Caracterização molecular e análise filogenética de regiões parciais do genoma do Equine infectious anemia virus circulante em equídeos brasileiros
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Editor
Universidade Federal de Minas Gerais
Descrição
Tipo
Tese de doutorado
Título alternativo
Primeiro orientador
Membros da banca
Paulo César Peregrino Ferreira
Maria Isabel Maldonado Coelho Guedes
Pedro Augusto Alves
Daniel Moura de Aguiar
Maria Isabel Maldonado Coelho Guedes
Pedro Augusto Alves
Daniel Moura de Aguiar
Resumo
A Anemia infecciosa equina (AIE) é uma doença que acomete todos os membros da família
Equidea, causada pelo retrovírus Equine infectious anemia virus (EIAV). A AIE é uma
doença de ocorrência mundial, sendo uma das 11 doenças de equídeos de notificação
obrigatória pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE). A AIE encontra-se
amplamente disseminada no território brasileiro, apresentando uma elevada soroprevalência
no Pantanal. O diagnóstico da AIE é feito principalmente empregando o teste de
imunodifusão em gel de agar (IDGA). Embora a AIE tenha sido descrita há mais de 150
anos, existem poucas sequências de genoma completo do EIAV disponíveis no GenBank, o
que tem impacto nos estudos de detecção e caracterização molecular do vírus. Assim, o
objetivo deste estudo foi detectar, caracterizar molecularmente e analisar filogeneticamente
o EIAV circulante em amostras de campo de equídeos brasileiros. Para isso foram
desenhados iniciadores e desenvolvidas Reações em Cadeia da Polimerase (PCRs) para a
amplificação de diferentes regiões do genoma proviral do EIAV em amostras clínicas de
equídeos do Pantanal brasileiro, e do estado do Ceará. O DNA amplificado nestas reações
foi sequenciado e as sequências nucleotídicas foram empregadas para estudos de
alinhamento do genoma e análise filogenética. Foram obtidas sequências nucleotídicas para
duas regiões parciais do genoma do EIAV, sendo 23 para a região 5’ LTR ao exon 1 do
gene tat, e 61 para o exon 1 do gene tat ao gene gag. Também foi feita a caracterização
molecular de regiões parciais do genoma de uma amostra do Pantanal, sendo uma
sequência nucleotídica completa da ORF tat, e sequências parciais da região 5’ LTR, dos
gene gag, pol, e env, e da ORF S2. A análise filogenética das sequências nucleotídicas para
as diferentes regiões do genoma analisadas apresentou diferentes resultados. Na maioria
das análises das sequencias parciais as amostras de equídeos brasileiros sempre agrupam
separadamente das demais sequências mundiais de EIAV. Na análise das sequências das
amostras brasileiras e mundiais foram observadas várias substituições nucleotídicas e
mutações de aminoácidos. Para avaliar o status sorológico dos equídeos foram empregados
os testes IDGA, ELISA gp90 e ELISA p26. Portanto, os dados obtidos neste trabalho
contribuem com novas informações sobre a diversidade genética do genoma do EIAV, e
destaca a importância da caracterização do EIAV para o desenvolvimento de métodos
moleculares para o diagnóstico da AIE em complementação aos testes sorológicos
atualmente utilizados. Além disso, os resultados sorológicos demonstram a maior
sensibilidade dos testes ELISAs empregados neste estudo em comparação ao IDGA
utilizado para o diagnóstico da AIE.
Abstract
The Equine infectious anemia (EIA) is a disease that affects all members of the Equidea
family, caused by the retrovirus Equine infectious anemia virus (EIAV). EIA presents a
worldwide distribution, being one of the eleven diseases of compulsory notification by the
World Organisation for Animal Health (OIE). The EIA is widely disseminated in the Brazilian
territory, presenting a high seroprevalence in the Pantanal. The diagnosis of EIA is mainly
made using agar gel immunodiffusion (AGID). Although the EIA has been described for more
than 150 years, there are few complete EIAV genome sequences available in GenBank
which has an impact on the molecular characterization and detection studies of the virus.
Considering the shortage of EIAV sequences, the studies of detection and molecular
characterization of EIAV are important. Therefore, the objective of this study is to detect,
molecularly characterize and analyze phylogenetically the circulating EIAV in equidae from
Brazil. For this, primers were designed and Polymerase Chain Reactions (PCRs) were
developed for the amplification of different regions of the EIAV proviral genome in clinical
samples of equidae from the Brazilian Pantanal of the states of Mato Grosso and Mato
Grosso do Sul, and equidae from the state of Ceará. The amplified DNA in these reactions
was sequenced and the nucleotide sequences were employed for genome alignment studies
and phylogenetic analysis. We obtained nucleotide sequences for two partial regions of the
EIAV genome, being 23 for the 5'LTR region to the exon 1 of tat, and 61 for the exon 1 of the
tat to the gag gene. Also, the molecular characterization of partial regions of the genome
from a Pantanal sample, which were a complete nucleotide sequence of ORF tat, and partial
sequences of gag, pol and env genes, and of ORF S2. The phylogenetic analysis of
nucleotide sequences for different regions of the genome analyzed shows that different
results. In most partial sequence analyzes of the Brazilian equines samples always group
separately from the other EIAV world sequences. In the analysis of the sequences of the
Brazilian and world samples several nucleotide substitutions and mutations of amino acids
were observed. To evaluate the serological status of the equine samples were employed the
tests IDGA, ELISA gp90 and ELISA p26. Therefore, the data obtained in this work contribute
with new information on the genetic diversity of the EIAV genome, and highlights the
importance of characterizing the EIAV for the development of molecular methods for the
diagnosis of EIA in addition to the serological tests currently used. In addition, the serological
results demonstrate the greater sensitivity of the ELISAs used in this study compared to the
IDGA utilized for the diagnosis of EIA
Assunto
Microbiologia, Anemia infecciosa equina, Reação em cadeia da polimerase, Filogenia
Palavras-chave
Anemia Infecciosa equina, Equine infectious anemia virus, Caracterização molecular, Análise filogenética