Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/1843/38540
Type: Tese
Title: Investigação da participação da via PI3KΓ/AKT/NO/GMPC/CANAIS para Potássio Sensíveis ao ATP no controle endógeno da dor neuropática induzida por dieta hiperlipídica em camundongos obesos
Other Titles: Investigation of the participation of the pi3kγ / akt / no / gmpc / atp-sensitive potassium channels in the endogenous control of neuropathic pain induced by a high-fat diet in obese mice
Authors: William Valadares Campos Pereira
First Advisor: Thiago Roberto Lima Romero
First Referee: Stêfany Bruno de Assis Cau
Second Referee: Adriana Cristina Soares de Souza
Third Referee: Sérgio Henrique Sousa Santos
metadata.dc.contributor.referee4: Luciana Souza Guzzo Costa
Abstract: A Diabetes mellitus (DM) é uma das doenças crônicas mais documentadas no mundo e afeta mais de 100 milhões de pessoas no planeta. Possui como característica principal a hiperglicemia crônica, resultante da ausência da produção de insulina ou à resistência da mesma, a diabetes mellitus tipo 2 é o tipo mais prevalente, representando cerca de 85-90% dos casos. O controle inadequado da diabetes compromete tecidos musculares e nervosos, cujo metabolismo depende fundamentalmente do suprimento de glicose e aumenta a probabilidade do surgimento de complicações microvasculares, como: retinopatia diabética, nefropatia diabética, neuropatia autonômica e neuropatia diabética periférica. As neuropatias diabéticas caracterizam-se pela presença de sintomas e/ou sinais de disfunção dos nervos do sistema nervoso periférico somático e/ou do autonômico em indivíduos com diagnóstico de DM. Atualmente existe um número reduzido de tratamentos disponíveis para a dor neuropática diabética, sendo basicamente utilizados antidepressivos tricíclicos e anticonvulsivantes, no entanto tais fármacos não possuem grande eficácia no controle da dor, com apenas 30% dos pacientes apresentando algum tipo de alívio. Neste contexto, a proposta deste estudo foi avaliar se a via PI3Kγ/AKT/NO/GMPc/canais para potássios sensíveis ao ATP, participa do controle endógeno na dor neuropática diabética. A descoberta de vias que participem de mecanismos modulatórios da dor podem trazer respostas importantes para a escolha de fármacos mais eficazes ou a criação de drogas específicas que garantam alívio satisfatório deste tipo de dor, com consequente melhoria da qualidade de vida dos pacientes. A dor neuropática diabética foi induzida por dieta hiperlipídica (HFD 40%), os animais foram alimentados por 12 semanas até o surgimento da hiperalgesia, este fenômeno foi então acompanhado do diagnóstico de obesidade, resistência a insulina e intolerância a glicose, representando assim um modelo semelhante a diabetes tipo 2 em humanos. A hiperalgesia foi testada através do método de compressão mecânica da pata e para confirmar que a dor frente ao estímulo mecânico possui características neuropáticas e não apenas inflamatórias, realizou-se a histopatologia da pata e do nervo ciático dos animais do grupo controle e alimentados com a dieta diabetogênica. Os resultados encontrados foram satisfatórios para a comprovação de que a dor evocada pela dieta possui características tipicamente neuropática, registros de desorganização do tecido conjuntivo do epineuro/perineuro, axônios retraídos e posicionados excentricamente, aumento do espaço correspondente à mielina e perda axonal foram observados, garantindo assim a eficácia do modelo na indução da dor neuropática diabética. Para os testes farmacológicos, as análises estatísticas utilizaram two-way ANOVA, seguido do pós-teste de Bonferroni, para a quantificação das alterações morfológicas por análise histopatológica e imunohistoquímica, utilizou-se teste T pareado. Todas as drogas foram administradas pela via intraplantar. Para a avaliação da participação da via PI3k, foi utilizado AS-605240, inibidor seletivo de PI3Kγ nas dosagens de 90 e 180 µg/pata, observou-se que PI3Kγ quando inibida não modulou a nocicepção induzida pela dieta hiperlipídica. Para a determinação da expressão das proteínas p-AKT/total AKT, utilizou-se a técnica de Western Blot e para isso foram coletados coxins plantares dos animais do grupo controle e alimentados com a dieta diabetogênica. Verificou-se diferença estatística significativa na expressão da proteína p-AKT, que representa a forma ativa desta proteína, a mesma, encontra-se expressa em menor quantidade nos animais acometidos pela dor neuropática diabética (DNP), o que reforça a não participação desta via na modulação endógena na dor investigada. Para avaliação da participação da via de sinalização do óxido nítrico foram utilizadas as drogas L-NOarg, inibidor não seletivo das enzimas oxido nítrico sintase, nas doses de 24 e 48 µg/pata e o ODQ, inibidor seletivo da enzima guanilato ciclase solúvel, nas doses de 100 e 200 µg/pata, não se observou modulação endógena na dor neuropática diabética quando utilizado, L-NOarg ou ODQ, significando que a via do óxido nítrico não participa da modulação endógena da dor investigada. Seguimos para a análise da participação seletiva destes canais, desta forma, foi utilizada a glibenclamida, bloqueador seletivo de canais para potássio sensíveis ao ATP, nas doses 80 e 160 µg/pata, onde observou-se redução do limiar nociceptivo nos animais com dor neuropática diabética, o que significa que estes canais participam endogenamente na tentativa de controle da dor neuropática diabética. Após esses achados, investigou-a expressão dos canais para potássio sensíveis ao ATP, com intuito de observar se, em um cenário de DNP induzido exclusivamente por dieta rica em gordura, estes apresentavam sua expressão alterada, para isso, foi realizada a imunohistoquimica dos coxins plantares, estes foram marcados com Kir 6.2, um marcador de canais para potássio sensíveis ao ATP e os resultados encontrados, apresentaram aumento da expressão destes canais, o que acredita-se ser uma estratégia de alteração funcional do sistema endógeno, na tentativa de controle da dor. Para determinação da atividade de canais para potássio sensíveis a voltagem (KV), foi utilizado o Tetraetilamonio, bloqueador seletivo de canais para KV, na dose de 30 µg, onde observou-se modulação do limiar nociceptivo dos animais acometidos pela dor neuropática diabética. A partir destes achados, investigou-se também a participação dos canais para potássio sensíveis ao cálcio de baixa e alta condutância. Para tais análises utilizou-se respectivamente, Dequalíneo (bloqueador seletivo de canais para potássio sensíveis ao cálcio de baixa condutância), na dose de 50 µg/pata e Paxilína (bloqueador seletivo de canais para potássio sensíveis ao cálcio de alta condutância), na dose de 20 µg/pata. O limiar nociceptivo dos animais com dor neuropática diabética não sofreu alteração quando administrado nenhum dos fármacos supracitados, descartando assim a participação dos canais para potássio sensíveis ao cálcio na modulação endógena da dor neuropática diabética. Os resultados fornecem evidências de que a dor evocada pelo modelo de indução exclusivamente por dieta hiperlipídica possui característica neuropática. Além disso, observou-se que a via PI3Kγ/AKT/NO/GMPc não participa endogenamente do controle da dor neuropática diabética, no entanto, os canais para potássio sensíveis ao ATP e a voltagem, modulam endogenamente a dor supracitada, o bloqueio destes canais reduziu o limiar nociceptivo dos animais acometidos pela dor, além disso, a expressão de KATP encontra-se aumentada. Nossa hipótese é que o aumento da expressão destes canais sejam uma adaptação fisiológica funcional do sistema endógeno periférico, uma tentativa de controle da dor neuropática diabética e que fármacos que potencializem a abertura destes canais podem contribuir com o controle da dor neuropática diabética. APOIO FINANCEIRO: CAPES. PROTOCOLO CEUA: 57/2017. APOIO FINANCEIRO: CAPES. PROTOCOLO CEUA: 57/2017. PEREIRA, William Valadares Campos. Investigation of the participation of the pi3kγ / akt / no / gmpc / atp-sensitive potassium channels in the endogenous control of neuropathic pain induced by a high-fat diet in obese mice.2021. 86 páginas. Universidade Federal de Minas Gerais Instituto de Ciências Biológicas Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas - Fisiologia e Farmacologia.
Abstract: Diabetes mellitus (DM) is one of the most documented chronic diseases in the world and affects more than 100 million people on the planet. Its main characteristic is chronic hyperglycemia, resulting from the absence of insulin production or its resistance, type 2 diabetes mellitus is the most prevalent type, representing about 85-90% of cases. Inadequate diabetes control compromises muscle and nerve tissues, the metabolism of which depends fundamentally on the supply of glucose and increases the likelihood of the appearance of microvascular complications, such as: diabetic retinopathy, diabetic nephropathy, autonomic neuropathy and peripheral diabetic neuropathy. Diabetic neuropathies are characterized by the presence of symptoms and / or signs of somatic and / or autonomic nervous system nerve dysfunction in individuals diagnosed with DM. Currently, there is a reduced number of treatments available for diabetic neuropathic pain, and basically tricyclic antidepressants and anticonvulsants are used, however, these drugs are not very effective in controlling pain, with only 30% of patients showing some type of relief. In this context, the purpose of this study was to evaluate whether the PI3Kγ / AKT / NO / cGMP / channels for potassium sensitive to ATP, participates in endogenous control in diabetic neuropathic pain. The discovery of pathways that participate in modulatory mechanisms of pain can bring important answers to the choice of more effective drugs or the creation of specific drugs that guarantee satisfactory relief of this type of pain, with a consequent improvement in the quality of life of patients. Diabetic neuropathic pain was induced by a high-fat diet (HFD 40%), the animals were fed for 12 weeks until the onset of hyperalgesia, this phenomenon was then accompanied by the diagnosis of obesity, insulin resistance and glucose intolerance, thus representing a model similar to type 2 diabetes in humans. Hyperalgesia was tested using the mechanical paw compression method and to confirm that the pain at the mechanical stimulus has neuropathic and not just inflammatory characteristics, the histopathology of the paw and the sciatic nerve of the animals in the control group and fed with diabetogenic diet. The results found were satisfactory to prove that the pain evoked by the diet has typical neuropathic characteristics, records of disorganization of the connective tissue of the epineurium / perineurium, axons retracted and positioned eccentrically, an increase in the space corresponding to myelin and axonal loss were observed, guaranteeing thus the effectiveness of the model in the induction of diabetic neuropathic pain. For pharmacological tests, statistical analyzes used two-way ANOVA, followed by the Bonferroni post-test, for the quantification of morphological changes by histopathological and immunohistochemical analysis, a paired T test was used. All drugs were administered via the intraplantar route. To assess the participation of the PI3k pathway, AS-605240 was used, a selective inhibitor of PI3Kγ in the dosages of 90 and 180 µg / paw, it was observed that PI3Kγ when inhibited did not modulate the nociception induced by the hyperlipidic diet. For the determination of the expression of p-AKT / total AKT proteins, the Western blot technique was used and for this purpose plantar cushions were collected from the animals of the control group and fed with the diabetogenic diet. There was a statistically significant difference in the expression of the p-AKT protein, which represents the active form of this protein, the same, it is expressed in a smaller amount in animals affected by diabetic neuropathic pain (DNP), which reinforces the non-participation of this via endogenous modulation in the investigated pain. To evaluate the participation of the nitric oxide signaling pathway, the drugs L-NOarg, a non-selective inhibitor of the enzymes nitric oxide synthase, were used at doses of 24 and 48 µg / paw and ODQ, a selective inhibitor of the enzyme soluble guanylate cyclase, in doses of 100 and 200 µg / paw, endogenous modulation was not observed in diabetic neuropathic pain when used, L-NOarg or ODQ, meaning that the nitric oxide pathway does not participate in the endogenous modulation of the investigated pain. We proceeded to the analysis of the selective participation of these channels, thus, we used glibenclamide, a selective blocker of potassium channels sensitive to ATP, at doses 80 and 160 µg / paw, where a reduction in the nociceptive threshold was observed in animals with neuropathic pain diabetic, which means that these channels participate endogenously in the attempt to control diabetic neuropathic pain. After these findings, he investigated the expression of ATP-sensitive potassium channels, with the aim of observing whether, in a scenario of DNP induced exclusively by a high-fat diet, they showed their altered expression, for this, immunohistochemistry of the cushions was performed. plants, these were marked with Kir 6.2, a marker of potassium channels sensitive to ATP and the results found, showed an increase in the expression of these channels, which is believed to be a strategy of functional alteration of the endogenous system, in an attempt to control the ache. To determine the activity of voltage-sensitive potassium channels (KV), Tetraethylammonium, a selective blocker of channels for KV, was used at a dose of 30 µg, where modulation of the nociceptive threshold of animals affected by diabetic neuropathic pain was observed. Based on these findings, the participation of low- and high-conductivity calcium channels for potassium was also investigated. For such analyzes, Dequalíneo (selective blocker of potassium channels sensitive to calcium of low conductance) was used, respectively, in the dose of 50 µg / paw and Paxilína (selective blocker of channels for potassium sensitive to calcium of high conductance), in the dose 20 µg / paw. The nociceptive threshold of animals with diabetic neuropathic pain did not change when any of the aforementioned drugs were administered, thus ruling out the participation of calcium-sensitive potassium channels in the endogenous modulation of diabetic neuropathic pain. The results provide evidence that the pain evoked by the induction model exclusively by high-fat diet has a neuropathic characteristic. In addition, it was observed that the PI3Kγ / AKT / NO / cGMP pathway does not participate endogenously in the control of diabetic neuropathic pain, however, the ATP-sensitive potassium channels and voltage, endogenously modulate the pain, blocking these channels reduced the nociceptive threshold of animals affected by pain, in addition, the expression of KATP is increased. Our hypothesis is that the increased expression of these channels is a functional physiological adaptation of the peripheral endogenous system, an attempt to control diabetic neuropathic pain and that drugs that enhance the opening of these channels can contribute to the control of diabetic neuropathic pain. FINANCIAL SUPPORT: CAPES. CEUA PROTOCOL: 57/2017.
Subject: Farmacologia
Diabetes mellitus tipo 2
Neuropatias diabéticas
Dor / prevenção e controle
Analgesia
language: por
metadata.dc.publisher.country: Brasil
Publisher: Universidade Federal de Minas Gerais
Publisher Initials: UFMG
metadata.dc.publisher.department: ICB - DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGIA
metadata.dc.publisher.program: Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas - Fisiologia e Farmacologia
Rights: Acesso Aberto
URI: http://hdl.handle.net/1843/38540
Issue Date: 8-Jun-2021
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