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http://hdl.handle.net/1843/BUOS-8TFQPD| Type: | Dissertação de Mestrado |
| Title: | Purificação e caracterização biológica (estrutural, antibacteriana, antiparasitária, hemolítica e antigênica) de componentes do veneno da serpente Bothrops jararaca |
| Authors: | Paula Henriques Cruz Ciscotto |
| First Advisor: | Carlos Delfin Chavez Olortegui |
| First Referee: | Adriano Monteiro de Castro Pimenta |
| Second Referee: | Marcelo Matos Santoro |
| Abstract: | Os venenos de animais peçonhentos constituem rica fonte de informação para os pesquisadores, por serem compostos de substâncias biologicamente ativas. Dentre essas substâncias destacam-se as proteínas e os peptídeos que, ao serem caracterizados, possibilitam o seu entendimento funcional, além de promover uma possível aplicabilidade biotecnológica. O presente trabalho teve início após a observação que entre diferentes venenos de animais peçonhentos testados quanto à capacidade antibacteriana, os das serpentes do gênero Bothrops apresentaram significante atividade, principalmente B. jararaca. O veneno de B. jararaca mostrou-se capaz de inibir o crescimento de bactérias gram-positivas e gram-negativas, sendo então fracionado pela combinação sucessiva das cromatografias de gel filtração, troca aniônica e afinidade à heparina, obtendo-se ao final dos processos uma fração com atividade antibacteriana. A atividade antibacteriana está diretamente ligada a atividade L-aminoácido oxidase. A fração purificada HTP1 e o veneno bruto apresentaram também atividade antiparasitária, matando formas promastigotas de Leishmania amazonensis e atividade hemolítica, promovendo a lise parcial de hemácias de cavalo. As atividades biológicas de HTP1 foram inibidas pela adição de catalase, um antioxidante, o que leva a sugerir a ligação direta do peróxido de hidrogênio nestas atividades. Após cromatografia de troca aniônica foi purificada uma proteína heterodimérica, denominada proteína P8 com massa molecular de 30260,87 Da observada por espectrômetro de massa. Após redução das ligações dissulfetos esta apresentou duas subunidades com 15,8 kDa e 14,4 kDa. A seqüência de aminoácidos da região N-terminal da subunidade P8a foi DCPSGWSSYEGNCYKFFQQK, e da subunidade P8b foi XCPPDWSSYEGHCYRFFKEE. As subunidades da proteína P8 apresentaram alto grau de identidade com proteínas tipo-lectina tipo-C. A atividade antigênica da proteína P8 foi caracterizada e foi observado que a potência de antivenenos botrópicos se correlacionou com títulos de anticorpos medidos por ELISA, quando esta proteína foi imobilizada nas placas. |
| Abstract: | Snake venoms contain many proteinaceous components which incapacitate and digest prey. Neurotoxins, cytotoxins, myotoxins, proteases and nucleases are found in varying quantities in snake venoms. The biochemical characterization of these compounds would facilitate the study of their functions and give a clue of their applicability in biotechnology. Venoms from 13 different animal species were tested using agar diffusion assay for antibacterial effects against Staphylococcus aureus. The venoms from five species of Bothrops showed strong antibacterial effects, mainly Bothrops jararaca venom. The crude venom from B. jararaca displayed antibacterial activity against various gram-negative and gram-positive bacteria. Purification of active fractions from crude venom was performed by molecular size-exclusion, ion exchange and heparin affinity chromatography. The crude venom and purificated fraction (HTP1) presented a killing effect in vitro against promastigote forms of Leishmania amazonensis and hemolytic effect in horse blood agar. Antibacterial, anti-Leishmania and hemolytic activities correlated with L- amino acid oxidase and were terminated by catalase addition. The oxidation activity of HTP1 was characterized for substrate specificity through analysis of various amino acids as substrates, with high oxidase activity against L-leucina and L-metionina. The botrocetin-like protein (P8 protein) was purified after ion exchange chromatography. The apparent molecular mass of the protein P8 was 29,5 kDa before and 15,8 kDa and 14,4 kDa after reduction. The observed molecular mass, obtained by mass spectrometry, was 30,260.87 Da. The observed amino acid sequence for the two peptide chains were DCPSGWSSYEGNCYKFFQQK (P8a) and XCPPDWSSYEGHCYRFFKEE (P8b). These two chain sequences displayed high degree of similarity with C-type lectin-like protein. An assay based on enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed to test the potency of anti-Bothrops antivenoms, using P8 protein. |
| Subject: | Bioquímica Jararaca (Cobra) Veneno |
| language: | Português |
| Publisher: | Universidade Federal de Minas Gerais |
| Publisher Initials: | UFMG |
| Rights: | Acesso Aberto |
| URI: | http://hdl.handle.net/1843/BUOS-8TFQPD |
| Issue Date: | 25-Feb-2005 |
| Appears in Collections: | Dissertações de Mestrado |
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