Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/1843/35082
Type: Dissertação
Title: Efeito da deleção do gene que codifica uma proteína de ligação à RNA sobre o transcriptoma de epimastigotas de Trypanosoma cruzi
Authors: Wanessa Moreira Goes
First Advisor: Santuza Maria Ribeiro Teixeira
First Co-advisor: Fabiano Sviatopolk-Mirsky Pais
Abstract: Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas é um protozoário que apresenta três formas durante o seu ciclo de vida, as quais são bioquimicamente e morfologicamente distintas e programadas para responder rapidamente às drásticas mudanças ambientais que esse parasita enfrenta em seus vários hospedeiros. Ao contrário de outros eucariotos, os genes que codificam proteínas neste protozoário são transcritos em pré-mRNAs policristônicos, os quais são processados em mRNAs maduros por meio de reações acopladas de "trans-splicing" e de poli-adenilação. Devido a isso, o controle da expressão gênica depende principalmente de mecanismos pós-transcricionais mediados por proteínas de ligação ao RNA (RBPs), que controlam os níveis steady-state e as taxas de tradução dos mRNAs. RNA-seq de epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas, juntamente com buscas por motivos característicos de RBPs permitiu a identificação de uma proteína com níveis de expressão aumentados na forma epimastigota, quando comparados às formas amastigotas e tripomastigotas. Essa proteína foi nomeada TcRBP99. Experimentos de metaciclogênese comparando epimastigotas do tipo selvagem (WT) e epimastigotas nas quais o gene que codifica TcRBP99 foi eliminado identificou um papel relacionado à diferenciação do parasito uma vez que um aumento na taxa de metaciclogênese foi observado em parasitas nocautes. Com base nesses dados, o presente trabalho teve como objetivo analisar o efeito da deleção do gene que codifica a TcRBP99, no controle da expressão gênica de formas epimastigotas de T. cruzi, buscando identificar genes cuja expressão estaria associada à metaciclogênese. Foram conduzidas análises de RNA-seq que comparam a expressão gênica de epimastigotas WT e epimastigotas de duas linhagens nocautes para essa RBP. Bibliotecas de cDNA foram sequenciadas na plataforma Illumina MiSeq e em seguida foram conduzidas análises de qualidade das reads geradas. Posteriormente, realizou-se mapeamento das reads contra o genoma completo de CL Brener, por meio da ferramenta TopHat2 e análises de expressão gênica diferencial utilizando os seguintes pacotes: EdgeR, limma e Deseq2. Para a seleção de genes diferencialmente expressos (DGE), foram definidos os parâmetros p-ajustado (padj) < 0,05 e mudança de expressão maior ou menor que 2 vezes. Por fim, regiões 3’ UTR foram determinadas, possibilitando a identificação de motivos, por meio das ferramentas MEME e MAST. Como resultados, obtivemos em média, 3,6 milhões de reads com qualidade baseada no phred score igual ou maior que 20 para cada uma das sete bibliotecas, e mapeamento, em média, de 73,28% dessas reads. Análises de expressão diferencial revelaram 9 genes que apresentaram expressão reduzida em epimastigotas nocautes em comparação com WT: um deles codifica para a proteína associada à diferenciação, cujo mRNA está aumentado em epimastigotas WT comparadas com tripomastigotas e amastigotas. Dois genes da família RHS e um gene que codifica transportador de aminoácidos também tiveram a expressão diminuída na ausência da TcRBP99. Análises de motivos em regiões 3’ UTRs desses mRNAs mostraram que há três motivos conservados, mas que nenhum está presente nas quatro UTRs, ao mesmo tempo. Os resultados obtidos neste trabalho sugerem que a TcRBP99, ao se ligar a mRNAs em formas epimastigotas causa a estabilização desses mRNAs, aumentando assim a expressão de genes responsáveis pela proliferação de epimastigotas, o que consequentemente leva a diminuição da taxa de diferenciação de epimastigotas para tripomastigotas metacíclicas.
Abstract: Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas' disease, is a protozoan that presents three forms during its life cycle, which are biochemically and morphologically distinct and programmed to respond quickly to the drastic environmental changes that this parasite faces in its various hosts. Unlike other eukaryotes, the genes encoding proteins in this protozoan are transcribed into polyrcistronic pre-mRNAs, which are processed into mature mRNAs by coupled trans-splicing and polyadenylation reactions. Because of this, control of gene expression depends primarily on post-transcriptional mechanisms mediated by RNA binding proteins (RBPs), which control steady-state levels and translation rates of mRNAs. RNA-seq of epimastigotes, trypomastigotes and amastigotes, together with searches for motifs characteristic of RBPs allowed the identification of a protein with increased levels of expression in the epimastigote form, when compared to amastigote and trypomastigote forms. This protein was named TcRBP99. Metacyclogenesis experiments comparing wild-type epimastigotes (WT) and epimastigotes in which the gene encoding TcRBP99 was deleted identified a role related to parasite differentiation since an increase in the rate of metacyclogenesis was observed in parasitic knockouts. Based on these data, the present work had the objective of analyzing the effect of the deletion of the gene encoding TcRBP99, in the control of the gene expression of epimastigote forms of T. cruzi, in order to identify genes whose expression would be associated with metacyclogenesis. RNA-seq analyzes were performed comparing the gene expression of WT epimastigotes and epimastigotes from two knockout lines for this RBP. cDNA libraries were sequenced on the Illumina MiSeq platform and then quality analyzes of the generated reads were conducted. Later, the reads were mapped against the complete genome of CL Brener, using the TopHat2 tool and differential gene expression analyzes using the following packages: EdgeR, limma and Deseq2. For the selection of differentially expressed genes (GDE), the parameters p-adjusted (padj) <0.05 and change of expression greater than or less than 2 times were defined. Finally, 3 'UTR regions were determined, allowing the identification of motifs, using the MEME and MAST tools. As a result, we obtained, on average, 3.6 million reads with quality based on the phred score equal to or greater than 20 for each of the seven libraries, and an average mapping of 73.28% of these reads. Differential expression analyzes revealed 9 genes that showed reduced expression in epimastigotes knockouts compared to WT: one of them codes for the differentiation-associated protein, whose mRNA is increased in WT epimastigotes compared to trypomastigotes and amastigotes. Three RHS family genes and one amino acid transporter coding gene also had diminished expression in the absence of TcRBP99. Analysis of motifs in 3' UTRs regions of these mRNAs showed that there are three conserved motifs, but none are present in the four UTRs at the same time. The results obtained in this work suggest that the TcRBP99, when binding to mRNAs in epimastigote forms causes the stabilization of these mRNAs, thus increasing the expression of genes responsible for the proliferation of epimastigotes, which consequently leads to a decrease in the rate of epimastigote differentiation for trypomastigotes metacyclic.
Subject: Biologia computacional
Doença de Chagas
Trypanosoma cruzi
Motivo de reconhecimento de RNA
RNA-Seq
Regiões 3' não traduzidas
language: por
metadata.dc.publisher.country: Brasil
Publisher: Universidade Federal de Minas Gerais
Publisher Initials: UFMG
metadata.dc.publisher.department: ICB - INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLOGICAS
metadata.dc.publisher.program: Programa de Pós-Graduação em Bioinformatica
Rights: Acesso Aberto
metadata.dc.rights.uri: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/pt/
URI: http://hdl.handle.net/1843/35082
Issue Date: 28-Mar-2018
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