Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/1843/EJAO-8JKME8
metadata.dc.type: Tese de Doutorado
Title: Estudo dos ligantes da proteína prion celular com ênfase em estress inducible protein 1: modificação pós-traducional, tráfego e sinalização
metadata.dc.creator: Fabiana Andrade Caetano
metadata.dc.contributor.advisor1: Marco Antonio Maximo Prado
metadata.dc.contributor.advisor-co1: Vania Ferreira Prado
metadata.dc.contributor.referee1: Vilma Regina Martins
metadata.dc.contributor.referee2: Fabiola Mara Ribeiro
metadata.dc.contributor.referee3: Silvio Marques Zanata
metadata.dc.contributor.referee4: Marcus Vinicius Gomez
metadata.dc.description.resumo: A proteina prion celular (PrPC) constitui uma plataforma na membrana plasmatica capaz de interagir com diversos ligantes mediando a reuniao de complexos de sinalizacao na superficie celular. Um dos ligantes mais bem descritos para PrPC e a co-chaperonina Stress Inducible Protein1 ou STI1. STI1 e secretada por astrocitos e interage com PrPC na superficie neuronal induzindo neuritogenese e neuroprotecao por ativacao de vias de sinalizacao diferentes. Embora pouco se saiba sobre os mecanismos de secrecao de STI1, acredita-se que este processo e fundamental na regulacao das funcoes neurotroficas medidas pela interacao STI1- PrPC . A STI1 intracelular tem papel importante na reuniao do complexo Hsp70-Hsp90 sendo portanto, considerada uma proteina com funcoes intra e extracelulares. Na tentativa de elucidarmos mecanismos envolvido com as funcoes de STI1, novos ligantes de STI1 foram identificados em um ensaio de duplo hibrido. Dentre os principais ligantes, estao as proteinas da via de SUMOilacao, cujas interacoes de STI1 com os componentes desta via foram confirmadas neste trabalho. Nos mostramos que STI1 e SUMOilada por SUMO1 e SUMO3, sendo PIAS1 a E3 ligase especifica para este processo. A interacao de STI1 com PIAS1 e SUMO3 levou ao aumento da localizacao nuclear de STI1. Uma vez no nucleo, STI1 foi direcionada para os corpos PML (do ingles Pro-Myelocytic Leukaemia), de forma dependente de PIAS1, onde se co-localizou com SUMO1 e SUMO3. O estresse celular por Choque Termico nao induziu alteracoes na distribuicao celular de STI1, mesmo quando as proteinas da via de SUMOilacao foram co-expressas. Por outro lado, nos mostramos que o dano no DNA por irradiacao ionizante induziu o translocacao de STI1 para o nucleo, onde ela se co-localizou parcialmente com os Foci. Em conjunto os nossos resultados mostram que STI1 e preferencialmente modificada por SUMO3 e PIAS1. O seu direcionamento para os corpos PML, mediado por PIAS1, e translocacao nuclear induzido por estresse genotoxico sugerem o envolvimento de STI1 na via de reparo ao DNA. Tendo em vista a alteracao na distribuicao celular induzida pela sua interacao com as proteinas da via de SUMOilacao, novos estudos estao sendo realizados para avaliar o papel desta via sobre a secrecao de STI1. Em relacao ao contexto extracelular, nos mostramos que STI1 ao se ligar a PrPC na membrana induz a internalizacao desta ultima proteina. A internalizacao de PrPC foi fundamental para a regulacao da ativacao de ERK1/2, mas nao de PKA, induzida pela sua interacao com STI1. STI1 tambem foi endocitada, de forma independente da presenca de PrPC. Atraves de microscopia em tempo real, utilizando marcadores de vias endociticas, nos mostramos que STI1 e internalizada por duas vias: parte de STI1 e internalizada por vias dependentes de lipide rafts, enquanto uma segunda fracao e internalizada pela via classica, dependente de clatrina. Uma vez internalizada STI1 segue uma via intracelular distinta daquela vista para PrPC, sendo diretamente direcionada para vesiculas acidicas sem passar pelos endosomas primarios. Imagens em tempo real de celulas transfectadas com GFP- PrPC, perfundidas com STI1 fluorescente, confirmaram a natureza transiente da interacao entre estas proteinas na membrana celular e em vesiculas, sugerindo que o trafego de PrPC induzido por STI1 regula a duracao da sinalizacao mediada por estas proteinas. O uso de bloqueadores da endocitose (K44A e AP180-C) permitiu a visualizacao de forte co-localizacao entre estas proteinas na membrana plasmatica. A endocitose de PrPC ocorre via a ligacao com o receptor transmembrana LRP1, que dirige PrPC para vesiculas cobertas com clatrina. Utilizando o ligante de LRP1, RAP, nos mostramos o bloqueio da ativacao de ERK1/2 induzida pela interacao STI1-PrPC. Este resultado sugere que LRP1 seja a ponte que conecta o estimulo extracelular com as vias de sinalizacao intracelulares, atraves da sua participacao na endocitose de PrPC. Ainda explorando a internalizacao de PrPC, nos tambem mostramos que os oligomeros AÀ alteram o seu trafego. Porem, ao contrario de STI1, AÀ induziu um aumento de PrPC na superficie celular. Futuros experimentos serao necessarios para revelar a implicacao deste resultado nos efeitos neurotoxicos mediados pela interacao AÀ-PrPC. Concluindo, os nossos resultados mostram que STI1 exerce varios papeis na regulacao do sistema nervoso. Alem disso, o trafego de PrPC parece ser um mecanismo dinamico que pode ser rapidamente regulado por uma serie de ligantes para modular o funcionamento do sistema nervoso. Esses resultados sugerem que STI1 e PrPC tem papeis nao antecipados na funcao neuronal.
Abstract: The cellular prion protein (PrPC) is a dynamic platform for the assembly of signalling modules at the cell surface. One of the best described ligand of PrPC is the co-chaperonine Stress Inducible Protein1 or STI1. This protein is secreted by astrocytes and interacts with PrPC at neuronal surface inducing neuritogeneses and neuroprotection through different signaling pathways. Although the mechanisms urderlying STI1 secretion are still poorly understood, it is believed that this process is important for modulation of neurotrophic functions mediated by STI1-PrPC interaction. The intracellulat STI1 also has an important role in the assembly of HSP70-HSP90 complex. Therefore, STI1 is considered a protein with intra and extracellular functions. To further investigate the mechanisms involved with STI1 functions, new ligands were identified in a yeast two hybrid screening. Amongst them, we found several proteins involved with the SUMOylation pathway, whose interaction with STI1 were confirmed in this work. We have shown that STI1 is SUMOylated by SUMO1 and SUMO3, and PIAS1 is the specific E3 SUMO ligase for this process. The interaction between STI1 and PIAS1 or SUMO3 promoted an increase in the nuclear localization of STI1. Once in the nucleus, STI1 was directed to PML bodies (Pro Myelocytic Leukaemia bodies) in a PIAS1 dependent process. In these structures STI1 was observed co-localized with SUMO1 and SUMO3. The cellular stress by Heat Shock did not induce alterations on STI1 intracellular distribution, even when proteins from the SUMOylation pathway were over expressed. On the other hand, we showed that the DNA damage by ionizing irradiation induced the translocation of STI1 to the nucleus, where this protein partly co-localizes with Foci. Combined, our results show that STI1 is preferentily modified by SUMO3 and PIAS1. STI1 targeting to PML bodies mediated by PIAS1 and nuclear translocation induced by genotoxic stress strongly suggest its participation in the DNA repair pathway. Considering the alteration in STI1 intracellular distribution induced by proteins from the SUMOylation pathway, new experiments are being peformed to better evaluate the involvement of this pathway in STI1 secretion. In relation to the role of STI1 in the extracellular environment, we have shown that STI1 binds to PrPC at the cell surface and induces its internalization. This process was specific and critical for regulation of ERK1/2, but not PKA activation, which is mediated by STI1-PrPC interaction. STI1 was also internalized by cells in a PrPC-independent way. Using real-time microscopy and several endocitic markers, we showed that STI1 is internalized by two main pathways: part of STI1 is endocited through a lipid raft-dependent pathway, whereas another fraction is internalized via a clathrin-mediated pathway. Once internalized, STI1 takes a distinct intracellular route from that described for PrPC. STI1 is directed to acidic vesicles bypassing early endossomes. Real time images of GFP-PrPC transfected cells perfused with fluorescent STI1 showed that the interaction between these proteins at the cell surface and in vesicles has a transient nature, suggesting that the trafficking of STI1 regulates the duration of signalling through PrPC. By using endocytosis inhibitors (dynamin K44A and AP180-C), we were able to visualize strong co-localization between STI1 and PrPC at the plasmatic membrane. PrPC endocytosis occurs through interaction with the membrane receptor LRP1. We used the LRP1 ligand RAP to block its interaction with PrPC. We noticed the block of the ERK1/2 activation mediated by STI1-PrPC interaction in cells treated with RAP. This result suggests that LRP1 can be part of the transmembrane complex connecting the extracellular stimulus with the intracellular signalling. A¥â peptides are the major culprits in Alzheimer.s disease and have recently been shown to bind to PrPC. We examined if A¥â oligomers affected PrPC trafficking. We find that in contrast to the STI1 effect, A¥â induced an increase in PrPC at cell surface, by blocking the constitutive endocytosis of PrPC. New experiments will be necessary to elucidate the implication of this result upon neurotoxicity mediated by A¥â peptids. In conclusion, our results show that STI1 has different roles in regulation of CNS. Moreover, PrPC trafficking seems to be a dynamic mechanism which can be quickly regulated by several ligands to modulate neuronal homeostasis. These results suggest that STI1 and PrPC have unantecipated roles in neuronal function.
metadata.dc.subject.other: Prions
Farmacologia
Stress
metadata.dc.language: Português
Publisher: Universidade Federal de Minas Gerais
metadata.dc.publisher.initials: UFMG
metadata.dc.rights: Acesso Aberto
URI: http://hdl.handle.net/1843/EJAO-8JKME8
Issue Date: 24-Sep-2010
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