Avaliação in vitro de condrócitos da cartilagem articular e da diferenciação osteogênica das células tronco da medula óssea extraídas da prole de ratas tratadas com etanol
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Editor
Universidade Federal de Minas Gerais
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Tipo
Dissertação de mestrado
Título alternativo
Primeiro orientador
Membros da banca
Rogéria Serakides
Amanda Maria Sena Reis
Eliane Gonçalves de Melo
Bruno Machado Bertasoli
Amanda Maria Sena Reis
Eliane Gonçalves de Melo
Bruno Machado Bertasoli
Resumo
Foram realizados dois estudos para avaliar os efeitos do consumo materno de etanol
sobre os condrócitos da cartilagem articular e na diferenciação osteogênica das células
tronco mesenquimais da medula óssea (CTM-MO) da prole. Foram utilizadas 13 ratas
Wistar adultas distribuídas em dois grupos experimentais, grupo controle e o grupo
tratado com etanol. As ratas do grupo etanol e controle, receberam por gavagem diária,
a partir do nono dia de gestação, solução alcoólica 40% e água destilada,
respectivamente até o trigésimo dia de lactação. No dia do parto, foram eutanasiados
quatro neonatos por fêmea e, aos 30 dias de lactação, três filhotes por fêmea. O primeiro
estudo avaliou, in vitro, o efeito do consumo materno de etanol sobre os condrócitos da
cartilagem articular. Os condrócitos foram extraídos das cartilagens articulares e
cultivados em meio condrogênico por sete, 14 e 21 dias. Foram realizados os testes de
conversão do MTT, atividade de fosfatase alcalina, porcentagem de células por campo e
porcentagem de áreas PAS+ em cultura 3D. Aos 21 dias, foi realizada a quantificação
dos transcritos gênicos para agrecano, Sox-9, colágeno tipo II, colágeno X, Runx-2 e
VEGF pelo RT-PCR em tempo real. O segundo estudo avaliou o efeito do consumo
materno de etanol durante a gestação e lactação sobre a diferenciação osteogênica
CTM-MO dos filhotes ao desmame. As CTM-MO foram extraídas dos membros
pélvicos e cultivadas em meio osteogênico por sete, 14 e 21 dias. Foram realizados os
testes de conversão do MTT, atividade de fosfatase alcalina e porcentagem de células
por campo. Aos 21 dias, foram realizados a quantificação do tamanho médio dos
nódulos mineralizados e a quantificação dos transcritos gênicos para osteopontina,
osteocalcina, BMP-2, Runx-2 e colágeno tipo I por RT-PCR em tempo real. As médias
foram comparadas pelo teste t de student e as diferenças foram consideradas
significativas se p<0,05. Os neonatos das mães que receberam etanol foram menos
pesados quando comparados aos neonatos controle. A cultura dos condrócitos do grupo
etanol apresentou maior conversão de MTT, maior atividade de fosfatase alcalina e
maior porcentagem de células relação ao grupo controle em todos os períodos. Não
houve diferença entre ambos os grupos na porcentagem de áreas PAS+ em cultura 3D.
Houve maior expressão de colágeno tipo II e menor expressão de Sox-9 no grupo etanol
14
em relação ao grupo controle. O peso dos filhotes, ao desmame, das mães que
receberam etanol foi significativamente menor quando comparado ao controle. As
CTM-MO do grupo etanol apresentaram menor conversão de MTT aos sete dias de
diferenciação osteogênica porém maior atividade de fosfatase alcalina, maior
porcentagem de células, maior tamanho médio dos nódulos mineralizados bem como
maior expressão de BMP-2, osteopontina e osteocalcina. Conclui-se que o consumo
materno de etanol durante a gestação e lactação altera, in vitro, o fenótipo e a atividade
de síntese dos condrócitos dos neonatos bem como aumenta a diferenciação osteogênica
das CTM-MO da prole ao desmame.
Abstract
Two studies were performed to evaluate the effects of maternal ethanol consumption on
articular cartilage chondrocytes and on osteogenic differentiation of offspring bone
marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs). Thirteen adult female Wistar rats were
divided into two experimental groups, the control group and the ethanol-treated group.
The rats of the ethanol and control group received by daily gavage, from the ninth day
of gestation, 40% alcohol solution and distilled water, respectively until the thirtieth day
of lactation. On the day of delivery, four newborns were euthanized per female and, at
30 days of lactation, three pups per female. The first study evaluated in vitro the effect
of maternal ethanol consumption on articular cartilage chondrocytes. Chondrocytes
were extracted from articular cartilage and cultivated in chondrogenic medium for
seven, 14 and 21 days. MTT conversion tests, alkaline phosphatase activity, percentage
of cells per field and percentage of PAS+ areas in 3D culture were performed. At 21
days, the quantification of gene transcripts for agrecan, Sox-9, collagen type II, collagen
X, Runx-2 and VEGF was performed by real-time RT-PCR. The second study
evaluated the effect of maternal ethanol consumption during pregnancy and lactation on
BMMSCs osteogenic differentiation of pups at weaning. The BMMSCs were extracted
from the pelvic limbs and cultured in osteogenic medium for seven, 14 and 21 days.
MTT conversion, alkaline phosphatase activity and cell percentage per field tests were
performed. At 21 days, the average size of the mineralized nodules was quantified and
the gene transcripts were quantified for osteopontin, osteocalcin, BMP-2, Runx-2 and
collagen I by real-time RT-PCR. Means were compared by Student's t-test and
differences were considered significant if p <0.05. Neonates of mothers receiving
ethanol were less heavy when compared to control neonates. The chondrocyte culture of
the ethanol group showed higher MTT conversion, higher alkaline phosphatase activity
and higher percentage of cells compared to the control group in all periods. There was
no difference between both groups in the percentage of PAS+ areas in 3D culture. There
was higher expression of collagen type II and lower expression of Sox-9 in the ethanol
group compared to the control group. The weight of pups at weaning of mothers
receiving ethanol was significantly lower when compared to control. BMMSCs ethanol
group showed lower MTT conversion after seven days of osteogenic differentiation but
higher alkaline phosphatase activity, increased percentage of cells larger average size of
mineralized nodules as well as increased expression of BMP-2, osteopontin and
osteocalcin. In conclusion, maternal ethanol consumption during pregnancy and
lactation alters, in vitro, the phenotype and chondrocyte synthesis activity of neonates,
as well as increases the osteogenic differentiation of BMMSCs from weaning offspring
Assunto
Palavras-chave
Células tronco, Fosfatase alcalina, cartilagem, Rato como animal de laboratório
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