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http://hdl.handle.net/1843/35508| Type: | Tese |
| Title: | Caracterização e purificação parcial de substância antagonista produzida por Bacteroides fragilis isolado de paciente com infecção intra-abdominal |
| Authors: | Marcela Nascimento Pinheiro Braga |
| First Advisor: | Luiz de Macêdo Farias |
| First Co-advisor: | Paula Prazeres Magalhães |
| Abstract: | A microbiota indígena dos seres humanos é extremamente rica e diversificada, merecendo especial destaque a microbiota intestinal. Como constituinte desta microbiota, cita-se o gênero Bacteroides, cujos membros são bastonetes Gram negativos, anaeróbios obrigatórios, anfibiontes, associados à etiopatogenia de doenças infecciosas importantes, como, por exemplo, infecções intra-abdominais. Amostras de Bacteroides apresentam a habilidade de sintetizar substâncias antagonistas que desempenham função ecológica, principalmente, em habitats densamente colonizados, conferindo vantagem competitiva às amostras produtoras. O objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade de síntese de substâncias antagonistas por 40 amostras de Bacteroides e Parabacteroides isoladas de pacientes com infecções intra-abdominais. A expressão de antagonismo foi avaliada pelo método de difusão em sobrecamada, empregando, como reveladoras, além das amostras teste, 42 amostras de referência de bactérias Gram negativas e Gram positivas. Posteriormente, uma amostra produtora (Bacteroides fragilis) foi empregada para extração, purificação e caracterização parcial da substância antimicrobiana detectada. Como reveladoras, foram empregadas, nesta etapa, amostras de Bacteroides ovatus e Bacteroides caccae. A amostra produtora foi submetida a extração proteica, detectando-se atividade do extrato intracelular precipitado com (NH4)2SO4 nas concentrações de 30% (C30) e 50% (C50). Os extratos brutos C30 e C50 foram inativados por proteases e altas temperaturas e mantiveram-se ativos após exposição a solventes orgânicos e uma ampla faixa de pH. Ambas as frações apresentaram atividade antagonista de natureza bacteriostática. O extrato C50, por se mostrar mais ativo, foi submetido à cromatografia de troca iônica, gel filtração e de fase reversa, seguindo esta ordem. A fração 2C, oriunda da cromatografia de fase reversa manteve-se ativa. A espectrometria de massas, a partir da fração 2C, apresentou íons de aproximadamente 1300 Da, que geraram um sinal mais intenso. Foi realizada busca por similaridade entre fragmentos sequenciados e proteínas descritas nos bancos de dados BLASTP e Antimicrobial Peptide Database. A sequência do fragmento obtido por cromatografia de fase reversa resultou em identidade de 100% com uma proteína de secreção do tipo VII (BLASTP). Em conjunto, os resultados indicam a produção de substância antagonista pela amostra de B. fragilis em estudo. É plausível supor que as mesmas desempenhem papel relevante nas relações interbacterianas, como fator de virulência, em um ambiente complexo como o de uma infecção intra-abdominal. |
| Abstract: | The indigenous microbiota is extremely rich and diverse, in special the intestinal microbiota. Among its members Bacteroides and Parabacteroides should be highlighted. These bacteria are Gram negative, obligate anaerobes, associated with the etiopathogenesis of relevant infectious diseases such as, intra-abdominal infections. Bacteroides and Parabacteroides express the ability to synthesize bacteriocins, proteinaceous substances that play an ecological function, particularly in densely colonized habitats such as the intestine, confering a competitive advantage to the producer strains. This study aimed to evaluate the expression of bacteriocin-like substances by 40 isolates of Bacteroides and Parabacteroides recovered from patients with intra-abdominal infections. We searched for antagonism expression by employing the overlay method, using, as indicator, in addition to the test strains, 42 reference strains of Gram negative and Gram positive bacteria. After screening for antagonistic activity one producer strain was selected and employed in the subsequent steps of the study. This isolate (Bacteroides fragilis) was submitted to extraction, purification, and partial characterization of the antagonistic substance. Bacteroides ovatus and Bacteroides caccae were selected as indicator strains. The intracellular extracts precipitated with (NH4)2SO4 at concentrations of 30% (C30) and 50% (C50) showed activity. This extracts C30 and C50 were inactivated by proteases and high temperatures, and remained active after exposure to organic solvents and a wide range of pH. Both active fractions expressed antagonistic activity of bacteriostatic nature. The extract C50 was submitted to ion exchange chromatography, gel filtration chromatography and reversed phase chromatography, following this order. The fraction 2C remained active. Mass spectrometry of fraction 2C presented ions of approximately 1300 Da, which generated a more intense signal. A search for similarity between sequenced fragments and proteins described in the databases BLASTP and Antimicrobial Peptide Database was conducted. The sequence of a fragment obtained from reverse phase chromatography resulted in 100% identity with a type VII secretion protein (BLASTP). Taken together, the results indicate the production of antagonistic substances by the B. fragilis isolate under study. It is plausible to assume that they play a relevant role in interbacterial relationships as a virulence factor especially in a such complex environment as we observe in an event of an intra-abdominal infection. |
| Subject: | Microbiologia Bacteroides fragilis Microbioma gastrointestinal Infecções |
| language: | por |
| metadata.dc.publisher.country: | Brasil |
| Publisher: | Universidade Federal de Minas Gerais |
| Publisher Initials: | UFMG |
| metadata.dc.publisher.department: | ICB - DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA |
| metadata.dc.publisher.program: | Programa de Pós-Graduação em Microbiologia |
| Rights: | Acesso Aberto |
| metadata.dc.rights.uri: | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/pt/ |
| URI: | http://hdl.handle.net/1843/35508 |
| Issue Date: | 2-Dec-2016 |
| Appears in Collections: | Teses de Doutorado |
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