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Type:	Tese
Title:	Estudo do potencial biotecnológico da proteína SmKI-1 do Schistosoma mansoni: aplicabilidade de seu domínio Kunitz como uma molécula anti-inflamatória e de seu domínio C-terminal como candidato à uma vacina anti-esquistossomótica
Authors:	Fábio Mambelli Silva
First Advisor:	Sergio Costa Oliveira
First Co-advisor:	Mariana Torquato Quezado de Magalhães
First Referee:	Vasco Ariston de Carvalho Azevedo
Second Referee:	Rafael Pinto Vieira
Third Referee:	Luciana Cezar de Cerqueira Leite
metadata.dc.contributor.referee4:	Bárbara de Castro Pimentel Figueiredo
Abstract:	A proteína SmKI-1 do Schistosoma mansoni está intrinsecamente associada à sua sobrevivência; e apresenta um inibidor ubíquo de serino proteases do tipo Kunitz e uma domínio C-terminal desordenado e sem homólogos fora do gênero. O domínio Kunitz (KD) apresenta papel essencial no bloqueio da ligação com a elastase neutrofílica (HNE), no comprometimento da migração/ativação de neutrófilos, além de exibir elevado potencial anti-inflamatório. Este domínio apresenta em seu sítio ativo (P1) um resíduo de arginina (Arg18), sendo esta uma região central para a atividade inibidora da HNE. Neste estudo, foram realizadas análises estruturais in silico desta proteína visando sua produção para estudos de inibição enzimática da HNE e ensaios vacinais. Desenvolvemos um protocolo de expressão onde o KD foi clonado ao plasmídeo pET-32a junto à uma proteína de fusão (TRX) e recuperado de forma solúvel. Por meio de análises biofísicas, a estabilidade e o padrão de estruturação da proteína foram verificados. Análises in silico por modelagem e ancoragem molecular nos permitiram o desenho de duas mutações sítio-dirigidas com o objetivo de melhorar a atividade inibitória da HNE: (1) a substituição da Arg18 no sítio P1 por um resíduo de leucina e (2) a substituição do Glu14 por um resíduo de alanina (mutações RL-KD e EA-KD, respectivamente). Essas substituições basearam-se na preferência da HNE por resíduos hidrofóbicos como a leucina na posição P1, de inibidores reportados em bancos de dados, e em nossas análises estruturais, que também demonstraram que a substituição do Glu14 contribuiria para uma alteração na dinâmica conformacional do sítio P1 de modo a a facilitar o complexo com a HNE. As proteínas mutantes foram produzidas solúveis e funcionais e utilizadas em ensaios de inibição enzimática in vitro para HNE, demonstrando atividade inibitória melhorada quando comparadas ao KD. A variante RL-KD apresentou melhor performance nos ensaios de inbição in vitro e, portanto, foi avaliada quanto ao seu potencial anti-inflamatório em um modelo in vivo de artrite gotosa aguda induzida por cristais de MSU. Apesar da diminuição da sensação dolorosa pelos animais e redução dos parâmetros inflamatórios testados, não foi observada diferença estatística quando comparado ao KD. Paralelamente, avaliamos de forma individual a SmKI-1 e seus domínios estruturais em formulações vacinais em modelo murino. Observamos que a SmKI-1 induziu 46,7% de proteção e o domínio C-terminal 27,8% na redução do número de vermes; enquanto, o domínio KD não foi capaz de proteger contra à infecção. Este trabalho demonstra o potencial dos domínios da SmKI-1, o KD para o desenho racional de uma molécula anti-inflamatória e a região C-terminal como candidato à vacina contra à esquistossomose.
Subject:	Genética Schistosoma mansoni Vacinas Biotecnologia Elastase de leucócito
language:	por
metadata.dc.publisher.country:	Brasil
Publisher:	Universidade Federal de Minas Gerais
Publisher Initials:	UFMG
metadata.dc.publisher.department:	ICB - INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLOGICAS
metadata.dc.publisher.program:	Programa de Pós-Graduação em Genética
Rights:	Acesso Restrito
URI:	http://hdl.handle.net/1843/34817
Issue Date:	31-Aug-2020
metadata.dc.description.embargo:	31-Aug-2021
Appears in Collections:	Teses de Doutorado

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