Evaluation of the LyeTx I-b synthetic peptide derived from spider venom as a potential antitumoral prototype: pharmacological and toxicological studies

Abstract

Os peptídeos antimicrobianos apresentam um amplo espectro de aplicações terapêuticas, incluindo seu uso como peptídeos anticâncer. Estes peptídeos têm como alvo células microbianas, normais e cancerígenas. Neste trabalho, demonstramos pela primeira vez os efeitos citotóxicos do peptídeo antimicrobiano catiônico alfa-helicoidal, LyeTx I-b, sobre a linhagem de glioblastoma U87-MG, que está associado a um mecanismo membranolítico. A perda de integridade da membrana ocorreu após a incubação com o peptídeo por 15 minutos, observado pela captação de azul de tripan, redução da conversão de calceina-AM e liberação de LDH. Estudos morfológicos utilizando microscopia eletrônica de varredura demonstraram uma rápida ruptura da membrana plasmática de células tratadas com LyeTx I-b, incluindo a formação de orifícios ou poros. Análises por microscopia eletrônica de transmissão mostraram núcleos inchados com leve condensação de DNA, aumento do volume celular com citoplasma eletron-lucente e vacuolização de organelos, mas sem a ruptura de membranas nucleares ou plasmáticas. Análises morfométricas revelaram uma alta porcentagem de células em estágios de necroptose, seguidas de necrose e apoptose em níveis mais baixos. A necrostatina-1, um inibidor especifico de necroptose, protegeu parcialmente as células da toxicidade do péptido de um modo dependente da concentração. Estudos de citometria de fluxo por imagem confirmou que 59% das células tratadas com o peptide estavam em necroptose após 3 horas de incubação com o peptídeo. Ademais, o LyeTx I-b apresentou citotoxicidade para linhagens celulares não tumorais derivadas de rim embrionário humano (HEK293), fibroblasto (GM637), cérebro (Luhmes), PBMC e atividade hemolítica em eritrócitos humanos. Outros dados in vitro também demonstraram a citotoxicidade deste peptídeo catiônico contra linhagens de células de câncer de mama de humanos e camundongos (MCF-7, MDA-MB-231 e 4T1, respectivamente) em baixa concentração micromolar (<10 μM). O peptideo induziu morte por apoptose em células 4T1, observado pelo aumento de fragmentação do DNA e marcação com anexina-V, além de reduzir a sobrevivencia clonogenica das mesmas. Considerando estes achados, avaliou-se o efeito in vivo deste peptídeo utilizando o modelo de câncer de mama triplo-negativo 4T1 em camundongos, quanto à toxicidade e potencial antineoplásico. Avaliou-se a toxicidade sub-aguda do péptido LyeTx I_b in vivo, e os camundongos BALB/c tratados com o péptideo LyeTxI_b não apresentaram lesão ou alterações significativas no pulmão, rim, baço, coração, cérebro e fígado, após análise histopatológica. No entanto, o peptideo LyeTx I-b diminuiu o volume e o peso do tumor, o tamanho e numero de focos metastáticos nos animais portadores de tumor 4T1. Adicionalmente, após tratamento dos animais com o péptideo LyeTx I-b foi observada uma redução significativa de neutrófilos, eosinófilos e monócitos circulantes. Usando microscopia intravital, encontramos um aumento notável de leucócitos rolando e redução da adesão de leucócitos após o tratamento com o peptídeo LyeTx I-b na medula espinhal e vasos tumorais de animais portadores de tumor 4T1. A quantificação de citocinas e dos fatores de crescimento tumoral por ELISA revelaram que os grupos tratados com LyeTx I-b e carboplatina apresentaram uma redução significativa na expressão de TGF-β no tumor e no baço, e supressão de IL-1 β no pulmão e tumor. Além disso, o peptídeo LyeTx I-b induziu um aumento da citocina anti-inflamatória IL-10 no tumor. Em resumo, nossos dados in vitro e in vivo sugerem que o peptídeo LyeTx-I-b pode ser um protótipo interessante para o desenvolvimento de um quimioterápico antitumoral, com um potencial imunomodulador.