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http://hdl.handle.net/1843/SFSA-9H7RQH| Tipo: | Tese de Doutorado |
| Título: | Análise estrutural e topológica de peptídeos bioativos em meios biomiméticos de membranas |
| Autor(es): | Victor Hugo de Oliveira Munhoz |
| primer Tutor: | Dorila Pilo Veloso |
| primer Co-tutor: | Antonio Flavio de Carvalho Alcantara |
| primer miembro del tribunal : | Burkhard Bechinger |
| Segundo miembro del tribunal: | Ana Carolina de Mattos Zeri |
| Tercer miembro del tribunal: | Fabio Ceneviva Lacerda Almeida |
| Cuarto miembro del tribunal: | Rosemeire Brondi Alves |
| Quinto miembro del tribunal: | Jose Dias de Souza Filho |
| Resumen: | Este trabalho consiste no estudo de estrutura e interação com meios miméticos de membrana dos peptídeos antimicrobianos Distinctina, heterodímero composto de duas cadeias polipeptídicas (cadeia 1 e cadeia 2) ligadas covalentemente por meio de uma ligação de dissulfeto entre resíduos de cisteína, e isolada de secreções epiteliais de anuros da espécie Phyllomedusa distincta, nativa da Mata Atlântica brasileira; Hilaseptina P2 (HSP2) e das fenilseptinas, constituídas pelo par de epímeros [L-Phe2]-Fenilseptina (L-Phes) e [D-Phe2]-Fenilseptina (DPhes), todas as três isoladas de glândulas epiteliais de anuros da espécie Hypsiboas punctatus, nativa da Floresta Amazônica. Todos esses peptídeos apresentam considerável atividade contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e, por isso, há interesse em se estudar o mecanismo pelo qual essas substâncias exercem essa atividade biológica. O modelo de mecanismo mais aceito para esse tipo de peptídeo, denominado modelo de Shai-Matsuzaki-Huang (Matsuzaki, 1999; Shai, 1999; Huang, 2000; Yang, 2000; Papo, 2005) leva em conta forte influência da estrutura dos peptídeos sobre suas atividades biológicas. Tendo isso em vista, surge a necessidade de se estudar as estruturas dessas biomoléculas para se elucidar o mecanismo de suas atividades antimicrobianas. Os peptídeos em questão foram estudados a nível estrutural utilizando-se técnicas de Dicroísmo Circular (CD) e Ressonância Magnética Nuclear (RMN) em solução. Resultados mostraram que todos eles apresentam estruturas terciária ordenadas, ricas em a-hélice e de caráter altamente anfipático. O modelo estrutural do peptídeo distinctina, embora tenha apresentado ordenação considerável levando-se em conta cada cadeia monomérica separadamente, não apresenta orientação relativa entre as duas cadeias muito bem definida. Resultados de CD, no entanto, indicam forte estruturação a-helicoidal, tanto do heterodímero quanto de suas cadeias monoméricas individuais, apesar de sugerir que a interação peptídeo fosfolipídeo se dá por meio de um equilíbrio envolvendo mais de dois estados. Para a HSP2, resultados de CD em vesículas unilamelares e RMN em 2,2,2-trifluoretanol (TFE) mostraram alto conteúdo de a-hélice e os modelos obtidos a partir da RMN apresentam ainda alto grau de anfipaticidade. Estudos de RMN em DPC das fenilseptinas levaram a modelos também ricos em a-hélice, sendo que a D-Phes mostrou grau de estruturação ligeiramente maior que a L-Phes. Os experimentos de RMN em fase sólida foram realizados para a HSP2 e as fenilseptinas, com amostras mecanicamente orientadas contendo bicamadas do fosfolipídeo 1-palmitoil-2- oleoilfosfatidilcolina (POPC) e os respectivos peptídeos seletivamente marcados com 15N e 2H. A partir da medição de propriedades anisotrópicas como deslocamento químico de 15N e desdobramento quadrupolar de 2H, foi possível determinar as possíveis orientações das estruturas calculadas com base nos dados de RMN em solução e inferir a respeito da maneira pela qual a interação peptídeo-membrana ocorre. Para a HSP2, a análise conjunta dos resultados de RMN em solução e em fase sólida mostrou que o peptídeo interage fortemente com a bicamada, de forma que sua face hidrofóbica está em contato direto com o interior alifático da estrutura fosfolipídica e orientado quase totalmente paralelo à superfície da bicamada. Os epímeros L-Phes e D-Phes, embora tenham estruturas terciárias próximas, mostraram orientações bastante diferentes entre si, evidenciando que os peptídeos interagem com membrana de formas distintas. Uma outra parte do trabalho diz respeito aos estudos termodinâmicos da interação peptídeo-lipossoma da HSP2 por meio da técnica de Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC). Esses estudos mostraram que a interação em questão é fortemente dependente da concentração do peptídeo no meio e que, apesar de possuir um caráter mais eletrostático em um momento inicial, que envolve a aproximação do peptídeo com a membrana, ela é mantida principalmente por interações do tipo hidrofóbicas entre os resíduos de cadeia lateral apolares e o interior alifático da bicamada fosfolipídicas. A análise conjunta de todos os resultados obtidos por diferentes metodologias permitiu construir um modelo mais detalhado para a interação entre o peptídeo e a membrana bacteriana. |
| Abstract: | This work consists of studies on the structure and interactions with membrane-mimetic media of the antimicrobial peptides distinctin, an heterodimer composed of two peptide chains (chain 1 and chain 2) covalently bonded through a dissulfide bond and isolated from the skin ofPhyllomedusa distincta anurans, native from the Brazilian Atlantic Forest; Hylaseptin P2 (HSP2) and the phenylseptins [L-Phe2]-Phenylseptin (L-Phes) and [D-Phe2]-Phenylseptin (D-Phes), all three isolated from Hypsiboas punctatus anurans, found on the Amazon tropical forest. All these peptides show considerable activity against both Gram-positive and Gram-negative bacteria, reason why there is growing interest in better understanding the mechanistic pathway these molecules follow on exerting their biological activities. The most widely accepted model for such mechanism is the Shai-Matsuzaki-Huang model (Matsuzaki, 1999; Shai, 1999; Huang, 2000; Yang, 2000; Papo, 2005), which takes into account a strong influence of the peptides structures on theirbiological activities. Hence the need to study these peptides on a structural level in order to propose a consistent model. The aforementioned peptides had their structures studied and determined by means of Circular Dichroism (CD) and solution Nuclear Magnetic Resonance (NMR). The results showed that all peptides presented well-ordered tertiary structures, all of them also quite rich on a-helicalsecondary structure and with a sharp amphipathic character. Distinctins structural model, albeit showing considerable ordering when taking into account each monomeric chain separately, did not present a very well-defined overall orientation of one chain in relation to the other. The CD results, however, indicated stark a-helical structuration for both the chains as well as for the heterodimer, although it suggests that the interaction between the peptide and the phospholipid is better described as an equilibrium with more than two states. For the HSP2, the results of the CD experiments on small unilamelar vesicles and the NMR experiments in 2,2,2-triluoroethanol (TFE) showed a high content of a-helix and the models derived from the NMR data also showeda sheer amphipathic character. For the phenylseptins, the NMR experiments in DPC also led to a-helix-rich structures, being that D-Phes showed a slightly higher structuration degree than LPhes. The solid-state NMR experiments were performed for HSP2 and the two phenylseptins,with mechanically-oriented samples containing 1-palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholine (POPC) bilayers and the peptides selectively-labeled with 15N and 2H. From the measurements of anisotropic properties such as 15N chemical shifts, and 2H quadrupolar splitting, it was possible to calculate the possible orientations for the structure determined from the solution NMR data. ForHSP2, the concomitant analysis of both solid-state and solution NMR results showed that the peptide interacts strongly with the bilayer, in way such that its hydrophobic side is in direct contact with the phospholipids aliphatic chains and in a quasi-paralell orientation in relation tothe bilayers surface. The epimers L-Phes and D-Phes, albeit showing very similar tertiary structures, their calculated orientations are significantly different, which suggests that these peptides interact with the bilayer in distinct manners when comparing one to the other.Another part of this work comprises the study of the HSP2 peptide-lyposome interactions thermodynamics through Isotermal Titration Calorimetry (ITC). These studies showed that the interaction in question is strongly dependent on the concentration of the peptideon the media and that, in spite of having a sharp electrostatic character at an initial moment which consist on the approximation of the peptide to the membrane, it is mostly maintained by hydrophobic interactions between the non-polar sidechains and the membranes hydrophobiccore. The analysis of these results together with the NMR ones, allowed us to build a more complete and detailed model for the interaction between the peptide and the bacterial membrane. |
| Asunto: | Ressonância magnética nuclear Membranas (Biologia) Química orgânica Peptídios |
| Idioma: | Português |
| Editor: | Universidade Federal de Minas Gerais |
| Sigla da Institución: | UFMG |
| Tipo de acceso: | Acesso Aberto |
| URI: | http://hdl.handle.net/1843/SFSA-9H7RQH |
| Fecha del documento: | 24-feb-2012 |
| Aparece en las colecciones: | Teses de Doutorado |
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