UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS ESCOLA DE ENGENHARIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA JOSÉ GERALDO ESTEVES GUEDES JUNIOR DESENVOLVIMENTO E OTIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO DE DIÉSTERES DE ETILENO GLICOL (BIOLUBRIFICANTES) POR HIDROESTERIFICAÇÃO ENZIMÁTICA DO ÓLEO DE FRITURA BELO HORIZONTE - MG 2021 JOSÉ GERALDO ESTEVES GUEDES JUNIOR DESENVOLVIMENTO E OTIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO DE DIÉSTERES DE ETILENO GLICOL (BIOLUBRIFICANTES) POR HIDROESTERIFICAÇÃO ENZIMÁTICA DO ÓLEO DE FRITURA Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química da Escola de Engenharia da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Química. Linha de Pesquisa: Tecnologias limpas, materiais e nanotecnologia. Orientador: Prof. Dr. Adriano Aguiar Mendes BELO HORIZONTE – MG 2021 Guedes Junior, José Geraldo Esteves. G924d Desenvolvimento e otimização da produção de diésteres de etileno glicol (biolubrificantes) por hidroesterificação enzimática do óleo de fritura [recurso eletrônico] / José Geraldo Esteves Guedes Junior. - 2021. 1 recurso online (103 f. : il., color.) : pdf. Orientador: Adriano Aguiar Mendes. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Minas Gerais, Escola de Engenharia. Inclui bibliografia. Exigências do sistema: Adobe Acrobat Reader. 1. Engenharia química - Teses. 2. Biolubrificantes - Teses. 3. Lipase - Teses. 4. Otimização - Teses. I. Mendes, Adriano Aguiar. II. Universidade Federal de Minas Gerais. Escola de Engenharia. III. Título. CDU: 66.0(043) Ficha catalográfica elaborada pelo bibliotecário Reginaldo Cesar Vital dos Santos CRB6/ 2165 Biblioteca Prof. Mário Werneck, Escola de Engenharia da UFMG UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS ESCOLA DE ENGENHARIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA FOLHA DE APROVAÇÃO “DESENVOLVIMENTO E OTIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO DE DIÉSTERES DE ETILENO GLICOL (BIOLUBRIFICANTES) POR HIDROESTERIFICAÇÃO ENZIMÁTICA DO ÓLEO DE FRITURA” José Geraldo Esteves Guedes Junior Dissertação submetida à Banca Examinadora designada pelo Colegiado do Programa de Pós- Graduaçãoem Engenharia Química da Escola de Engenharia da Universidade Federal de Minas Gerais, como partedos requisitos à obtenção do título de MESTRE EM ENGENHARIA QUÍMICA. 288ª DISSERTAÇÃO APROVADA EM 29 DE OUTUBRO DE 2021 POR: Documento assinado eletronicamente por Marcelo Fernandes Vieira, Usuário Externo, em 29/10/2021, às 10:57, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 5º do Decreto nº 10.543, de 13 de novembro de 2020. Documento assinado eletronicamente por Adriana Silva Franca, Professora do Magistério Superior, em 29/10/2021, às 16:26, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 5º do Decreto nº 10.543, de 13 de novembro de 2020. Documento assinado eletronicamente por Adriano Aguiar Mendes, Usuário Externo, em 29/10/2021, às 16:26, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 5º do Decreto nº 10.543, de 13 de novembro de 2020. A autenticidade deste documento pode ser conferida no site https://sei.ufmg.br/sei/controlador_externo.php? acao=documento_conferir&id_orgao_acesso_externo=0, informando o código verificador 1027995 e o código CRC FE618939. http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_Ato2019-2022/2020/Decreto/D10543.htm http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_Ato2019-2022/2020/Decreto/D10543.htm http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_Ato2019-2022/2020/Decreto/D10543.htm http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_Ato2019-2022/2020/Decreto/D10543.htm http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_Ato2019-2022/2020/Decreto/D10543.htm https://sei.ufmg.br/sei/controlador_externo.php?acao=documento_conferir&id_orgao_acesso_externo=0 https://sei.ufmg.br/sei/controlador_externo.php?acao=documento_conferir&id_orgao_acesso_externo=0 AGRADECIMENTOS Agradeço, primeiramente, a Deus. Ele foi quem permitiu que eu trilhasse esse caminho e me deu forças para que eu não desistisse do mesmo. Posteriormente, aos meus pais, José e Sonia, que sempre estiveram ao meu lado, me apoiando em minhas decisões e fazendo o impossível para que eu realizasse tudo o que eu desejasse. Aos meus irmãos, Sarah e Edilberto, que apesar das brigas sempre foram base e força nos momentos de necessidade. Aos meus amigos, os quais não irei citar nomes para não causar discórdia, que estiveram comigo nos momentos de lamentações e nos quais a vontade de desistir foi enorme. Obrigado por me ajudarem a perseverar em meus objetivos e por serem minha fortaleza. Ao meu orientador, Prof. Dr. Adriano Aguiar Mendes que tornou todo esse trabalho possível, sempre me motivando a crescer como pessoa e como pesquisador, e me tirando da minha zona de conforto para, dessa maneira, evoluir constantemente. À Profa. Dra. Érika Cristina Crén, não só pela parceria com esse trabalho, mas também pela trajetória que trilhamos desde a graduação até o estágio docência. Aos professores do Departamento de Engenharia Química da UFMG, que permitiram juntamente com a instituição, que eu me tornasse primeiramente Bacharel em Engenharia Química e atualmente almejando esse título de Mestre. Agradeço em especial às Profas. Dra.Kátia Figueiredo, Dra. Andrea Oliveira e Dra. Vanessa Lins que estiveram comigo desde a graduação até este momento. À Universidade Federal de Minas Gerais e à Universidade Federal de Alfenas pela infraestrutura e pelo apoio concedidos a nós, alunos de pós-graduação. Em especial gostaria de agradecer ao pessoal do Laboratório de Bioprocessos da UNIFAL pelo auxílio e acolhimento. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão de bolsa (Processo 130015/2020-2). Agradeço também ao CNPq (Processo 404929/2016–8) e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais – FAPEMIG (Processo APQ-02196-15) pelo suporte financeiro. Dedico essa dissertação a Deus, aos meus pais, amigos e familiares. Sem cada um de vocês eu não seria nada e nada disso seria possível. Obrigado por estarem sempre comigo, comemorando e sofrendo juntos. “E não sede conformados com este mundo, mas sede transformados pela renovação do vosso entendimento, para que experimenteis qual seja a boa, agradável e perfeita vontade de Deus.” Romanos 12:2 RESUMO O objetivo do presente projeto de mestrado foi a produção um biocatalisador enzimático capaz de sintetizar diésteres com propriedades lubrificantes (biolubricantes) pela hidroesterificação do óleo de fritura. A primeira etapa deste processo consistiu na sequencial produção de ácidos graxos livres (AGL) por hidrólise enzimática do óleo de fritura catalisada pelo extrato enzimático bruto de lipase de Candida rugosa (LCR). Completa hidrólise do óleo foi obtida em 3 h de reação empregando razão mássica óleo:água de 40% m/m, 45°C, agitação mecânica de 1500 rpm e concentração de lipase de 3,2 g/L. Em seguida, os AGL obtidos foram separados do meio de reação, lavados com água destilada e desidratados para serem empregados como matéria-prima na segunda etapa do processo (esterificação). As reações de produção dos diésteres por esterificação foram realizadas em sistemas ambientalmente corretos (isentos de solventes orgânicos). Nesta etapa, uma preparação de lipase de Thermomyces lanuginosus (Eversa® Transform 2.0) imobilizada em partículas de poli(estireno-divinilbenzeno) foi empregada como biocatalisador heterogêneo. A lipase foi imobilizada via adsorção física (mecanismo de ativação interfacial) no suporte hidrofóbico empregado em tampão acetato de sódio pH 5,0 com baixa força iônica (5 mM), por 18 h de contato a 25°C e em agitação mecânica em banho termostatizado (200 rpm) e a carga enzimática inicialmente oferecida foi de 40 mg/g de suporte. Elevada concentração de proteína imobilizada da ordem de 36 mg/g (que corresponde a um rendimento de imobilização da ordem de 90%) foi obtido devido à alta área superficial e diâmetro de poros do suporte que permite imobilizar alta concentração de lipase. Após a preparação do biocatalisador heterogêneo, foi avaliada a influência do tipo de glicol na sua atividade catalítica. Neste estudo, foram empregados quatro tipos de glicóis como dietieleno glicol (DEG), propileno glicol (PG), neopentil glicol (NPG) e o etileno glicol (EG). Máxima conversão dos AGL de 87% após 90 min de reação foi observada para o EG, então selecionado para estudos de ótimização. O efeito de parâmetros relevantes na produção dos ésteres como temperatura de reação, concentração de biocatalisador e razão molar EG:AGL foi avaliado por um delineamento central composto rotacional (DCCR). Nas condições ótimas de reação, foi avaliado o efeito do tempo para alcançar a máxima conversão da reação. De acordo com os resultados obtidos, a conversão total dos grupos hidroxila do EG foi alcançada em 40 min de reação a 65°C empregando razão molar EG:AGL de 1:3 e 18% m/m do biocatalisador heterogêneo preparado. Nas mesmas condições, o extrato da lipase solúvel proporcionou uma conversão máxima de apenas 32,5%. Esses resultados mostram claramente que o biocatalisador preparado é altamente ativo na produção de ésteres industriais (biolubrificantes) e que a imobilização é de extrema importância, visto que aumenta a atividade catalítica e permite a reutilização da enzima. Testes de reuso foram realizados a fim de analisar a estabilidade do biocatalisador preparado após sucessivas bateladas de esterificação. Após sete ciclos sucessivos de esterificação, máxima conversão dos ácidos foi de 37%. A produção de diésteres foi confirmada por ressonância magnética nuclear de próton (1H RMN). As propriedades físicas dos diésteres de EG produzidos como viscosidade cinemática, índice de viscosidade, e ponto de fluidez foram determinadas por metodologias padrões. Com base nos resultados obtidos, a viscosidade cinemática a 40°C e 100°C dos diésteres preparados foi respectivamente de 27,3 ± 1,6 e 5,7 ± 0,4 mm2/s. O índice de viscosidade determinado foi de 166,2 ± 18,2. Os diésteres produzidos apresentam bom desempenho em baixas temperaturas, pois o seu ponto de fluidez foi de –9 ± 2°C. Suas propriedades físicas foram similares aos diésteres de EG obtidos a partir do óleo de soja descritos na literatura e com lubrificantes comerciais fornecidos pela Emery Oleochemicals (Dehylube® 4016 e Dehylube® 4016 US) e Zschimmer & Schwarz (LEXOLUBE 3JN-310 e LUBRICIT NGDO). Estes resultados mostram que o processo proposto pode ser uma alternativa interessante do ponto de vista industrial devido à alta atividade catalítica do biocatalisador em condições brandas de reação. Além disso, as propriedades físicas dos diésteres produzidos a partir de uma matéria-prima de baixo custo obtida no procesamento de alimentos foram similares aos biolubrificantes disponíveis comercialmente. Palavras-chave: Biolubrificantes, Óleo de fritura, Hidroesterificação, Lipase imobilizada, Otimização. ABSTRACT The aim of this Dissertation (Master of Science) has been the production of na enzimatic biocatalyst capable of synthesizing diesters with lubricant properties (biolubricants) through hydroesterification of used soybean cooking oil – USCO (or waste cooking oil). The first step consisted in FFA production via enzymatic hydrolysis of USCO catalyzed by a crude lipase extract from Candida rugosa (CRL). Complete hydrolysis of the oils were achieved after 3 h of reaction at 40 °C, using 3.2 g/L of CRL, mechanical stirring frequency of 1500 rpm and oil:water mass ratio of 40% m/m. Next, the produced FFA have been separed, washed with distilled water and dehydrated to be used as starting materials in esterification step. In this study, the esters production has been performed in an eco-friendly process (solvent-free systems) and open reactors to eliminate formed water molecules in the reaction. In this step, a liquid lipase preparation from Thermomyces lanuginosus (Eversa® Transform 2.0)has been immobilized on poly(styrene-divinylbenzene) paarticles and it has been used as heterogeneous biocatalyst. The immobilization protocol proceeded by physical adsorption via mechanism of interfacial activation at low ionic strenght (5 mM) buffer sodium acetate pH 5.0 at 25°C, 18 h of contact under continuous mechanical stirring (200 rpm) in a controlled water bath temperature using an initial protein loading of 40 mg protein/g of support. High protein loaded biocatalyst around of 36 mg/g (immobilization of ≈90%) has been obtained due to high surface area and pore size of the support. In this study, four different glycols such as ethylene glycol (EG), propylene glycol (PG), diethylene glycol (DEG) and neopentyl glycol (NPG) were used as reactants in diesters production via esterification of the produce FFA using immobilized Eversa® Transform 2.0 as heterogeneous biocatalyst. Maximum OH conversion of 87% at 90 min of reaction was achieved using EG. Thus, further tests for optimizing the enzymatic esters production using statistical tools were performed with EG. The effect of three relevant parameters such as heterogeneous biocatalyst concentration, reaction temperature and EG:FFA molar ratio was evaluated using a full factorial design in a CCRD mode. Under optimal experimental conditions, the effect of contact time on the esters production hs also been evaluated. According to results, full OH conversion was achieved at 65 °C, EG:FFA molar ratio of 1:3, and biocatalyst concentration of 18% m/m at 40 min of reaction. Maximum OH conversion of only 32.5% was obtained using crude lipase extract under such conditions. The biocatalyst retained ≈37% of its original activity after seven successive esterification batches. The diesters production has been confirmed by proton nuclear magnetic resonance analysis (1H NMR). The physical properties of the produced diesters such as kinematic viscosity, visccosity index and pour point have been determined according to standard methods. Based on these results, kinematic viscosity values at 40°C and 100°C were 27.3 ± 1.6 e 5.7 ± 0.4 mm2/s. In addition, the viscosity index was of 166.2 ± 18.2. They presented good cold temperature properties, since its pour point was –9 ± 2°C. The physical properties of the produced diesters were comparable with EG diesters from soybean oils described in literature and comercial synthetic esters from two companies: Emery Oleochemicals (Dehylube® 4016 and Dehylube®4016 US) and Zschimmer & Schwarz (LEXOLUBE 3JN-310 and LUBRICIT NGDO). These results clearly show that the proposed process can be an interesting option in industrial processes due to its high catalytic activity under mild reaction conditions (65 °C and atmosphere pressure). Moreover, the physical properties of the produced diesters using a low-cost oleaginous feedstock, a waste oil from the food processing, were similar to commercial synthetic esters. Keywords: Biolubricants, Used soybean cooking oil, Hydroesterification, Immobilized lipase, Optimization. LISTA DE FIGURAS Figura 1- Produção mundial de lubrificantes em 2019 segmentada pelos países produtores. ............................................................................................................................ 211 Figura 2- Estrutura química dos ácidos graxos componentesdo óleo de soja. .......... 24 Figura 3- Diferentes reações catalisadas por lipases. .............................................. 29 Figura 4- Protocolos de imobilização de Lipases. ........................................................... 31 Figura 5- Lipase imobilizada via ativação interfacial em superfície hidrofóbica. ........ 34 Figura 6- Representação esquemática da reação de copolimerização de estireno com divinilbenzeno. ........................................................................................................................ 36 Figura 7- Estrutura química do etileno glicol. ................................................................... 37 CAPÍTULO 1 Figure 1- Representative scheme of the enzymatic production of the different glycol esters via esterification. ........................................................................................................ 65 Figure 2- Effect of reaction time on the esterification of different glycols with FFA from USCO in solvent-free systems catalyzed by Eversa® Transform 2.0 immobilized on PSty-DVB beads. The reactions were performed using a stoichiometric glycol:FFA molar ratio (1:2), 40°C, 240 rpm and biocatalyst concentration of 10% m/m. ............. 66 Figure 3- 3D response surfaces for enzymatic production of EG diesters. Effect of biocatalyst concentration and EG:FFA molar ratio (A), and effect of reaction temperature and EG:FFA molar ratio (B) on the OH conversion percentage. ............. 71 Figure 4- Effect of reaction time on the enzymatic production of EG esters (A) and operational stability tests (B) under optimal experimental conditions (EG:FFA molar ratio of 1:3, 65 ºC, 240 rpm and biocatalyst concentration of 18% m/m). .................... 77 Figure 5- 1H NMR spectra of EG diesters production at different reaction times. ..... 79 LISTA DE TABELAS Tabela 1- Comparação entre a catálise homogênea e heterogênea. .......................... 28 Tabela 2-Reações catalisadas por lipases para produção de biolubrificantes. .......... 30 Tabela 3- Vantagens e Desvantagens da porosidade na imobilização. ...................... 36 Tabela 4- Estudos utilizando etileno glicol para produção de biolubrificantes. ........... 38 CAPÍTULO 1 Table 1- CCRD matrix for the analysis of the effect of independents variables on the enzymatic production of EG esters. .................................................................................... 68 Table 2- Regression coefficients, standard errors and p-values and analysis of variance (ANOVA) for the proposed model of enzymatic production of EG esters. ... 69 Table 3- Validation of the developed CCRD by performing enzymatic production of EG esters under optimal experimental conditions. .................................................................. 73 Table 4- Physical properties of the produced EG esters and comparison with other lubricant esters. ...................................................................................................................... 82 Table 5- Bibliographic survey for EG esters production using several catalysts and oleaginous feedstocks. ......................................................................................................... 85 LISTA DE ABREVIAÇÕES AGL – Ácidos graxos livres. BSA – Albumina sérica bovina DCCR- Delineamento central composto rotacional DEG - Dietileno glicol EG - Etileno glicol LCR – Lipase de cândida rugosa NPG - Neopentilglicol PG - Propileno glicol PSty-DVB - Poli(estireno-divinilbenzeno) TLL- Thermomyces lanuginosus. APRESENTAÇÃO O trabalho desenvolvido durante o mestrado aborda a produção e caracterização de biocatalisadores heterogêneos preparados por imobilização de lipase via adsorção física em suporte hidrofóbico comercial – partículas de poli(estireno-divinilbenzeno), a fim de aplicá-los na síntese de biolubrificantes por hidroesterificação de óleo de cozinha com etileno glicol. O texto apresentado nesse documento está dividido em três principais partes, além da conclusão e sugestões para trabalhos futuros. Na introdução desse trabalho, são reportadas a motivação e a proposta do projeto, especificando o preparo de biocatalisadores heterogêneos a partir da imobilização por adsorção física de lipases, assim como sua aplicação na síntese de um éster com propriedades biolubrificantes, além dos objetivos gerais e específicos do trabalho desenvolvido. A segunda parte aborda uma revisão bibliográfica para o desenvolvimento do trabalho através de conceitos como biolubrificantes, óleos residuais, modificações químicas de óleos, tipos de catálise, lipases, métodos de imobilização enzimática e tipos de suportes. Essa revisão justifica a escolha desse tema, bem como trás todo o embasamento teórico necessário para o andamento e posteriores conclusões dessa dissertação. A terceira parte consiste na compilação da metodologia e resultados obtidos no decorrer do projeto em um artigo submetido para publicação em periódico indexado. São também apresentadas a conclusão e algumas sugestões e recomendações para trabalhos futuros. SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 16 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................................. 21 2.1 LUBRIFICANTES ................................................................................................ 21 2.2 BIOLUBRIFICANTES .......................................................................................... 22 2.2.1 ÓLEOS VEGETAIS........................................................................................... 23 2.2.1.1 OLEO DE SOJA ............................................................................................. 23 2.2.1.2 MODIFICAÇÃO QUIMICA DOS OLEOS VEGETAIS ..................................... 24 2.2.1.3 VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS ÓLEOS VEGETAIS ....................... 25 2.2.2 ÓLEOS RESIDUAIS ......................................................................................... 25 2.3CATALISADORES PARA A FABRICAÇÃO DE BIOLUBRIFICANTES ................. 27 2.3.1 CATÁLISE QUÍMICA: HOMOGÊNEA X HETEROGÊNEA ............................... 27 2.3.2 CATÁLISE ENZIMÁTICA: LIPASES ................................................................. 28 2.4 IMOBILIZAÇÃO DE LIPASES POR DIFERENTES PROTOCOLOS .................... 31 2.4.1 PROTOCOLOS DE IMOBILIZAÇÃO ................................................................ 31 2.4.2SUPORTES ....................................................................................................... 34 2.4.3 POLI (ESTIRENO-DIVILBENZENO)................................................................. 36 2.5 ALCOOIS PARA A SINTESE DE BIOLUBRIFICANTES ...................................... 37 2.5.1ETILENO GLICOL ............................................................................................. 37 2.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS .................................................................... 39 3. ARTIGO: DEVELOPMENT AND OPTIMIZATION OF A SUSTAINABLE PROCESS FOR ENZYMATIC PRODUCTION OF ETHYLENE GLYCOL DIESTERS FROM USED SOYBEAN COOKING OIL ................................................................ 51 4. CONCLUSÃO GERAL ...................................................................................... 99 5. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ............................................ 101 16 1. INTRODUÇÃO Nos dias atuais, a sustentabilidade deixou de ser um tabu e algo fora da realidade, passando a ser mandatória nos processos produtivos. A extinção de recursos, os grandes desperdícios e a intensa poluição foram os grandes responsáveis por tal mudança. Com as atuais reservas de petróleo no mundo e o corrente consumo, vislumbra-se a exaustão do mesmo e uma instabilidade em seu abastecimento (YOSHIDA et al., 2021). Além disso, a mudança climática decorrente das emissões dos gases de efeito estufa aponta uma crise ambiental gerada por mudanças na temperatura e nas precipitações (CHEN et al., 2021). Esses motivos levaram os diversos setores industriais a buscarem alternativas ao petróleo e seus derivados. No setor de lubrificantes, compostos utilizados para reduzir o atrito entre superfícies móveis pela formação de uma película protetora (HO et al., 2019), a dependência de insumos de origem fóssil bem como o descarte incorreto desses materiais fica muito evidente.Cerca de 50% de todo lubrificante utilizado no mundo contribui para a poluição do ambiente pela perda de funcionalidade, derramamentos ou volatilização (RIOS et al., 2020).Com o intuito de contribuir com o controle da poluição e na preservação ambiental, surgem produtos ecologicamente corretos, em destaque os biolubrificantes, como alternativa promissora aos lubrificantes clássicos provenientes do petróleo(BASSI et al., 2016; CECILIA et al., 2020; ZHANG et al., 2020a). Os biolubrificantes são óleos, naturais ou sintéticos, que possuem bom desempenho de lubrificação, alto índice de viscosidade e boa lubrificação a frio (CHAN et al., 2018).Entre eles destacam-se os óleos vegetais, as gorduras animais, óleos microbianos e óleos residuais (MCNUTT E HE, 2016; ZAINAL et al., 2018; HO et al., 2019; ALVES et al., 2017) bem como ésteres sintéticos e polialfaolefinas (REEVES et al., 2017).Entretanto, a aplicação direta de óleos e gorduras apresenta algumas limitações como baixa estabilidade termo-oxidativa e sua alta viscosidade(DA SILVA et al., 2015; SYAHIR et al., 2017). Com o intuito de superar estas limitações, algumas estratégias têm sido propostas como, por exemplo, modificações químicas dos mesmos (KARMAKAR et al., 2017; REEVES et al., 2017; FERNANDES et al., 2018; 17 KUMAR E PAL, 2021). Entre as rotas de modificação química de óleos destacam-se a esterificação, transesterificação, hidroesterificação e epoxidação empregando catalisadores químicos clássicos e enzimas (CECILIA et al., 2020). Como exemplo de catalisadores químicos utilizados nesses processos tem-se os catalisadores homogêneos ácidos (HCl, H2SO4 e H3PO4) e básicos (NaOH e KOH). Como exemplo de catalisadores heterogêneos tem-se as resinas catiônicas, óxidos e bases (ANGULO et al., 2020). A utilização desses catalisadores, por sua vez, apresenta adversidades devido à necessidade de condições reacionais intensas (temperaturas elevadas na faixa de 120 a 180°C) para a obtenção de elevados rendimentos ou conversão (IVAN-TAN et al., 2017; SABOYA et al., 2016; SABOYA et al., 2017a). Dessa maneira, as lipases surgem como uma alternativa mais sustentável e ambientalmente correta em relação aos catalisadores químicos (BOLINA et al., 2021). As lipases (triacilglicerol acilhidrolases E.C. 3.1.1.3) são um grupo de enzimas capazes de catalisar a hidrólise de triacilgliceróis em meio aquoso e reações de esterificação, transesterificação e interesterificação em meio não aquoso (JAVED et al., 2018; THANGARAJ et al., 2019; CHANDRA et al., 2020). Entre as lipases utilizadas em âmbito industrial pode-se destacar a LCR (lipase de Candida rugosa), TLL (lipase de Themomyces lanuginosus), LBC (lipase de Burkholderia cepacia) entre outras (LAGE et al., 2016; DA SILVA et al., 2020; CAVALCANTI et al., 2018). A utilização das lipases em sua forma livre (extratos enzimáticos brutos na forma líquida ou em pó) não é viável do ponto de vista industrial devido às dificuldades de recuperação, baixa estabilidade térmica e baixa atividade catalítica em reações em meio orgânico (CAVALCANTI et al., 2018; THANGARAJ et al., 2019; ZHONG et al., 2020).Dessa maneira, torna-se necessário realizar a imobilização dessas enzimas por diferentes protocolos para que as lipases possam ser recuperadas e reutilizadas por diversos ciclos, reduzindo o custo do processo e prevenindo a contaminação do produto final. Além disso, em alguns casos os processos de imobilização podem aumentar a estabilidade catalítica, tornando o catalisador mais robusto (GRECO- DUARTE et al., 2017; REIS et al., 2019; BILAL et al., 2018). Diversos métodos de imobilização de enzimas podem ser utilizados para as lipases. Protocolos como adsorção física, encapsulação, ligação covalente e reticulação. A simplicidade e o baixo custo do processo tornam a imobilização por 18 adsorção física em suportes hidrofóbicos a mais utilizada (MULINARI et al., 2020; ZHAO et al.,2019; CARVALHO et al., 2020). Nesse protocolo, é possível alcançar a estabilização da lipase e um aumento expressivo da sua atividade catalítica (RODRIGUES et al., 2019). Além disso, as lipases apresentam um mecanismo específico de ação denominado ativação interfacial, o que favorece esse protocolo de imobilização (BOLINA et al., 2021). A maioria das lipases possui uma cadeia polipeptídica, denominada tampa ou aba (lid), que tem uma face hidrofílica e uma face hidrofóbica. Na conformação fechada das lipases, a área hidrofóbica da lid interage com as áreas hidrofóbicas no entorno do sítio ativo, tornando-se inacessível às moléculas de substrato. Na presença de uma interface hidrofóbica, como suportes ou gotículas de óleo, essa tampa é capaz de se mover, expondo o sítio ativo e a sua região hidrofóbica para o meio (conformação aberta). Em meios com alta concentração de íons, as lipases encontram-se preferencialmente na conformação fechada devido à forte agregação destas enzimas – formação de agregados bimoleculares. Dessa maneira, utiliza-se um meio de baixa força iônica no processo de imobilização via ativação interfacial em suportes hidrofóbicos a fim de deslocar o equilíbrio conformação fechada/aberta e evitar a sua agregação (MANOEL et al., 2015; RODRIGUES et al., 2019; MACHADO et al., 2019). Para realizar o processo de imobilização são necessários suportes, que devem apresentar alta área específica e tamanho de poros para garantir um biocatalisador com alta atividade catalitica e minimizar as limitações difusionais (MANOEL et al., 2015; BASSI et al., 2016; MULINARI et al., 2020).Entre os suportes mais utilizados figuram os orgânicos – resinas acrílicas e hidrogéis de quitosana- e os inorgânicos – sílicas, zeólitas e aluminas (BEZERRA et al., 2015;MANOEL et al., 2015; ZUCCA et al., 2014; VERMA et al., 2019; MULINARI et al., 2020). No que diz respeito à imobilização via adsorção física, diversos suportes hidrofóbicos tem sido investigados, como poli-metracrilato, sílica funcionalizada, partículas magnéticas, poli-hidroxibutirato, carbono ativado e resina de poli(estireno- divinilbenzeno) (ALVES et al., 2017). O poli(estireno-divinilbenzeno) vem sendo bastante estudado e considerado promissor para a imobilização de lipases. A alta 19 capacidade de adsorção deste suporte se deve à sua elevada área específica (500 m2/g) e aos grandes diâmetros de poros (250 Ǻ) (ALVES et al., 2017; BENTO et al., 2017; CORREA et al., 2021). Neste contexto, o objetivo da presente dissertação de mestrado consistiu no desenvimento de um processo sustentável e ecologicamente correto de produção de ésteres lubrificantes por hidroesterificação de óleo residual de fritura. Os ésteres foram produzidos por um processo sequencial de produção de AGL por hidrólise enzimática do óleo residual de fritura, seguido de esterificação enzimática dos ácidos graxos livres com etileno glicol em meios isentos de solventes orgânicos. A aplicação do extrato enzimático bruto de lipase de Candida Rugosa, uma lipase microbiana não- específica, como biocatalisador na produção de AGL é devida à sua versatilidade e alta atividade catalítica na hidrólise completa de diferentes óleos (BARBOSA et al., 2019). Na etapa de esterificação, foi empregada a preparação enzimática comercial Eversa®Transform 2.0, nas formas solúvel e imobilizada por adsorção física em partículas de poli(estireno-divinilbenzeno), como biocatalisador. Esta preparação enzimática é disponível na forma líquida e é uma variante da lipase de Thermomyces lanuginosus expressa em Aspergillus oryzae fornecida pela Novozymes desde 2014 (MONTEIRO et al., 2020). A Eversa® Transform 2.0 tem sido amplamente empregada na produção de biodiesel a partir de diferentes matérias-primas – óleos vegetais e residuais (MONTEIRO et al., 2020). Entretanto, a sua aplicação na produção de biolubrificantes ainda é escassa. Em consulta à Base de Dados Scopus, foi encontrado apenas um recente estudo de aplicação desta preparação de lipase na forma imobilizada por reticulação (Cross-linked Enzyme Aggregates) para transesterificação de óleo residual de fritura com álcool isoamílico (GUIMARÃES et al., 2021). O caráter diferencial desta proposta é a aplicação de Eversa® Transform 2.0 imobilizada por adsorção física em partículas de poli(estireno-divinilbenzeno). Além disso, foi empregado EG devido às excelentes propriedades dos biolubrificantes obtidos como alta biodegradabilidade, boa estabilidade térmica, alto ponto de fulgor e baixa volatilidade (SHABA et al., 2018; SUKIRNO & FARHANDIKA, 2020). O objetivo geral desse trabalho foi alcançado mediante a execução dos objetivos específicos descritos a seguir. https://doi.org/10.1016/j.renene.2020.10.071 https://doi.org/10.3390/molecules26010193 20 • Produção de AGL a partir da hidrólise enzimática do óleo de fritura catalisada por LCR; • Imobilização da preparação enzimática Eversa® Transform 2.0 por adsorção física em partículas de poli (estireno-divinilbenzeno); • Determinação dos parâmetros de imobilização em termos de concentração de proteína imobilizada e atividade na hidrólise da emulsão de azeite de oliva; • Aplicação do biocatalisador heterogêneo preparado na produção de biolubrificantes por esterificação de AGL e diferentes glicóis em meios isentos de solventes; • Avaliação da influência de fatores como razão molar EG:AGL, concentração do catalisador e temperatura por delineamento composto central rotacional (DCCR). • Avaliação do tempo de reação na produção de ésteres nas condições otimizadas; • Realização de testes de reuso após sucessivas bateladas de reação nas condições experimentais otimizadas previamente selecionadas. • Identificação dos diésteres produzidos por ressonância magnética nuclear • Caracterização de suas propriedades físicas (viscosidade cinemática, índice de viscosidade, densidade e ponto de fluidez) de acordo com metodologias padrão. 21 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 LUBRIFICANTES Os lubrificantes são compostos orgânicos utilizados para lubrificar peças de máquinas, a fim de reduzir o atrito entre elas e consequentemente aumentando sua vida útil (KARMAKAR et al., 2017). Esses materiais são amplamente utilizados no meio industrial e automotivo, destacando-se os fluídos e óleos utilizados em motores, turbinas, engrenagens, compressores e ferramentas pneumáticas (SINGH et al.,2019). Para que uma substância seja considerada um bom lubrificante, ela deve apresentar algumas características como alto índice de viscosidade e fluidez em uma ampla faixa de temperatura. Além disso, a eficiência de lubrificação também está associada à estabilidade térmica, à capacidade de prevenção à corrosão e à resistência à oxidação (PANCHAL et al.,2017). Segundo a Grand View Research Inc (2020), o mercado mundial de lubrificantes gerou receita de $126.5 bilhões no ano de 2019. Além disso, estima- se que a produção desses compostos será de cerca de 43.87 milhões de toneladas em 2022, valor esse que representa uma taxa de crescimento de 2,4% do mercado. Em 2019, a China liderou o mercado de lubrificantes, seguida pelos Estados Unidos, Índia, Japão, Rússia, Brasil e Alemanha (STATISTA, 2020). Na Figura 1, pode-se observar a produção mundial de lubrificantes em 2019, segmentada pelos países produtores. Figura 1- Produção mundial de lubrificantes em 2019 segmentada pelos países produtores. Fonte: Do autor. 7,3 6,05 1,7 1,35 1,3 1,1 1 0 2 4 6 8 China EUA Índia Japão Rússia Brasil Alemanha P ro d u çã o (m ilh õ e s d e t o n ) Países produtores de Lubrificantes 22 Um grande problema, relacionado aos lubrificantes, se encontra no seu descarte inadequado no meio ambiente. Estima-se que 40 a 55% de todo lubrificante consumido mundialmente é descartado de maneira incorreta no ambiente aquático, no solo e na atmosfera (SYAHIR et al.,2017). Outro fator alarmante é que mais de 95% desses lubrificantes são de origem fóssil, causando sérios problemas aos ecossistemas devido à alta toxicidade e baixa biodegradabilidade (REEVES et al., 2017) O esgotamento progressivo dos combustíveis fósseis bem como a crescente preocupação com o impacto negativo desses combustíveis no meio ambiente levou à necessidade crítica de explorar fontes alternativas de energia (ZAINAL, 2018). Surge então o interesse por compostos de origem renovável como lubrificantes ecologicamente corretos chamados de biolubrificantes. 2.2 BIOLUBRIFICANTES O termo “biolubrificante” aplica-se a todos os lubrificantes que sejam biodegradáveis e produzidos por fontes renováveis e sustentáveis, de maneira que seja garantida a reinserção da sua matéria orgânica no ciclo natural do carbono, causando assim um baixo impacto ao meio ambiente (REEVES et al., 2017). Os biolubrificantes podem ser divididos em duas categorias – os óleos naturais e os óleos sintéticos. Os óleos naturais, também conhecidos como ésteres naturais ou triacilgliceróis (TAG), são representados pelos óleos vegetais ou microbianos (comestíveis ou não), gorduras animais, ácidos graxos livres (AGL) e óleos residuais (CHAN et al.,2018). Já os óleos sintéticos compreendem as polialfaolefinas, ésteres sintéticos, polialquilenoglicóis, silicones, entre outros (KARMAKAR et al., 2017). 23 2.2.1 Óleos vegetais Uma atenção maior é dada aos óleos vegetais, devido à sua extensa gama de origens bem como sua ampla produção. Esses óleos apresentam regiões polares e apolares em suas estruturas, sendo a região polar responsável pela adsorção ou adesão na superfície deslizante, enquanto a região apolar é responsável pela resistência e oleosidade do fluido lubrificante (ZAINAL et al., 2018). A utilização direta dos óleos vegetais como lubrificantes apresenta certas desvantagens, como por exemplo, sua instabilidade termo-oxidativa e hidrolítica, sua alta viscosidade e sua baixa compatibilidade com tintas e selantes (MOBARAK et al., 2014; DA SILVA et al.,2015; SYAHIR et al., 2017; ZAINAL et al., 2018; FERNANDES et al., 2018). Dessa maneira, tem-se que o uso direto de óleos vegetais como lubrificantes não é apropriado. Para serem utilizados para esse propósito eles devem ser primeiramente modificados quimicamente (KARMAKAR et al.,2017; REEVES et al., 2017; FERNANDES et al., 2018; KUMAR E PAL, 2021). 2.2.1.1 Óleo de soja A soja é uma das principais fontes na produção mundial de óleos vegetais, representando 60% desse mercado. Em 2018, essa produção excedeu as 56 milhões de toneladas (XU et al., 2020). Essa alta representatividade da soja se deve às suas características de mercado e à qualidade do óleo fornecido (SUBROTO et al., 2020). O grão de soja tem como principal componente a proteína vegetal (40%), porém a presença de óleos nesses grãos é muito significativa, podendo variar de 18 a 22% (SUBROTO e QONIT, 2020). O óleo de soja consiste em cerca de 90 a 95% de triacilgliceróis, mas também contêm componentes como fosfatídeos, esteróis, tocoferóis e outros compostos solúveis em gordura. No que diz respeito ao perfil graxo, sua composição se baseia em ácido linoléico (54,17%), ácido oléico (24,77%) e ácido palmítico 24 (11,67%) (DORNI et al., 2018).Na Figura 2, observa-se as estruturas dos ácidos graxos componentes do óleo de soja. Além da sua ampla produção, o óleo de soja apresenta algumas vantagens quando comparado a outros óleos vegetais, incluindo alto conteúdo de ácidos graxos poli-insaturados (65%), mantendo-o liquido a temperaturas mais baixas e a possibilidade de serem hidrogenados de forma seletiva (SUBROTO et al., 2020). Figura 2- Estrutura química dos ácidos graxos componentesdo óleo de soja. Fonte: Do autor. 2.2.1.2 Modificação química dos óleos vegetais Existem diversos métodos para a modificação química de diferentes triacilgliceróis, de modo a torná-los aptos a serem utilizados como lubrificantes. Entre eles encontram-se a transesterificação, esterificação, hidroesterificação, e epoxidação seguido de ruptura do anel epóxi (CECILIA et al., 2020; BOLINA et al., 2021). Entre os processos de modificação química dos óleos vegetais destaca-se a hidroesterificação, responsável pela modificação química de qualquer matéria- prima graxa (gordura animal, óleo vegetal, óleo de fritura usado, borras ácidas de refino de óleos vegetais, entre outros) para obtenção de biolubrificantes (BRESSANI et al., 2015; POURZOLFAGHAR et al., 2016). Nesse processo, primeiramente as matérias graxas são convertidas em ácidos graxos livres (AGL) e glicerol por reação de hidrólise. Em seguida, os ácidos graxos livres são 25 extraídos do meio reacional e convertidos em ésteres por esterificação direta em meio orgânico (BRESSANI et al., 2015; CAVALCANTI et al., 2018; SARNO et al., 2019). Esse processo tem como vantagem o fato de não produzir sabões, subprodutos obtidos pela reação de catalisadores alcalinos com os ácidos graxos, que normalmente são produzidos nas reações de transesterificação (DE LACERDA et al., 2019). Além disso, o processo de transestrificação direta, apesar de possuir apenas uma etapa, possui problemas de transferência de massa devido à alta viscosidade do óleo base, sendo necessário um grande tempo reacional (DA SILVA et al., 2015). Por fim, o processo de hidroesterificação produz glicerol com alta pureza, característica essa muito importante para propósitos farmacêuticos, cosméticos e alimentícios (POURZOLFAGHAR et al.,2016). 2.2.1.3 Vantagens e Desvantagens dos óleos vegetais Os biolubrificantes produzidos de óleos vegetais são alternativas promissoras aos lubrificantes de origem mineral devido às suas altas performances de lubrificação, alto índice de viscosidade, alto ponto de fulgor, baixo ponto de fluidez e baixas perdas por volatilização (HO et al.,2019). As desvantagens se concentram no custo dos mesmos. A utilização de óleos vegetais refinados para a produção de lubrificantes é um grande desafio econômico, visto que compete com a indústria de alimentos (XIE E WAN, 2020). Neste sentido, a utilização de óleos não comestíveis ou residuais pode reduzir o custo de produção dos lubrificantes em cerca de 80% (SARNO et al., 2019). Essa discussão põe em evidência a utilização de óleos residuais como uma opção atrativa dos pontos de vista ambiental e econômico para esta finalidade. 2.2.2 Óleos residuais A produção anual global de óleos residuais de fritura ultrapassa 16 milhões de toneladas (LINYUN et al., 2021). Esses óleos e gorduras, utilizados repetidamente em frituras, sofrem alterações significativas em suas 26 propriedades, devido à degradação térmica dos triacilgiceróis por oxidação e hidrólise (DI PIETRO et al., 2020). Dentre essa grande produção de óleos residuais, a maior parte é descartada de maneira inadequada na natureza. Aproximadamente 15 milhões de toneladas de óleos processados em todo o mundo são lançados anualmente sem nenhum tipo de tratamento no meio ambiente (MANSIR et al., 2018).Esses óleos são grandes poluidores de cursos d’água, o que pode ser confirmado pelo fato de que apenas um litro de óleo de fritura é capaz de esgotar o oxigênio dissolvido de até 20 mil litros de água, formando, em poucos dias, uma fina camada sobre uma superfície de 100 m2 que bloqueia a passagem de ar e luz e, conseqüentemente, impede a respiração e a fotossíntese (BIOCOLETA, 2013). O óleo de cozinha usado, bem como óleos não comestíveis são matérias- primas atrativas para a produção de biodiesel, por aumentarem a viabilidade econômica do processo (AMBAT, 2018; MONTEIRO et al., 2020).O biodiesel nada mais é que um éster monoalquílico de ácidos graxos de cadeia longa oriundo da transesterificação de óleos naturais, processo que se assemelha à produção de biolubrificantes (SINGH et al., 2019). Além disso, esses óleos não concorrem com o mercado de abastecimento de alimentos, portanto, sendo de grande interesse (SARNO et al., 2019; ZHANG et al., 2020b).O desenvolvimento de novos produtos eficientes e viáveis ambientalmente como os biolubrificantes à base de óleo de fritura acabam por reduzir a dependência por recursos não renováveis, como o petróleo e seus derivados (REEVES et al.,2017; SARNO et al., 2019; GUIMARÃES et al., 2020). Os processos de modificação química, para tornar viável a utilização desses óleos residuais como lubrificantes, requerem a utilização de catalisadores, podendo eles serem químicos ou enzimáticos (SYAHIR et al., 2017; KARKAMAR et al., 2017; CECILIA et al., 2020). https://doi.org/10.3390/molecules26010193 27 2.3 CATALISADORES PARA A FABRICAÇÃO DE BIOLUBRIFICANTES A catálise é um procedimento muito utilizado em diversos ramos industriais. Exemplos de aplicações da mesma podem ser vistas na indústria alimentícia, processamento de papel e celulose, biocombustíveis, tratamento de esgoto, farmacêutica e de química fina (SINGH et al.,2016). A catálise na produção de biolubrificantes pode ser classificada de diversas maneiras. Dentre elas destacam-se a fase na qual se encontram os catalisadores (homogênea e heterogênea) e a origem dos mesmos (enzimática ou química). 2.3.1 Catálise Química: homogênea x heterogênea De forma geral, as reações catalíticas podem ser classificadas em homogêneas ou heterogêneas, sendo a principal diferença entre elas a fase na qual o catalisador se encontra em relação aos reagentes. No que diz respeito à produção de biolubrificantes, os catalisadores químicos homogêneos mais utilizados são os ácidos fosfórico, clorídrico, p- toluenossulfônico e sulfúrico, bem como as bases – hidróxidos e álcóxidos de sódio e potássio (ARAVIND et al., 2018; AFIFAH et al., 2019; GHAFAR et al., 2019; ATTIA et al., 2020). As principais vantagens da utilização de catalisadores homogêneos estão no seu baixo custo e suas altas taxas de cinética de reação (DA SILVA et al., 2013; THANGARAJ et al., 2019; THANGARAJ E SOLOMON, 2019). As desvantagens, porém, desse tipo de catalisador são os problemas operacionais causados devido à difícil regeneração do meio reacional, dificultando o reuso do catalisador, bem como a alta demanda de água e energia nos processos necessários para a purificação dos produtos (CHUA et al., 2019; TAN et al., 2019; FARUQUE et al., 2020; GUPTA et al., 2020). Entre os catalisadores heterogêneos mais utilizados na síntese de biolubrificantes destacam-se as resinas de troca iônica (SABOYA et al., 2017a), carvões ativados sulfonados (FERREIRA et al., 2020), zircônia sulfatada (OH et al., 2013),sílica funcionalizada com ácido sulfúrico (AKERMAN et al., 2011),bem como as bases – métóxido de magnésio, óxido de cálcio e óxidos mistos - CaO- SrO (IVAN-TAN et al., 2017; HUSSEIN et al., 2021; ALMASI et al., 2021).Os 28 catalisadores heterogêneos têm como principal vantagem permitir uma fácil separação do produto obtido, facilitando assim o reuso subsequente do catalisador e reduzindo os custos dos processos de purificação (GUPTA et al., 2020). Além disso, esse tipo de catalisador provoca uma menor corrosão dos equipamentos utilizados, se comparado aos catalisadores homogêneos. A desvantagem da utilização de catalisadores heterogêneos está na necessidade de condições reacionais como altas temperaturas para reduzir a viscosidade do meio reacional e melhorar os processos de transferência de massa. As altas temperaturas levam à degradação térmica de ácidos graxos e triacilgliceróis, sendo necessário assim realizar etapas posteriores de purificação, aumentando a geração de resíduos (SABOYA et al., 2017b; IVAN-TAN et al., 2017; FATTAH et al., 2020; ZHANG et al., 2020b). A Tabela 1 fornece um comparativo entre as características de ambas as catálises. Tabela 1- Comparação entre a catálise homogênea e heterogênea. Catálise Homogênea Catálise Heterogênea Maior contato entre substratos e catalisador Menor contato entre substratos e catalisador Maior desempenho catalítico Menor desempenho catalítico Permite altas seletividades Não permite altas seletividades Difícil separação do produto Fácil separação do produto Difícil recuperação do catalisador Fácil recuperação do catalisador Alta geração de efluentes para purificação do produto Baixa geração de efluentes para separação do produto Fonte: Do Autor. 2.3.2 Catálise enzimática: Lipases A catálise enzimática, para a produção de biolubrificantes, vem como uma alternativa atrativa aos catalisadores químicos, visto que requer condições reacionais moderadas de temperatura e pressão, além de apresentar alta especificidade e alto grau de pureza dos produtos – reduzindo a geração de resíduos e tornando os processos ambientalmente corretos (CERÓN et al., 2018; PAPADAKI et al., 2019; SARNO et al., 2019; AGUIEIRAS et al., 2019; FERNANDES et al., 2020;GUIMARÃES et al., 2021; BOLINA et al., 2021) https://doi.org/10.3390/molecules26010193 29 As lipases (éster triacilglicerol acil-hidrolases EC 3.1.1.3) são um importante grupo de enzimas que podem ser obtidas de fontes animais, vegetais e microbianas, sendo as de fontes microbianas as mais utilizadas no âmbito industrial devido à sua grande diversidade bioquímica, fácil manipulação genética e fácil condições de cultivo (SALIHU E ALAM, 2015; JEMLI et al., 2016; JAVED et al., 2018). Essas enzimas são capazes de catalisar diversos tipos de reações como a hidrólise dos triacilgliceróis em glicerol e ácidos graxos livres (ANGAJALA et al., 2016; SHUAI et al., 2017; JAVED et al., 2018; BASSO E SERBAN, 2019), além de processos de esterificação, transesterificação e interesterificação em meios não aquosos (ABED et al., 2018; BARSÉ et al., 2019; LÖFGREN et al., 2019). A Figura 3 esquematiza a versatilidade de reações que podem ser catalisadas pelas lipases. Figura 3- Diferentes reações catalisadas por lipases. Fonte: Do autor Entre as aplicações das lipases, encontra-se a produção de biolubrificantes, e a sua utilização para este fim é bastante reportada pela literatura (BOLINA et al., 2021). Na Tabela 2, podemos ver alguns exemplos de trabalhos relacionados a essa temática. R 1 C00R 2 + H 2 O R 1 C00R 2 + R 3 C00R 4 R 1 C00R 2 + R 3 C00H R 1 C00R 2 + R 3 0H R 1 C00R 2 + R 3 NH 2 R 1 C0OH + R 2 OH Hidrólise Esterificação Interesterificação Acidólise Alcoólise Aminólise R 1 C0OH + R 2 OH R 1 C00R 2 + H 2 O R 3 C00R 2 + R 1 C00R 4 R 3 C00R 2 + R 1 C00H R 1 C00R 3 + R 2 0H R 1 C0NHR 3 + R 2 OH 30 Tabela 2-Reações catalisadas por lipases para produção de biolubrificantes. Reação Fonte da Lipase Óleo/Ácido Álcool Éster Conversão (%) Referência Esterificação Thermomyces lanuginosus Ácido Butírico Isoamílico Butirato de isoamila 96.0 Todero et al(2015) Ácido Oléico/Ácido Octanoico/ Ácido Esteárico Cetílico Oleato de cetila/Octanoato de cetila/ Estearato de cetila 94.0 Machado et al(2019) Ácido Esteárico Butanol Estearato de butila 90.0 Bolina et al(2018) Ácido Decanóico Cetílico Decanoato de cetila 92.5 Alves et al(2016) Transesterificação Pâncreas de porco Óleo de Karanja Etanol Oleato de etila 88.0 Kumar e Pal(2021) Burkholderia cepacia Óleo de Palmiste Isoamílico Oleato de isoamila 99.5 Cerón et al(2018) Hidroestrificação Pseudomonas fluorecens Óleo de Fritura Etanol Oleato de etila /Linoleato de etila 94.1 Costa et al (2020) Candida rugosa Óleo de Soja Neopentilglicol Oleato de n- octila 99.0 Cavalcanti et al(2018) Thermomyces lanuginosus Óleo de Soja Metanol Oleato de metila 97.1 Wancura et al(2019) Fonte: Do Autor. A aplicação de lipases na forma de extratos enzimáticos brutos (formulações em pó ou líquida) é dificultada em um processo industrial, pois torna difícil a recuperação e reciclagem da enzima, causa custos elevados na purificação do produto e leva a uma grande inativação das lipases devido à temperatura e uso de solventes orgânicos (MOHAMAD, 2015; ZHAO et al., 2015; ZHONG et al., 2020). Dessa maneira, surge a necessidade de realizar algum procedimento, a fim de minimizar essas complicações industriais e permitir o reuso dessas enzimas, procedimento este denominado imobilização. 2.4 IMOBILIZAÇÃO DE LIPASES POR DIFERENTES PROTOCOLOS A imobilização enzimática permite a regeneração e reuso das enzimas em diversos ciclos reacionais, previne a contaminação do produto final, gera robustez devido ao aumento da estabilidade, bem como permite o desenvolvimento de processos contínuos, processos esses muito atrativos 31 industrialmente. (CERÓN et al., 2018; ZHONG et al., 2020).O processo de imobilização enzimática se baseia no confinamento de enzimas em certos materiais ativos ou por ligação com matrizes específicas, permitindo que as mesmas realizem suas funções com uma menor tendência à inativação e sendo preservadas por um maior tempo (GIRELLI et al., 2019; SANTOS et al., 2020; KHAN, 2021). 2.4.1 Protocolos de imobilização Existem diversos protocolos nos quais as lipases podem ser imobilizadas, entre eles destacam-se a encapsulação, a imobilização por ligação covalente, a imobilização por reticulação (Cross-linked Enzymes Aggregates – CLEAs) e a adsorção física (iônica, hidrofóbica e por ligação de hidrogênio).Na Figura 4, pode-se observar um esquema desses protocolos de imobilização. Figura 4- Protocolos de imobilização de Lipases. Fonte: do autor A escolha apropriada do método de imobilização deve ser baseada em parâmetros como a máxima atividade catalítica da enzima imobilizada, estabilidade operacional, custo de imobilização, toxicidade dos reagentes e propriedades desejadas para o catalisador imobilizado (BOLINA et al., 2021). 32 O processo de encapsulação se baseia no confinamento da enzima em uma rede polimérica porosa que permite a difusão das moléculas de substrato para o microambiente reacional e a difusão de moléculas de produtos do mesmo (MULINARI et al., 2020). Nesta técnica são utilizados, normalmente, polímeros naturais como quitosana, alginato e celulose, bem como os sintéticos - poliuretano e poliacrilamida (KOUKLUKAYA et al., 2016;JI et al., 2017; PADILHA et al., 2018; KAUSHAL et al., 2018).Como vantagens desse método, destacam- se a estabilidade enzimática devido ao fato de não serem formadas ligações químicas ou interações físicas entre a enzima e o suporte, além da grande quantidade de sítios de interação entre substrato e enzima (FENG et al., 2015). Já como desvantagem pode-se citar a alta resistência à transferência de massa para o substrato e uma possível liberação de enzimas da estrutura após sucessivos ciclos (REIS et al., 2019). A imobilização de enzimas por ligações covalentes acontece pela formação de ligações entre os resíduos de aminoácidos que constituem a enzima, e que não são essenciais para sua atividade catalítica, e os grupos reativos atuais na superfície do suporte (NADAR e RATHOD, 2018; ZHONG et al., 2019; BASHIR et al., 2020). A vantagem deste processo é fornecer uma maior estabilidade enzimática em relação ao ambiente reacional, como variação de pH, temperatura, solventes e ação de inibidores, além de evitar a dessorção da enzima do suporte (POPPE et al., 2015; ZDARTA et al., 2018; DE SOUZA et al., 2020). As principais desvantagens dessa técnica estão relacionadas às condições rigorosas de preparo, que se utilizam de reagentes tóxicos, o que acaba por elevar os custos de obtenção destes materiais (ABDULLA et al., 2017; THANGARAJ E SOLOMON, 2019; DE ANDRADES et al., 2019). No método de imobilização por reticulação, não há a presença de suportes. Nesse processo, a utilização de solventes orgânicos (acetona, etanol, etc), sais ou polímeros leva à precipitação das enzimas. Posteriormente, um agente reticulante (usualmente o glutaraldeído) é adicionado, resultando na formação de um agregado de enzimas (MUKHERJEE E GUPTA, 2017; SHELDON, 2019; NAIR E CHELLAPAN, 2019). Este método é considerado de grande importância no preparo de biocatalisadores para serem utilizados em processos industriais (ZHENG et al., 2018; SHELDON, 2019). 33 A adsorção física, por sua vez, é um método muito utilizado na imobilização de lipases devido a sua simplicidade e baixo custo. Como vantagens desse procedimento destacam-se a preservação da conformação tridimensional da enzima, bem como um fácil reuso do suporte por dessorção das enzimas inativas, estabilização enzimática e aumento da atividade catalítica. (MIGUEZ et al., 2018; ZHAO et al., 2019; RODRIGUES et al., 2019; OKURA et al., 2020). Esse protocolo de imobilização pode ser explicado por diferentes tipos de interações como as forças de Van der Waals, ligações de hidrogênio e interações iônicas e hidrofóbicas. Essas interações irão depender dos grupos funcionais presentes na superfície do suporte e da composição dos aminoácidos presentes na superfície da lipase (MOHAMAD et al., 2015; REIS et al., 2019; QUAYSON et al., 2020). Vale ressaltar que no campo das lipases, a adsorção por interações hidrofóbicas é mais comum, devido ao seu mecanismo específico de ação que é denominado ativação interfacial (BASSI et al., 2016). Muitas lipases possuem uma cadeia polipeptídica, denominada aba ou tampa (lid), que possui tanto uma região hidrofóbica, quanto uma região hidrofílica. Quando a lipase se encontra na chamada conformação fechada, a área hidrofóbica da aba interage com as áreas também hidrofóbicas no entorno dos sítios ativos das lipases, cobrindo-os e consequentemente impedindo o contato dos mesmos com o meio reacional (RODRIGUES et al., 2019; LIU et al., 2019). Porém, na presença de uma superfície hidrofóbica, a cadeia polipeptídica se desloca, expondo os sítios ativos da enzima para o meio – conformação aberta. Em meios na qual a força iônica é elevada (acima de 50 mM), a conformação aberta da lipase torna-se instável, dessa maneira a mesma toma a sua conformação fechada. A fim de evitar uma baixa atividade catalítica devido à conformação fechada, bem como reduzir a agregação das lipases na sua forma aberta, são utilizados meios com baixa força iônica. (MANOEL et al., 2015; MACHADO et al., 2019). A Figura 4 mostra um esquema da ativação interfacial de enzimas em suportes hidrofóbicos. 34 Figura 5- Lipase imobilizada via ativação interfacial em superfície hidrofóbica. Fonte: do autor Uma das desvantagens desse método é a possibilidade de dessorção enzimática da superfície do suporte devido às mudanças de temperatura, pH, força iônica ou pela presença de substâncias químicas como surfactantes, uréia e co-solventes (FILHO et al., 2019). Além disso, a tendência das lipases de adsorverem em suportes hidrofóbicos pode gerar a formação de dímeros de lipase, devido à agregação de lipases em sua conformação aberta que não se encontram fixadas na superfície do suporte. As lipases também podem ser adsorvidas em outras proteínas como algum produto gerado na reação, competindo assim pelo sítio ativo com o substrato, reduzindo o rendimento reacional (MANOEL et al., 2015;ZHANG et al., 2017). 2.4.2 Suportes As características a serem analisadas na seleção de um suporte para imobilização de enzimas são a área superficial, a permeabilidade, a capacidade de regeneração, a morfologia e a composição, a natureza hidrofílica ou hidrofóbica, a resistência mecânica, entre outras (CANTONE et al., 2013; SIGURDARDÓTTIR et al., 2018; SASTRE et al., 2019; MULINARI et al., 2020). Os suportes podem ser classificados como orgânicos e inorgânicos, de acordo com suas características químicas, e podem ser subdivididos em naturais ou sintéticos. Suportes naturais possuem facilidade na degradação sem causar 35 danos ao meio ambiente, além de possuírem baixo custo. Os suportes sintéticos, por sua vez, podem ser combinados com uma variedade de propriedades físicas e químicas de tal modo a formar um suporte ideal para uma aplicação específica (MOHAMAD et al., 2015; GHOLAMZADEH et al. 2017; VERMA et al., 2019). Dentre os suportes orgânicos destacam-se os polímeros, naturais ou sintéticos, que são amplamente utilizados no campo da imobilização de biocatalisadores. Como exemplos desses suportes pode-se citar a agarose, a quitosana, resinas acrílicas e nanomateriais (LAGE et al., 2016; BASSI et al., 2016; SOUZA et al., 2017; ORTIZ et al., 2019). Os suportes inorgânicos são amplamente utilizados em aplicações industriais por apresentarem excelentes propriedades mecânicas, alta relação área superficial/ tamanho de poro, alta estabilidade de encubação em solventes orgânicos e por serem de fácil funcionalização com uma variedade de componentes (MULINARI et al., 2020). Exemplos desses suportes são as sílicas, as argilas, as aluminas e as zeólitas (CARVALHO et al., 2015; GHOLAMZADEH et al., 2017; DARONCH et al., 2020). Independente da natureza do suporte, a classificação do mesmo pode ser realizada levando em consideração também a sua morfologia. Nessa classificação os suportes podem ser porosos e não porosos. Os materiais porosos apresentam uma grande área superficial interna disponível para a imobilização das enzimas, protegendo-as dos efeitos de agitações vigorosas. Uma limitação desses materiais são os tamanhos de poros, que devem ser grandes o suficiente para a acomodação das enzimas e o posterior acesso das moléculas de substrato (MOHAMAD et al, 2015; SIGURDARDÓTTIR et al., 2018; REN et al., 2020).No que diz respeito aos materiais não-porosos, é eliminado o problema de transporte interno de massa, porém existe uma pequena área superficial disponível para que a enzima possa se ligar (SANTOS et al., 2015).A Tabela 3 demonstra as vantagens e desvantagem da porosidade no processo de imobilização enzimática. 36 Tabela 3- Vantagens e Desvantagens da porosidade na imobilização. Material Vantagens Desvantagens Poroso Elevada área superficial interna Limitações difusionais para o interior dos poros Não poroso Maior interação catalisador- subtrato devido à acomodação na superfície externa Pequena área superficial Fonte: Do autor. 2.4.3 Poli (estireno-divinilbenzeno) Dentre os diversos polímeros que podem ser utilizados como suporte para imobilização, o poli (estireno-divinilbenzeno) tem se destacado. Esses suportes são obtidos através da copolimerização do estireno utilizando divinilbenzeno como agente reticulante (RODRIGUES et al.,2015). A reação de copolimerização foi esquematizada na Figura 6. Figura 6- Representação esquemática da reação de copolimerização de estireno com divinilbenzeno. Fonte: do autor Esse material é extremamente hidrofóbico, o que permite uma fácil adsorção hidrofóbica de enzimas. Outro fator interessante desse material se encontra nas suas características morfológicas. O poli (estireno-divinilbenzeno) apresenta uma elevada área superficial e possui poros com diâmetros elevados, 37 o que acarreta em uma elevada capacidade de adsorção desse suporte (ALVES et al., 2017; BENTO et al., 2017; CORREA et al.,2021; MARTINS et al., 2013). 2.5 ÁLCOOIS PARA A SINTESE DE BIOLUBRIFICANTES Como mostrado anteriormente, a produção de biolubrificantes, em sua maioria, se dá pela modificação química de óleos, sendo eles vegetais, animais, residuais ou microbianos. Nos processos mais comuns, como é o caso da transestericação e da hidroesterificação, é necessário a utilização de alcoóis como reagentes. Entre esses alcoóis se destacam o metanol, etanol e polióis como o etileno glicol, trimetilol propano, pentaeritritol e neopentil glicol (SHABA et al., 2018; SANNI et al., 2017; HUSSEIN et al., 2021) 2.5.1 Etileno glicol Entre os poliois utilizados em processos de modificação química de óleos, o etileno glicol se destaca por possuir uma estrutura ramificada e propriedades anti-congelantes que são consideradas de grande importância para a produção de biolubrificantes (SHABA et al., 2018). A estrutura do etileno glicol pode ser observada na Figura 7. Figura 7- Estrutura química do etileno glicol. Fonte: do autor A utilização de etileno glicol como reagente de esterificação, gera como produto ésteres de etileno glicol, um biolubrificante atóxico, com boa lubricidade devido à sua capacidade de aderência, protegendo assim a superfície de desgastes sob pressão, além de boa estabilidade térmica, alto ponto de fulgor e baixa volatilidade (SUKIRNO & FARHANDIKA, 2020). Na Tabela 4, podemos ver alguns exemplos de trabalhos da literatura que utilizam do etileno glicol para esse fim. HO OH 38 Tabela 4- Estudos utilizando etileno glicol para produção de biolubrificantes. Matéria-prima Reação Catalisador Condições de reação Rendimento Tempo Referência Óleo de soja Transesterificação Metóxido de sódio 6:1 óleo/álcool; 120°C; 0,4% catalisador m/m 88,30% 3 horas Sanni et al (2017) Óleo de palma Transesterificação Metóxido de sódio 6:1 óleo/álcool; 120°C; 0,6% catalisador m/m 92% 3 horas Sanni et al (2017) Óleo de palma Transesterificação Metóxido de sódio 3:1 óleo/álcool; 135°C 81,48% 2 horas e 48 min Shaba et al (2018) Óleo de palma de grau industrial Transesterificação Catalisador básico 3,5:1 óleo/ álcool; 170°C 93% 3 horas Sukirno & Farhandika (2020) Ácido Oléico e ácido decanoico Esterificação Novozyme 435 6:1 óleo/ álcool; 23°C; 5% catalisador m/m 90% 24 horas Yao et al (2014) Óleo de fritura usado Transesterificação Óxido de cálcio 3,5:1 óleo/álcool; 130°C ; 1,2% catalisador m/m 94% 1 hora e 30 min Hussei et al (2021) Fonte: do autor Essa dissertação de mestrado visa trazer como inovação a utilização da lipase Eversa® Transform 2.0, enzima amplamente empregada na produção de biodiesel, na produção de biolubrificantes, aplicação essa que ainda é muito escassa. Essa lipase será imobilizada por adsorção física em partículas de poli (estireno-divinilbenzeno), devido suas caracteristicas morfológicas e hidrofobicidade. Além disso, será empregado o etileno glicol, como o álcool necessário para o processo de hidroesterificação. Dentre os estudos presentes na literatura, apenas esse trabalho utilizou de catálise enzimática (lipase) com esse diol como reagente, sendo outro ponto diferencial. O mesmo foi selecionado devido às excelentes propriedades dos biolubrificantes como boa estabilidade térmica, alto ponto de fulgor e boa lubricidade obtidos com este poliol (SHABA et al., 2018; SUKIRNO & FARHANDIKA, 2020; BILAL et al., 2013). Vale ainda ressaltar a importancia ambiental deste trabalho, visto que o mesmo busca reaproveitar e gerar valor agregado a subprodutos, como é o caso do óleo de fritura, evitando assim o desperdicio de insumos e reduzindo a geração de resíduos. 39 2.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABDULLA R; SANNY AS; DERMAN E (2017) Stability studies of immobilized lipase on rice husk and eggshell membrane. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering, v. 206, n. 1. ABED SM. et al (2018) Synthesis of structured lipids enriched with medium-chain fatty acids via solvent-free acidolysis of microbial oil catalyzed by Rhizomucor miehei lipase. Lwt, v. 93, p. 306–315. AFIFAH NA; SYAHRULLAIL S; WANAZLEE NI et al (2019) Biolubricant production from palm stearin through enzymatic transesterification method. BiochemEng J 148:178–184. AGUIEIRAS ÉCG; CAVALCANTI EDC; DA SILVA PR; SOARES VF; FERNANDEZ-LAFUENTE R; BESSA ASSUNÇÃO CL;… FREIRE D. M G (2019). 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