Trypanosoma cruzi inositol phosphorylceramide synthase as a potential drug target for Chagas disease

Abstract

Os esfingolipídios (SLs) são uma parte essencial de todas as membranas celulares eucarióticas. A inositol fosforilceramida (IPC) é um SL presente em numerosos protozoários, mas ausente em mamíferos. No Trypanosoma cruzi, este SL complexo é sintetizado pela IPC sintase; uma proteína integral de membrana expressa em todas as formas do parasito. Por conseguinte, a IPC sintase constitui um alvo ideal para o desenvolvimento de novas quimioterapias para a doença de Chagas, causada pelo T. cruzi, a qual carece de tratamento eficaz. Neste estudo, o nosso objetivo foi validar a IPC sintase do T. cruzi (TcIPCS) como potencial alvo terapêutico da doença de Chagas, através da geração e caracterização de parasitos geneticamente modificados. Além disso, a avaliação de potenciais compostos anti-TcIPCS também foi analisado para verificar o potencial da enzima como alvo de drogas. Utilizando a tecnologia CRISPR-Cas9, geramos mutantes nocautes do gene da TcIPCS, refutando a suposição sobre a essencialidade desse gene em T. cruzi. No entanto, as caracterizações fenotípicas dos parasitos nocautes da TcIPCS demonstraram a importância da TcIPCS para o fitness do T. cruzi. A deleção do TcIPCS afetou negativamente a proliferação de epimastigotas e a metaciclogênese. Além disso, os parasitos nocautes apresentaram diminuição das capacidades de infecção in vitro, replicação intracelular das amastigotas e liberação de tripomastigotas das células hospedeiras. Curiosamente, o sobrenadante de células infectadas com os mutantes mostrou a predominância de amastigotas extracelulares (EA), provavelmente como resultado de alterações metabólicas que desencadeiam a diferenciação das tripomastigotas liberadas para as formas EA. Também visando caracterizar o papel do TcIPCS em T. cruzi, geramos linhagens celulares transfectadas que superexpressam o TcIPCS usando o vetor de expressão pROCK-Hygro. Esses parasitos mostraram in vitro uma metaciclogênese precoce e aumentada. Embora várias tentativas de obter a proteína completa expressa em E. coli tenham sido malsucedidas, fomos capazes de expressar e purificar uma fração C-terminal antigênica da proteína que será usada para imunizar camundongos. Finalmente, testamos inibidores específicos da IPCS da L. major identificados recentemente, contra os parasitos nocautes e selvagens usando um ensaio de viabilidade celular baseado na resazurina. Os resultados dos ensaios de dose-resposta com quatro compostos selecionados não mostraram atividade anti-TcIPCS significativa contra as formas epimastigotas. Em conclusão, embora a TcIPCS tenha demonstrado ser não essencial para a viabilidade do T. cruzi, a caracterização fenotípica tanto dos parasitos nocautes como dos superexpressores sugerem que esta enzima é um alvo interessante para o desenvolvimento de drogas.