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http://hdl.handle.net/1843/30688| Type: | Dissertação |
| Title: | Caracterização funcional do gene Hus1 de Trypanosoma cruzi |
| Authors: | Héllida Marina Costa Silva |
| First Advisor: | Carlos Renato Machado |
| First Co-advisor: | Ceres Luciana Alves |
| First Referee: | Débora de Oliveira Lopes |
| Second Referee: | Ronaldo Alves Pinto Nagem |
| Abstract: | A resposta ao dano de DNA (DDR) é um mecanismo coordenado de sinalização do dano, no qual a detecção da lesão leva à parada do ciclo celular e o recrutamento da maquinaria de reparo. Uma das vias da DDR é ativada pela cinase ATR. Em resposta à replicação parada, o complexo 9-1-1, formado por Rad9, Rad1 e Hus1, é carregado para regiões de DNA de fita simples recobertas pela proteína RPA. A presença de 9-1-1 facilita o recrutamento de TopBP1, ativador alostérico de ATR. ATR ativa é capaz de fosforilar a cinase Chk1 que, por sua vez, fosforila e inativa Cdc25, promovendo o checkpoint de replicação e a parada do ciclo celular. Estudos em Leishmania major sugerem a associação entre Hus1 e o aumento da capacidade desse parasito em lidar com o estresse replicativo. Os mecanismos envolvidos na resposta ao estresse replicativo não estão elucidados em Trypanosoma cruzi. Dessa forma, este trabalho visou caracterizar o gene Hus1 de T. cruzi, o parasito causador da doença de Chagas. Para estudar a função de TcHus1 foi construída uma linhagem de T. cruzi com níveis aumentados deste gene. Assim, formas epimastigotas da cepa CL Brener foram transfectadas com o vetor pROCKhigro contendo o gene TcHus1. A análise do perfil de crescimento do parasito superexpressor em condições normais de cultivo, sugeriu que a expressão elevada desse gene não compromete as funções básicas da célula. Também foi analisado o perfil de crescimento dos parasitos quando submetidos ao tratamento com agentes genotóxicos causadores de estresse replicativo. Os tratamentos realizados com benzonidazol, cisplatina, camptotecina, hidroxiureia e metil metano sulfonato (MMS) não apresentaram diferença no perfil de crescimento da célula superexpressora de TcHus1 quando comparada com as células controle. Contudo, a reação de PCR quantitativa em tempo real de células submetidas ao tratamento com MMS mostrou que apenas os parasitos pROCK-Hus1 foram capazes de aumentar a expressão de Hus1 em resposta ao estresse replicativo gerado pelo MMS. Os resultados apresentados neste trabalho não permitem concluir se a função do gene Hus1 de T. cruzi é promover a ativação da cinase de checkpoint ATR, como descrito nos demais eucariotos. Mais estudos serão necessários para compreender a função e a importância dessa via na manutenção da integridade do genoma desse protozoário. |
| Abstract: | The DNA damage response (DDR) is a coordinated mechanism of damage signaling, in which lesion detection leads to cell cycle arrest and recruitment of repair machinery. One branch of the DDR is activated by the ATR kinase. In response to replication arrest, the 9-1-1 complex, formed by Rad9, Rad1 and Hus1, is loaded into single strand DNA regions covered by RPA. The presence of 9-1-1 facilitates the recruitment of TopBP1, allosteric activator of ATR. Active ATR is capable of phosphorylating the Chk1 kinase which in turn phosphorylates and inactivates Cdc25, promoting replication checkpoint and cell cycle arrest. Studies in Leishmania major suggest an association between Hus1 and increased capacity of this parasite in dealing with replicative stress. The mechanisms involved in the replicative stress response are not elucidated in Trypanosoma cruzi. Thus, this study aimed to characterize the Hus1 gene in T. cruzi, the parasite that causes Chagas disease. To study TcHus1 function was constructed a T. cruzi strain with increased levels of this gene. Thus, epimastigotes of CL Brener strain were transfected with the vector pROCKhigro containing the gene TcHus1. The analysis of overexpressor parasite growth profile under normal culture conditions suggested that overexpression of this gene does not compromise the basic functions of the cell. The growth profile of the parasites treated with replicative stress inducing drugs was analyzed. The treatment with benznidazole, cisplatin, camptothecin, hydroxyurea and methyl methane sulfonate (MMS) showed no difference in the growth profile between TcHus1 overexpressing cells and control cells. However, the quantitative real time PCR reaction of MMS treated cells showed that only pROCK-Hus1 parasites were able to increase Hus1 expression in response to replicative stress generated by MMS. The results presented in this study do not allow to conclude whether the function of Hus1 gene in T. cruzi is to promote the activation of the checkpoint kinase ATR, as describing in other eukaryotes. More studies are needed to understand the role and the importance of this pathway in the maintenance of genome integrity on this protozoan. |
| Subject: | Bioquímica Dano ao DNA Trypanosoma cruzi Genes cdc |
| language: | por |
| metadata.dc.publisher.country: | Brasil |
| Publisher: | Universidade Federal de Minas Gerais |
| Publisher Initials: | UFMG |
| metadata.dc.publisher.department: | ICB - INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLOGICAS |
| metadata.dc.publisher.program: | Programa de Pós-Graduação em Bioquímica e Imunologia |
| Rights: | Acesso Aberto |
| metadata.dc.rights.uri: | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/pt/ |
| URI: | http://hdl.handle.net/1843/30688 |
| Issue Date: | 20-Feb-2015 |
| Appears in Collections: | Dissertações de Mestrado |
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| Dissertação - Héllida Marina Costa Silva COM ATA.pdf | Aberto | 4.29 MB | Adobe PDF | View/Open |
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