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http://hdl.handle.net/1843/53732
Type: | Dissertação |
Title: | Utilização da proteína HSP70 na otimização de método diagnóstico imuno-histoquímico para detecção de formas amastigotas de protozoários do gênero Leishmania |
Authors: | Pedro Paulo de Abreu Teles |
First Advisor: | Wagner Luiz Tafuri |
First Referee: | Tatiane Alves da Paixão |
Second Referee: | Lucelia de Jesus Pinheiro |
Third Referee: | Hélida Monteiro de Andrade |
Abstract: | As Leishmanioses correspondem a um espectro clínico de doenças tanto no homem como como no cao variando das formas tegumentares localizadas até as formas viscerais (sistêmicas). Entretanto é uma doença de caráter crônico causada por protozoários do gênero Leishmania. A técnica de imuno-histoquimica (IHQ) é um dos métodos de diagnostico baseada na visualização de formas amastigotas de Leishmania nos tecidos, Tafuri et. al (2004) descreveram uma técnica alternativa de IHQ utilizando, como anticorpo primário, soro hiperimune de cão naturalmente infectado com Leishmania infantum. Essa técnica mostrou-se efetiva na detecção de formas amastigotas de Leishmania nos diversos tecidos de cães com leishmaniose visceral e no homem com as diferentes formas de Leishmaniose Tegumentar. Nesse trabalho padronizamos uma outra técnica de IHQ utilizando soro de coelho experimentalmente sensibilizado pelo antígeno HSP70 (antígeno ribossomal de Leishmania) como anticorpo primário. O objetivo foi de comparar com a técnica de Tafuri et al. (2004), Cortes histológicos em duplicata foram analisados de acordo com as duas técnicas de IHQ aplicadas. Observou-se uma correlação absoluta na classificação de reatividade das formas amastigotas, tanto quando se utilizou soro hiperimune de cão naturalmente infectado ou soro de coelho sensibilizado com HSP70. Para essa análise semi-quatitativa da reação, foi estabelecido um escore baseado no número de campos com amastigotas imunorreativas: grau 1 (0 – 15 campos), grau 2 (15 a 30 campos) e grau 3 (> que 30 campos). Após análise histológica os resultados foram de vinte cortes histológicos (68,9%) para o grau 1; de um corte histológico (3,5%) para o grau 2 e oito cortes histológicos (27,6%) para o grau 3. Um estudo quantitativo foi realizado por microscopia óptica e análises morfométricas utilizando o sistema KS300 da Zeiss (Carl Zeiss®, Germany). Vinte e cinco imagens foram aleatoriamente capturadas e utilizadas para a contagem de amastigotas imunorreativas. O software Prism 5.0 foi utilizado para a análise dos dados. Não houve diferença estatística entre os testes de IHQ (P<0,05). Portanto os resultados demonstraram que é possível obter imunomarcação de formas amastigotas de acordo com o teste de IHQ a partir da utilização de soro de coelho sensibilizado com o antígeno HSP70. Melhorias na técnica para a redução de background ainda devem ser realizadas. A utilização da produção de anticorpo primário de coelho pode permitir maior acurácia no processo diagnóstico da IHQ. |
Abstract: | Leishmaniasis corresponds to a group of infectoparasitary diseases caused by protozoa of the Leishmania species. Developed by Tafuri, et. al (2004), the alternative technique of Immunohistochemistry (IHQ) which uses hyperimmune serum to Leishmania infantum in naturally infected dogs as primary antibody showed to be effective for the detection of amastigote forms of Visceral Leishmaniasis (VL) and American Cutaneous Leishmaniasis (ACL). Three of the most common species in the state of Minas Gerais, L. infantum, L.(V.)amazonensis and L.(V.) braziliensis had the proteomic characterization of their antigens to determine their immunogenic reactivities to the dog hyperimmune serum. In this study we describe the standardization of a new IHQ protocol using rabbit serum sensitized by the antigen HSP70 as primary antibody aiming at the comparison and enhancement of the technique in order to improve the diagnosis in dogs infected by Leishmania spp. Duplicate histological sections were analyzed according to the two applied techniques of IHQ. A 100% correlation was obtained in the classification of reative amastigote forms, both when using hyperimmune serum from naturally infected dogs or rabbit serum sensitized by the antigen HSP70. For that semiquantitative analysis of the reaction a score was established based on the number of fields with immunolabeled amastigotes, ranging from 1 (0 -15 fields), 2 (15-30 fields) to 3 (> 30 fields) according to the infection level and the results were: 1) twenty (68,9%) histological sections; 2) one (3,5%) histological sections and 3) eight (27,6%) histological sections. Quantitative study was carried out by optical microscopy and morphometrical analysis. Twenty five images were randomly chosen and used to count immunolabeled amastigotes. The images were analyzed by software, viewed on a computer video screen and sent to a computer-assisted image analysis system KS300 (Carl Zeiss®, Germany). The program Prism 5.0 was used for the analyses. There was no statistical difference between IHQ tests (P<0,05). Thereby the results demonstrated that it was possible to obtain the labeling of amastigote forms through this IHQ test made from the rabbit serum sensitized by the antigen HSP70. Improvements in technique for background reduction have yet to be performed. The use of the primary rabbit antibody production could allow for the creation of a better IHQ diagnosis process. |
Subject: | Imuno-histoquímica Proteínas de Choque Térmico HSP70 Diagnóstico Infecções por Protozoários Leishmania Dissertação Acadêmica |
language: | por |
metadata.dc.publisher.country: | Brasil |
Publisher: | Universidade Federal de Minas Gerais |
Publisher Initials: | UFMG |
metadata.dc.publisher.program: | Programa de Pós-Graduação em Patologia |
Rights: | Acesso Aberto |
URI: | http://hdl.handle.net/1843/53732 |
Issue Date: | 26-Feb-2018 |
Appears in Collections: | Dissertações de Mestrado |
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