de H2SO4 1 mol/L. A atividade da MPO foi calculada pela medida das alterações na densidade óptica a 450 nm. Os resultados foram expressos como neutrófilos x 105. 3.11.3. Dosagem da atividade da NAG O tecido processado foi centrifugado (3.000 rpm; 4˚C; 10 minutos) e o sobrenadante coletado. A reação iniciou-se com a adição de 100 µL das amostras em uma placa de 96 poços. Às amostras foram adicionados 100 µL do substrato (p-nitrofenil-N-acedtil-β-D- glicosamina, Sigma) diluído em tampão citrato/fosfato pH 4,5 na concentração de 2,24 mol/L. Sobrenadante e substrato foram incubados a 37˚C durante 10 minutos. Após essa incubação, a reação foi interrompida pela adição de 100 µL de tampão glicina 0,2 mol/L, pH 10,6. A absorbância foi analisada por espectrofotômetro (Spectra Max 190, Molecular Devices) no comprimento de onda de 405 nm. Os resultados foram expressos como NAG unidades relativas em 100 mg de tecido.   39 3.12. Investigação da ativação de micróglia por marcação imuno- histoquímica da proteína adaptadora de ligação ao cálcio ionizado-1 Para o estudo da ativação de micróglia foi utilizado o método de imuno-histoquímica e quantificação do total de células positivas para proteína adaptadora de ligação ao cálcio ionizado-1 (ionized calcium-binding adaptor molecule-1, Iba-1, Abcam 1:250). Após os animais serem devidamente anestesiados e perfundidos por via transcardíaca com paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1M (Na2PO4 0,1M, NaHPO4 0,1M em pH 7,4), seus encéfalos serão retirados e colocados em solução de paraformoldeído por 24 horas. Após esse período, os tecidos foram transferidos para uma solução de sacarose 30%. Os encéfalos foram cortados em criostato na espessura de 20µm e colocados em solução crioprotetora. Foram utilizadas as secções de córtex frontal para os procedimentos de imuno- histoquímica, colocadas em placas de 24 poços contendo PBS para a retirada do excesso de crioprotetor. Os cortes receberam lavagens sucessivas com PBS. Após o procedimento, as secções foram colocadas em solução de bloqueio de BSA 1% por 2 horas, seguidos de incubação por 12 horas com os anticorpos primários contra Iba-1. Depois do período de incubação, os cortes foram lavados e, em seguida, incubados por 1 hora com anticorpo secundário biotinilado (1:1000; Kit Vecastein-Vector Lab). Após essa etapa, o tecido foi submetido à incubação por 1 hora com o complexo AB (1:1000) e revelação pelo método de DAB (3,3'-diaminobenzidina). Os cortes foram lavados em PBS e montados em lâminas e lamínulas com auxilio do meio de montagem Entelan. As imagens foram analisadas com auxílio de um microscópio de luz Zeiss e dos programas de computador AxioVision® 4.8.1 (Carl Zeiss) e ImageJ 1.6.0 (Wayne Rasband). 3.13. Análise estatística Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (standard error of the mean, SEM). As diferenças entre as médias de dois grupos foram analisadas utilizando-se o teste T não-pareado. No caso de três ou mais grupos, foi utilizado One-Way ANOVA seguido do pós-teste de Turkey. No caso de duas ou mais variáveis a serem analisadas, foi utilizado Two-Way ANOVA seguido do pós-teste de Bonferroni. As análises estatísticas foram realizadas pelo programa de computador GraphPad Prism® (GraphPad Software Corporation, versão 5.00, EUA, 2007). Os resultados foram considerados estatisticamente significativos quando p < 0.05.   40 4) RESULTADOS 4.1. A atividade locomotora está diminuída nos animais que receberam injeção de TAA Com intuito de avaliarmos qual seria o momento mais precoce do aparecimento de sintomas nos animais que receberam TAA i.p., foi utilizado o teste comportamental em campo aberto. Podemos observar uma tendência à queda na atividade locomotora 12 horas p.i. da EH (7105 ± 1315, N=7), entretanto sem diferença estatística quando comparado ao controle. Contudo, em 24 horas p.i. (3845 ± 325,5, N=7), há significativa redução na movimentação ativa desses animais, quando comparada ao controle (9818 ± 1326, N=8) (p<0.001). Observamos tendência à melhora em 36 (4594 ± 410,2, N=9) e 48 horas p.i. (5917 ± 804,4, N=8), quando há aumento da locomoção, ainda estatisticamente significativa se comparada ao grupo controle (p<0.01 e p<0.05, respectivamente) (Figura 1).   41 Figura 1. Diminuição da atividade locomotora dos animais que receberam TAA por via i.p. Os animais foram divididos em cinco grupos experimentais e avaliados por meio do teste em campo aberto. Sua movimentação livre em uma arena foi filmada por 5 minutos e analisada pelo AnyMaze®. Quando comparados ao controle, os grupos 24, 36 e 48 horas p.i. apresentam redução estatisticamente significativa na atividade locomotora. Não houve diferença entre os grupos 12, 24, 36 e 48 horas p.i. (* p<0.05, ** p<0.01, *** p< 0.001, resultados expressos em média ± SEM, N: contole=8, 12 hrs p.i.=7, 24 hrs p.i.=7, 36 hrs p.i.=9, 48 hrs p.i.=8, teste estatístico One-Way ANOVA com teste de Turkey). Co ntr ole 12 hr s p .i. 24 hr s p .i. 36 hr s p .i. 48 hr s p .i. 0 5000 10000 15000 *** ** * D is tâ nc ia p er co rr id a (c m )   42 4.2. No momento em que os animais tornam-se sintomáticos, há intensa lesão hepática generalizada Em 24 horas p.i. da EH por TAA, momento em que os animais tornaram-se estatisticamente sintomáticos por diminuição da atividade locomotora, optamos por investigar se a injeção de TAA foi suficiente para causar lesão hepática. Observamos então intensa necrose hemorrágica centrolobular em cortes histológicos de fígado em 24 hrs p.i. da EH (Figura 2B) quando comparados ao controle (Figura 2A). Em paralelo, há elevação dos níveis séricos de ALT (24 hrs p.i. 2903 ± 349,7, N=7 versus controle 34,51 ± 8,61, N=5, p < 0.001).   43 Figura 2. Evidência de lesão hepática significativa em 24 horas p.i. da EH com TAA. Os animais foram divididos em dois grupos experimentais. O sangue foi retirado e o soro separado por centrifugação enquanto o fígado formolizado. (A) Corte histológico de fígado dos animais controle demonstrando parênquima hepático conservado com tríade portal e hepatócitos íntegros. (B) 24 horas após injeção de TAA, observa-se intensa necrose hemorrágica centrolobular com infiltrado leucocitário discreto e vacuolização de alguns hepatócitos. H&E, x200. (C) Elevação do nível sérico de ALT 24 horas após injeção de TAA comparado ao controle (*** p < 0.001, resultados expressos em média ± SEM, N: controle=5, 24 hrs p.i.=7, teste de t não pareado). Co ntr ole 24 hr s p .i. 0 1000 2000 3000 4000 *** C A LT ( U /L )   44 4.3. Concomitante à lesão hepática extensa e à diminuição da atividade locomotora, há alterações ultraestruturais no cérebro Com o intuito de identificar alterações ultraestruturais no cérebro desses animais no momento em que se tornam sintomáticos, realizamos análise em microscopia eletrônica. Quando comparados ao controle (Figura 3A, C, E), pudemos observar alargamento de processos perivasculares com rarefação do conteúdo citoplasmático sugestivos de edema de astrócito (Figura 3D). Além disso, notamos aumento do volume das células endoteliais (Figura 3B), tumefação das mitocôndrias (Figura 3F) e vacuolização celular (Figura 3G, H), denotando processos degenerativos.   45 ............   46 Figura 3. Alterações ultraestruturais no cérebro de animais com EH. Os animais foram divididos em dois grupos e após perfusão transcardíaca, seus cérebros retirados e processados para análise em microscopia eletrônica. (A & B) Capilar cerebral e região perivascular nos animais controle (A) comparado aos animais com EH em 24 horas p.i. (B) demonstrando edema de células endoteliais (cabeça de setas pretas). (C & D) Corte em maior aumento da região perivascular de animais controle (C) comparados aos animais com EH em 24 horas p.i. (D) demonstrando edema de processos astrocitários perivasculares (setas pretas). (E & F) Corte em maior aumento mostrando mitocôndria (seta branca) nos animais controle (E) comparado aos animais com EH em 24 horas p.i. (F) evidenciando tumefação da organela com apagamento das cristas mitocondriais. (G & H) Vacuolização (*) celular nos animais com EH em 24 horas p.i. C= capilar   47 4.4. Há disfunção da barreira hemato-encefálica nos animais 24 horas após injeção de TAA Frente aos achados de alterações celulares ultraestruturais em região perivascular cerebral, decidimos investigar a manutenção da funcionalidade da BHE. Observamos extravasamento do corante azul de Evans em tecido cerebral dos animais 24 horas p.i. da EH (11,49 ± 1,23, N=5) comparado ao controle (2,12 ± 0,49, N=5) (p < 0.001) (Figura 4), sugerindo perda da permeabilidade seletiva da BHE.   48 Figura 4. Extravasamento do corante azul de Evans em tecido cerebral 24 horas após injeção de TAA. Os animais foram divididos em dois grupos experimentais e todos receberam injeção intra- venosa do corante azul de Evans. Houve aumento significativo do extravasamento do corante para tecido cerebral 24 horas após injeção de TAA quando comparado ao controle (*** p < 0.001, resultados expressos em média ± SEM, N=5, teste de t não pareado). Co ntr ole 24 hr s p .i. 0 5 10 15 *** A zu l d e Ev an s (! g/ 10 0m g de c ér eb ro )   49 4.5. Há aumento dos níveis de citocinas e quimiocinas em tecido cerebral principalmente em 24 horas pós-injeção de TAA Através da mensuração dos níveis das citocinas TNF-α e IL-1β e das quimicionas CXCL1/KC, CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α e CCL5/RANTES em tecido cerebral, observamos aumento da resposta inflamatória local principalmente em 24 e 36 horas p.i. da EH por TAA. O TNF-α apresentou maior nível em 36 horas p.i. da EH (390,1 ± 56,01, N=6) quando comparado ao controle (171,8 ± 22,86, N=6) (p < 0.05). Em 24 horas p.i. (378,5 ± 57,91, N=6) houve aumento semelhante ao grupo de 36 horas, embora sem diferença estatística. Em 48 horas p.i. da EH (308,9 ± 64,47, N=6), o nível de TNF-α apresentou queda, sem diferença estatística quando comparado aos outros grupos (Figura 5A). A IL-1β apresentou maior nível em 24 horas p.i. da EH (143,7 ± 14,07, N=6) quando comparada ao controle (94,56 ± 9,83, N=6) (p < 0.05). Em 36 (129,2 ± 9,47, N=6) e 48 horas p.i. da EH (104,4 ± 8,93, N=6), os níveis da citocina apresentaram queda sem diferença estatística quando comparadas aos outros grupos (Figura 5B). A CXCL1/KC apresentou os maiores níveis cerebrais em 24 (167,0 ± 20,62, N=6) e 36 horas p.i. da EH com TAA (140,5 ± 12,38, N=6) com significativa diferença estatística quando comparados aos grupos controle (77,74 ± 4,29, N=6) e 48 horas p.i. da EH (80,58 ± 16,12, N=6) (Figura 5C). A CCL2/MCP-1 apresentou maior nível em 24 horas p.i. da EH (70,74 ± 6,93, N=6) com diferença estatística quando comparada ao controle (27,13 ± 5,06, N=6) e ao grupo 48 horas p.i. da EH (34,60 ± 4,93, N=6) (Figura 5D). Comportamento semelhante foi observado nos níveis cerebrais de CCL3/MIP-1α com aumento significativo em 24 horas p.i. da EH (272,4 ± 27,42, N=6) quando comparado ao controle (140,3 ± 9,21, N=6) e ao grupo 48 horas p.i. da EH (174,4 ± 24,19, N=6) (Figura 5E). A CCL5/RANTES também apresentou maiores níveis em 24 (5521 ± 705,5, N=6) e 36 horas p.i. da EH (5043 ± 352,1, N=6) quando comparada ao controle (2576 ± 321,7, N=6) e ao grupo 48 horas p.i. (2814 ± 261, N=6) (Figura 5F).   50 Figura 5. Aumento dos níveis de citocinas e quimicionas cerebrais pelo tempo. O animais foram divididos em quatro grupos experimentais. O lobo cerebral frontal direito foi retirado e homogeneizado. Foi observado aumento de IL-1β (B), CXCL1/KC (C), CCL2/MCP-1 (D), CCL3/MIP-1α (E) e CCL5/RANTES (F) principalmente em 24 horas p.i. da EH por TAA, enquanto que o aumento de TNF-α (A) foi estatisticamente diferente do controle em 36 horas p.i. da EH por TAA. Em todas as citocinas e quimiocinas mensuradas, houve tendência à queda de seus níveis pelo tempo (* p<0.05, ** p<0.01, *** p< 0.001, resultados expressos em média ± SEM, N=6, teste estatístico One-Way ANOVA com teste de Turkey). Controle 24 36 48 0 100 200 300 400 500 * Horas pós-indução TN F- ! (p g/ m l) A Controle 24 36 48 0 50 100 150 200 ** ** * * Horas pós-indução C XC L1 /K C (p g/ m l) C Controle 24 36 48 0 100 200 300 400 ** * * Horas pós-indução C C L3 /M IP -1 ! (p g/ m l) E Controle 24 36 48 0 50 100 150 200 * B Horas pós-indução IL -1 " (p g/ m l) Controle 24 36 48 0 20 40 60 80 100 * *** ** Horas pós-indução C C L2 /M C P- 1 (p g/ m l) D Controle 24 36 48 0 2000 4000 6000 8000 *** ** ** * Horas pós-indução C C L5 /R A N TE S (p g/ m l) F   51 4.6. Há aumento dos níveis de citocinas e quimiocinas séricas principalmente em 48 horas pós-injeção de TAA Através da mensuração dos níveis das citocinas TNF-α e das quimicionas CXCL1/KC e CCL3/MIP-1α em soro, observamos aumento da resposta inflamatória sistêmica principalmente em 48 horas p.i. da EH por TAA. O TNF-α apresentou maior nível em 36 (154,8 ± 28,04, N=4) e 48 horas p.i. da EH (150,1 ± 11,61, N=4) quando comparado ao controle (12,05 ± 10,17, N=4) e ao grupo 24 horas p.i. da EH (43,91 ± 13,47, N=4) (Figura 6A). A CXCL1/KC apresentou o maior nível sérico em 48 horas p.i. da EH com TAA (735,9 ± 205,7, N=4) com significativa diferença estatística quando comparado ao grupo controle (31,92 ± 7,57, N=4) (Figura 6B). Comportamento semelhante foi observado no nível sérico de CCL3/MIP-1α com aumento significativo em 48 horas p.i. da EH (79,93 ± 4,08, N=4) quando comparado ao controle (30,55 ± 4,13, N=4) (Figura 5C).   52 Figura 6. Aumento dos níveis de citocinas e quimicionas séricas pelo tempo. O animais foram divididos em quatro grupos experimentais. O sangue foi coletado e o soro separado por centrifugação. Foi observado aumento de CXCL1/KC (B) e CCL3/MIP-1α (C) principalmente em 48 horas p.i. da EH por TAA, enquanto que o aumento de TNF-α (A) foi estatisticamente diferente do controle em 36 e 48 horas p.i. da EH por TAA (** p<0.01, *** p< 0.001, resultados expressos em média ± SEM, N=4, teste estatístico One-Way ANOVA com teste de Turkey). Controle 24 36 48 0 50 100 150 200 ** *** *** ** Horas pós-indução TN F- ! (p g/ m l) A Controle 24 36 48 0 200 400 600 800 1000 ** Horas pós-indução C XC L1 /K C (p g/ m l) B Controle 24 36 48 0 20 40 60 80 100 ** Horas pós-indução C C L3 /M IP -1 ! (p g/ m l) C   53 4.7. Há um maior gradiente de TNF-α e de CCL3/MIP-1α no cérebro e de CXCL1/KC no soro Comparando os níveis de TNF-α, CCL3/MIP-1α e CXCL1/KC entre o cérebro e o soro, observamos concentrações maiores de TNF-α e de CCL3/MIP-1α no cérebro e gradiente intertecidual maior em 24 e 36 horas p.i. da EH com TAA (Figura 7A e 7B, respectivamente). Por outro lado, a CXCL1/KC apresentou concentração maior no soro e gradiente maior em 36 e 48 horas p.i. da EH (Figura 7C).   54   Figura 7. Diferença de concentração de TNF-α, CXCL1/KC e CCL3/MIP-1α entre cérebro e soro. Os níveis da citocina TNF-α e das quimiocinas CXCL1/KC e CCL3/MIP-1α encontrados nos experimentos anteriores foram plotados em um mesmo gráfico para comparação entre si. Há maior concentração cerebral de TNF-α (A) e de CCL3/MIP-1α (B) no cérebro, com gradiente de citocinas mais significativo em 24 e 36 horas p.i. Por outro lado, a concentração de CXCL1/KC (C) é maior no soro e gradiente de citocinas mais significativo em 36 e 48 horas p.i. (* p<0.05, *** p< 0.001, resultados expressos em média ± SEM, teste estatístico Two- Way ANOVA com teste de Bonferroni). 24 hr s p .i. 36 hr s p .i. 48 hr s p .i. 0 100 200 300 400 500 *** * Cérebro Soro TN F- ! (p g/ m l) A 24 hr s p .i. 36 hr s p .i. 48 hr s p .i. 0 200 400 600 800 1000 * ***Cérebro Soro C XC L1 /K C (p g/ m l) C 24 hr s p .i. 36 hr s p .i. 48 hr s p .i. 0 100 200 300 400 Cérebro Soro*** * *** C C L3 /M IP -1 ! (p g/ m l) B   55 4.8. Há redução da atividade de enzimas antioxidantes no cérebro dos animais 24 horas p.i. da EH por TAA Há redução significativa da atividade da enzimas SOD no cérebro de animais 24 horas p.i. da EH por TAA (2,19 ± 0,15, N=3) quando comparados ao controle (2,85 ± 0,18, N=4) (p<0.05, figura 8A). O mesmo comportamento foi observado na atividade da enzima GSH-Px (25,90 ± 2,25, N=3) comparado ao controle (37,68 ± 2,56, N=5) (p<0.05, figura 8B) e na atividade da enzima catalase (316,75 ± 38,39, N=3) comparado ao controle (467,86 ± 35,62, N=4) (p<0.05, figura 8C). Ao avaliarmos indiretamente o nível de peroxidação lipídica, no cérebro dos animais 24 horas pós injeção de TAA, pela dosagem de TBARS, observamos tendência ao aumento (163,70 ± 11,73, N=3) quando comparados aos controles (116,12 ± 4,74, N=4), embora sem diferença estatística (figura 8D).   56 Figura 8. Redução significativa da atividade das enzimas antioxidantes no cérebro pós TAA. Os animais foram divididos em dois grupos experimentais e o lobo frontal esquerdo do cérebro retirado e homogeneizado. Houve redução estatisticamente significativa na atividade das enzimas SOD (A), GSH-Px (B) e catalase (C). Os níveis de TBARS (D) apresentaram tendência ao aumento entretanto sem diferença estatística. (* p < 0.05, resultados expressos em média ± SEM, teste de t não pareado). Co ntr ole 24 hr s p .i. 0 50 100 150 200 TB A R S (n m ol .1 00 m g- 1 d e pr ot eí na )D Co ntr ole 24 hr s p .i. 0 10 20 30 40 50 * A tiv id ad e da G SH -P x (n m ol .m g- 1 d e pr ot eí na ) B Co ntr ole 24 hr s p .i. 0 1 2 3 4 * A tiv id ad e da S O D (u ni da de s. m g- 1 d e pr ot eí na )A Co ntr ole 24 hr s p .i. 0 200 400 600 * A tiv id ad e da c at al as e nm ol .m in -1 (m g de p ro te ín a)C   57 4.9. Há aumento no rolamento de leucócitos em microvasos cerebrais em 48 horas p.i. da EH por TAA Em decorrência do gradiente de citocinas encontrado entre cérebro e soro, decidimos avaliar o comportamento da migração leucocitária para tecido cerebral através de microscopia intravital. Observamos aumento do rolamento de leucócitos por minuto em 48 horas p.i. da EH por TAA (10,33 ± 0,87, N=4) quando comparado ao controle (1,65 ± 0,47, N=4) e aos grupos 12 (1,77 ± 0,96, N=3), 24 (1,66 ± 0,66, N=5) e 36 horas p.i. (4,19 ± 1,05, N=6) (p < 0.001, Figura 9A). Por outro lado, não houve diferença estatística na adesão leucocitária entre os grupos controle (0,15 ± 0,08, N=4), 12 (1,33 ± 0,86, N=3), 24 (1,53 ± 0,68, N=5), 36 (2,33 ± 0,76, N=6) e 48 horas p.i. (2,75 ± 1,01, N=4) (Figura 9B).   58 Figura 9. Comportamento de migração leucocitária para tecido cerebral. Os animais foram divididos em cinco grupos, devidamente anestesiados, e uma craniotomia foi realizada para estudo in vivo do comportamento leucocitário. Houve aumento do rolamento de leucócitos estatisticamente significativo em 48 horas p.i. da EH por TAA (A) sem diferença de adesão celular entre os grupos (B) (*** p < 0.001, resultados expressos em média ± SEM, N: controle=4, 12 hrs p.i.=3, 24 hrs p.i.=5, 36 hrs p.i.=6, 48 hrs p.i.=4, teste estatístico One-Way ANOVA com teste de Turkey). Co ntr ole 12 hr s p .i. 24 hr s p .i. 36 hr s p .i. 48 hr s p .i. 0 5 10 15 *** *** *** A *** Ro la m en to e m nú m er o de c él ul as /m in ut o Co ntr ole 12 hr s p .i. 24 hr s p .i. 36 hr s p .i. 48 hr s p .i. 0 1 2 3 4 5 B Ad es ão e m nú m er o de c él ul as /1 00 µm   59 4.10. A indução da EH por TAA leva ao aumento da atividade da N-Acetil- β-D-Glicosaminidase no cérebro Ao constatar aumento de rolamento em 48 horas p.i. e uma tendência ao aumento da adesão leucocitária pelo tempo, embora sem diferença estatística, decidimos investigar a presença de leucócitos em tecido cerebral pela atividade das enzimas MPO e NAG. Notamos então que não houve diferença estatisticamente relevante entre os grupos controle (920,3 ± 107,1, N=8), 12 (1046,0 ± 92,6, N=8), 24 (1183,0 ± 96,9, N=9), 36 (1018,0 ± 136,2, N=9) e 48 horas p.i. da EH por TAA (1339,0 ± 188,8, N=8) quanto ao número de neutrófilos, quantificado pela atividade da MPO (Figura 10A). Por outro lado, a atividade da enzima NAG mostrou-se aumentada quando comparado o grupo 36 (7,78 ± 0,34, N=9) e 48 (7,65 ± 0,66, N=8) com 12 horas p.i. da EH (6,63 ± 0,22, N=6) (p < 0.01 e p < 0.05, respectivamente) (Figura 10B).   60 Figura 10. Atividade das enzimas MPO e NAG como quantificação de leucócitos em tecido cerebral Os animais foram divididos em 5 grupos experimentais e o lobo frontal direito retirado e homogeneizado. Nota-se aumento da atividade da NAG em 36 e 48 horas p.i. da EH quando comparado ao grupo 12 horas p.i. (B). Demais comparações entre os grupos não demonstraram diferença estatística. (* p< 0.05, ** p < 0.01, resultados expressos em média ± SEM, N: controle=8, 12 hrs p.i.=8, 24 hrs p.i.=9, 36 hrs p.i.=9, 48 hrs p.i.=8, teste estatístico One-Way ANOVA com teste de Turkey). Co ntr ole 12 hr s p .i. 24 hr s p .i. 36 hr s p .i. 48 hr s p .i. 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 A nú m er o re la tiv o de ne ut ró fil os x 1 03 Co ntr ole 12 hr s p .i. 24 hr s p .i. 36 hr s p .i. 48 hr s p .i. 0 2 4 6 8 10 ** *B N A G u ni da de s re la tiv as (p or 1 00 m g de c ér eb ro )   61 4.11. Avaliação histológica do cérebro em 48 horas p.i. da EH por TAA não revela infiltrado inflamatório compatível com macrófagos Partindo do princípio de que em 48 horas p.i. da EH há gradiente quimiotático, aumento do rolamento leucocitário e aumento da atividade da NAG, utilizamos a técnica H&E para investigar a presença de macrófagos em tecido cerebral. Contudo, sem demonstrar infiltrado inflamatório, foi observado presença de edema proteináceo perivascular (Figura 11B, setas) e hemorragia (Figura C) quando comparados ao grupo controle (Figura 11A). No detalhe, notamos células astrocitárias Alzheimer tipo II.   62 Figura 11. Corte histológico de cérebro em 48 horas p.i. da EH por TAA. (A) Tecido cerebral normal de animais contole; (B) Tecido cerebral dos animais que receberam TAA mostrando edema proteináceo perivascular (setas) e (C) presença de hemorragia. No detalhe (C), astrócito Alzheimer tipo II. H&E, x400, detalhe x1000.   63 4.12. Análise imuno-histoquímica de córtex cerebral não revelou maior densidade celular de micróglia Para investigarmos a ativação de micróglia e sua possível participação no processo neuroinflamatório, optamos por avaliar a densidade celular por marcação imuno-histoquímica da proteína Iba-1. A quantidade de células por área de córtex cerebral não foi estatisticamente diferente entre os grupos controle (2.017 ± 0.22, N=5), 24 (2.592 ± 0.25, N=5) e 36 horas p.i. da EH (2.408 ± 0.37, N=4). Além disso, também não notamos diferença morfológica entre as células marcadas de cada grupo avaliado. Foi observado aparência estrelada com prologamentos finos ramificados do corpo celular.   64 Co ntr ole 24 hr s p .i. 36 hr s p .i. 0 1 2 3 D en si da de c el ul ar (c él ul a/ po le ga da 2 ) G   65 Figura 12. Análise morfológica por imuno-histoquímica de córtex cerebral e mensuração da densidade celular. Os animais foram divididos em dois grupos e após perfusão transcardíaca, seus cérebros retirados e processados para análise em microscopia óptica. (A & B) Marcação da protéina Iba-1 em tecido de córtex cerebral normal dos animais controle. Micróglia em estado de repouso com prolongamentos finos em aspecto ramificado. (C & D e E & F) Marcação de Iba-1 nos grupos 24 e 36 horas, respectivamente, também com aspecto celular de repouso. (G) Densidade celular por número de células em uma área de uma polegada (inch) ao quadrado, sem diferença estatística entre os grupos. (A, C & E: imuno-histoquímica de Iba-1, x20; B, D & F: imuno-histoquímica de Iba-1, x40; G: resultados expressos em média ± SEM, N: controle=5, 24=5, 36=4).   66 5) DISCUSSÃO A EH é uma síndrome neuropsiquiátrica grave e progressiva que se desenvolve em pacientes com FHA em torno de 1-2 semanas após a instalação dos sintomas hepáticos, como náusea e vômitos ou aumento sérico de bilirrubinas. A taxa de sobrevida de pacientes com FHA varia de acordo com a etiologia da lesão hepática e a gravidade da EH (LEE, 2012). Atualmente, o único tratamento definitivo para a FHA é o transplante hepático, procedimento médico de grande complexidade técnica, alto custo financeiro e com necessidade de imunossupressão permanente do paciente pós-cirurgia (BERNAL et al., 2010; STRAVITZ & KRAMER, 2009). Em uma análise de 1696 pacientes com FHA, 39% foram indicados ao transplante, entretanto, apenas 24% foram submetidos à cirurgia e, destes, 9% morreram durante o procedimento. Dos 1696, apenas 49% sobreviveram recebendo tratamento exclusivamente clínico e 27% foram a óbito (LEE, 2012). Embora o surgimento do transplante tenha mudado o painel de mortalidade dos pacientes com FHA, hoje, a taxa de sobrevida em 1 ano pós-tranplante é de 79% em estatística europeia (GERMANI et al., 2012). Em um estudo recente, todos os pacientes (N=90) avaliados apresentavam algum grau de EH e foram submetidos ao transplante hepático. Desses, foi observado sinais de edema cerebral em 33% através de neuroimagem. Após o procedimento, 7 (7,8%) pacientes evoluiram com déficits neurológicos permanentes, desde prejuízo funcional até morte encefálica. Desses sete, 5 apresentavam edema cerebral grave pré-transplante (TAN et al., 2012). A EH é uma patologia cuja evolução culmina em edema cerebral, hipertensão intracraniana, herniação cerebral e morte (VAQUERO et al., 2003a). Rolando e colaboradores (2000) investigaram a relação entre a inflamação sistêmica e a FHA. Nesse estudo, pacientes com SIRS à admissão, foram comparados aos sem SIRS e evoluíram com pior progressão da EH, aumento da PIC durante a internação (p = 0.022) e maior chance de ir a óbito (p = 0.002). Nos casos em que houve concomitância de SIRS e bacteremia, a taxa de mortalidade chegou a 76,9%. Além disso, nos pacientes com EH grave ou aumento da PIC, a chance de desenvolver SIRS e infecções foi significativamente maior (p < 0.001). Outro estudo realizado com 227 pacientes apresentando FHA medicamentosa, a presença de SIRS também estava relacionada à piora da EH quando comparado aos que não desenvolveram SIRS (p < 0.05) (VAQUERO et al., 2003b). Nesse grupo, aqueles que apresentavam FHA por   67 intoxicação com APAP (N=96), apresentaram rápida piora da EH quando adquiriram algum quadro infeccioso (p < 0.01). Dessa maneira, observamos evidências de um cenário sobre a EH e seu envolvimento estreito com o prognóstico e evolução do paciente com FHA. Em paralelo a essa relação, caminha o quadro inflamatório sistêmico colaborando para acelerar a deterioração do quadro. A partir dessa premissa, desenvolvemos um modelo animal de EH com o intuito de estudar essa relação em um momento anterior ao quadro grave, quando seria ideal para realizar alguma intervenção efetiva no sentido de lentificar a evolução da EH. Assim, poderia-se evitar complicações infecciosas, aumentar as chances de uma boa evolução pós-transplante, recuperação espontânea do fígado, além de maior sobrevida e melhor qualidade de vida do paciente. Ao avaliarmos o camundongo com FHA induzida por TAA através de teste em campo aberto, encontramos o momento mais precoce de manifestação sintomática em 24 horas p.i. da EH. Interessantemente, esse também foi o momento em que os animais apresentavam-se com menor atividade locomotora, denotando maior gravidade dos sintomas. O fato de realizarmos o experimento com grupos distintos e nosso modelo apresentar o auge de sua mortalidade entre 24 e 48 horas poderia explicar esse achado (MIRANDA et al., 2010). Os animais clinicamente piores tendem a morrer nesse período e os grupos de 36 e 48 horas p.i. da EH seriam formados majoritariamente pelos potenciais sobreviventes. Dessa maneira, seriam animais que podem ter desenvolvido uma EH menos grave. Esse é um aspecto do nosso modelo que deve sempre ser levado em consideração, pois pode dificultar a interpretação dos resultados observados em 36 horas p.i. da EH, já que o grupo representa alguns animais em estágio mais grave e outros em recuperação. A análise do comportamento locomotor é um parâmetro largamente utilizado em experimentos animais para estudar a EH (BRÜCK et al., 2011; CHANG et al., 2011; RANGROO THRANE et al., 2012). A presença de letargia e diminuição da movimentação é um sinal precoce, fácil de monitorizar, objetivo e sua reversão indica recuperação do quadro (BRÜCK et al., 2011). A atividade locomotora do animal é fundamental para outros testes cognitivos, como para a exploração de objetos e o nado no labirinto aquático de Morris usados para avaliar memória e aprendizado. Dessa maneira, inviabiliza o uso de outros testes comportamentais, pois cria um viés de resultado pela baixa movimentação. Uma bateria de avaliação neurológica baseada em reflexos motores e de tronco encefálico também pode ser usada.   68 Baseia-se na perda progressiva desses reflexos conforme a EH progride e apresenta boa correlação com a movimentação (AVRAHAM et al., 2011; JAYAKUMAR et al., 2011). Frente ao quadro sintomático encontrado em nosso modelo, consideramos 24 horas como um bom momento para avaliarmos os parâmetros inflamatórios desencadeados pela indução da EH pela TAA, pois trata-se de um momento precoce, quando surgem os sintomas e ainda não há mortalidade (MIRANDA et al., 2010). Mas, antes, investigamos se, concomitante às alterações comportamentais, havia lesão hepática e alteração morfológica cerebral que justificasse o quadro. Apesar de haver muitos modelos animais com TAA, a grande maioria utiliza ratos. Esse é um fator limitante para fazermos comparações ao nosso modelo, uma vez que diferenças interespecíficas podem gerar resultados divergentes. Em um estudo cinético sobre as alterações provocadas por uma dose única de TAA em ratos pelo tempo, Chen e colaboradores (2008) demonstraram que a lesão hepática varia de maneira dose-dependente. Os autores encontraram o pico sérico de ALT em 24 horas pós-injeção para uma dose menor (70 mg/kg) e em 48 horas para uma dose maior (280 mg/kg). Em ambas as doses, o pico sérico de NH3 ocorreu em 24 horas p.i. da lesão hepática. A lesão hepática causada pela TAA apresenta um padrão histológico de necrose centrolobular, local onde há maior concentração da enzima CYP2E1, pertencente ao complexo microssomal do citocromo P450, responsável por transformar a TAA em seu metabólito ativo S-dióxido de TAA (ASHWORTH et al., 1965; CHEN et al., 2008; CHILAKAPATI et al., 2005; FORKERT et al. 1991). O padrão de lesão histológica observado em nossos animais está de acordo com o descrito na literatura e ocorre concomitantemente ao aumento sérico de ALT, corroborando a lesão hepática causada pela TAA em 24 horas p.i. da EH. Embora não tenha sido realizado um estudo cinético da variação da ALT, Miranda e colaboradores (2010) já descreveram que seu nível sérico é estável comparando animais que receberam 600mg/kg de TAA 24 e 48 horas após a injeção. Como nosso objetivo não é descrever a lesão hepática, mas estudar as alterações neurológicas no momento de aparecimento dos sintomas, nos restringimos apenas à constatação da existência de necrose hepatocelular. Apesar de não terem sido mensurados os níveis de NH3 ou Gln em nosso modelo, demonstramos, por microscopia eletrônica, a presença de alterações ultraestruturais em células cerebrais. O edema celular de astrócito, mais especificamente na região dos prolongamensto perivasculares, conhecidos por pé de astrócito, é uma característica típica da   69 EH (KATO et al., 1992; NORENBERG & LAPHAM, 1974). Em um estudo da região perivascular cerebral de pacientes com FHA, Kato e colaboradores (1992), utilizando microscopia eletrônica, relataram diversas alterações morfológicas semelhantes às observadas em nosso modelo, corroborando nossos achados e engrossando nossas evidências de que o animal desenvolve a EH após a injeção de TAA. Nesse trabalho, foi descrito edema celular de processos perivasculares de astrócitos, de pericitos e de células endoteliais - componentes da unidade neurovascular, que forma a BHE. Além disso, os autores também descreveram alargamento da membrana basal e presença de vacuolização celular principalmente em pericitos. Outro estudo investigou, por microscopia eletrônica, mitocôndrias não-sinápticas isoladas de cérebro de ratos com EH induzida por TAA e demonstraram importante edema dessas estruturas semelhante ao observado em nossos animais (CHADIPIRALLA et al., 2012). Por fim, foi investigado a integralidade das junções endoteliais e observou-se que, mesmo frente às alterações celulares observadas, elas permenecem intactas (KATO et al., 1992). Assim sendo, o edema celular da EH é classificado como do tipo citotóxico - ou seja, gerado principalmente por edema celular e não por aumento do conteúdo aquoso através de extravazamento de plasma sanguíneo pela BHE. Chavarria e colaboradores (2010) corroboram essa hipótese ao avaliar, por ressonância magnética, o encéfalo de ratos com FHA induzida por desvascularização hepática. Nesse trabalho, os autores demonstraram edema cerebral com BHE intacta em animais pré-coma e em coma. Em nosso trabalho, investigamos a funcionalidade da BHE através da técnica de extravazamento vascular do corante azul de Evans e demonstramos disfunção da permeabilidade seletiva. Entretanto, esse resultado não foi reproduzível em outro grupo de pesquisa do nosso instituto utilizando o mesmo modelo (dados não publicados). A disfunção da BHE é um ponto de discussão intensa na fisiopatologia da EH quando resultados divergentes foram descritos na literatura. Em dois trabalhos utilizando modelo murino de EH induzida por AOM, Shimojima e colaboradores (2008) reportaram aumento do extravazamento de fluoresceína de sódio no estágio de coma enquanto Bémeur e colaboradores (2010a) não encontraram os mesmo achados utilizando a imunoglobulina G para avaliar a integralidade da BHE. A ruptura e disfunção da BHE não parece ser um evento essencial ao desenvolvimento da EH, surgindo, aparentemente, como uma consequência do processo evolutivo da doença e em estágios mais avançados (RANGROO THRANE et al., 2012). É altamente sugestivo que o principal componente na gênese do edema cerebral seja o   70 citotóxico. Os achados referentes a integralidade da BHE precisam ser aprofundados e melhor estudados para definirmos essa variabilidade de comportamento da BHE. Além disso, outros processos simultâneos, como os níveis séricos de TNF-α, podem influenciar diretamente a funcionalidade da BHE (WANG et al., 2011). O TNF-α é uma citocina proinflamatória diretamente envolvida no desenvolvimento e gravidade da EH como demonstrado em estudos com pacientes com FHA (GUPTA et al., 2010; JALAN et al., 2004; ROLANDO et al., 1995). Avaliando o nível sérico de TNF-α, observamos aumento em 36 e 48 horas p.i. da EH, com baixos níveis em 24 horas, embora o número de animais foi relativamente pequeno por grupo. Chastre em colaboradores (2012), em seu estudo utilizando o etanercept em animais com EH induzida por AOM, relatou aumento do nível sérico do TNF-α pelo tempo, embora discreto. Interessantemente, o bloqueio do sTNFR-2 acarretou em melhora importante da EH, com atraso na instalação do coma, compatível com o observado por Bémeur e colaboradores (2010c) ao utilizar animais knock-out para TNFR-1, evidenciando o importante papel do TNF-α no tempo de evolução e piora da EH. No cérebro, observamos aumento significativo de TNF-α somente em 36 horas p.i. da EH com redução em 48 horas p.i. da EH, em um comportamento inverso ao observado na atividade locomotora, quando essa aumenta, embora sem diferença significativa, se comparado com o grupo 36 horas p.i. da EH. Contudo, não é possível estabelecer uma correlação direta entre o nível dessa citocina e a sintomatologia dos animais, por se tratarem de dois experimentos distintos. Ao compararmos os níveis de TNF-α no sangue e no cérebro do nosso modelo, observamos uma diferença máxima em 24 horas p.i. da EH, com maior nível cerebral do que sérico (Figura 7A). É interessante ressaltar que esse achado coincide com o momento em que os animais apresentam maior diminuição da atividade locomotora. Essa relação também foi observada em pacientes com FHA nos quais a diferença entre os níveis de TNF-α da veia jugular interna, por onde drena o fluxo sanguíneo cerebral, e da artéria carótida interna, por onde entra o fluxo sanguíneo cerebral, era maior naqueles que apresentaram hipertensão intracraniana mais grave (WRIGHT et al., 2007). O alto nível cerebral de TNF-α também parece estar relacionado à gravidade do quadro da EH em modelos animais, quando estes atingem o coma (BÉMEUR et al, 2010c; JIANG et al., 2009a; JIANG et al., 2009b). Em um estudo em que foi avaliado a concentração de TNF-α, IL-1β e IL-6 no sangue e no líquor de ratos pós-desvascularização hepática, observou-se aumento significativo apenas de IL-6, em   71 ambos os tecidos, 6 horas após indução da FHA, e ausência de edema cerebral. Por outro lado, ao atingir o coma, esses animais apresentavam aumento significativo nos níveis cerebrais de TNF-α, IL-1β e IL-6, além de franco edema cerebral (JIANG et al., 2009b). Utilizando esse mesmo modelo e tempo de avaliação, mas em outro estudo, os autores observaram aumento significativo da expressão da eNOS e da iNOS, mas sem produção de nitrato, no cérebro dos animais com FHA por isquemia hepática já em 6 horas p.i. da EH (JIANG et al., 2009c). Interessante observar que, se colocados lado a lado, os estudos em conjunto demonstram que, antes do aumento expressivo de TNF-α e IL-1β no cérebro e do edema, há aumento de IL-6 e aumento da expressão de enzimas produtoras de NO. Em um estudo utilizando cultura celular de astrócito e de micróglia separadamente, a exposição à NH3 desencadeou a expressão de Iba-1 na micróglia, demonstrando sua ativação, com produção de ROS e expressão de iNOS, mas sem aumento dos níveis de citocinas. Já na cultura de astrócitos houve aumento da expressão de mRNA para IL-1β e de iNOS (ZEMTSOVA et al., 2011). Infelizmente, os autores não realizaram co-cultura desses tipos celulares e esses resultados devem ser considerados com cautela, uma vez que há uma enorme diferença entre o ambiente in vivo e in vitro. Em nosso modelo experimental, observamos aumento significativo de IL-1β em tecido cerebral já em 24 horas p.i., em congruência com os achados nesse trabalho. Animais knock- out para receptor de IL-1β também apresentam melhor evolução com redução do edema e aumento do tempo necessário para desenvolver coma (BÉMEUR et al., 2010c). Dessa maneira, a IL-1β também parece estar envolvida na evolução da EH, e em sua gravidade, mas com um papel mais precoce do que a TNF-α. Ao avaliarmos o estresse oxidativo por medida indireta da atividade de enzimas antioxidantes, observamos, em 24 horas p.i. da EH, concomitante ao aumento de citocinas, queda da atividade da SOD, GSH-Px e catalase. Embora essa seja uma medida indireta, em um estudo avaliando os mesmos parâmetros, Kosenko e colaboradores (2003) observaram o mesmo perfil em ratos que receberam injeção intraperitoneal de NH3. Os autores também descreveram maior produção de ROS. Um fato intrigante é que esses achados foram todos revertidos por um inibidor de receptor NMDA, o qual está envolvido na via Glu-cGMP-NO, cujo produto final é o NO. Embora nós não avaliamos diretamente os níveis de ROS e RNS em nossos animais, essas são evidências importantes para tentarmos entender o panorama inflamatório e oxidativo, e sua relação, em nosso modelo. Um ponto fundamental a ser   72 investigado é o nível de produção de NO em nosso modelo e sua importância contemporânea à redução das enzimas antioxidantes e à produção das citocinas proinflamatórias. Dessa maneira, trabalhando com o modelo de EH em 24 horas p.i. por TAA, podemos inferir que estamos lidando com um momento interessante do ponto de vista terapêutico. Notamos que, nesse momento, o animal apresenta sintomas exuberantes sem ainda haver aumento estatisticamente significativo de TNF-α no cérebro ou no soro. Observamos também estresse oxidativo e aumento dos níveis cerebrais de IL-1β, fenômenos relativamente precoces na fisiopatologia da EH, como demonstrado por outros estudos. Por outro lado, outros trabalhos evidenciaram a IL-1β como uma citocina expressa em tecido cerebral em um momento posterior ao aumento dos níveis de IL-6 e expressão de enzimas produtoras de NO no cérebro de ratos com EH (JIANG et al., 2009c). Dessa maneira, devemos considerar a importância de investigarmos o cenário fisiopatológico em um momento anterior ao de 24 horas e posterior à 12 horas p.i. da EH. Assim, poderemos elucidar alguns pontos importantes na relação entre as citocinas e o estresse oxidativo. Ademais, a avaliação da citocina IL-6, ainda não realizada nesse estudo, será de suma relevância. Nós observamos também, em nosso modelo, aumento significativo dos níveis cerebrais das quimiocinas CXCL1/KC, CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α e CCL5/RANTES. Na literatura não há quaisquer relatos sobre a produção dessas quimiocinas em animais com EH. A CCL2/MCP-1 é uma quimiocina extensivamente estudada no SNC (MADRIGAL et al., 2010; SEMPLE et al., 2010; THOMPSON & VAN ELDIK, 2009). Um estudo descreveu sua produção pela micróglia dependente de ROS, um aspecto que pode ocorrer na EH em virtude do importante estresse oxidativo (QUAN et al., 2011). A CCL5/RANTES já foi descrita como responsável por ativar um fenótipo proinflamatório na micróglia e consequente aumento da produção de NO (SKULJEC et al., 2011). Além disso, foi desmonstrado em cultura de astrócitos produção de CCL5/RANTES mediada por TNF-α e IL-1β (CHEN et al., 2011). Johnson e colaboradores (2011) descreveram a produção de CXCL1/KC e CCL3/MIP- 1α no cérebro de ratos após status epilepticus. Segundo os autores, a produção de CXCL1/KC é mediada por neurônios e células endoteliais enquanto CCL3/MIP-1α por neurônios e micróglia. Após o aumento dessas quimiocinas no cérebro, houve intensa invasão do tecido por neutrófilos. Dessa maneira, decidimos investigar o gradiente quimiotático dessas quimiocinas em nosso modelo dosando seus níveis também no sangue. Além disso, avaliamos o comportamento dos leucócitos e se houve migração de algum desse tipo celular para o   73 cérebro, o que poderia explicar parte da inflamação local observada. Notamos então que houve diferença significativa entre cérebro e soro de ambas as quimiocinas, entretanto com padrão antagônico. Enquanto a CXCL1/KC apresentou maior nível sérico com gradiente mais significativo em 48 horas p.i. da EH, a CCL3/MIP-1α apreentou maior nível cerebral com gradiente mais significativo em 24 horas p.i. da EH (Figuras 7B & 7C, respectivamente). Desse modo, prosseguimos com a investigação pela microscopia intravital para avaliar adesão e rolamento leucocitário. Paradoxalmente ao maior gradiente quimiotático para o cérebro, houve maior rolamento em 48 horas p.i. da EH, embora sem diferença de adesão de células na parede endotelial - processo este fundamental para a migração. De qualquer maneira, há gradiente quimiotático estatisticamente significativo de CCL3/MIP-1α em 48 horas p.i. da EH. Prosseguimos então com a dosagem da atividade de MPO e NAG como inferência da presença de neutrófilos e monócitos, respectivamente, em tecido cerebral. Não houve diferença significativa entre os grupos para MPO, entretanto, encontramos aumento na atividade de NAG em 36 e 48 horas comparado ao grupo 12 horas p.i. da EH. Esse resultado deve ser avaliado com cautela. Em primeiro lugar, não houve diferença estatística com o grupo controle. E em segundo lugar, a NAG é uma enzima presente no lisossomo de monócitos e, sendo a micróglia uma célula de origem e função semelhante ao macrófago, a atividade de NAG mensurada no cérebro pode advir da micróglia (GUILLEMIN & BREW, 2004; PRINZ & MILDNER, 2011). Frente à esse cenário, procedemos com a investigação histopatológica por meio de H&E para nos certificar da aparente ausência de infiltrado inflamatório periférico em tecido cerebral. Não observamos alteração tecidual que contrariasse tal suposição e, sendo assim, confirmamos a não participação dos leucócitos no cérebro. Nesse contexto imunológico observado, onde, aparentemente, há uma relação intrínseca entre a neuroinflamação e o estresse oxidativo, sem a participação de leucócitos periféricos, é imprescindível o estudo do envolvimento da micróglia. O papel da micróglia num momento de maior gravidade na EH está sendo estabelecido e a utilização de medicamentos que interferem nesse processo, como a minociclina, estão se mostrando benéficos (JIANG et al., 2009a; RANGROO THRANE et al., 2012). Entretanto, novos aspectos, mais precoces, devem ser explorados quanto ao papel das células da neuroglia. Em nosso estudo, através da marcação da expressão da proteína Iba-1, não observamos aumento da quantidade de micróglias em córtex cerebral após induzir a EH. Além disso, não houve alteração morfológica típica da sua ativação, quando a micróglia apresenta edema de seus   74 prolongamentos e aumento de sua ramificação, até chegar na forma amebóide (TADOWAKI et al., 2007). Estudos prévios, realizados em modelos experimentais, relataram a ativação da micróglia precocemente, muito embora não tenha sido observada produção de mediadores inflamatórios em paralelo (JIANG et al., 2009b; ZEMTSOVA et al., 2011). Outro estudo, investigando o comportamento dessa célula pelo tempo, em um modelo animal de EH por AOM, relatou ativação da mesma somente em estágio tardio mas não em um momento precoce (RANGROO THRANE et al., 2011). No grupo animal de 24 horas p.i. da EH, apesar de haver produção de citocinas proinflamatórias, não houve aumento na expressão de Iba-1 pela micróglia. Talvez, esse seja um momento inicial da doença em que a neuroinflamação possa ser regida pelo próprio astrócito. Além disso, é importante lembrar que, no grupo de 36 horas p.i. da EH, os animais avaliados possam ser possíveis sobreviventes com menor grau de EH e sem ativação da micróglia. Por outro lado, houve uma tendência ao aumento da densidade celular em 24 horas p.i. da EH, embora sem diferença estatística. Dessa maneira, seria fundamental realizar uma investigação mais detalhada e, possivelmente, com outros métodos científicos para se determinar a importância da participação na EH de cada tipo celular constituinte da neuroglia. Explorar a neuroinflamação será fundamental para se entender a EH em um futuro próximo e retardar a sua evolução, aumentando o tempo de sobrevida desses pacientes. Nesse cenário, ainda deverá ser melhor determinado a relação temporal entre os processos inflamatórios e oxidativos envolvidos nessa doença, buscando um gatilho inicial comum às duas vias. Nosso trabalho é apenas uma navegação inicial nesse campo. A participação de processos que agem em sinergia ao insulto inicial amplia as possibilidades de intervenção clínica e renova a perspectiva neuroimunológica no desenvolvimento da EH. Podemos destacar, entre os pontos discutidos, a importância de estabelecer um modelo murino para a EH induzido por TAA pelas diversas vantagens em relação ao custo-benefício. Por fim, abrimos uma porta antes não descrita na literatura sobre o papel das quimiocinas nesse processo, em cuja intervenção poderá trazer resultados benéficos. As perspectivas são enormes e, assim como outros grupos de pesquisa, ainda nos confrontamos com algumas divergências a serem esclarecidas.   75 6) CONCLUSÕES A EH é uma complicação importante da FHA em cuja fisiopatologia há um envolvimento estreito com processos inflamatórios que parecem contribuir com sua gravidade. Em nosso modelo murino de EH, pudemos observar que em 24 horas os animais tornam-se estatisticamente mais sintomáticos e apresentam um taxa de mortalidade de 40% entre 24-48 horas p.i. da EH. Desse modo, prosseguimos com nossa investigação em 24 horas p.i. da EH pela premissa de avaliarmos um momento em que houvesse sintomas, embora antes do quadro se tornar demasiadamente grave. Demonstramos que, em 24 p.i. da EH, a neuroinflamação participa principalmente através do aumento do nível cerebral da citocina proinflamatória IL-1β e de uma maior diferença entre a concentração cerebral e sérica da TNF-α. Houve também, no cérebro, um aumento generalizado de quimiocinas e uma redução na atividade de enzimas antioxidantes, uma medida indireta do estresse oxidativo. Ao investigarmos o perfil celular dentro desse cenário imunológico, pudemos notar alterações morfológicas de astrócitos, as células-alvo na EH, mas ainda sem ativação da micróglia. De fato, outros trabalhos responsabilizam a micróglia apenas em um momento tardio na evolução da EH (coma e pré-coma) e nós avaliamos nossos animais precocemente, embora estavam mais sintomáticos. Dessa maneira, podemos inferir que a neuroinflamação possa advir do acometimento do astrócito per se, e que a micróglia seja importante em estágios mais terminais. O papel das quimiocinas permanece em aberto e abre precedente para estudar seu envolvimento com a progressão da doença e ativação da micróglia. Por fim, a investigação da relação entre as citocinas, as quimiocinas e o estresse oxidativo deverá ser aprofundada.   76 7) REFERÊNCIAS ADEVA MM, SOUTO G, BLANCO N, DONAPETRY C. Ammonium metabolism in humans. Metabolism. 2012 Nov;61(11):1495-511. ALBA L, HAY J, ANGULO P, LEE WM. Lactulose therapy in acute liver failure. J Hepatol 2002; 36:33A. ALBRECHT J, DOLINSKA M, HILGIER W, LIPKOWSKI AW, NOWACKI J. Modulation of glutamine uptake and phosphate-activated glutaminase activity in rat brain mitochondria by amino acids and their synthetic analogues. Neurochem Int 2000;36:341-347. ALBRECHT J, NORENBERG MD. Glutamine: a Trojan horse in ammonia neurotoxicity. Hepatology 2006 Oct;44(4):788-94. ALBRECHT J, ZIELIŃSKA M, NORENBERG MD. Glutamine as a mediator of ammonia neurotoxicity: A critical appraisal. Biochem Pharmacol. 2010 Nov 1;80(9):1303-8. 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