Exploring the CRISPR-Cas9 potential to revert beta-lactam resistance in clinically relevant gram-negative bacteria

Abstract

A crise de resistência bacteriana a antimicrobianos (AMR) torna necessária o desenvolvimento de medidas efetivas para a redução da disseminação de genes de resistência transmitidos por plasmídeos, cenário em que os patógenos oportunistas da família Enterobacteriaceae apresentam um papel relevante. O sistema CRISPR-Cas9 representa uma abordagem inovadora e efetiva para combater a AMR, o qual foi recentemente empregado para a total eliminação de plasmídeos em linhagens laboratoriais de Escherichia coli. Nesta tese, este sistema foi amplamente explorado, tendo como alvo o gene de resistência blaTEM-1 tanto localizado em um plasmídeo de alto número de cópias (> 100 cópias / célula) quanto presente em isolados clínicos. Além disso, o gene blaKPC, prevalente em amostras multirresistentes, também foi utilizado como alvo para o CRISPR-Cas9, em isolados clínicos bacterianos. Sabe-se que as linhagens clínicas da família Enterobacteriaceae possuem múltiplos mecanismos de resistência que podem prejudicar a eficiência do sistema. Além disso, os níveis de resistência são diretamente dependentes do número de cópias do plasmídeo. Assim, o objetivo desta tese foi explorar ainda mais a tecnologia CRISPR-Cas9 em condições desafiadoras, isto é, na presença de plasmídeos de alto número de cópias e para reverter resistência em isolados clínicos. Com isso, o presente estudo visa contribuir para o esclarecimento de todos os possíveis cenários obtidos com a aplicação do sistema CRISPR-Cas9 na redução da resistência, a fim de consolidá-la como um método alternativo para neutralizar a AMR. Utilizando técnicas independentes como citômetro de fluxo (FACS), qPCR e microscopia de fluorescência, foram verificados níveis baixos de manutenção de plasmídeos nas células após a inserção do CRISPR-Cas9. No entanto, mesmo detectando a integridade do plasmídeo, a sequência do gene blaTEM-1 se encontrava alterada, resultando em uma 18 disfunção da proteína transcrita e, portanto, em um clone sensível a antibióticos. No isolado clínico de E. coli, CRISPR-Cas9 foi responsável pela completa remoção do plasmídeo, juntamente com a re-sensibilização bacteriana a cinco beta-lactâmicos. Antibióticos puderam ser reutilizados com eficácia para tratar larvas da espécie Galleria mellonella infectadas com clones de isolados clínicos de E. coli previamente tratados com CRISPR-Cas9. De forma contrária, baixos níveis de sobrevivência foram obtidos em larvas infectadas com o isolado clínico não tratado pelo CRISPR-Cas9. Os níveis de sensibilidade a antimicrobianos também aumentaram em isolados clínicos de Enterobacter cloacae e, em menor grau, em Klebsiella variicola, ambos contendo também o gene blaCTX-M. Ao alterar o alvo para o gene blaKPC, foi possível obter uma redução da resistência a imipenem para o nível intermediário em 63% dos clones de Klebsiella oxytoca. Curiosamente, em ambos os clones resistentes e com sensibilidade intermediária, uma redução no número de cópias do plasmídeo, bem como na expressão gênica do blaKPC foi obtida. Além disso, os níveis de fitness bacteriano também foram significativamente reduzidos quando clones com sensibilidade intermediária ou ainda resistentes foram comparados ao controle, este não tratado pelo CRISPR-Cas9. Apesar disso, nenhum impacto in vivo pôde ser alcançado quando larvas de G. mellonella infectadas com diferentes clones de K. oxytoca foram tratadas com imipenem. Finalmente, um sistema funcional de entrega do CRISPR-Cas9 por meio de bacteriófagos foi desenvolvido, ampliando as possibilidades de aplicabilidade da técnica. Para concluir, nossos dados demonstraram que as linhagens tratadas pelo CRISPR-Cas9 não foram capazes de evadir eficientemente do sistema e manter o fenótipo de resistência por meio de amplificação do plasmídeo. Apesar dos desafios versáteis impostos pelos isolados clínicos, a interferência por meio do CRISPR-Cas9 nos genes de resistência levou tanto a aumentos marginais quanto significativos na sensibilidade a 19 antimicrobianos. A superexpressão de bombas de efluxo ou alterações nas porinas nos isolados clínicos, caso tenham ocorrido, não impediram a redução da resistência. Além disso, todos os possíveis resultados obtidos pelo CRISPR-Cas9 quando usado para reduzir AMR, isto é, eliminação total do plasmídeo; ruptura do gene de resistência; ou redução do número de cópias do plasmídeo, impactam diretamente na transferência horizontal de genes. Tendo em vista o fato de que a resistência antimicrobiana se espalhou globalmente, gerando graves impactos na vida humana, os resultados deste estudo fornecem detalhes relevantes sobre o uso do CRISPR-Cas9 como uma ferramenta alternativa para reduzir a resistência em bactérias clinicamente relevantes.