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Type: Dissertação de Mestrado
Title: Caracterização do internalizador de peptídeos Opp em Corynebacterium pseudotuberculosis e o estudo do seu papel na virulência e patogenicidade dessa bactéria
Authors: Pablo Matias Ribeiro de Oliveira Moraes
First Advisor: Vasco Ariston de Carvalho Azevedo
First Co-advisor: Anderson Miyoshi
First Referee: Andrea Maria Amaral Nascimento
Second Referee: Frederico Marianetti Soriani
Abstract: Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria Gram-positiva, parasita intracelular facultativa, causadora da linfadenite caseosa (LC), uma doença infecto-contagiosa crônica que acomete pequenos ruminantes e acarreta sérias perdas econômicas para as atividades de ovinocaprinocultura. A ampla ocorrência e importância econômica da enfermidade estimulam estudos sobre as bases moleculares da virulência deste patógeno, cujas informações ainda são escassas. Dentre os fatores moleculares associados à virulência de bactérias patogênicas, têm-se destacado os internalizadores de peptídos (Opp), que são complexos protéicos multi-subunitários, pertencentes à família dos ABC transportadores. Esses internalizadores ficam localizados na membrana plasmática e tem como principal função a captação de peptídeos do meio extracelular para que sirvam como fonte de carbono e nitrogênio. Além do papel nutricional os peptídeos podem ser utilizados, por bactérias Gram-positivas, como moléculas sinalizadoras em um processo de comunicação intercelular, o qual permite às bactérias coordenarem a expressão de determinados genes em uma escala populacional. O controle de diversos processos celulares já foi relacionado ao mecanismo de comunicação via peptídeos sinalizadores dentre os quais incluem: esporulação, conjugação e virulência. Com o objetivo de se estudar o papel do transportador de peptídeos (Opp) na bactéria C. pseudotuberculosis foi construída uma linhagem mutante para o transportador Opp utilizando um plasmídeo suicida. Essa linhagem foi crescida na presença do peptídeo tóxico glutationa (GSH) nas concentrações de 5mM e 10 mM, como forma de se obter uma confirmação fenotípica da perda da capacidade da linhagem mutante em internalizar peptídeos. Porém, a linhagem mutante se mostrou sensível aos efeitos tóxicos do GSH, demonstrando que esse peptídeo pode estar sendo internalizado pela bactéria por uma via diferente do Opp ou que não exista a necessidade dele ser internalizado para ser tóxico à bactéria. Posteriormente, através de uma análise proteômica comparativa entre as proteínas extracelulares das linhagens selvagem e oppD mutante, utilizando 2-DE, foi gerado mapas protéicos que demonstraram a presença de 11 spots exclusivos na linhagem selvagem e 17 spots exclusivos na linhagem mutante. Esse resultado indica que o transportador Opp pode estar relacionado a algum processo de controle da expressão gênica em C. pseudotuberculosis. Por fim, para verificar se o transportador de peptídeos de C. pseudotuberculosis possui alguma relação com a virulência e patogenicidade dessa bactéria foram realizados ensaios in-vitro, de adesão e colonização de macrófagos, e in vivo, de infecção de camundongos BALB/c. Os resultados desses ensaios demonstraram que apesar da linhagem mutante possuir uma capacidade reduzida de aderir e infectar macrófagos em cultura durante a primeira hora de experimentação, ambas as linhagens apresentaram o mesmo potencial de causar morte, lesão, e de colonizar o baço de camundongos infectados. Através desse estudo podemos concluir que provavelmente a mutação do gene oppD não afetou a virulência da linhagem mutante. E que será necessário realizar o sequenciamento dos spots protéicos exclusivos de cada linhagem para que possamos inferir em quais processos celulares essas proteínas estão relacionadas
Abstract: Corynebacterium pseudotuberculosis is a Gram-positive, facultative intracellular parasite, which causes caseous lymphadenitis (CL), a chronic infectious disease in small ruminants, generating great economic losses for sheep and goat producers. Its worldwide occurrence, economic gravity and scarce information stimulate studies on the molecular basis of C. pseudotuberculosis virulence mechanisms. Among molecular factors associated to virulence of many pathogenic bacteria, the oligopeptide importers (Opp), which are multi sub-unitary protein complexes belonging to the ABC transporters family, can be highlighted. These Opp are located in the membrane and their main function is to capture peptides from the extracellular environment to serve as carbon and nitrogen source. In addition to their nutritional role, these peptides may also be used by Gram-positive bacteria as signaling molecules in a process of intercellular communication, which allows bacteria to coordinate the expression of certain genes in a population scale. The control of several cellular processes has been linked to the signal peptides communication system, which include: sporulation, conjugation, and virulence. In order to study the role of the peptide transporter (Opp) in the C. pseudotuberculosis bacterium, a mutant strain for the Opp transporter was constructed using a suicide plasmid. This strain was grown in the presence of the toxic peptide glutathione (GSH) with concentrations of 5mM and 10 mM in order to confirm the lack of ability of the mutant strain to internalize peptides. However, the mutant strain was sensitive to the toxic effects of GSH, showing that this peptide could be internalized by the bacteria through a different mechanism than Opp transport system or that it may not need to be internalized to be toxic to bacteria. In addition, a comparative proteomic analysis between the extracellular proteins from wild and mutant strains using 2-DE, made it possible to generate protein maps showing the presence of 11 unique spots for the wild strain and 17 unique spots for the mutant strain. This result indicates that the transporter Opp may be related to some regulation process of gene expression in C. pseudotuberculosis. Finally, to verify if the peptide transporter of C. pseudotuberculosis has any relation to its virulence and pathogenicity, in vitro tests, adhesion and colonization of macrophages in vivo and infection assays of BALB/c mouse were carried out. The results of these tests showed that although the mutant strain has a reduced capacity to adhere and infect macrophages in culture during the first hour of experimentation, both strains showed the same potential to cause death, injury, and to colonize the spleens of infected mice. As such, we can conclude for this study that the oppD gene mutation did probably not affect the virulence of the mutant strain of C. pseudotuberculosis and that the individual protein spots of each strain should be sequenced to infer to which cellular processes these proteins are related.
Subject: Corynebacterium pseudotuberculosis
Genetica molecular
Genética bacteriana
Virulência (Microbiologia)
Genética
language: Português
Publisher: Universidade Federal de Minas Gerais
Publisher Initials: UFMG
Rights: Acesso Aberto
URI: http://hdl.handle.net/1843/BUOS-8UAP67
Issue Date: 16-Mar-2012
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