Gissandra Farias Braz LENTIVIRUS DE PEQUENOS RUMINANTES: CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA E ANTIGÊNICA DE ISOLADOS DE CAPRINOS E OVINOS DO BRASIL Tese apresentada à Universidade Federal de Minas Gerais, Escola de Veterinária, como requisito parcial para obtenção do título de doutor em Ciência Animal. Área de concentração: Medicina Veterinária Preventiva Orientador: Prof. Rômulo Cerqueira Leite Belo Horizonte Escola de Veterinária da UFMG 2013 2 Braz, Gissandra Farias, 1976- B827l Lentivírus de pequenos ruminantes: caracterização genética e antigênica de isolados de caprinos e ovinos do Brasil / Gissandra Farias Braz. – 2013. 79 p. : il. Orientador: Rômulo Cerqueira Leite Tese (doutorado) – Universidade Federal de Minas Gerais, Escola de Veterinária. Inclui bibliografia 1. Caprino – Doenças – Teses. 2. Ovino – Doenças – Teses. 3. Lentivírus – Teses. I. Leite, Rômulo Cerqueira. II. Universidade Federal de Minas Gerais. Escola de Veterinária. III. Título. CDD – 636.390 89 3 4 5 Meus pais, Maria e José, Dedico. 6 7 AGRADECIMENTOS A Deus pela presença constante em minha vida. Aos meus pais pela confiança, apoio, amor, incentivo, força e conselhos. As minhas irmãs Gislane, Giselma, Gisleide, Dyana, e Graciéla, pelo apoio, amizade, alegria, incentivo e carinho. Aos meus sobrinhos Tháfyne, Letícia, Gustavo e Deyvisson pelos momentos de felicidade e carinho. Ao professor Rômulo pela oportunidade, confiança e orientação. Ao Professor Marcos Bryan Heinemann, pelo apoio, paciência, dedicação e amizade. Ao Jenner Karlisson Pimenta dos Reis pelo suporte científico, apoio e amizade. A toda equipe do Retrolab em especial Ana Paula, Cairo, Paula, André, Fê, Dani, Juliana Quintanilha e João Helder pelo apoio e bons momentos compartilhados. A Eduardo Nunes, Grazielle Cossenzo, Anita e Graciéla pelo suporte técnico, paciência e dedicação. A Escola de veterinária da UFMG, pela contribuição à minha formação profissional. A Cnpq pelo auxílio financeiro. A colaboração e suporte técnico das instituições, onde uma fase experimental deste projeto foi realizado: Universidades: Universidade Federal da Bahia-UFBA, Universidade Federal do Piauí -UFPI, Universidade Federal de Pernambuco - UFRPE, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia/FMVZ- Unesp-Botucatu (SP); Instituições: EMEPA (Soledade, PB), EMPARN (Cruzeta, RN), ADAB (Salvador, BA), EBDA (Feira de Santana, BA), EMBRAPA-CNPC (Sobral, Ceará). À Dr. Leonardo Toreão e Dalva (EMEPA), Souza jr e Kaliandra (UFPI), Serginho e Luciana Coutinho (UFRPE), Prof. Edízio (UFCG), Profa. Lygia (Unes-FMVZ), Profa Sílvia Sardi (UFBA), pelo empenho e suporte dedicado à realização deste trabalho. La France: À mes amis français: Pauline, Nicolas, Julia, Elodie, Jonathan, Antoine, Pékola, Marion, Pierri, Lourdinha et Adriana, pour votre soutien, les moments passés ensemble de détente et de découverte. Pour l’accueil et l’amitié inestimable. 8 À mes formateurs de langue française (ASFODEP): Sylvain RUELLE et Lydie BREMBOR, merci pour l’initiation à la langue française. Je tiens à remercier également tout le personnel de l’Anses Laboratoire de Niort: Je remercie Madame Jaquemine VIALARD pour m’avoir accueillie au sein de son laboratoire; À Stephen VALAS que jeremercie pour sa disponibilité, son soutien pendant mon séjour en France, sa patience ainsi que de son accompagnement pendant ma thèse, ce qui m’a permis d’enrichir mes propres connaissances; À ma chère Sylvie, merci pour son amitié sincère, pour nos conversations en langue portugaise et aussi pour les sorties gastronomiques à Niort; À Alain LE VEN et Benoît CROISÉ pour leur soutien et pour avoir partagé le laboratoire avec moi; Et enfin à Isabelle PORS, Christian, Pascale LE COZ, Carine, Thierry, Cécile, Isabelle, Gaëlle, Sophie, Marie-Pierre, Pascale, Patrick et Anaïs, merci pour leur soutien et leur sympathie qui m’ont permis de passer un stage très agréable au laboratoire ANSES. A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho. 9 Sofrer, é só uma vez; Vencer, é para a eternidade. Soren Kierkegaard 10 SUMÁRIO LISTA DE ABREVIAÇÕES 14 RESUMO ............................................................................................................................................. 15 ABSTRACT ........................................................................................................................................ 16 INTRODUÇÃO .................................................................................................................................. 17 CÄPÍTULO 1: Isolamento de amostras brasileiras de lentivirus de pequenos ruminantes (LVPR) ................................................................................................................................................ 18 RESUMO ............................................................................................................................................. 18 1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................................. 18 2. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................................... 19 2.1 Animais e espécimes para o isolamento viral .............................................................................. 19 2.2 Coleta de Dados ............................................................................................................................. 19 2.3 Controles......................................................................................................................................... 20 2.4 Cultivo celular primário de MSC não infectadas ......................................................................... 20 2.5 Isolamento de LVPR...................................................................................................................... 20 2.5.1 Isolamento viral de LVPR a partir de cultivo primário de plexo coróide e MSC. ................ 20 2.5.2 Isolamento viral de LVPR a partir Cocultivo de leucócitos e lavado brônquio alveolar ....... 20 2.6 Detecção de LVPR nos cultivos de tecidos .................................................................................. 21 2.7 Sequenciamento ............................................................................................................................. 22 2.8 Análise filogenética ....................................................................................................................... 22 Análise estatística ................................................................................................................................. 22 3. RESULTADOS ............................................................................................................................... 23 3.1 Isolamento viral.............................................................................................................................. 23 3.1.1 Isolamento viral e características de cultivos ............................................................................ 23 3.1.2 Associação da freqüência de isolamento viral e possíveis fatores de risco ............................ 23 4. DISCUSSÃO ................................................................................................................................... 31 5. CONCLUSÕES .............................................................................................................................. 33 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................................... 33 ANEXO ................................................................................................................................................ 37 CAPÍTULO 2: Caracterização filogenética de Lentivirus de Pequenos Ruminantes (LVPR) em caprinos e ovinos naturalmente infectados em rebanhos brasileiros ................... 38 RESUMO ............................................................................................................................................. 38 1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................................. 38 2. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................................... 40 2.1 Amostras ......................................................................................................................................... 40 2.2 Extração de DNA proviral ............................................................................................................. 40 2.3 Amplificação proviral ................................................................................................................... 40 2.3.1 Amplificação dos fragmentos dos genes env e gag pela PCR ................................................. 40 2.4 Sequenciamento ............................................................................................................................. 41 2.5 Análise filogenética ....................................................................................................................... 43 2.6 Números de acesso das sequências de nucleotídeo...................................................................... 43 3. RESULTADOS ............................................................................................................................... 43 3.1 Análise filogenética baseadas na região SU de env ..................................................................... 43 3.1.1 Análise filogenética da região V1/V2 ....................................................................................... 43 3.1.1.1 Comparação das sequências .................................................................................................... 43 3.1.1.2 Matriz e distâncias das região V1/V2.................................................................................... 44 3.1.2 Análise filogenética da região V4/V5 ....................................................................................... 44 3.2 Análise filogenética baseada na região MA/CA (gag) ............................................................... 50 3.2.1 Comparação das sequências ....................................................................................................... 50 11 33.2. Matriz de distância do gene env (CA) ...................................................................................... 50 3.2.3 Análise de aminoáciodos das regiões imunodominante de MA/CA ....................................... 54 4. DISCUSSÃO ................................................................................................................................... 57 5. CONCLUSÕES .............................................................................................................................. 59 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................................... 60 Capítulo 3: Caracterização antigênica de Lentivirus de Pequenos Ruminantes (LVPR) por ELISA recombinante (MA/CA e SU) em rebanhos de caprinos e ovinos brasileiros...... 62 RESUMO ............................................................................................................................................. 62 1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................................. 62 2. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................................... 65 2.1 Amostras ......................................................................................................................................... 65 2.2 Imunodifusão em gel de agarose (IDGA) ................................................................................... 66 2.3 Antígenos recombinantes SU1/GAG/SU5 e SU1/SU5 ............................................................... 66 2.4 Elisa recombinante e ELISA chekit .............................................................................................. 66 2.5 Caracterização antigênica de soros de caprinos e ovinos por ELISA SSB1 e SS0016 ............. 67 2.6 Técnica de ELISA com proteínas recombinantes ........................................................................ 67 2.7 ELISA chekit CAEV/MVV screening.......................................................................................... 68 2.8 Análise estatística........................................................................................................................... 68 3. RESULTADOS ............................................................................................................................... 68 3.1 Caracterização antigênica de soros de caprinos e ovinos por ELISA de proteínas recombinantes SSB1 e SS0016 ........................................................................................................... 68 3.1.1Caprinos ........................................................................................................................................ 68 3.1.2 Ovinos .......................................................................................................................................... 69 3.2 Caracterização molecular versus caracterização antigênica ........................................................ 69 4. DISCUSSÃO ................................................................................................................................... 74 5. CONCLUSÕES .............................................................................................................................. 75 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................................... 75 CONSIDERAÇÕES FINAIS............................................................................................................ 79 CONCLUSÕES FINAIS ................................................................................................................... 79 12 LISTA DE TABELAS Capítulo 1 Tabela 1 - Caprinos utilizados para o isolamento viral de LVPR ...................................................................... 25 Tabela 2 - Identidade das sequências de nucleotídeos do gene gag (412 nt) de isolados brasileiros de LVPR com CAEV cork (nBlast, Genbank)................................................................ 27 Tabela 3 - Identidade das sequências de nucleotídeos do gene env (379 nt) de isolados brasileiros com CAEV cork (nBlast, Genbank). ............................................................................... 27 Tabela 4 - Estatística descritiva dos períodos em dias do isolamento de LVPR............................................... 29 Tabela 5 - Resultado da frequência de isolamento do LVPR a partir de caprinos oriundos de rebanhos brasileiros considerando a raça ...................................................................................... 30 Tabela 6 - Resultado da frequência de isolamento do LVPR de diferentes tecidos isolados de caprinos oriundos de rebanhos brasileiros considerando idade do caprino ................................ 30 Tabela 7 - Resultado da frequência de isolamento do LVPR de diferentes tecidos isolados de caprinos oriundos de rebanhos brasileiros considerando sinais clínicos..................................... 30 Capítulo 2 Tabela 1 - Amostras sequenciadas a partir de isolados de LVPR de caprinos e PBL de caprinos e ovinos oriundos da região nordeste e sudeste do Brasil ................................................. 45 Tabela 2 - Números de acesso das sequências de LVPR brasileiras no Genbank ........................................... 47 Tabela 3 - Distâncias de nucleotídeo e aminoácidos entre as sequências de V1V2 de isolados brasileiros e os genótipos de LVPR..................................................................................... 49 Tabela 4 - Divergência de nucleotídeos e aminoácidos do gene gag das amostras Br1163 e Br195. ................................................................................................................................................ 52 Tabela 5 - Matriz de comparação das distâncias genéticas de nucleotídeos e aminoácidos entre sequências do gene Gag (MA/CA) e subtipos de LVPR......................................................... 52 Tabela 6 - Destaque dos principais achados obtidos em análise filogenética das sequências brasileiras de LVPR ......................................................................................................... 55 Capítulo 3 Tabela 1 - Descrição de soros de caprinos e ovinos e respectivos testes diagnósticos realizados ............................................................................................................................................. 67 Tabela 2 - Resultados sorológicos de proteínas recombinantes SS e SGS obtidos em caprinos de rebanhos brasileiros ......................................................................................................... 70 Tabela 3 - Classificação antigênica de LVPR de caprinos de rebanhos brasileiros obtidos na proteína recombinante SS .............................................................................................................. 70 Tabela 4 - Soro caprinos que obtiveram reação antigênica exclusivamente para o antígeno SS0016 ou que apresentaram DO elevada em ELISA SSB1 e SS0016........................................... 71 Tabela 5 - Soros de caprinos (n=70) com reatividade simultânea nas proteínas recombinantes SSB1* e SS0016** e a classificação antigênica de acordo com os critérios estabelecidos..................................................................................................................... 72 13 Tabela 6 - Classificação genética obtida no gene env (V1/V2 e V4/V5) e gag (MA/CA) e antigênica (SU1/SU5) de caprinos e ovinos naturalmente infectados com LVPR no Brasil ................................................................................................................................... 73 LISTA DE QUADROS Capítulo 1 Quadro 1 - Oligonucleotídeos utilizados na nested-PCR e seqüenciamento ...................................................... 21 Capítulo 2 Quadro 1 - Iniciadores utilizados na amplificação dos genes gag e env ............................................................. 42 LISTA DE ANEXO Capítulo 1 Anexo 1 - Cocultivo de Lavado brônquio alveolar ............................................................................................. 37 Anexo 2 - Cultivo primário de membrana sinovial caprina (MSC) e Plexo coróide (PC). .............................. 37 LISTA DE FIGURAS Capítulo 1 Figura 1 - Isolados de LVPR de Caprinos (n = 42) e estados oriundos no Brasil. ........................................... 28 Figura 2 - Eletroforese duplex - nested – PCR do CAEV. ................................................................................. 28 Figura 3 - Box-plot do período (dias) do isolamento viral. ................................................................................ 29 Capítulo 2 Figura 1 Genoma do lentivirus de pequenos ruminantes (LVPR) .................................................................. 42 Figura 2 - Relação filogenética de sequências de nucleotídeos (env) de amostras brasileiras de LVPR de caprinos e ovinos ......................................................................................... 48 Figura 3- Alinhamento de dedução de sequências brasileiras e referências de SRLV de aminoácidos da região V4/V5 do gene env (V4V5) ......................................................................... 51 Figura 4 - Alinhamento de dedução de sequências de aminoácidos de LVPR da região V4 do gene env (379 nt) ............................................................................................................................ 52 Figura 5- Relação Filogenética de sequências de nucleotídeos (gag) de amostras brasileiras de LVPR de caprinos e ovinos ......................................................................................... 53 Figura 6- Alinhamento de dedução de sequências de aminoácidos de SRLV da região do gene gag (MA/CA) (947 nt). .............................................................................................................. 56 Capítulo 3 Figura 1 Antígenos recombinantes SGS e SS................................................................................................... 67 Figura 2 Reatividade em ELISA SSB1* e SS0016** de soros de caprinos oriundos das regiões NE, SE e SU do Brasil ........................................................................................................... 70 14 LISTA DE ABREVIAÇÕES BA – Bahia BR - Brasil BVD – Diarréia viral bovina CA – Capsídio CAEV – Artrite encefalite caprina DNA - Ácido desoxirribonucleico EDTA - Ácido etilnodiamino tetracético ELISA - Ensaio imunoenzimático IDGA - Imunodifusão em gel de Agar IgG - Imunoglobulina G HIV 1 - Vírus da imunodeficiência humana tipo 1 LBA - Lavado brônquio alveolar LVPR - Lentivirus de pequenos ruminantes M.O. I - Multiplicidade de infecção MA - Maranhão MA - Proteína da matriz MEM - Meio essencial mínimo MG - Minas Gerais MHR - Região de homologia principal MVV -Vírus Maedi- Visna NaCl - Cloreto de sódio NE - Nordeste DO - Densidade óptica Kpb, pb – kilopares de base, pares de base PBL - Leucócitos do sangue periférico PBMC - Células monoculares do sangue periférico PBS - Solução salina de fosfato PC - Plexo coróide PE - Pernambuco P.I. - Pós-inoculação PI - Piauí PO4 - Fosfato RJ - Rio de Janeiro RN - Rio Grande do Norte RS - Rio Grande do Sul SE - Sudeste SFB - Soro fetal bovino SP - São Paulo STV - Solução de tripsina Versene S – Sul SU – Glicoproteína de superfície TM - Proteína transmembrana 15 RESUMO Com o objetivo de isolar e caracterizar por análise filogenética e antigênica os lentivirus de pequenos ruminantes (LVPR), amostras de Plexo coróide, MSC, PBMC e LBA de 44 caprinos e soros de 1882 caprinos e de 67 ovinos e soros de caprinos (n=1882) e de ovinos (n=67) oriundos das regiões NE, SE e S do Brasil foram coletados entre 2009 a 2011. Trinta e dois DNA proviral de isolados de LVPR e de sangue (caprinos=6 e ovinos=2) foram amplificados por nested – PCR em dois fragmentos do gene env compreendendo a região V1V2 (394p) e V4V5 (608pb) e a região da matriz e capsídio do gene gag (990pb), seguido de sequenciamento de nucleotídeos. A resposta antigênica dos soros foi avaliada frente aos antígenos recombinantes multiepítopos com domínios imunodominantes das proteínas estruturais (MA, CA e SU baseado nos subtipos B1 e A13). LVPR foram isolados de 42 caprinos e não houve associação entre isolamento de LVPR e os achados clínicos, idade e nem tipo de raça ou produção. A caracterização genética e antigênica dos LVPR evidenciou, principalmente, a presença do subtipo B1 nos rebanhos caprinos, apesar de também ter sido encontrado em rebanhos de ovinos. Adicionalmente, encontrou-se o genótipo A em isolados de caprinos. A classificação de LVPR de ovinos no genótipo B e de caprinos no grupo A evidenciou a transmissão de MVV e CAEV interespécie entre caprinos e ovinos no Brasil. Análise de aminoácidos (V4/V5) identificou recombinação ou coinfecção ocorrendo em caprinos, dentre os quais, dois discordantes vírus agruparam nos grupos A e B, demonstrando que estes caprinos foram dualmente infectados, enquanto outro vírus apresentou uma inserção de novo motivo na região imunogênica da proteína de superfície (domínio V4). Estes resultados demonstram a diversidade genética e antigênica de estirpes de LVPR circulantes no Brasil e confirma a necessidade de considerar todos os genótipos virais em antígenos utilizados em testes sorológicos, a fim de evitar diagnósticos incorretos e aumentar a acurácia dos mesmos nos programas de controles de LVPR. Palavras chaves: Caracterização genética e antigênica, isolamento, lentivirus de pequenos ruminantes, ovino, caprino, Brasil ABSTRACT With the goal to isolate and characterize by phylogenetic and antigenic analysis the small ruminant lentiviruses (SRLV), choroid plexus; MSC, PBMC and BAL samples from 44 goats and 1882 goat and 67 sheep serums from Northeast, Southeast and South of the Brazil were collected between 2009 at 2011. Proviral DNA from 32 SRLV isolates and from blood (6 goats and 2 sheep) were amplified by nested – PCR PCR in two fragments spanning either the V1V2 (394pb) or V4V5 (608pb) of env region, and one gag fragment (990pb) containing partial MA and entire CA coding sequence, followed by nucleotide sequencing. The antigenic response of sera ware evaluated against multiepitope recombinant antigens with immunodominant domains of structural proteins (CA, MA, SU, based on the A13 and B1 subtypes). LVPR were isolated from 42 goats, and showed no association between LVPR isolation and clinical signs, age, breed or production type. LVPR genetic and antigenic characterization showed mainly the B1 subtype in dairy goats, despite having also been found in sheep. Additionally, the genotype A was found in goats. LVPR classification of sheep in B and goat in A-groups evidenced the MVV and CAEV interspecies transmission in Brazil. Amino acid analysis (V4/V5) identified coinfection or recombination occurring in goats, among which two discordant virus clusters corresponding to group A and B group, demonstrating that this goats was dually infected, while another virus showed a new motive inserted in the protein surface immunogenic region (V4 domain). These results demonstrated the genetic and antigenic diversity of Brazilian SRLV strains circulating in country, and confirm the necessity to consider all the viral genotypes in antigens used to serological tests, in order to prevent misdiagnosis and increase the accuracy of these in the SRLV controls programs Keywords: Genetic and antigenic characterization, isolation, small ruminant lentivirus, sheep, goat, Brazil. 17 INTRODUÇÃO Os Lentivirus de pequenos ruminantes (LVPR) compreendem as infecções pelos vírus Maedi Visna (MVV) e Artrite Encefalite Caprina (CAEV) que têm como hospedeiros os ovinos e caprinos. São doenças de grande distribuição geográfica, causando grandes perdas nas produções de ovinos e caprinos mundialmente. No Brasil, essas espécies de ruminantes não são nativas e foram introduzidas no período colonial. Estes animais têm sua origem na Península Ibérica e mantiveram-se livres dessas doenças até a década de 1970, quando no intuito de melhorar geneticamente os rebanhos nacionais ocorreram grandes importações de animais de várias raças e origens sem os devidos controles sanitários. Assim, em 1986 animais positivos aos LVPR foram diagnosticados em rebanhos do Rio Grande do Sul, onde foi também realizado o primeiro isolamento viral em 1993. Após estes eventos, rebanhos de todas as regiões geográficas do Brasil foram diagnosticados para as doenças. Diante dessa situação, é de fundamental importância o conhecimento dos vírus circulantes nos rebanhos nacionais e sua caracterização filogenética. Para isso, a proposta dessa pesquisa, foi isolar vírus (LVPR), nas regiões Nordeste e Sudeste do Brasil, e realizar o estudo filogenético dos isolados e caracterização antigênica para identificar quais os vírus circulantes e suas possíveis origens, auxiliando a melhoria dos métodos de diagnóstico e controle dessas doenças. 18 CAPÍTULO 1 Isolamento de amostras brasileiras de Lentivirus de Pequenos Ruminantes (LVPR) RESUMO Lentivirus de pequenos ruminantes (LVPR) foram isolados de 42 caprinos oriundos de 34 propriedades localizadas nas regiões Sudeste (RJ, SP e MG) e Nordeste (RN, CE, BA, PE, BA, PI e MA) do Brasil. Diferentes espécimes para obtenção do isolamento viral foram comparados: cultivo primário de membrana sinovial caprina (MSC), plexo coróide (PC) e macrófagos (cocultivo de leucócito e lavado brôquio alveolar). A MSC ofereceu melhores condições e rendimento de cultivo para isolamento viral. O isolamento de LVPR foi confirmado por amplificação de uma região do gene gag do vírus a partir do DNA - proviral em uma nested-PCR. Não houve associação entre isolamento de LVPR e achados clínicos, idade e nem tipo de raça e tipo de produção. Palavras chaves: Isolamento, LVPR, caprino, Brasil, nested-PCR, MSC. 1. INTRODUÇÃO Infecções causadas por Lentivirus de Pequenos Rruminantes (LVPR) compreendem aquelas causadas pelos vírus Maedi Visna (MVV) e artrite encefalite caprina (CAEV), inicialmente isolados em ovinos e caprinos, respectivamente. Os LVPR são distribuídos amplamente em todo mundo, causando infecção persistente em seus hospedeiros e são particularmente prevalentes entre as raças de caprinos leiteiros (Adams et al., 1984). Todos os animais infectados por LVPR tornam-se transmissores potenciais do vírus, embora muitos deles sejam portadores assintomáticos. As infecções pelos LVPR resultam em quatro síndromes crônicas de doença incluindo encefalomielite, artrite, pneumonia intersticial e mastite (Cork et al., 1974b; Crawford et al., 1980; Phelps e Smith, 1993). Os LVPR infectam monócitos e macrófagos, onde se replicam e integram seu DNA intermediário (provirus) ao genoma dos hospedeiros, estabelecendo uma infecção persistente (Narayan et al., 1983; Narayan e Cork, 1985; Phelps e Smith, 1993). Outros tipos celulares, como células epiteliais de diferentes órgãos, fibroblastos, células endoteliais, e células dendríticas, também são infectados e desempenham diferentes papéis na manutenção e propagação do vírus dentro do organismo e entre indivíduos (Gendelman et al., 1985; Narayan e Clements, 1989; Zink et al., 1990; Ryan et al., 2000; Lamara et al., 2001,2002; Adebayo et al., 2010). É importante ressaltar que as células epiteliais da glândula mamária, bem como o colostro e o leite, contêm vírus livre, sendo uma importante via de transmissão para prole (Zink et al., 1990; Ravazzolo et al., 2006) Desde a descoberta dos LVPR, a membrana sinovial caprina (MSC) e o plexo coróide (PC) foram os tecidos de escolha para o isolamento e identificação do CAEV e MVV (Sigurdsson et al., 1960; Crawford et al., 1980). O CAEV foi demonstrado em diferentes tecidos nervosos (plexo coróide, células microglial, astrócitos, oligodentrócitos, epitélio ependimal) (Sanna et al., 1999), com uma replicação restrita em células de plexo coróide ovino (Chebloune et al., 1996; Barros et al., 2005), o que foi correlacionada à clivagem proteolítica anormal da glicoproteína do envelope viral (Chebloune et al., 1996). No Brasil foi realizado no Rio Grande do Sul, por cocultivo de leucócitos, o primeiro isolamento do CAEV (Hotzel et al., 1993) e MVV (Moojen et al., 1996). Isolamentos subsequentes foram realizados 19 principalmente a partir de cocultivo de leucócitos e cultivo primário de MSC (Castro et al., 1999a; Lima et al., 2004; Tigre et al., 2006; Costa et al., 2007; Feitosa et al., 2011). Atualmente, a doença acomete os pequenos ruminantes em várias partes do Brasil acarretando grandes perdas econômicas (Leite et al., 2004; Bohland e D'Angelino, 2005; Bandeira et al., 2009; Silva et al., 2012). Um estudo de isolamento para posterior caracterização de LVPR circulantes em diferentes regiões geográficas do Brasil, dentre as principais regiões produtoras de caprinos (Nordeste e Sudeste), seria importante para compreender a real importância desses vírus para a caprinocultura brasileira. Nesse trabalho, propôs-se o isolamento de LVPR de caprinos oriundos das regiões sudeste e nordeste do Brasil e compararam- se diferentes tecidos para o isolamento viral. Além de estudar as características dos cultivos e/ou possíveis associações do isolamento viral com achados clínicos, raciais, tipo de produção e idade dos hospedeiros, também se objetivou estabelecer um banco de estirpes brasileiras de LVPR para estudos futuros. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Animais e espécimes para o isolamento viral As amostras foram coletadas durante os anos de 2009 a 2011 (Tabela 1) de 44 caprinos sorologicamente positivos para CAEV pelo teste de imunodifusão em Agar gel (Kit IDGA-CAE, Biovetech, Recife-PE, Brasil) provenientes de 34 propriedades comerciais nas regiões Sudeste (RJ, SP e MG) e Nordeste (RN, CE, BA, PE, BA, PI, e MA) do Brasil. Os animais tinham idade entre um a 12 anos e eram das raças Anglo nubiano (n = 10), Boer (n = 1), British alpina (n = 1), Pardo alpina (n = 7), Saanen (n = 21) e Toggenburg (n = 4) (Tabela 2). Os grupos amostrais foram classificados segundo a faixa etária dos animais (até 2 (< 2), 2 a 4 (4), e maior que 4 anos (> 4)) (Tabela 1). Trinta e nove animais foram eutanasiados e necropsiados. Coletaram-se as articulações dos carpos direito e esquerdo, o encéfalo e o lavado brônquio alveolar (LBA), os quais foram acondicionados em gelo até o procedimento de cultivos para o posterior isolamento viral (Tabela 1). O sangue dos 39 caprinos e de outros cinco animais não necropsiados, foi coletado com anticoagulante (EDTA) por venopunção da veia jugular e mantido refrigerado (4 o C) para posterior extração das células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e isolamento dos LVPR por cocultivo de leucócitos. Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de Minas Gerais (CETEA-UFMG protocolo # 101/2010). 2.2 Coleta de dados Os animais foram examinados clinicamente quanto à presença de artrite, mastite ou sinais respiratórios. O exame clínico foi baseado na avaliação geral do estado de marcha, inspeção e palpação das articulações e da glândula mamária. Sinais clínicos relacionados aos LVPR foram observados como forma articular (aumento articular, claudicação), forma respiratória (tosse, secreção nasal) e forma mamária (endurecimento glandular, nodulações, hipertrofia de linfonodos retro-mamário e assimetria de tetos). Foram também categorizados em: artrite, artrite-mamária, mamária e outros (artrite e/ou mamária mais respiratória) e sem sinais clínicos (ausentes). As formas clínicas e os dados coletados referentes ao tipo de exploração do rebanho, raça e sexo e idade, considerados prováveis fatores de risco, foram submetidos ao teste de associação com a frequência de isolamento viral. 20 2.3 Controles Os controles positivos e negativos para cultivo viral e extração do DNA proviral foram: amostra padrão de LVPR 75-G63 clone (ATCC ® : VR-905™) e células de membrana sinovial caprina (MSC) não infectadas (ver item 2.4), respectivamente. 2.4 Cultivo celular primário de MSC não infectado As células de MSC foram obtidas a partir de explantes de MSC da articulação carpal de fetos caprinos oriundos de cabras com dois testes (IDGA) subsequentes negativos para LVPR. A membrana sinovial foi fragmentada em pequenos pedaços e transferida para garrafas de cultivo de 25cm 2 e cultivada em meio essencial mínimo (MEM) suplementado com 20% de SFB, 1% de anfotericina B (0,5 g/mL) e 2% de penicilina e estreptomicina (solução estoque 200 UI/mL e 200 g/mL, respectivamente), incubadas a 37ºC, em atmosfera de 5% de CO2, por até 30 dias e depois congelada por processo lento contendo MEM, DMSO e 20% SFB e estocada em nitrogênio líquido. Para Para a identificação de LVPR e patógenos contaminantes (Diarréia Bovina a Vírus - BVD e Micoplasma spp) foi utilizada uma reação em cadeia de polimerase (PCR) com iniciadores específicos para cada caso. A PCR para LVPR foi realizada segundo Barlough et al. (1994), enquanto os diagnósticos de BVD e Micoplasma spp. foram realizados no Lanagro -MG - MAPA (Oliveira, 2012). 2.5 Isolamento de LVPR O isolamento do vírus da artrite encefalite caprina foi obtido a partir de cultivo primário de plexo coróide (PC) e MSC, cocultivo de lavado brônquio alveolar (LBA) de animais necropsiados e/ou cocultivo de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) com MSC. 2.5.1 Isolamento viral de LVPR a partir de cultivo primário de plexo coróide e MSC O encéfalo e as articulações dos carpos sem os tecidos tegumentares foram imersos em solução fisiológica de NaCl 0,9% esterilizada contendo antibiótico (penicilina 200 UI/mL/estreptomicina 200 µg/mL) e 5 mg/L anfotericina B por no mínimo 30 min a 4°C. O PC (lavado antes com 2 mL de meio MEM) e a MSC foram transferidos para uma Placa de Petri esterilizada (INLAB) imersos em 0,5 mL de meio MEM com antibiótico e cortados em minúsculos fragmentos com bisturi n° 22. Em seguida, com um auxílio de uma seringa de insulina esterilizada (1 mL), foram transferidos para garrafas de cultivo de 25cm 2 e placas de 24 poços (Sarsted) (Figura 2). Após 30 min em estufa a 37ºC, 5% CO2, para adesão dos explantes na superfície da garrafa, foi adicionado lentamente meio MEM suplementado com 20% de SFB, 1% de anfotericina B (0,5 mg/mL) e 2% de penicilina e estreptomicina (solução estoque 200 UI/mL e 200 g/mL, respectivamente), e incubadas a 37ºC, 5% CO2 em uma atmosfera umidificada. No décimo quarto dia de cultivo, os explantes foram transferidos para outra garrafa e monocamadas foram tripsinizadas e subcultivadas na proporção de 1:1 por até três meses. Em intervalos de sete a 14 dias, realizaram-se repiques e extração de DNA da suspensão celular para detecção do DNA proviral, além de fixação e coloração das placas com cristal violeta a 0,1% (cristal violeta 0,1% 10 min seguido de lavagem com água destilada), para verificação do efeito citopático (Anexo, Figura 5). 2.52 Isolamento viral a partir de cocultivo de PBMC e LBA As células mononucleares do sangue periférico foram obtidas por centrifugação de 20 mL do sangue com EDTA em gradiente de ficoll (Phicoll-paque ® , GE Healthcare, UK). Inicialmente o sangue foi 21 centrifugado a 400 x g por 10 min a 4°C e a capa leucocitária retirada por pipetagem e diluída (1:2) em solução salina fosfato 1x (PBS) (0,01M PO4, 0,15M NaCl, pH 7,2). Esta camada foi vertida lentamente sobre 2 mL de ficoll e centrifugada a 500 x g por 30 min. Após centrifugação o PBMC foi lavado duas vezes com PBS 1x, depois ressuspendido em 1 mL de meio MEM e transferido para garrafa de 25cm 2 e placas de 24 poços, para maturação dos monócitos em macrófagos e incubação por sete dias a 37°C e 5% CO2. O LBA foi coletado após introdução de cerca de 200 mL de solução salina esterilizada (0,9% NaCl) em cada lobo pulmonar com uma seringa (20 ou 60 mL) acoplada a um cateter uretral n º . 22 (IBRAS- CBO, São Paulo), depois transferido para um tubo de 50 mL esterilizado e mantido sobre refrigeração até o processamento (Anexo, Figura 4). O LBA foi filtrado em uma gaze esterilizada e adicionado 2% de penicilina-estreptomicina (200 UI/mL e 200 g/mL, respectivamente) e 1% de anfotericina B (0,5 mg/mL), centrifugou-se a 300 x g por 15 min. O sedimento foi lavado duas vezes com PBS 1x e ressuspendido em 1 mL de meio MEM e transferido (50.000 cel/cm 2 ) para garrafas de 25cm 2 e placas de 24 poços. Após 24 horas mantidas em 37°C e 5% CO2, as células não aderentes dos cultivos de leucócitos e do LBA foram removidas após duas lavagens com PBS 1x esterilizado. Após sete dias, procedeu-se ao cocultivo dos macrófagos com MSC não infectada, acrescentando 30.000 células/cm 2 de MSC e meio essencial mínimo (MEM–Sigma Aldrich Co., U.S.A), suplementado com 10% de soro fetal bovino (Sigma Aldrich Co., U.S.A), 0,5% de anfotericina B (50g) e 1% de penicilina (200 UI/mL) e estreptomicina (200 g/mL) e cultivados a 37ºC, 5% CO2 em uma atmosfera umidificada. No décimo quarto dia de cultivo as monocamadas dos cocultivos foram tripsinizadas e subcultivadas na proporção de 1:1. No período máximo de três meses, em intervalos de 7 a 14 dias realizaram-se repiques e extração de DNA da suspensão celular para detecção do DNA proviral, além de fixação e coloração das placas com 0,1%, de cristal violeta para verificar a formação de efeito citopático (Anexo, Figura 4). 2.6 Detecção de LVPR nos cultivos de tecidos. 2.6.1 Amplificação do gene gag do DNA proviral A detecção de LVPR nos cultivos celulares foi feita usando uma nested-PCR duplex como descrito previamente por Barlough et al. (1994). O DNA foi purificado usando o QIAamp mini DNA kit ® (Qiagen, Courtaboeuf, France) de acordo com as instruções do fabricante. Duas reações de amplificação (nested-PCR duplex) foram usadas para detectar o gene gag do LVPR. Na primeira amplificação usou-se os oligonucleotídeos externos (Quadro 1) GAG 1 - EX e GAG 2 – EX, correspondendo às bases 953 a 975 e de 1249 a 1226 (referência a CAEV cork), respectivamente (Quadro 1). Oligonucleotídeos internos foram usados na segunda amplificação, GAG 3 - IN e GAG 4 - IN, localizados na posição 997-1024 nt e 1181 a 1154 nt (referência à CAEV cork), respectivamente (Quadro 1). A integridade do DNA foi verificada pela amplificação do gene de β-actina (ES30, ES32, ES31 e ES33) usando iniciadores baseados em sequências humana (Ali Al Ahmad et al., 2008) (Quadro 1). Na primeira reação de amplificação foi usado até 500ng de DNA genômico (5 µL em 50µL em uma reação contendo 1,5 mM MgCl2, 200 µM de cada dNTP, 1,25U TaqDNA polimerase GoTaq Flex (Promega, Madson-WI, USA), 10 µL de tampão de reação 5x e 15 pmoles de cada iniciador (GAG 1 - EX, GAG 2 - EX, ES30 e ES32). 22 As condições de ciclagem foram 94°C por 3 min, seguido por 35 ciclos de 94°C por 30 s e 56°C por 30 s, com extensão final de 72°C por 10 min. A segunda reação de amplificação foi realizada com 2µL da primeira reação e os iniciadores internos (GAG 3 - IN, GAG 4 – IN, ES31 e ES33) sob as mesmas condições. Os fragmentos amplificados de 186 pb (gene gag) e 393 pb (β-actina) foram detectados em gel de agarose 1,5% corado com SYBR Safe ® (Life Technologies, USA) e marcador de tamanho molecular de 100 pb (Life Technologies, USA) (Figura 2). Controles negativo (água destilada) e positivos (MSC infectada com LVPR 75-G63 cloned (ATCC ® VR-905™) foram usados em cada reação ou gel. 2.6.2 Amplificação do DNA-proviral para sequenciamento Os iniciadores para a amplificação do gene env (SU) foram descritos por Leroux et al. (1997) e do gene gag (CA) por Lima et al. (2004), ambos com as sequências equivalentes de CAEV Cork (Saltarelli et al., 1990) (Quadro 1). Para PCRs utilizadas no sequenciamento a reação de amplificação foi realizada usando até 0,5µg de DNA genômico (5 µL em 50µL em uma reação contendo 2,0 mM MgCl2, 200 µM de cada dNTP, 1,0U TaqDNA polimerase GoTaq Flex (Promega, Madson- WI, USA), 20 pmoles de cada iniciador e 10µL de tampão de PCR 5x), para gene gag e env (5 µL em 50µL em uma reação contendo 1,5 mM MgCl2, 200 µM de cada dNTP, 1,5U TaqDNA polimerase GoTaq Flex (Promega, Madson-WI, USA), 20 pmoles de cada iniciador e 10µL de tampão de PCR 5x). Cada amplificação de PCR env e gag consistiram de uma desnaturação inicial de 5 min a 95°C, 35 ciclos de amplificação e extensão final de 10min (env) ou 8 min (gag) a 72°C. Os ciclos de amplificação foram: env (95°C, 45°C e 72°C por 45 min cada) e gag (94°C, 45°C e 72°C por 45 min cada). 2.7 Sequenciamento Bandas específicas de 630 e 530 pb, correspondentes aos produtos de amplificação dos genes gag (n = 13) e env (n = 23), respectivamente, foram purificadas com Gel Extraction Kit columns (Qiagen, Mississauga, ON), e foram sequenciadas, sem serem clonadas, em ambas as direções (senso e anti-senso). A reação de sequenciamento foi realizada usando o Kit Big Dye v3.1 da Applied Biosystems em sequenciador 3130 (Life Technologies, USA). As sequências de nucleotídeos foram editadas usando o seqScape software v2.7 (Life Technologies, USA). 2.8 Análise das sequências As sequências editadas foram analisadas e tiveram a identidade comparada com as sequências de referências CAEV cork utilizando-se o programa Blastn 2.2.28 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) (Tabelas 2 e 3). 2.9 Análise estatística Os dados foram tratados em programa Excel. A estatística descritiva e a associação da frequência do isolamento viral com possíveis fatores de risco (formas clínicas do LVPR, tipo de exploração do rebanho, raça e sexo) foram avaliadas e analisadas com o teste exato de Fisher, considerando nível de significância p<0,05 utilizando o programa Statistica versão 12. A estatística descritiva dos dados obtidos nos isolamentos dos tecidos de MSC, PC, cocultivo de leucócitos e LBA (períodos de dias máximos, mínimo e médio, mediana dos cultivos virais) foi computada considerando o intervalo de confiança para médias com margem de erro de 5%. 23 Quadro 1. Oligonucleotídeos utilizados na nested-PCR e sequenciamento Iniciador Sequência 5’- 3’ Senso Posição CAEV cork Tamanho (bp) Fonte GAG 1- EXa CAAGCAGCAGGAGGGAGAAGCTG + 953 - 975 Barlough et al., 1994 GAG 2- EXa TCCTACCCCCATAATTTGATCCAC _ 1249 -1226 297 GAG 3- INa GTTCCAGCAACTGCAAACAGTAGCAATG + 997-1024 GAG 4- INa ACCTTTCTGCTTCTTCATTTAATTTCCC _ 1181-1154 186 ES30b TCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCAG + ES32b CCAGGGGAAGGCTTGAAG AGT GCC _ ES31b CC CAGCCATGTACGTTGCTATCC + 393 Ali Al Ahmad et al., 2008 ES33b GCCTCAGGGCAGCGGAACCGCTCA - GAG 1c GGAGGGAGAAGCTGGAA + Lima et al., 2004 GAG 2c CACATC TCTACATGCTTGCA - 630 ENV 1d GATATGGTGGAACATATGAC + 7.313-7332 Leroux et al., 1997 ENV 2d CCATATGTRTAAGCTC - 7.842-7827 530 Legenda: anested PCR-LVPR, b nested - PCR β- actina, c, dsequenciamento 3. RESULTADOS 3.1 Isolamento do Viral 3.1.1 Isolamento viral e características de cultivos Dos 44 animais utilizados para o isolamento de LVPR, apenas em dois não foram isolados o LVPR (Figuras 1 e 2; Tabela 1 e 4). Dentre os animais com isolamento positivo, os espécimes de MSC, PC, leucócitos e LBA foram positivos em 76,1% (35/39), 58,7% (27/39), 54,3% (25/33) e 28,3% (13/24), respectivamente (Tabela 1 e 4, Figura 1). De acordo com o sequenciamento os isolados tiveram sequências de nucleotídeos de significante identidade (78 a 94%, e-value ≤10-5 com CAEV cork (Tabelas 2 e 3). Os isolados de LVPR ficaram disponíveis para estudos posteriores e foram armazenados no banco de estirpes brasileiras do INCT- Informação Genética - Sanitária da Pecuária Brasileira com sede na Escola de Veterinária da UFMG. Os explantes de tecidos do cultivo primário de plexo coróide e MSC aderiram em sua maioria à superfície da garrafa de cultura celular e as células se multiplicaram formando uma monocamada após 13 dias do cultivo (Anexo, Figura 5 - B e F). Os explantes de tecido em suspensão, quando transferidos para outra garrafa seguiram o mesmo padrão. Os cultivos foram submetidos de duas a cinco passagens. O efeito citopático (ECP) foi observado com no mínimo 15 dias de cultivo, dentre eles, formação de sincício, lise, inclusão citoplasmática, vacuolização, arredondamento e formato estrelar da célula (MSC) (Anexo, Figura 5 - C a I). O controle positivo (MSC infectada com a cepa padrão CAEV 75-G63) apresentou efeito citopático no quinto dia de cultivo celular. Não foram observados os ECP descritos acima no controle negativo. Considerando a média em dias de cultivo para o isolamento de LVPR entre os espécimes (plexo coróide, cocultivo de leucócitos, LBA e MSC), o período de 28 dias (23,2±33,2) e mediana de 23 dias 24 obtidos pelo cultivo da MSC foi o menor (Tabela 4, Figura 3). Treze dias foi período mínimo de cultivo, o qual foi observado no isolamento viral a partir de duas amostras de MSC e uma de PC, enquanto que, 70 dias foi período máximo de cultivo para isolamento viral, obtido em um espécime de MSC (Tabela 4, Figura 3). O animal 30M-RJ/10 apresentou os períodos mínimos de dias para o isolamento viral em todos os espécimes (MSC = 13, PC = 19, leucócitos e LBA = 17 dias). Considerado o tipo de espécime cultivado para o isolamento de LVPR, não houve diferença significativa quando comparado os resultados de isolamento viral a partir de cocultivo de leucócito com MSC (p=0,396), plexo coróide (p =0,648) e LBA (p=0,768) ou plexo coróide com MSC (p=0,379). Em relação ao processo relacionado ao pós- cultivo, os cultivos primários, especialmente, o cultivo de MSC, apresentaram manipulação mais prática e de rápida obtenção do isolamento viral, considerando o crescimento ótimo e contínuo dos explantes, formação da monocamada, manutenção dos cultivos e aparecimento do ECP. Em contraste, os cocultivos de leucócitos (n = 11) e LBA (n = 10) apresentaram fatores que levaram ao insucesso do isolamento viral, dentre os quais, destaca-se a contaminação do cultivo e concentração celular insuficiente. Em algumas culturas de leucócitos o acúmulo de fibrina foi observado após 24 horas de cultivo. Enquanto que em alguns cultivos de LBA foram observados na monocamada outros tipos celulares além de macrófagos. 3.1.2 Associação da frequência de isolamento viral com possíveis fatores de risco. Dados referentes ao tipo de exploração do rebanho, raça, sexo e forma clínica da doença foram coletados e analisados para verificar a existência de alguma associação destas variáveis com o isolamento de LVPR. As variáveis raças, forma clínica, sexo, tipo de exploração e idade não apresentaram associação estatística com a frequência de isolamento viral (Tabelas 5 a 7). Considerando a variável sexo e raça, obtiveram maiores frequências de isolamento viral os animais da raça saanen (45%) e aqueles de faixa etária de dois a quatro anos (Tabelas 5 e 6). As frequências do isolamento viral de acordo com o tipo de exploração foran: 76,2% leite (32/42), 2,4% carne (1/42), 21,4% (9/42) com p= 0,635. Dentre os sinais clínicos relacionados aos LVPR, os quais incluem as formas artrite, mamária e respiratória, a forma clínica artrite obteve a maior frequência de isolamento viral em todos os tecidos utilizados para o isolamento (Tabela 7). 25 Tabela 1. Caprinos utilizados para o isolamento viral de LVPR Ident. Sinal Tipo Isolamento Tecidos isolados Animal Raça Sexo Idade Rebanho Região Estado Cidade Clínico Exploração Resultado MSC PC LEUC LBA 01A-PE/09 Pardo alpino F 4 1 NE PE Garanhus S/S Leite Positivo Positivo Positivo Negativo NR 02B-PE/09 Pardo Alpino F <2 2 NE PE Recife Loc Leite Positivo Positivo Positivo NR NR 3C -RN/09 Saanen F 4 3 NE RN Cruzeta LocMam Leite Positivo Positivo Positivo NR NR 4C-RN/09 Boer F >4 3 NE RN Cruzeta LocMam Leite Positivo Positivo Positivo NR NR 5C-RN/09 Toggenburg F >4 3 NE RN Cruzeta LocMam Leite Positivo Positivo Positivo NR NR 6C-RN/9 Toggenburg F 4 3 NE RN Cruzeta S/S Leite Positivo Positivo Positivo Positivo NR 8C-RN/10 A. nubiano F 4 3 NE RN Cruzeta LocMam Mista Negativo NR NR Negativo NR 9C-RN/10 Saanen F 4 3 NE RN Cruzeta Mam Leite Positivo NR NR Positivo NR 10D- MG/10 Saanen F 4 4 SE MG Florestal Loc Leite Positivo Positivo Positivo Positivo NR 12D-MG/10 Saanen F 4 4 SE MG Florestal LocMam Leite Positivo NR NR Positivo NR 14D-MG/10 Saanen F 4 4 SE MG Florestal Loc Leite Positivo NR NR Positivo NR 11D-MG/10 Saanen F >4 4 SE MG Florestal Loc Leite Positivo NR NR Positivo NR 18E-MG/10 Toggenburg F >4 5 SE MG C. Pacheco Loc Leite Positivo Positivo Positivo Negativo Negativo 17E-MG/10 Toggenburg F 4 5 SE MG C. Pacheco S/S Leite Positivo Positivo Positivo Negativo Positivo 19 F-MG/10 Saanen F >4 6 SE MG C. Pacheco S/S Leite Positivo Positivo Negativo NR Negativo 22G-MG/10 Saanen F >4 7 SE MG S. Gotargo Loc Leite Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo 21G-MG/10 Saanen F 4 7 SE MG S. Gotargo Loc Leite Positivo Positivo Negativo Positivo Positivo 23G-MG/10 Saanen F 4 7 SE MG S. Gotargo LocMam Leite Positivo Positivo Negativo Positivo Positivo 20G-MG/10 Saanen F <2 7 SE MG S. Gotargo Loc Leite Positivo Positivo Negativo Positivo Positivo 24H-PB/10 British alpina F >4 8 NE PB Soledade Loc Leite Positivo Positivo Positivo Positivo Negativo 25H-PB/10 A. nubiano F 4 8 NE PB Soledade S/S Mista Positivo Positivo Negativo Positivo Negativo 27J- PB/10 Pardo alpino F 4 9 NE PB Gurjão Mam Leite Positivo Negativo Positivo Positivo Negativo 26 I-PB/10 Saanen F 4 9 NE PB Gurjão LocMam Leite Positivo Negativo Positivo NR NR 28L-RJ/10 Saanen F 4 10 SE RJ N. Friburgo LocMam Leite Positivo Positivo Negativo Negativo Negativo 29M-RJ/10 Saanen F >4 11 SE RJ N. Friburgo Loc Leite Negativo Negativo Negativo NR Negativo continua 26 continuação Ident. Sinal Tipo Isolamento Tecidos isolados Animal Raça Sexo Idade Rebanho Região Estado Cidade Clínico Exploração Resultado MSC PC LEUC LBA 30M-RJ/10 Saanen M 4 11 SE RJ N. Friburgo Loc Leite Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo 32N- RJ/10 Pardo alpino M >4 12 SE RJ Teresópolis LocMam Leite Positivo Positivo Negativo Negativo Negativo 31N-RJ/10 Saanen F 4 12 SE RJ Teresópolis S/S Leite Positivo Positivo Positivo Positivo Negativo 33O-SP/10 Pardo alpino F >4 13 SE SP Botucatu Out Leite Positivo Positivo Positivo NR NR 37P-SP/10 Saanen F >4 14 SE SP São Pedro LocMam Leite Positivo Positivo Positivo NR Positivo 38P-SP/10 Saanen F >4 14 SE SP São Pedro Loc Leite Positivo Positivo Positivo NR Positivo 39Q - PI/11 A. nubiano F <2 16 NE PI Tab.do Pau Loc Mista Positivo Positivo Positivo Positivo NR 40R-MA/11 A. nubiano F 4 17 NE MA Timon Out Mista Positivo Positivo Negativo Negativo Positivo 41S-Ma/11 A. nubiano F 4 18 NE MA S.J.Ribamar LocMam Mista Positivo Positivo Positivo Positivo NR 42T-MA/11 Boer M 4 19 NE MA V. Grande S/S Corte Positivo Negativo Negativo Positivo Negativo 43U- MA/11 A. nubiano M 4 20 NE MA Iga. Grande Loc Mista Positivo Positivo Positivo Positivo NR 44W-CE/11 Saanen F >4 21 NE CE Sobral Out Leite Positivo Positivo Negativo Positivo Positivo 45W-CE/11 Pardo Alpino M >4 21 NE CE Sobral Out Leite Positivo Positivo Negativo Positivo NR 46V-PI/11 A. nubiano F <2 22 NE PI União LocMam Mista Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo 47V-PI/11 A. nubiano F <2 22 NE PI União Loc Mista Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo 48Y-CE/11 A. nubiano F 4 23 NE CE Sobral S/S Mista Positivo Positivo Positivo Negativo Positivo 49K-BA/11 P. alpino F >4 24 NE BA F. Santana Out Leite Positivo Positivo Positivo Positivo NR 50X-BA/11 A. nubiano F 2 25 NE BA Ipirá Loc Mista Positivo Positivo Positivo Positivo Negativo 51Z-BA/11 Saanen F 4 26 NE BA S. A. Jesus Mam Leite Positivo Positivo Positivo NR NR Descrição de origem (região, estado, cidade, rebanho), raça, sexo, sinais clínicos, sistema de exploração, resultado de isolamento e os diferentes tecidos cultivados. Quarenta e quatro caprinos oriundos dos estados de Minas Gerais (MG), Rio de Janeiro (RJ), São Paulo (SP), Bahia (BA), Pernambuco (PE), Rio Grande do Norte, Ceará (CE), Paraíba (PB), Maranhão (MA), Piauí (PI). Os dois animais em negritos foram negativos. A identificação do animal informa a propriedade (letra alfabética), estado brasileiro e ano que foi coletado. MSC, membrana s inovial caprina; LBA, lavado brônquio-alveolar; PC, Plexo coróide; Leuc, cocultivo de leucócitos; F, fêmea; M, Macho; NE, nordeste; SE, Sudeste; NR, não realizado. Faixa etária dos animais: até 2 (< 2), 2 a 4 (4), e maior que 4 anos (> 4). Sinais clínicos: Loc, artrite; Loc-mam, artrite-mamária; mam, mamária; outros (artrite e/ou mamária mais respiratória); S/S, sem sinais clínicos. 27 Tabela 2. Identidade das sequências de nucleotídeos do gene gag (412 nt) de isolados brasileiros de LVPR com CAEV cork (nBlast, Genbank). Isolado Query cover E value Max ident 1 17E.MG.10.MSC 100% 0.0 94% 2 17E.MG.10.PC 100% 0.0 94% 3 40R.MA.11.LBA 100% 3e-178 93% 4 49K.BA.11.PC 100% 8e-160 91% 5 49K.BA.11.MSC.D 100% 8e-160 91% 6 18E.MG.10.PC.1 100% 0.0 94% 7 43U.MA.11.PC 100% 8e-160 91% 8 10D.MG.10.Leuc 100% 2e-176 93% 9 49K.BA.11.MSC.E 100% 2e-176 93% 10 51Z.BA.11.MSC.E 100% 8e-165 91% 11 51Z.BA.11.PC 100% 8e-165 91% 12 18E.MG.10.MSC 100% 0.0 94% 13 05C.RN.09.MSC 100% 0.0 94% Tabela 3. Identidade das sequências de nucleotídeos do gene env (379 nt) de isolados brasileiros com CAEV cork (nBlast, Genbank). Isolado Query cover E value Max Ident 1 30M.RJ.10.Leuc.1 99% 1e-106 84% 2 43U.MA.11.PC.1 99% 4e-97 83% 3 43U.MA.11.PC.2 99% 2e-95 83% 4 43U.MA.11.MSC.1 99% 9e-94 82% 5 41S.MA.11.Leuc.1 97% 4e-107 85% 6 44W.CE.11.MSC.1 99% 2e-95 83% 7 44W.CE.11.MSC.2 99% 9e-94 82% 8 11D.MG.10.Leuc.1 99% 3e-94 83% 9 10D.MG.10.Leuc.1 99% 1e-112 85% 10 17E.MG.10.PC.1 97% 4e-117 86% 11 18E.MG.10.MSC.1 99% 3e-113 85% 12 10D.MG.10.MSC.1 99% 1e-117 86% 13 10D.MG.10.MSC.2 99% 1e-107 85% 14 23G.MG.10.Leuc.1 98% 1e-62 78% 15 28L.MG.10.MSC.D.1 99% 9e-119 86% 16 19F.MG.10.MSC.1 100% 1e-106 84% 17 02B.PE.11.MSC.1 97% 2e-115 86% 18 01A.PE.10.Leuc.1 98% 1e-122 87% 19 28L.MG.10.MSC.E.1 99% 9e-119 86% 20 03C.RN.09.MSC.1 100% 1e-126 87% 21 24H.PB.10.MSC.1 100% 3e-128 88% 22 24H.PB.10.MSC.2 100% 7e-130 88% 23 05C.RN.09.MSC.1 98% 2e-124 87% As sequências de nucleotídeos dos isolados brasileiros apresentaram significante alinhamento com CAEV no nBlast, Genbank. e- value ≤10-5 é significativo (e=10); Max ident = identidade; query cover = cobertura da consulta. Leu = leucócitos, PC= Plexo coróide, MSC D= membrana sinovial caprina direita, MSC E = membrana sinovial caprina esquerda. Identidade com CAEV cork: gene gag = 91 a 93% e gene env 78 a 88 %. 28 Figura 1. Isolados de LVPR de Caprinos (n = 42) e estados oriundos no Brasil. Quarenta e dois caprinos oriundos dos estados de Minas Gerais (MG), Rio de janeiro (RJ), São Paulo (SP), Bainha (BA), Pernambuco (PE), Rio Grande do Norte, Ceará (CE), Paraíba (PB), Maranhão (MA), Piauí (PI). Figura 2. Eletroforese duplex - nested – PCR do CAEV. Amostras: 1, 2 e 3 são negativas; 4 a 14 são positivas. PM = peso molecular; CP = controle positivo; CN = controle negativo; pb= pares de base. Bandas: de 393 pb, β – actina; 186 pb, de CAEV. 29 Tabela 4. Estatística descritiva dos períodos em dias do isolamento de LVPR Espécime N % Média Dias IC 95% Mediana Mínimo Dias Máximo Dias DP MSC 35 76,1 28 23,6±33,2 23 13 70 13,91 PC 27 58,7 28,5 23,9±33,0 24 13 55 11,47 Co-Leucócitos 25 54,3 32,4 27,7±37,1 27 17 57 11,38 Co-LBA 13 28,3 28,4 22,4±34,3 24 17 49 9,85 Valores médio, mediana, mínimo e máximo em dias do período de cultivo para o isolamento de LVPR a partir de plexo coróide, leucócitos, LBA e MSC. Legenda: N= número, DP= desvio padrão, IC= intervalo de confiança. Figura 3. Box-plot do período (dias) do isolamento viral. Apresenta: mediana, os períodos máximos e mínimos em dias e percentagem de cada tecido cultivado. Legenda: Min, mínimo; Max, máximo; PC, Plexo coróide; MSC, Membrana sinovial caprina; co-Leuc, co-cultivo de leucócito; co-LBA, cocultivo de lavado brônquio alveolar. Limites confiança = 95%. Isolamento de LVPR Mediana 25%-75% Min-Max MSC PC Co-Leuc Co-LBA 10 20 30 40 50 60 70 80 30 Tabela 5. Resultado da frequência de isolamento do LVPR a partir de caprinos oriundos de rebanhos brasileiros considerando a raça Raça Caprinos Negativo Positivo A. nubiano 10 1 9 Boer 1 0 1 Britsh alpina 1 0 1 Parda alpino 7 0 7 Saanen 21 1 20 Toggenburg 4 0 4 Total 44 2 42 Tabela 6. Resultado da frequência de isolamento do LVPR de diferentes tecidos isolados de caprinos oriundos de rebanhos brasileiros considerando idade do caprino. Positivo Idade MSC PC LBA Leuc (anos) n= 39 n= 39 n= 24 n= 33 p=0.427 p=0.195 p=0.593 p=0.337 < 2 6 6 3 5 2 a 4 15 (42,8%) 11(40,7%) 5 13(52%) >4 14 10 5 7 Total 37 27 13 25 Legenda: MSC (membrana sinovial caprina), LBA (lavado brônquio-alveolar), PC (Plexo coróide), Leuc (cocultivo de leucócitos). Tabela 7. Resultado da frequência de isolamento do LVPR de diferentes tecidos isolados de caprinos oriundos de rebanhos brasileiros considerando sinais clínicos. Positivos Sinais MSC PC LBA LEUC Clínicos n= 39 n=39 n=24 n=33 p=0.380 p=0.456 p=0.388 p=0.265 Artrite 13 (37,1%) 11 (40,7%) 6 (46,1%) 12 (44%) Art-Mam 9 7 3 4 Mam 1 2 0 2 Outros 5 2 2 3 Ausente 7 5 2 4 Total 35 27 13 25 Legenda: MSC, membrana sinovial caprina; LBA, lavado brônquio-alveolar; PC, Plexo coróide; Leuc, cocultivo de leucócitos; art-mam, forma artrite e mamária. p <0.05 31 4. DISCUSSÃO LVPR foi isolado de 42 caprinos, oriundos de rebanhos brasileiros, por explantação de plexo coróide e membrana sinovial caprina e cocultivo de leucócitos e LBA. O período médio, mínimo e máximo de cultivo para isolamento viral entre os tipos de cultivos foram relativamente próximos. Com objetivo de avaliar as características de isolamento de LVPR, este trabalho utilizou quatro diferentes espécimes biológicos oriundos das linhagens monocítica- fagocitária (LBA e monócitos) e fibroblástica (plexo coróide caprino e MSC), obtendo maior sucesso de isolamento de LVPR em cultura primária de MSC (76,1%). Como a priori, sendo a artrite a síndrome mais característica de caprinos infectados com CAEV, as células derivadas de MSC foram usadas para cultivar este vírus (Crawford et al., 1980; Narayan et al., 1980), do mesmo modo que, o MVV foi cultivado em células de plexo coróide ovino, considerando as lesões inflamatórias envolvendo este tecido (Sigurdsson et al., 1960). A semelhança entre estes dois lentivirus, inclusive a sintomatologia nervosa (Sigurdsson et al., 1957; Cork et al., 1974a; Cork e Narayan, 1980; Sundquist, 1981), a constituição vascularizada do PC (Wolburg e Paulus, 2010), bem como, a replicação produtiva em PC observada em HIV-1 (Petito, 2004), levou este trabalho a realizar também o isolamento viral a partir do cultivo primário deste órgão (58,7%), o qual foi o segundo tecido com maior sucesso para o isolamento do LVPR. Embora tenha sido relatada uma replicação restrita do CAEV em células de PC ovino (Chebloune et al., 1996; Barros et al., 2005), no presente estudo o isolamento em PC caprino apresentou uma replicação produtiva do CAEV. E ambos os cultivos, de MSC e PC, apresentaram manipulação mais prática e de rápida obtenção do isolamento viral, considerando o crescimento contínuo dos explantes, formação da monocamada, manutenção dos cultivos e aparecimento do ECP (Anexo, Figura 5). Uma alta taxa de insucesso de isolamento foi observada nas culturas de cocultivos de leucócitos e LBA, o que pode estar associado à maior possibilidade de contaminação do cultivo ou concentração celular insuficiente, levando ao descarte da cultura. A menor recuperação de monócitos, provavelmente, pode estar associada a não adesão destas células a superfície da garrafa de cultivo, a baixa concentração de monócitos circulantes, ou ainda, a pequena taxa de maturação destes in vitro e de célula infectadas com vírus. De acordo com Narayan et al., (1983) apenas uma quantidade mínima de monócitos (1:200) se maturam em macrófagos, dos quais cerca de 3% são infectados com o LVPR. Além disso, ocorreu formação de fibrina em alguns cultivos de leucócitos, provavelmente como consequência da coleta do plasma junto com o PBMC no gradiente de ficoll. A lavagem do PBMC com cloreto de amônia (ClNH4 0.15M) com objetivo de evitar a formação de fibrina foi adotada por alguns autores (Castro et al., 1999a; Tigre et al., 2006). Em alguns cultivos de LBA foram observadas células fibroblásticas oriundas de fragmentos de pulmão, como relatado por Davies e Gordon (2005), as quais foram removidas pela filtração do LBA com gaze esterilizada. O isolamento viral foi obtido entre 13 e 70 (média = 28) dias após a explantação dos tecidos ou cocultivos, com visualização de monocamada confluente e ECP em 13 e 17 dias, respectivamente. Outros grupos obtiveram isolamento do LVPR entre 45 e 180 dias (Hotzel et al., 1993; Castro et al., 1999a; Test et al., 1999; Lima et al., 2004; Tigre et al., 2006; Feitosa et al., 2011). Em cocultivo de leucócitos foram observados sincício com seis meses após a cultura (Daltabuit Test et al., 1999), enquanto que 32 no isolamento por explantação de MSC foi observado confluência em três semanas e ECP entre três (vacuolização e células sinciciais isoladas) e quatro semanas (sincícios multinucleados envolvendo a maioria da monocamada) (Crawford et al., 1980). Em um estudo usando a técnica de digestão enzimática do tecido sinovial, em substituição à explantação, foi observada a formação de monocamada entre sete e 10 dias (Ratanapob e Rukkwamsuk, 2012). No processo pré-cultivo, que envolveu desde a coleta dos espécimes até a sua cultura, todos os tecidos ofereceram particularidades e dificuldades que poderiam influenciar o sucesso do isolamento viral, dentre as quais podemos citar: Plexo coróide: 1- Foi necessária muita habilidade para retirar o encéfalo íntegro, bem como atenção para não perder o PC durante sua retirada do crânio; 2- A lavagem do PC com meio de cultura para retirar o excesso de massa encefálica (excluindo a inclusão de outros tipos celulares); 3- Houve formação de algumas granulações sobre a monocamada, que desapareceram após algumas passagens do cultivo. MSC: 1- A MSC foi coletada por escarificação utilizando o bisturi (evitou a inclusão de tecido conjuntivo fibroso e cartilaginoso no cultivo); 2- As articulações foram coletadas com a pele (evitando contaminação) e com distância de cerca de 8 cm dos ossos da tíbia e do rádio (facilitando a manipulação). Leucócitos: 1- Algumas garrafas formaram uma camada de fibrina sobre a superfície celular, 2- Coágulos ou coagulação do sangue (dificultando ou inviabilizando a separação do PBMC). LBA: 1- Grumos de células que não aderiram à superfície da garrafa de cultivo celular (LBA foi filtrado com uma gaze antes da centrifugação para reduzir o muco e excluir fragmentos de tecidos pulmonares); 2- Contato do LBA com conteúdo traqueal (introduzido o cateter por uma incisão na traquéia, próxima aos lóbulos pulmonares) (Anexo, Figura 4); 3- Pouco volume de LBA recuperado (infundido mais solução fisiológica nos lóbulos pulmonares para aumentar o volume de LBA recuperado e obter maior concentração celular). Desde que excluam alguns fatores de insucesso para a obtenção do isolamento (concentração celular insuficiente, risco de contaminação e presença de fibrina) e que disponha de células negativas para o cocultivo (ex.: MSC, PC ou córnea caprina), o cocultivo de leucócito pode ser a técnica de escolha para isolamento de LVPR, quando houver a indisponibilidade de abate do animal, considerando a facilidade de obtenção do sangue. O isolamento do LVPR não foi influenciado pela raça do animal, tipo de exploração do rebanho, idade do animal ou sinal clínico. Apesar da raça saanen (45%) e o tipo de exploração leiteira (71,7%) representar a maior frequência obtida de isolamento do LVPR, não foram observadas associações com esses fatores, os quais têm sido relacionados à soropositividade de infecção para o LVPR (Adams et al., 1984; Karesh et al., 2007). Caprinos com idade de dois a quatro anos apresentaram as maiores frequências de 33 isolamento em todos os tipos de tecidos isolados. Entretanto, a associação entre o isolamento viral e a faixa etária dos animais não foi estatisticamente significativo. A idade do animal (animais mais velhos) tem sido associada à cronicidade da infecção por LVPR, entretanto, Crawford et al. (1980b) não encontraram esta relação, pois os caprinos entre dois e quatro anos apresentavam mais lesões articulares. Maior frequência de isolamento viral foi observada nos animais que apresentaram a como forma clínica. Há relatos de correlação positiva entre cronicidade da lesão com o sucesso do isolamento viral (Adams et al., 1980) ou com altos títulos virais (Ravazzolo et al., 2006). Nos animais deste estudo, artrite foi clinicamente evidente, apresentando sinais clínicos como: rigidez em marcha, claudicação, inchaço das articulações e bursas (em particular na área do carpo), sensibilidade ao toque e atitudes e aprumos anormais. Este estudo possibilitou o isolamento de LVPR de caprinos de diferentes regiões brasileiras e disponibilização dessas estirpes para estudos moleculares, genéticos e antigênicos posteriores, dentre outros. Adicionalmente, observou-se que o sucesso do isolamento viral não é influenciado por fatores clínicos, raciais, tipo de produção ou idade. 5. CONCLUSÕES Neste estudo, foram obtidos isolados de LVPR de 42 caprinos oriundos da região Sudeste e Nordeste do Brasil. O isolamento de LVPR pode ser obtido a partir dos cultivos de MSC, plexo coróide, cocultivo de leucócito e LBA, embora a MSC tenha apresentado melhores condições para o isolamento de LVPR (maior frequência de positividade e obtenção do isolamento viral com menor média de dias). A frequência do isolamento viral não é influenciada por fatores de risco, tais como sinais clínicos de LVPR, tipo de exploração do rebanho, raça e sexo. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ADAMS, D. S.; CRAWFORD, T. B.; KLEVJER-ANDERSON, P. 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Encéfalo (1) com o plexo coróide (seta); articulação do carpo e MSC (seta); introdução dos explantes com uma seringa de insulina na garrafa de cultivo celular (A); monocamada celular, explante aderido (seta) e migração celular do tecido de PC (B) e MSC (F); efeito citopático: sincício (C, D, E, G), vacuolização (E) e inclusão citoplasmática e lise celular (H e I), célula estrelar (I). Corado com cristal violeta 0,1%. Aumento 100x. 38 CAPÍTULO 2 Caracterização filogenética de Lentivirus de Pequenos Ruminantes (LVPR) em caprinos e ovinos naturalmente infectados em rebanhos brasileiros RESUMO Trinta e dois isolados de LVPR de caprinos e oito DNAs provirais de sangue de caprinos e ovinos oriundos da região sudeste e nordeste do Brasil foram caracterizados filogeneticamente baseado nos genes gag (MA/CA) e env (V1V2, V4/V5). A análise filogenética de isolados brasileiros de LVPR evidenciou, principalmente, a presença do subtipo B1 nos rebanhos caprinos. Houve também a identificação do genótipo A em caprinos, com alta divergência genética sugerindo a formação de dois novos subtipos. Dois ovinos foram identificados com subtipo B1 de LVPR pela primeira vez no Brasil. A classificação de LVPR de ovinos no subtipo B1 (grupo CAEV) e de caprinos no grupo A (MVV) evidenciou que a transmissão de CAEV e MVV interespécie de caprino e ovino tem ocorrido naturalmente no Brasil. A análise de aminoácidos da região V4/V5 identificou recombinação ou coinfecção ocorrendo em caprinos, dentre os quais, dois discordantes vírus (Br849 e Br195) agruparam nos grupos A e B, demonstrando que estes caprinos foram dualmente infectados, enquanto outro vírus (Br1163) apresentou uma inserção de novo motivo na principal região imunogênica da proteína de superfície (SU4). 1. INTRODUÇÃO Lentivirus de pequenos ruminantes (LVPR) são grupos heterogêneos de retrovírus causando doença multisistêmica crônica em ovinos e caprinos. Os vírus da artrite encefalite caprina (CAEV) e Maedi-Visna (MVV), originalmente isolados em caprinos e ovinos, respectivamente, têm sido segregados dentro dos maiores genótipos de LVPR (A a E). Relatos recentes indicam que a espécie-especificidade destes vírus não é restrita como previamente acreditava-se. Vírus MVV-like têm sido encontrados em caprinos, e alguns isolados de ovinos têm sido agrupados dentro dos genótipos de CAEV (Shah et al., 2004a), confirmando a hipótese de que transmissão do vírus entre as diferentes espécies pode ocorrer em condições naturais (Shah et al., 2004b; Pisoni et al., 2006; Gjerset et al., 2007). A coinfecão e a recombinação de ambos os virus têm sido reportadas em caprinos e ovinos (Pisoni et al., 2007; Olech et al., 2012; Santry et al., 2013). LVPR são disseminados mundialmente, e as perdas econômicas resultantes impulsionaram o desenvolvimento de programas de erradicação baseados principalmente na segregação dos animais infectados em vários países (Valas et al., 2011). A biologia molecular tem sido uma importante ferramenta para o estudo epidemiológico sobre a circulação viral, classificação e evolução genômica dos LVPR e outros vírus (Zanoni, 1998; Shah et al., 2004a; Fevre et al., 2006; Wan et al., 2008; Giammarioli et al., 2011). Shah et al. (2004a), baseando-se na classificação do vírus da imunodeficiência humana (HIV-1), estruturaram a relação filogenética do LVPR baseando-se nos genes pol e gag, em grupos/genótipos e subtipos, aos quais novas descobertas têm sido agregadas. Atualmente, os LVPR classificam-se em cinco grupos principais, de A a E, que diferem de 25 a 37% na sequência de nucleotídeos (Shah et al., 2004a; Grego et al., 2007). MVV e CAEV, protótipos do grupo A e B, respectivamente, tem distribuição mundial, enquanto o grupo C e E são mais restritos geograficamente. O grupo A é bastante heterogêneo, uma vez 39 que contém 13 subtipos (A1 a A13), enquanto que o grupo B contém apenas três subtipos, B1 a B3. As estirpes virais isoladas da Noruega são classificadas dentro do grupo C e as estirpes virais isoladas na Suíça e Espanha são incluídas no grupo D. O grupo E foi detectado apenas na Itália e contém dois subtipos (E1 e E2) (Zanoni, 1998; Shah et al., 2004a; Pisoni et al., 2005; Pisoni et al., 2006; Reina et al., 2006; Grego et al., 2007; Bertolotti et al., 2011; Giammarioli et al., 2011; Reina et al., 2011). O genótipo ou grupo A é chamado de MVV e o grupo B de CAEV. O genoma dos LVPR (9,2 Kpb) é similar a de outros lentivirus, constituído por genes codificadores das proteínas estruturais (gag e env) e enzimas virais (pol), acessórios (tat, rev e vif) com funções regulatórias na replicação viral, além de duas regiões terminais não codificantes (LTRs) (Saltarelli et al., 1994; Blacklaws, 2012) (Figura 1). LVPR são caracterizados por um alto grau de variabilidade genética durante o processo de replicação, com consequências na diversidade e evolução lentiviral, resultando na formação de estirpes diferentes e quasispecies (Pasick, 1998; Zanoni, 1998). Estas variações ocorrem, principalmente, no gene env, enquanto pol e gag são regiões relativamente bem conservadas (Saltarelli et al., 1994; Zanoni, 1998) (Figura 1). As proteínas estruturais dos genes gag (capsídio - CA e matriz - MA) e env (superfície-SU e transmembrana - TM) são os principais alvos da resposta imune humoral e têm sido selecionadas como antígenos para o sorodiagnóstico (Gogolewski et al., 1985) (Figura 1). Entretanto, as variações antigênicas de estirpes dos LVPR podem interferir no diagnóstico e a identificação dos subtipos virais circulantes em cada país e sua relação antigênica com estirpes de referências é de fundamental importância para a acurácia do diagnóstico (Peterhans et al., 2004; Herrmann-Hoesing, 2010). Nestas proteínas estruturais tem sido identificado epitopos imunodominantes importantes para a resposta imune. A proteína SU (554 aminoácidos) é muito variável, com numerosos resíduos de cisteínas e altamente glicolizada (Saltarelli et al., 1994). O perfil de variabilidade de SU é comparado ao HIV, com cinco regiões variáveis (V1 a V5) e quatro regiões conservadas (C1 a C4) (Valas et al., 2000) (Figura 1). Cinco domínios imunogênicos foram identificados em SU, sendo os epitopos dentro da região C1 (SU1) e V5 (SU5) considerados imunodominantes (Bertoni et al., 2000; Valas et al., 2000), e um domínio neutralizante na região V4. Neste domínio da região V4, que é imunogênico e muito divergente, os vírus tipo maedi visna têm deleções de seis aminoácidos (Saltarelli et al., 1990). Na proteína gag foram identificados quatro epitopos imunodominantes (Rosati et al., 1999; Grego et al., 2002; Rosati et al., 2004; Lacerenza et al., 2008), incluindo a região de homologia principal (MHR) presente na porção central do capsídio (aa153 a 172, HIV-1), que é muito conservada em todos os retrovírus, possuindo os resíduos invariáveis (Q155, E159 e K167) e um resíduo aromático invariável (F164) (Mammano et al., 1994). A conservação de MHR tem importante função na replicação viral. Em alinhamentos do gene gag, MVV apresenta uma inserção de sete aminoácidos na porção c-terminal da proteína da matriz. A identificação da diversidade genética dos LVPR nos rebanhos brasileiros, assim como, a avaliação da variabilidade nas principais regiões imunodominantes de SU (env) e MA/CA (gag) é importante para estabelecer a epidemiologia da circulação viral e melhorar o diagnóstico visando o controle dos LVPR no Brasil. Os LVPR foram introduzidos no rebanho brasileiro, provavelmente a partir de 1976 com importação de raças geneticamente melhoradas, inicialmente para a região 40 sudeste, oriundas da Europa, principalmente Inglaterra, Suíça, Alemanha e França. Atualmente, a prevalência de CAEV chega até a 43%, acometendo rebanhos caprinos em várias partes do Brasil e causando prejuízos na caprino-ovino cultura local (Bohland e D'Angelino, 2005; Bandeira et al., 2009; Silva et al., 2012). Os poucos estudos de filogenia no Brasil, dentre os quais nos estados do CE, RS e MG (Castro et al., 1999b; Ravazzolo et al., 2001; Lima et al., 2004; Feitosa et al., 2010), têm identificado os genótipos A e B em ovinos e caprinos, respectivamente (Ravazzolo et al., 2001; Leite et al., 2004; Lima et al., 2004). Entretanto, relato feito por Castro et al. (1999b) do genótipo A ocorrendo em caprino naturalmente infectado, evidencia a possibilidade de transmissão interespécie nos rebanhos brasileiros. Considerando a importância da caprino- ovino cultura e a hipótese que as LVPR são prevalentes nos rebanhos brasileiro com possibilidade de transmissão interespécie, o objetivo deste trabalho foi a caracterização filogenética dos LVPR isolados nas regiões nordeste e sudeste do Brasil, baseando-se em sequências dos genes gag (CA/MA) e env (SU) e avaliar a variabilidade das principais regiões imunodominantes destes genes nas estipes brasileiras de LVPR. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Amostras Trinta e dois isolados de LVPR de caprinos e oito DNAs provirais de sangue de caprinos e ovinos oriundos da região sudeste e nordeste do Brasil integraram este estudo. Vinte e cinco estirpes, dentre os 42 isolados de LVPR de caprinos obtidos durante 2009 a 2011, foram oriundos de 20 propriedades comerciais (MG (7); PB (1); RN (2); RJ (4); SP (1); MA (3); PI (2); CE (3); BA (2)). Além de seis DNAs provirais de sangue de caprinos (PB (1); MA (2), PI (1), RJ (1); BA (1)) e dois de ovinos (MA), positivos para LVPR em teste de ELISA recombinante (Olech et al., 2012), foram selecionados para o estudo de caracterização filogenética (Tabela 1). Sete isolados obtidos no ano de 1995 e oriundos de caprinos de duas propriedades dos estados de MG (6) e uma de PE (2), foram incluídos no estudo, alguns dos quais já relatados previamente (BrMg1 (01); BrMg1(02); BrMg2 (03), BrPe1 (01)) (Castro et al., 1999b) (Tabela 1). Os animais tinham idade entre um a 12 anos, incluindo as raças: Anglo nubiano, Boer, British alpina, Pardo alpino, Saanen, Toggenburg. O isolamento de LVPR foi obtido a partir do cultivo primário de plexo coróide (PC), MSC e cocultivo de leucócitos ou LBA (lavado brônquio alveolar). O sangue de caprinos e ovinos foi coletado em sistema a vácuo com anticoagulante (EDTA) por venopunção da veia jugular, e centrifugado a 400 x g por 10 min a 4°C e os leucócitos do sangue periférico (PBL) foram aspirados por pipetagem. 2.2 Extração de DNA proviral O DNA-proviral da monocamada celular dos isolados de LVPR e leucócitos do sangue periférico (PBL) foram purificado usando o QIAamp min DNA kit (Qiagen, Courtaboeuf, France) de acordo com as instruções do fabricante. 2.3 Amplificação do DNA proviral 2.3.1 Amplificação dos fragmentos dos genes env e gag pela PCR Dois fragmentos compreendendo a região V1V2 (394pb) e V4V5 (608pb) do gene env foram amplificados por nested-PCR (Figura 1). A posição dos nucleotídeos refere-se ao clone CAEV-Cork (Genbank: acesso M33677) (Saltarelli et al., 1990). Os iniciadores Ptat1 e Penv foram desenhados pelo alinhamento de várias sequências de SRLV disponíveis no banco de genomas GenBank 41 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) e usados na primeira PCR (Quadro 1). Os iniciadores A51/B31 e 567/564 foram utilizados na segunda reação para a amplificação dos fragmentos V1V2 e V4V5, respectivamente (Quadro 1) (Germain e Valas, 2006; Mordasini et al., 2006). Onze isolados com sequenciamentos ineficientes em V4V5 foram amplificados com os iniciadores Env1 e Env2, que incluíam domínio V4 de SU (379 pb) (Leroux et al., 1997) (Quadro 1). Um fragmento de 990 pb relativo ao gene gag incluindo a MA, exceto os 38 primeiros resíduos da porção N- terminal da proteína, mais a sequência completa de CA foi amplificado por nested- PCR usando os iniciadores GAGf1 e P15, na primeira reação, e MA3f e NC3r na segunda (Quadro 1). O primeira reação de amplificação foi realizada usando 0,5µg de DNA genômico dentro de um volume final de 50µL contendo tampão de PCR 1X (Bio-Rad), 2 mM MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP, 300 nM de cada iniciador e 1,25 U de Taq DNA polimerase (iTaq, Bio-Rad). A segunda amplificação foi realizada com 5µL da primeira reação e os iniciadores internos. Cada amplificação de PCR consistiu de uma desnaturação inicial de 3 min a 95°C, 35 ciclos de amplificação e extensão final de 10min a 72°C. Cada ciclo dos 35 ciclos amplificação do fragmento env incluiu desnaturação 30 s a 95°C, hibridação dos iniciadores 40 s a 56°C e extensão 90 s a 72°C na primeira reação, e respectivamente 30 s a 95°C, 40 s a 58°C e 50 s a 72°C na segunda reação. As condições de ciclagens referentes à amplificação do fragmento gag foram respectivamente 30s a 95°C, 40 s a 55°C e 90 s a 72°C na primeira reação, e 30 s a 95°C, 40 s a 51°C e 60 s a 72°C na segunda. As PCRs foram realizadas em termociclador BioRad cycler (Bio-Rad). Os fragmentos amplificados foram detectados em gel de agarose 1% corado com Brometo de etídeo (Life Technologies, USA) e marcador de tamanho molecular de 100 pb. 2.4 Sequenciamento As bandas específicas em gel de agarose provenientes das PCR com iniciadores gag e env amplificadas (Quadro 1) foram purificadas com QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Mississauga, ON) e foram sequenciadas, sem serem clonadas, e as sequências consenso foram usadas no alinhamento de nucleotídeos usando ClustalW versão 1.8 (Valiente Moro et al., 2005 (Valiente Moro et al., 2005)A reação de sequenciamento foi realizada em ambas as direções usando o ABI BigDye v3.1 reação. Rearranjos manuais do alinhamento, incluindo exclusão de gaps e ajuste do tamanho, foram aplicados para atingir resultados ótimos. Alinhamentos múltiplos das sequências de nucleotídeos e dedução de aminoácidos foram feitos com ClustalW em MEGA versão 5 e Bioedit versão 7.0, respectivamente. Comparação das distâncias genéticas foi calculada em software MEGA 5.0 com modelo de substituição p-distance (aminoácidos) e Kimura-2 distribuição gamma 1 (nucleotídeos). 42 Figura 1. Genoma do lentivirus de pequenos ruminantes (LVPR). Genes estruturais (gag e env), enzimas virais (pol), acessórios (tat, rev e vif) e duas regiões terminais não codificantes (LTRs). Na proteína de superfície do gene env contém cinco regiões variáveis (V1 a V5) e quatro regiões conservadas (C1 a C4) (Valas et al., 2000). Proteínas: MA= matriz, CA= capsídio, NC=nucleocapsídio, SU=superfície e TM=transmembrana. Quadro 1. Iniciadores utilizados na amplificação dos genes gag e env. Gene Iniciador Sequência Orientação Posição(nt) Tamanho(pb) Fonte env Ptat1 5'-ACAAAGATGGCTAGCWATGCTTAC-3’ senso 5807 Penv 5'-ATGCCAGCAATCCAATTCWTGGT-3’ antisenso 8179 2300 A51 5'-TTGCAAAATGGGGATGTCAACC-3' senso 6353 Germain e Valas, 2006 B31 5'-GGCATCTTTTCTGTACAGGAGACTGCT-3' antisenso 6719 394 567 5'-GGIACIAAIACWAATTGGAC-3' Senso 7482 Mordasini et al, 2006 564 5'-GCYAYATGCTGIACCATGGCATA-3' antisenso 8089 608 ENV1 5’-GATATGGTGGAACATATGAC-3’ senso 7313 Leroux et al., 1997 ENV2 5’-CCATATGTRTAAGCTC-3’ antisenso 7842 530 gag GAGf1 5'-TGGTGARKCTAGMTAGAGACATGG-3’ Senso 513 Shah et al., 2004 P15 5'-GTTATTCCATAGGAGGAGCGGACGGCACCA-3’ antisenso 1859 1350 MA3f 5’-TAAGGCCTCTGTCGACGGAGCACTTGACAGAAGGAAA-3’ Senso 623 NC3r 5'-CAGAATTCGCAAGCTTTGCATTTTAAAYCCTTCKGATC-3’ antisenso 1614 990 43 2.5 Análise filogenética As sequências editadas foram analisadas e comparadas com as sequências das amostras de LVPR CAEV disponíveis no Genbank utilizando-se os programas Blastn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi ). As árvores filogenéticas foram construídas usando o método Neighbour-Joining (Saitou e Nei, 1987) implementadas em MEGA 5.0 (Tamura et al., 2011) com distância Tamura- Nei e distribuição gamma-1 (Tamura e Nei, 1993). Os limites de confiança das topologias dos filogramas foram determinados pela análise de 1000 replicatas de bootstraps (Felsenstein, 1985). 2.6 Números de acesso das sequências de nucleotídeos Os número de acesso no GenBank das sequências previamente publicadas e utilizadas neste estudo foram as seguintes: Cork (M33677), 496 (FJ195346), SAOMVV (M31646), K1514 (M60609), EV-1 (S51392), P1OLV (AF479638), 4668 (AY445885), Fonni (JF502416) e Volterra (JF502416) para os genomas completos; 1217 (FJ623126) e 5720 (AY842774) para sequências de env; 85/34 (AY101611), 5720 (AY454218), 5560 (AY454175), 5561 (AY454176), 5586 (AY454186), 5667 (AY454200), ItPi1 (AY265456), It008g03 (EF675999), It030g02 (EF676006), It060s01 (EF676017), It063s01 (EF676018), 2803.34/UM/10 (FR693822), 2357/UM10 (FR693827), 0016 (FJ623120), 4007 (FJ623122), 4819(FJ623122), Brasil (Br/UFRGS-4/C18 (AJ305040), Br/UFRGS- 5/C47 (AJ305041), Br/UFRGS-2/C767 (AJ305042) e Br/UFRGS-2/V27 (AJ305039)) para sequências de gag. As sequências deste estudo foram depositadas no Genbank com os números de acessos KF861550 a KF861574 para gene gag (Tabela 2). 3. RESULTADOS 3.1 Análise filogenética baseada na região SU de env 3.1.1 Análise filogenética da região V1/V2 (env) 3.1.1.1 Comparação das sequências A análise filogenética baseada na região V1- V2 do gene env do CAEV foi realizada em 28 sequências brasileiras, as quais incluíram 23 isolados de CAEV em cultivo celular/tecido oriundo de caprinos e cinco sequências de DNA proviral de sangue (ovino = 1 e caprinos = 4) (Tabela 1, Figura 2). As sequências brasileiras agruparam-se com a estirpe CAEV-cork, o protótipo do grupo genético B de LVPR, formando um clado dentro do subtipo B1; dentre os quais incluiu um ovino (Br198), oriundo do rebanho 15 (Figura 2). As sequências dos LVPR dos isolados e/ou de DNA proviral de sangue formaram ramificações com 58 a100% de valores de bootstrap. Cinco ramificações terminais com 99 a100% de valor de bootstrap entre elas eram formadas por sequências oriundas de diferentes rebanhos e localizadas em vários estados (Br425-RJ, Br329-PB), (Br198-MA, Br845-MG), (Br53-RN, Br607-MA), (Br634-MA, Br769-BA, Br847-PE), exceto de um, formados pelos isolados Br664 e Br653, oriundos de dois rebanhos localizados no estado do Piauí. O isolado Br845 (MG) formou um ramo de 100% de identidade com a sequência de lentivirus ovino Br198 do rebanho do maranhão. Duas ramificações com 99-100% de valor de bootstrap eram constituídas por isolados do mesmo rebanho obtidos no ano de 1995 (Br842 - Br841 e Br844 - Br843) (Figura 2). 3.1.1.2 Matriz de distância da região V1/V2 A divergência entre as sequências de nucleotídeos e aminoácidos de V1/V2 dos 44 vírus brasileiros variou de 0 a 29% (média = 21,9, SD = 0,021) e 0 a 45,5% (média = 32,9, SD = ,025), respectivamente (Tabela 3). Quando as sequências brasileiras foram comparadas entre os lentivirus do grupo A e B, a divergência variou de 19,8 a 67,7% e 29,9 a 61%, respectivamente (Tabela 3). A média de divergência considerando todas as sequências comparadas foi de 31,9% (DP = 0,023) para nucleotídeo e 39,4 (DP = 0,026) para aminoácidos. A diversidade genética (nucleotídeo) entre os LVPR brasileiros, cork e K1514 foi de 24% e 46%. 3.1.2 Análise filogenética da região V4/V5 (env) Para analisar a variabilidade de epitopos imunodominantes de SU, foi amplificado um fragmento abrangendo a região c- terminal (V4V5) da glicoproteína de superfície de env. As deduções de aminoácidos das sequências brasileiras foram alinhadas com sequências referências correspondentes a ambos os genótipos A (MVV K1514) e B (CAEV cork). O alinhamento das sequências mostrou que a divergência entre as variantes do mesmo genótipo foi concentrada na já descrita região variável dos domínios V4 (c- terminal) e (V5) (Figuras 3 e 4). O domínio V4 incluiu vários resíduos conservados de cisteína e sítios de ligação de n-glicosilação, dos quais foram perfeitamente conservados em todas as sequências tipo CAEV (Figuras 3 e 4). 45 Tabela 1. Amostras sequenciadas a partir de isolados de LVPR de caprinos e PBL de caprinos e ovinos oriundos da região nordeste e sudeste do Brasil continua Isolado Rebanho ENV ENV GAG Espécie Cong. Animal Raça Espécime Caprino/ Ovino Propriedade Estado Região V1V2 V4V5 MA/CA 1 Caprino 51 05C-RN/09 Toggenburg MSC Não 1 RN NE x 2 Caprino 53 06C-RN/09 Toggenburg MSC Não 1 RN NE x x 3 Caprino 148 10D-MG/10 Saanen PBMC cocultivo Não 2 MG SE x x 4 Caprino 150 14D-MG/10 Saanen PBMC cocultivo Não 2 MG SE x x 5 Caprino 168 17E-MG/10 Toggenburg Plexo coróide Não 3 MG SE x x 6 Caprino 272 18E-MG/10 Toggenburg Plexo coróide Não 3 MG SE x 7 Caprino 185 19F-MG/10 Saanen MSC Não 4 MG SE x 8 Caprino 295 20G-MG/10 Saanen MSC Sim 5 MG SE x x 9 Caprino 195 21G-MG/10 Saanen MSC Sim 5 MG SE x 10 Caprino 329 24H-PB/10 British alpino Plexo coróide Sim 6 PB NE x x 11 Caprino 387 28L-RJ/10 Saanen MSC Não 7 RJ SE x x x 12 Caprino 425 30M-RJ/10 Saanen MSC Não 8 RJ SE x x x 13 Caprino 423 31N-RJ/10 Saanen MSC Não 9 RJ SE x x 14 Caprino 497 32N-RJ/10 Pardo alpino MSC Não 9 RJ SE x 15 Caprino 491** 37P_SP/10 Saanen MSC Não 10 SP SE x 15 Caprino 434** 37P-SP/10 Saanen Plexo coróide Não 10 SP SE x 16 Caprino 664 39Q-PI/11 A. nubiano Plexo coróide Sim 11 PI NE x x 17 Caprino 638 40R-MA/11 A. nubiano LBA Não 12 MA NE x 18 Caprino 607 41S-MA/11 A. nubiano MSC Sim 13 MA NE x x 19 Caprino 634 42T-MA/11 Boer PBMC cocultivo Sim 14 MA NE x x 20 Caprino 628 43U-MA/11 A. nubiano MSC Sim 15 CE NE x x 21 Caprino 655 44W-CE/11 Saanen MSC Sim 16 CE NE x x x 22 Caprino 653 47V-PI/11 A. nubiano LBA Não 17 PI NE x x 23 Caprino 727 48Y-CE/11 A. nubiano Plexo coróide Sim 18 CE NE x 24 Caprino 769 50X-BA/11 A. nubiano Plexo coróide Sim 19 BA NE x x 25 Caprino 798 51Z-BA/11 Saanen Plexo coróide Sim 20 BA NE x 26 Caprino 841* BrMG1 (01) Sannen MSC - 21 MG SE x x 46 continuação A tabela contém informações sobre espécie, identificação do animal, raça, espécimes sequenciados (1 a 32: isolados de tecidos e 33 a 40: isolados de PBL), informação se a propriedade cria ovino e caprino, propriedade, estado, região, amostras sequenciadas e respectivos fragmentos. A identificação do animal (1 a 25) informa a propriedade (letra alfabética), estado brasileiro e ano que foi coletado. Legenda: MSC = membrana sinovial caprina, PBMC = células mononucleares do sangue periférico, LBA = lavado brônquio alveolar, PBL = leucócitos do sangue periférico, (-) = sem informação, cong.= congelamento e Br = Brasil. * sequências de isolados obtidos no ano de 1995 (negrito) (Castro et al., 1999); ** Vírus isolado de espécimes do mesmo animal (37P_SP/10). Isolado Rebanho ENV ENV GAG Espécie Cong. Animal Raça Espécime Caprino/ Ovino Propriedade Estado Região V1V2 V4V5 MA/CA 27 Caprino 842* BrMG1 (02) Sannen PBMC cocultivo - 21 MG SE x x 28 Caprino 843* BrMG2 (01) Toggenburg MSC - 22 MG SE x 29 Caprino 844* BrMG2 (02) Toggenburg MSC - 22 MG SE x x x 30 Caprino 845* BrMG2 (03) Toggenburg MSC - 22 MG SE x x 31 Caprino 847* BrPe2 Saanen PBMC cocultivo - 23 PE SE x 32 Caprino 849* BrPe1(01) Saanen MSC - 24 PE NE x x 33 Ovino 198 Santa inês PBL Sim 15 MA NE x x 34 Ovino 200 Santa inês PBL Sim 15 MA NE x 35 Caprino 1163 A. nubiano PBL Sim 6 PB NE x x 36 Caprino 44 A. nubiano PBL Sim 25 PI NE x 37 Caprino 9007 A. nubiano PBL Sim 15 MA NE x x 38 Caprino 7003 A. nubiano PBL Sim 15 MA NE x x 39 Caprino 29 A. nubiano PBL - 26 BA NE x 40 Caprino 81 Saanen PBL Não 27 RJ SE x 47 Tabela 2. Números de acesso das sequências de LVPR brasileiras no Genbank A identificação da amostra (1 a 25) informa a propriedade (letra alfabética), estado brasileiro e o país(Br=Brasil). (-) = Não realizado Identificação do LVPR Nº. de acesso no Genbank Nº congelamento Genbank GAG Espécie Isolado Amostra MA/CA 1 Caprino 51 05C-RN/Br - 2 Caprino 53 06C-RN/Br KF861569 3 Caprino 148 10D-MG/Br - 4 Caprino 150 14D-MG/Br KF861550 5 Caprino 168 17E-MG/Br KF861554 6 Caprino 272 18E-MG/Br KF861558 7 Caprino 185 19F-MG/Br KF861559 8 Caprino 295 20G-MG/Br - 9 Caprino 195 21G-MG/Br KF861573 10 Caprino 329 24H-PB/Br - 11 Caprino 387 28L-RJ/Br KF861570 12 Caprino 425 30M-RJ/Br KF861560 13 Caprino 423 31N-RJ/Br - 14 Caprino 497 32N-RJ/Br KF861568 15 Caprino 491 37P-SP/Br KF861565 15 Caprino 434 37P-SP/Br - 16 Caprino 664 39Q-PI/Br KF861553 17 Caprino 638 40R-MA/Br 18 Caprino 607 41S-MA/Br KF861561 19 Caprino 634 42T-MA/Br KF861566 20 Caprino 628 43U-MA/Br - 21 Caprino 655 44W-CE/Br KF861552 22 Caprino 653 47V-PI/Br KF861551 23 Caprino 727 48Y-CE/Br KF861567 24 Caprino 769 50X-BA/Br - 25 Caprino 798 51Z-BA/Br KF861557 26 Caprino 841 BrMG1 (01) - 27 Caprino 842 BrMG1 (02) KF861562 28 Caprino 843 BrMG2 (01) - 29 Caprino 844 BrMG2 (02) KF861571 30 Caprino 845 BrMG2 (03) KF861563 31 Caprino 847 BrPe2 - 32 Caprino 849 BrPe1(01) KF861564 33 Ovino Br198 KF861572 34 Ovino Br200 KF861555 35 Caprino Br1163 KF861574 36 Caprino Br44 - 37 Caprino Br9007 - 38 Caprino Br7003 - 39 Caprino Br29 KF861556 40 Caprino Br81 - 48 Figura 2. Relação filogenética de sequências de nucleotídeos de amostras brasileiras de LVPR de caprinos e ovinos. As sequências são de 327 nt da região V1-V2 do gene ENV do CAEV. A árvore foi construída pelo método Neighbour-Joining. Valores de bootstrap são baseados em 1000 replicatas (todos os valores ≥70% estão apresentados nos clados). As 29 sequências brasileiras estão destacadas (negrito) são apresentados no dendograma. Amostras sequenciadas a partir de PBL de caprinos (Br81, Br9007, Br7003 Br44) e ovino (Br198). Os isolados brasileiros de caprinos e as sequências obtidas a partir sangue de ovino e caprino agruparam no subtipo B1 de LVPR Br844 Br843 Br148 Br150 Br81 Br638 Br423 Br387 Br329 Br425 Cork Br198 Br845 Br9007 Br7003 Br44 Br628 Br664 Br653 Br168 Br295 Br842 Br841 Br607 Br53 Br655 Br634 Br769 Br847 496 1217 5720 Fonni Volterra 4668 P1OLV SAOMVV EV-1 K1514 97 61 100 81 100 100 100 99 100 87 89 99 92 0.05 B1 A B2 B3 49 Tabela 3. Distâncias de nucleotídeo e aminoácidos entre as sequências de V1V2 de isolados brasileiros e os genótipos de LVPR Br 844 Br 843 Br 842 Br 9007 Br 44 Br 81 Br 198 Br 7003 Br 148 Br 295 Br 423 Br 607 Br 628 Br 634 Br 638 Br 664 Br 769 Br 847 Br 653 Br 53 Br 150 Br 168 Br 329 Br 387 Br 425 Br 655 Br 841 Br 845 (B3) Fonni (B3) Volte rra (B2) 1227 (B2) 496 (B1) Cork K151 4 (A) P1Ov l (A) 4668 (A) Ev-1 SAO MVV (B2) 5720 Br844 1,3 20,5 23,3 20,0 19,6 21,3 21,8 21,9 25,0 16,4 22,6 23,5 25,2 23,8 21,7 25,2 25,2 18,3 23,1 16,9 21,1 22,0 21,5 21,2 18,4 21,0 21,7 54,0 45,7 34,1 27,8 23,2 34,4 38,0 40,8 54,3 37,2 29,9 Br843 3,9 20,5 23,3 20,0 19,6 22,6 21,8 23,1 25,0 18,6 23,8 23,5 26,5 25,1 21,7 26,5 26,5 19,4 24,3 16,9 22,3 23,2 22,7 22,4 19,5 21,0 22,9 56,3 47,6 32,5 27,8 24,4 35,9 39,7 42,6 56,5 38,8 28,5 Br842 32,5 31,2 22,1 23,8 21,2 23,6 23,9 22,0 16,1 20,9 22,7 19,3 26,4 22,4 23,8 26,4 26,4 20,8 22,2 24,2 16,8 22,6 20,1 23,3 17,8 2,6 22,8 52,1 52,4 27,3 23,3 22,1 46,7 43,0 41,0 64,7 41,9 26,4 Br9007 39,0 37,7 32,5 13,4 24,8 7,7 13,0 24,6 26,0 19,7 20,2 20,0 27,1 20,8 22,5 27,1 27,1 22,5 20,7 25,6 23,7 17,6 22,1 18,6 21,4 23,8 8,9 59,9 50,7 22,2 24,4 21,4 40,5 31,6 39,1 57,1 42,7 27,6 Br44 29,9 29,9 39,0 28,6 29,5 17,7 11,6 29,9 25,5 22,6 18,5 10,0 24,9 25,1 19,7 24,9 24,9 18,6 21,4 26,4 21,0 24,0 24,7 25,2 20,9 26,2 20,2 51,6 46,1 23,5 26,6 23,7 41,2 33,9 41,5 59,7 39,0 28,8 Br81 32,5 33,8 31,2 37,7 39,0 23,4 29,7 20,4 24,9 22,1 26,9 22,2 25,3 19,7 27,4 25,3 25,3 22,4 23,6 21,6 24,2 24,3 18,8 24,2 21,3 20,0 23,8 49,5 47,4 32,7 27,9 26,2 43,3 39,0 41,5 59,0 39,0 29,8 BR198 40,3 41,6 37,7 16,9 35,1 39,0 18,8 21,4 28,6 16,4 21,7 20,2 25,9 17,2 23,2 25,9 25,9 23,0 21,6 23,6 26,1 15,4 19,3 16,4 24,9 23,1 3,6 54,9 53,0 24,9 24,9 20,9 41,0 38,3 40,6 58,5 40,3 27,4 Br7003 32,5 32,5 36,4 20,8 23,4 37,7 35,1 28,3 26,7 23,0 21,0 23,5 26,5 26,5 23,5 26,5 26,5 22,3 22,9 25,6 21,5 29,0 26,5 30,2 23,8 26,4 22,1 67,3 44,4 25,4 30,8 20,8 45,9 37,2 41,3 63,7 43,1 31,8 Br148 35,1 37,7 36,4 32,5 40,3 28,6 33,8 35,1 24,3 23,3 25,1 27,8 23,9 22,2 23,3 23,9 23,9 20,6 22,2 14,3 27,3 19,0 21,4 18,9 22,8 23,7 21,8 55,5 51,5 32,1 28,1 29,2 45,3 33,5 41,7 66,8 38,7 27,9 Br295 33,8 32,5 27,3 35,1 37,7 29,9 40,3 39,0 31,2 23,1 24,7 24,6 27,3 21,5 24,6 27,3 27,3 23,1 25,9 26,2 17,2 23,3 20,3 24,4 19,7 15,5 26,2 51,9 51,6 28,8 26,3 21,4 46,4 38,1 40,8 65,7 37,3 31,2 Br423 23,4 26,0 35,1 28,6 29,9 32,5 28,6 35,1 35,1 33,8 18,2 21,1 23,8 17,4 22,2 23,8 23,8 21,0 18,8 29,0 22,7 17,4 12,5 17,3 20,4 19,3 15,7 50,8 57,2 23,2 23,4 23,0 43,1 42,4 47,4 59,9 43,5 27,3 Br607 40,3 42,9 41,6 40,3 33,8 33,8 41,6 42,9 39,0 36,4 32,5 20,3 21,3 22,8 19,1 21,3 21,3 17,6 10,7 24,3 21,7 17,1 18,1 18,1 16,5 25,7 20,4 51,9 48,5 26,8 23,6 26,0 46,4 32,3 37,5 63,1 39,1 28,9 Br628 35,1 35,1 35,1 33,8 11,7 31,2 33,8 32,5 39,0 36,4 26,0 32,5 28,7 24,4 22,0 28,7 28,7 20,2 22,6 27,7 19,5 24,8 24,4 26,0 21,9 22,1 18,4 50,5 46,8 26,8 27,0 26,0 41,7 35,4 41,7 54,1 35,3 28,8 Br634 33,8 36,4 42,9 37,7 29,9 36,4 37,7 36,4 28,6 36,4 32,5 32,5 35,1 25,9 20,9 0,0 0,0 21,4 23,4 25,9 23,7 26,4 22,9 26,3 17,2 27,1 27,6 48,2 41,0 27,2 29,0 24,2 49,1 39,5 45,7 65,2 42,4 29,3 Br638 33,8 35,1 36,4 35,1 39,0 29,9 35,1 35,1 31,2 28,6 29,9 35,1 39,0 32,5 23,8 25,9 25,9 22,4 19,9 26,4 23,6 20,3 17,2 20,2 20,0 23,1 14,9 49,0 45,5 22,8 21,2 21,9 39,7 40,0 37,3 62,7 37,6 26,8 Br664 28,6 28,6 36,4 32,5 19,5 32,5 36,4 31,2 29,9 33,8 32,5 32,5 24,7 24,7 33,8 20,9 20,9 5,7 23,2 21,8 19,5 21,2 24,2 22,3 18,0 23,5 23,6 49,5 45,3 26,1 25,9 24,1 42,4 35,9 39,2 53,0 37,1 26,8 Br769 33,8 36,4 42,9 37,7 29,9 36,4 37,7 36,4 28,6 36,4 32,5 32,5 35,1 0,0 32,5 24,7 0,0 21,4 23,4 25,9 23,7 26,4 22,9 26,3 17,2 27,1 27,6 48,2 41,0 27,2 29,0 24,2 49,1 39,5 45,7 65,2 42,4 29,3 Br847 33,8 36,4 42,9 37,7 29,9 36,4 37,7 36,4 28,6 36,4 32,5 32,5 35,1 0,0 32,5 24,7 0,0 21,4 23,4 25,9 23,7 26,4 22,9 26,3 17,2 27,1 27,6 48,2 41,0 27,2 29,0 24,2 49,1 39,5 45,7 65,2 42,4 29,3 Br653 23,4 26,0 31,2 35,1 24,7 28,6 36,4 31,2 26,0 31,2 33,8 32,5 29,9 24,7 28,6 6,5 24,7 24,7 21,4 20,1 16,9 19,0 22,4 20,0 16,5 20,3 25,2 51,0 45,3 28,8 25,3 23,3 43,8 33,7 36,8 56,9 37,6 25,7 Br53} 37,7 40,3 35,1 36,4 31,2 29,9 41,6 37,7 36,4 36,4 32,5 14,3 29,9 28,6 33,8 27,3 28,6 28,6 27,3 25,8 22,2 23,2 21,2 22,5 16,4 23,3 23,2 52,7 50,2 25,3 25,0 24,1 53,5 40,8 39,5 63,4 40,1 30,3 Br150 29,9 28,6 41,6 40,3 39,0 29,9 41,6 41,6 22,1 31,2 37,7 37,7 40,3 35,1 35,1 28,6 35,1 35,1 26,0 39,0 27,4 26,1 23,2 26,6 24,9 26,6 23,3 57,8 48,6 37,6 33,6 29,2 41,7 36,4 44,8 59,4 36,8 33,9 Br168 29,9 31,2 26,0 35,1 31,2 31,2 39,0 33,8 35,1 22,1 33,8 37,7 32,5 28,6 27,3 27,3 28,6 28,6 26,0 31,2 39,0 22,4 20,1 23,5 16,5 18,3 27,2 51,6 47,8 28,1 26,4 23,3 41,7 42,7 40,6 57,3 39,3 28,8 Br329 36,4 39,0 41,6 36,4 42,9 35,1 37,7 45,5 32,5 37,7 32,5 31,2 45,5 35,1 35,1 36,4 35,1 35,1 33,8 36,4 36,4 35,1 15,6 0,6 19,4 21,9 16,8 53,3 50,3 28,3 27,2 26,9 42,8 38,3 41,5 62,7 42,4 26,6 Br387 31,2 33,8 37,7 37,7 35,1 27,3 33,8 41,6 35,1 27,3 24,7 29,9 35,1 31,2 27,3 35,1 31,2 31,2 35,1 35,1 36,4 29,9 27,3 16,6 19,2 18,4 17,5 42,1 45,5 20,5 25,0 23,9 40,8 43,1 42,9 55,6 41,5 25,1 Br425 36,4 39,0 41,6 36,4 42,9 35,1 37,7 45,5 32,5 37,7 32,5 31,2 45,5 35,1 35,1 36,4 35,1 35,1 33,8 36,4 36,4 35,1 0,0 27,3 18,4 22,4 17,8 54,1 50,1 28,1 27,3 28,1 43,0 39,3 42,6 64,4 41,7 26,5 Br655 28,6 29,9 29,9 33,8 29,9 26,0 37,7 36,4 32,5 29,9 32,5 31,2 33,8 23,4 28,6 22,1 23,4 23,4 22,1 22,1 36,4 20,8 31,2 27,3 31,2 20,2 26,6 49,3 39,6 23,0 25,8 22,2 41,0 41,2 32,7 58,2 39,6 24,0 Br841 31,2 29,9 3,9 35,1 39,0 29,9 37,7 40,3 37,7 26,0 33,8 41,6 35,1 44,2 37,7 36,4 44,2 44,2 31,2 35,1 41,6 27,3 39,0 33,8 39,0 31,2 22,3 47,1 57,9 29,9 23,2 20,6 47,4 45,2 43,1 67,7 44,9 27,6 Br845 39,0 40,3 35,1 16,9 33,8 39,0 5,2 37,7 33,8 35,1 23,4 37,7 29,9 37,7 29,9 36,4 37,7 37,7 36,4 40,3 39,0 37,7 35,1 28,6 35,1 37,7 35,1 54,9 54,1 26,9 26,6 19,8 44,7 38,0 43,8 60,9 45,3 29,9 Fonni 46,8 46,8 49,4 54,5 51,9 49,4 53,2 59,7 54,5 50,6 46,8 46,8 46,8 48,1 50,6 45,5 48,1 48,1 48,1 48,1 49,4 48,1 53,2 42,9 53,2 48,1 46,8 51,9 41,6 56,3 50,3 57,5 49,7 58,1 51,4 72,0 44,2 44,6 Volterra (B3) 50,6 53,2 53,2 53,2 50,6 53,2 57,1 49,4 54,5 53,2 51,9 46,8 53,2 46,8 49,4 50,6 46,8 46,8 49,4 46,8 55,8 48,1 51,9 46,8 51,9 44,2 55,8 57,1 48,1 39,4 53,9 50,7 42,3 43,0 42,8 64,7 44,6 39,1 1217 (B2) 44,2 41,6 40,3 31,2 29,9 48,1 36,4 33,8 41,6 40,3 36,4 41,6 35,1 37,7 40,3 35,1 37,7 37,7 39,0 39,0 44,2 37,7 45,5 37,7 45,5 35,1 44,2 39,0 54,5 45,5 16,5 30,5 38,3 33,6 38,6 59,3 41,5 17,9 496 (B2) 39,0 37,7 32,5 33,8 35,1 40,3 37,7 36,4 35,1 33,8 33,8 36,4 39,0 33,8 35,1 33,8 33,8 33,8 35,1 32,5 41,6 33,8 42,9 39,0 42,9 35,1 33,8 37,7 48,1 53,2 26,0 31,2 40,5 34,5 37,5 59,4 41,0 18,4 Cork (B1) 37,7 39,0 33,8 35,1 35,1 32,5 37,7 37,7 45,5 33,8 35,1 40,3 37,7 35,1 32,5 36,4 35,1 35,1 32,5 36,4 46,8 36,4 41,6 36,4 41,6 32,5 32,5 36,4 55,8 57,1 46,8 39,0 49,5 46,2 40,4 65,7 46,6 33,9 K1514 (A) 46,8 46,8 51,9 46,8 44,2 51,9 46,8 45,5 51,9 46,8 45,5 49,4 45,5 54,5 48,1 48,1 54,5 54,5 49,4 51,9 46,8 49,4 50,6 41,6 50,6 51,9 49,4 45,5 48,1 51,9 39,0 45,5 54,5 23,7 29,1 28,9 26,1 43,0 P1OLV (A) 50,6 50,6 55,8 41,6 40,3 50,6 49,4 42,9 42,9 46,8 46,8 41,6 44,2 46,8 49,4 44,2 46,8 46,8 45,5 45,5 41,6 50,6 46,8 51,9 46,8 51,9 55,8 46,8 58,4 54,5 41,6 42,9 57,1 36,4 30,6 40,3 22,9 43,7 4668 (B3) 51,9 54,5 45,5 45,5 51,9 49,4 48,1 44,2 45,5 46,8 53,2 45,5 51,9 48,1 49,4 45,5 48,1 48,1 44,2 45,5 51,9 41,6 48,1 46,8 48,1 41,6 46,8 49,4 51,9 49,4 42,9 42,9 49,4 42,9 42,9 50,6 36,1 38,1 EV1 (A) 59,7 59,7 57,1 57,1 53,2 57,1 55,8 57,1 61,0 58,4 55,8 61,0 51,9 58,4 59,7 54,5 58,4 58,4 57,1 57,1 57,1 55,8 63,6 54,5 63,6 59,7 57,1 55,8 55,8 64,9 54,5 54,5 58,4 35,1 50,6 55,8 37,2 66,5 SAOMvv (A) 51,9 51,9 57,1 59,7 54,5 53,2 57,1 54,5 55,8 53,2 53,2 50,6 50,6 51,9 50,6 46,8 51,9 51,9 48,1 50,6 50,6 49,4 54,5 50,6 54,5 49,4 57,1 59,7 45,5 54,5 54,5 51,9 53,2 40,3 44,2 48,1 48,1 46,6 5720 (B2) 40,3 36,4 33,8 37,7 41,6 39,0 36,4 39,0 36,4 36,4 36,4 39,0 37,7 37,7 37,7 36,4 37,7 37,7 33,8 39,0 41,6 35,1 40,3 36,4 40,3 36,4 32,5 37,7 41,6 49,4 27,3 27,3 44,2 42,9 48,1 39,0 54,5 0,5 Distâncias genéticas (expressada como porcentagem do tamanho de V1/V2 (345 nt) estão presentes na matriz triangular. As distâncias de aminoácidos estão apresentadas na metade inferior de cada matriz e as distâncias de nucleotídeos estão na metade superior de cada matriz. 50 No domínio V4, três animais apresentaram significante e consistente divergência das sequências de aminoácidos. O vírus isolado de caprino Br849 (BrPe1 (01), Castro et al. 1999), classificado como CAEV no gene gag, apresentou a deleção de aminoácidos (resíduos 60 a 65) que é normalmente observada nas sequências de MVV (Figura 3). Enquanto que, a sequência da amostra Br1163, nesta mesma posição, apresentou a inserção de um novo motivo (resíduos 55 a 65) ligado por dois resíduos de cisteína (Figura 3). O isolado Br195, classificado como MVV (grupo A) na análise do gene gag (Figuras 5 e 6), não apresentou a deleção típica de MVV no gene env da região V4 (Figura 4). Na tabela 6 destaca os principais achados obtidos nestas sequências. 2.2 Análise filogenética baseada na região MA/CA (gag) 2.2.1 Comparação das sequências Para concluir a caracterização filogenética das estirpes brasileiras, um fragmento do gene gag de 990 nt abrangendo a região de CA/MA foi amplificado de isolados de LVPR caprinos (n=23) e DNA proviral de ovinos e caprinos (MA: ovino=2 e PB: caprino=1) (Tabela 1). A análise filogenética foi realizada baseada na região CA (467nt) cuja sequência é a mais representativa da maioria dos subtipos de LVPR disponíveis. As sequências de lentivirus brasileiras alinharam-se com as sequências referências de LVPR dos grupos A e B. Os lentivirus ovinos brasileiros segregaram para o subtipo B1, enquanto que, os lentivirus caprinos agruparam-se no subtipo B1 e ainda para dois prováveis novos subtipos no genótipo A, o qual foi baseado no significante valor de bootstrap (92%). Estes lentivírus caprinos são o isolado Br195 e a sequência Br1163 (PBL), que formaram uma ramificação com o isolado brasileiro ovino do Rio grande do Sul V27 (acesso genbank: AJ305039) e o MVV K1514 (acesso genbank: M60609), respectivamente (Figura 5). A topologia do dendograma apresentou formação de táxons constituídos por isolados brasileiros de LVPR oriundos de estados das regiões NE e SE do Brasil. Dois táxons foram constituídos por sequências de LVPR brasileiras isoladas no ano de 1995 (Br848 ou Br845 e Br844) e os isolados brasileiros do RS (C18 e C767 ou C47) (acesso genbank: AJ305040-C18; AJ305041- C47; AJ305042- C767). Doze fazendas tinham produção consorciada de caprinos e ovinos, dentre as quais o rebanho nº 15, que apresentou lentivirus de caprinos e ovinos (Br200 e Br198) agrupados no subtipo B1 (Tabelas 1 e 6, Figuras 2 e 5). 2.2.2 Matriz de distância do gene gag (MA/CA) A divergência entre as sequências de nucleotídeos e aminoácidos de MA/CA dos vírus candidatos aos novos subtipos (Br1163 e Br195) variou de 11,7 a 41 e 3,6 a 19,4, respectivamente (Tabela 4). A diversidade das sequências de nucleotídeos e aminoácidos entre estes dois supostos subtipos com aqueles dos grupos A e B é demonstrado na Tabela 5. As divergências de nucleotídeos e aminoácido das sequências de Br1163 e Br195 foram comparadas com K1514, Cork, os isolados deste estudo, V27 e entre eles e destacas na Tabela 4. 51 Figura 3. Alinhamento de dedução de sequências brasileiras e referências de SRLV de aminoácidos da região V4/V5 do gene env (V4V5). As sequências de aminoácido de 12 estirpes LVPR de caprinos e duas sequências de LVPR obtidas a partir leucócitos do sangue periférico (PBL) foram alinhadas com sequências de referencias do genótipo A (K1514) e B (cork). O epitopo imunodominante está destacadas dentro de retângulo (SU5). Os domínios variáveis de SU5 previamente identificados estão delimitados na região superior por linha tracejada. (*), resíduo de cisteína conservada; (---), sítio de N-glicosilação (NXS ou NXT, X = algum resíduo); (.), resíduo conservado. O isolado Br849 contém a deleção na porção central de SU5, que é identificada em todas as sequências de MVV, enquanto na sequência Br1163 (PBL) a deleção foi substituída por um novo motivo ligada por dois resíduos de cisteína (destacados em cinza). V4/V5 --------------------------V4----------------------------- 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ....|....|....|....| ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CORK TMWGIYKNCSGCENATLDNTGEGTLGGVANKNCSLPHKNESNKWTCAPRQ-----RD-GKTDSLYIAGGKKFWTRIKAQFSCESNIGQLDGMLHQQ K1514 ...N..Q...R.N.SS..R..S....T.N.LK.....R........KSQR-----------..-....-RD..GKV..KY.....L.G..S.M... Br7003 ..MER.......Q....A...G...............I..TG........R----G--.S.........G.....V...Y...Y...E....M... Br9007 ......RK....Q.....K..D......K.I...........R.......-----KH-..K........E.....V...Y.....V.E....M... Br51 N.....R.....K.....R.......N.K.L......I....Q.......-----KN-D.R........E.....V...Y.....L.E....M... Br295 ............G.....R...........I..................W-----K.-..K........E.....V...Y.......K....F... Br387 ...E.............AR..T....S...I..........LR.S.....-----KE-..K........E...E.V...Y.......E..S.M... Br423 ............Q.....RIET......S............GL.......D----QSS.R.............E.V...Y.....L.E....M... Br434 ............Q.....RRES........I..........D........G----.N-NTK........E.........Y...N.L.E....M... Br628 .........T.......AR..A.A..T.E.V.....Y..........R.RS----K.--.A..V.....E.....V...Y.......E....M... Br769 ............Q....A...G........I...................-----.S-.TK........E.....V...Y.....L.E....M... Br844 ....R.......Q.....R.DT....S...I.........TQQ......W-----KT-..K........RQ....V...Y.......E....M... Br841 ..............K...R..H........I...........I......W-----KK-R.K........E.....V...Y.......E....I... Br329 ...E........A.....Y.ER....A...............M.......E----Q--.R.........E.V...V...Y.......E....M... Br849 ...N..Q...R.N.SS..R..S....T.N.LK.....RK.......KSQR-----------..-....-RD..GKV..KY.....L.G..S.M... Br655 M..S........Q.....RQNI....A.K.I......I............N----.--.RK............E.V.P.Y.......E....M... Br1163 ...EH.E..T..K.Q..NR..K.A..T.E.I..........SQ....A.AKGKCQANETCR.......-RN..G.V...Y.....L.G..V.M... -*- * --- * --- * * -----V5----- SU>