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metadata.dc.type: Dissertação de Mestrado
Title: Análise da expressão de moléculas ancoradas ao glicosilfosfatidilinositol (GPI) em diferentes linhagens celulares, em pacientes com anemia aplásica e síndrome mielodisplásica
metadata.dc.creator: Juliana Maria Camargos Rocha
metadata.dc.contributor.advisor1: Silvana Maria Eloi Santos
metadata.dc.contributor.advisor-co1: Maria Luiza Silva
metadata.dc.contributor.referee1: Maria Luiza Silva
metadata.dc.contributor.referee2: Sandra Guerra Xavier
metadata.dc.contributor.referee3: Danielle Marquetti Vitelli Avelar
metadata.dc.description.resumo: A hemoglobinúria paroxística noturna (HPN) é definida como uma doença adquirida de células-tronco hematopoiéticas, rara, secundária a alterações genéticas que resultam na deficiência de síntese da molécula glicosilfosfatidilinositol (GPI) e consequente redução de expressão das proteínas de membrana ancoradas a esta molécula. O diagnóstico laboratorial baseia-se na detecção de células sanguíneas deficientes em proteínas ancoradas ao GPI, por citometria de fluxo. Pequenos clones celulares com fenótipo semelhante ao encontrado na HPN têm sido detectados em pacientes com anemia aplásica (AA) e síndrome mielodisplásica (SMD) e a sua presença tem sido associada à boa resposta ao tratamento imunossupressor. A utilização de técnicas sensíveis que propiciem a detecção de clones HPN pequenos é uma necessidade atual. Os objetivos deste estudo foram padronizar técnica de alta sensibilidade para detecção de células deficientes em proteínas ancoradas ao GPI, por citometria de fluxo, no Serviço de Medicina Laboratorial do Hospital das Clínicas/UFMG e pesquisar a presença de clones HPN em pacientes com AA e SMD. Amostras de sangue periférico de 20 pacientes com AA e 30 pacientes com SMD foram analisadas por citometria de fluxo, utilizando anticorpos monoclonais dirigidos aos antígenos CD16, CD24, CD55 e CD59 (neutrófilos); CD14 e CD55 (monócitos); e CD55 e CD59 (hemácias). Utilizou-se ainda aerolisina fluorescente (FLAER) na análise das populações de neutrófilos e monócitos. Marcadores de linhagem celular foram utilizados para seleção das populações de interesse. Foram incluídas amostras de sangue periférico de 20 voluntários adultos, que constituíram o grupo controle. Em 5 (25%) pacientes com AA foram identificadas células com fenótipo HPN, claramente distintas das células normais, nas três populações celulares estudadas. A deficiência de expressão das proteínas ancoradas ao GPI foi detectada por todas as combinações de reagentes incluídas no painel e a proporção de células HPN variou de 0,14 a 94,84% dos eventos analisados. Evidência clínica e laboratorial de hemólise intravascular foi descrita em apenas um paciente, sugerindo evolução de AA para HPN clássica. Células HPN não foram identificadas nas amostras dos pacientes com SMD. Observou-se, contudo, presença de neutrófilos hipogranulares e/ou monócitos imaturos em 53% dos pacientes, determinando sobreposição destas populações no gráfico SSC/CD45. Redução isolada de expressão dos antígenos CD14, CD16 e/ou CD55 nas células imaturas e displásicas foram observados em 50% destas amostras sem, entretanto, caracterizar o clone HPN, considerando os critérios de positividade estabelecidos. Desta forma, foi possível evidenciar as dificuldades técnicas e definir os cuidados necessários para a análise dos pacientes com SMD. Considerando o desempenho do reagente FLAER, observou-se reação intensa em neutrófilos e monócitos, propiciando separação clara e precisa entre células normais e células deficientes em GPI. Houve concordância total entre a marcação com FLAER e a expressão de proteínas ancoradas ao GPI. CONCLUSÃO: A análise multiparamétrica por citometria de fluxo apresenta sensibilidade e acurácia na detecção de pequenas proporções de células com fenótipo HPN, sendo adequada para a pesquisa de clones subclínicos em pacientes com AA e SMD. O reagente FLAER apresenta excelente desempenho na detecção de neutrófilos e monócitos com fenótipo HPN, podendo ser incluído em um painel mínimo para a triagem do clone HPN na rotina de um laboratório clínico.
Abstract: Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) is a rare acquired hematopoietic stem cell disorder, caused by genetic alterations that compromises the synthesis of glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor and results in deficiency of linked proteins. The laboratory diagnosis is based on the detection of blood cells deficient in GPI-anchored proteins by flow cytometry. Small PNH clones have been detected in patients with aplastic anaemia (AA) and myelodysplastic syndrome (MDS) and their presence has been associated to favorable response to immunosuppressive therapy. The use of sensitive assays for detection of small PNH clones is a current demand. Our goals were to develop a sensitive assay for detection of GPI-anchored proteins deficient cells, by flow cytometry, in the Laboratory Medicine Service of Hospital das Clínicas/UFMG and to investigate the presence of PNH clones in AA and MDS patients. Peripheral blood samples from 20 AA patients and 30 MDS patients were analyzed by flow cytometry using monoclonal antibodies to CD16, CD24, CD55 and CD59 (neutrophils); CD14 and CD55 (monocytes); CD55 and CD59 (erythrocytes). Fluorescent aerolysin (FLAER) was used to analyze neutrophils and monocytes.Lineage markers were used to select the cell populations of interest. The control group was represented by peripheral blood samples of 20 adult volunteers. PNH cells were detected in 5 (25%) AA patients. They were clearly distinct from normal cells in the three analyzed cell populations. The deficient GPI-anchored protein expression was detected by all combinations of reagents used and the proportions of PNH cells varied from 0.14 to 94.84% of the analyzed events. Clinical and laboratory evidence of intravascular hemolysis was present in only one patient, suggesting a case of AA that has evolved to classic PNH. PNH cells were not detected in blood samples of MDS patients. However, hypogranular neutrophils and/or immature monocytes were observed in 53% of the patients resulting in overlap between these two populations on the SSC/CD45 plot. In addition, single decreased expression/loss of CD14, CD16 and/or CD55 was observed on immature and dysplastic cells in 50% of these samples, which however was not interpreted as PNH cells, based on defined clone positivity criteria. Thereby, it was possible to identify the technical challenges and to define the procedures to evaluate samples of MDS patients. Concerning the FLAER performance, neutrophils and monocytes showed bright staining resulting in a clear distinction between normal cells and GPI deficient cells. The results showed total agreement between FLAER staining and GPI-anchored proteins expression. CONCLUSION: Multiparameter flow cytometry analysis offers high sensitivity and accuracy in the detection of subclinical PNH clones in the setting of AA and MDS. FLAER showsexcellent performance in the detection of PNH neutrophils and monocytes and may be used in a routine laboratory for screening of PNH clones.
metadata.dc.subject.other: Hemoglobinúria
Anemia aplástica
Paroxística/diagnóstico
Anemia
Antígenos CD55
Patologia
Citometria de fluxo
Síndromes mielodisplásicas
Análise Citogenética
Glicosilfosfatidilinositol
Técnicas de laboratório clínico
metadata.dc.language: Português
Publisher: Universidade Federal de Minas Gerais
metadata.dc.publisher.initials: UFMG
metadata.dc.rights: Acesso Aberto
URI: http://hdl.handle.net/1843/BUOS-96LF4H
Issue Date: 20-Feb-2013
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