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Type:	Tese
Title:	Família MASP de Trypanosoma cruzi: expressão gênica, variabilidade antigênica e participação na infectividade do parasito
Authors:	Ana Carolina de Araújo Leão
First Advisor:	Daniella Castanheira Bartholomeu
Abstract:	Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas (DC), é uma espécie heterogênea com alta diversidade genética e fenotípica, que circula entre insetos vetores e diferentes espécies de hospedeiros mamíferos. O sequenciamento do genoma do clone CL Brener de T. cruzi revelou que há uma expansão massiva de genes que codificam para famílias de proteínas de superfície, como as trans-sialidases, mucinas, gp63 e as MASPs. MASP compõem a segunda maior família multigênica de T. cruzi, com cerca de 1400 membros, o que sugere que esta família seja de grande importância para a biologia do parasito. As proteínas MASP contêm domínios N- e C- terminais altamente conservados que são removidos da proteína madura e uma região central extremamente variável, exposta na superfície do parasito. O elevado grau de polimorfismo da família MASP associado com a sua localização na superfície de formas infectivas de T. cruzi sugere que MASP participe de mecanismos de interação hospedeiro-parasito. Neste contexto, este trabalho tem como objetivo aprofundar os estudos sobre a expressão gênica, antigenicidade, além de investigar o possível envolvimento de MASP na infectividade de T. cruzi. Inicialmente, os membros da família foram divididos em 7 subgrupos baseados em similaridade de sequência proteica e o membro mais representativo de cada subgrupo foi escolhido para expressão heteróloga. Estas proteínas denominadas M1, M2, M3, M4, M5, M6 e M7 foram acopladas a diferentes beads fluorescentes e utilizadas em ensaios uniplex e multiplex de citometria de fluxo com soros de camundongos infectados com T. cruzi ao longo da fase aguda. Esta técnica apresentou alta sensibilidade e permitiu diferenciar a reatividade de cada MASP ao longo da infecção em um único ensaio. Na segunda parte do trabalho, foi realizada a análise da expressão e variabilidade antigênica de MASP. A seleção dos membros utilizados nesta etapa foi baseada nos níveis de expressão por RNA-seq e predição de antigenicidade, assim foram selecionadas as proteínas MASPs M9, M12, M13, M14, M18, M19 e M20. Anticorpos policlonais contra estas proteínas foram gerados e a expressão em células individuais analisada em ensaios de citometria de fluxo e imunofluorescência realizados utilizando tripomastigotas de CL Brener. Os resultados demonstraram que estas MASP não são expressas na superfície de todos parasitos na população e que estes anticorpos marcaram parasitos na população com diferentes intensidades, provavelmente devido ao compartilhamento de epítopos polimórficos que existe entre as proteínas de MASP. O próximo passo foi a produção de anticorpos monoclonais (mAb) contra membros M2, M14 e M18. Os mAbs anti-M2 e anti-M14 foram usados para enriquecer uma população de tripomastigotas para a expressão de M2 e M14, respectivamente, e os parasitos enriquecidos utilizados em ensaios de infecção experimental de camundongos em comparação com a população WT não enriquecida. Os resultados demonstraram um perfil bem distinto entre as curvas de parasitemia das populações enriquecidas em comparação a dos camundongos WT, indicando que a expressão mais homogênea de MASP na população de parasitos facilita o controle da infecção por parte do hospedeiro. Por fim, foi investigada a influência de diferentes proteínas de MASP na invasão de células hospedeiras. Foi realizado um ensaio de ligação de MASP em células L6 e resultados sugerem que alguns membros de MASP são capazes de se ligar na superfície da célula hospedeira. Ensaios de invasão com células L6 também foram realizados e, após o tratamento com as proteínas recombinantes de MASP M2, M13, M18 e M19, a infecção por T. cruzi nestas células foi reduzida de maneira significativa.
language:	por
metadata.dc.publisher.country:	Brasil
Publisher:	Universidade Federal de Minas Gerais
Publisher Initials:	UFMG
metadata.dc.publisher.program:	Programa de Pós-Graduação em Parasitologia
Rights:	Acesso Aberto
URI:	http://hdl.handle.net/1843/30022
Issue Date:	24-Apr-2019
Appears in Collections:	Teses de Doutorado

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