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Type: Tese de Doutorado
Title: Envolvimento da proteína neuronal sensora de cálcio-1 (NCS-1) na sinalização muscarínica em células PC12
Authors: Melissa Monteiro Guimaraes
First Advisor: Marco Aurelio Romano Silva
First Co-advisor: Helton Jose dos Reis
First Referee: João Luciano de Quevedo
Second Referee: Antonio Lucio Teixeira Junior
Third Referee: Silvia Carolina Guatimosim Fonseca
metadata.dc.contributor.referee4: Renato Arruda Mortara
Abstract: A proteína Neuronal Sensora de Cálcio-1 (NCS-1) pertence à superfamília de proteínas apresentando domínios EF-hand com afinidade ao Ca2+. É expressa em neurônios e células neuroendócrinas onde modula a transmissão sináptica e plasticidade celular. Trabalhos descritos mostraram aumento da expressão da proteína NCS-1 no córtex pre-frontal de pacientes esquizofrênicos a partir de análises pós-morte sugerindo o envolvimento de NCS-1 nos mecanismos moleculares de regulação da transmissão dopaminérgica associados aos transtornos mentais. Entretanto, pouco se sabe a respeito da participação de NCS-1 na regulação da via de sinalização muscarínica. Neste trabalho foram verificados efeitos da superexpressão da NCS-1 em células PC12 (PC12- NCS-1) nos processos de liberação de glutamato, níveis de Ca2+ e dinâmica de fosfoinositídeos provocados pela ativação da via muscarínica. Foi observado que o estímulo com carbacol (CCH) (300mM) induziu liberação de glutamato tanto nas células PC12 selvagens (PC12-wt) quanto nas células PC12-NCS-1. Entretanto a liberação de glutamato foi maior nas células PC12-NCS-1 em comparação às células PC12-wt respectivamente (14.4 ± 1.8 e 8.3 ± 0.9 nmol/mg de proteína). Níveis aumentados de glutamato liberado pelas células PC12-NCS-1 estimuladas com CCH foram observados tanto na presença quanto na ausência do influxo de Ca2+. Além disso, níveis aumentados de InsP3 (663,0 ± 63,0 e 310.0 ± 39.0 % de fluorescência em U.A. ± EPM) e na [Ca2+]i (766.35 ± 35.0 e 687.8 ± 37.0 em nM ± EPM) foram observados nas células PC12-NCS-1 em comparação às células PC12-wt estimuladas com CCH (300mM) respectivamente. Padrões distintos na dinâmica intracelular de Ca2+ foram observados após o estímulo das células com CCH. Nas células PC12-NCS-1 foi observado um aumento na [Ca2+]i seguido de um decaimento rápido. Nas células PC12-wt foi observado um decaimento lento na [Ca2+]i característico de um platô. Tanto o aumento na formação de InsP3 quanto na liberação de glutamato foram bloqueados pela atropina (10mM) nas células PC12-NCS-1 estimuladas com CCH. Esses resultados indicam que o aumento da expressão de NCS-1 nas células PC12 induz facilitação da dinâmica de formação de segundos mensageiros e da liberação de glutamato dependente da ativação muscarínica. Essas evidências sugerem que a proteína NCS-1 poderia estar envolvida na amplificação de processos adaptativos da sinalização muscarínica associados a patofisiologia dos transtornos neurais.
Abstract: Neuronal calcium sensor-1 (NCS-1) belongs to the superfamily of EF-hand Ca2+ binding protein. Overexpression of NCS-1 was implicated on potentiation of synaptic transmission and plasticity in many experimental models. In this study we investigated the possible involvement of NCS-1 in the facilitation of glutamate release evoked by two distinct stimuli in the neuronal-like pheochromocytoma (PC12) cell: membrane depolarization induced by 60mM KCl and GPCR activation induced by 300ìM carbachol (CCH). Both KCl depolarization and G-protein coupled receptor activation by CCH evoked glutamate release from PC12 wild type cells (PC12-wt) and PC12 cells stable overexpressing NCS-1 (PC12-NCS-1) compared with control conditions. Both KCl depolarization and CCH stimulation were more efficient to evoke glutamate release from PC12-NCS-1 cells when compared with release evoked from PC12-wt cells. The increased glutamate release induced by CCH from PC12-NCS-1 cells was independent of extracellular calcium entry, however this effect was dependent on extracellular calcium influx when depolarized with KCl. At permeabilizing conditions both PC12-NCS-1 and PC12-wt stimulated with CCH were able to increase glutamate release compared with non-stimulated cells indicating that part of glutamate release could be originated from vesicles source. Thus, our results suggest together that the NCS-1 facilitation of glutamate release could respond to different stimuli and is related to the increase in intracellular calcium originated from the extracellular compartment when associated to depolarization stimuli and from intracellular stores when associated to GPCR activation.
Subject: Ácido glutamico
Células Cultura e meios de cultura
Farmacologia
Receptores muscarínicos/metabolismo
Sinalização do cálcio
Proteínas sensoras de cálcio neuronal
celulas PC 12
Transdução de sinal/fisiologia
language: Português
Publisher: Universidade Federal de Minas Gerais
Publisher Initials: UFMG
Rights: Acesso Aberto
URI: http://hdl.handle.net/1843/BUOS-9R6HWA
Issue Date: 19-Jun-2007
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