Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/1843/43485
Type: Artigo de Periódico
Title: One-Step RT-qPCR assay for detection and quantification of equine infectious anemia virus in-vitro
Other Titles: Ensaio de RT-qPCR de uma etapa para detecção e quantificação do vírus da anemia infecciosa equina in vitro
Authors: Bruna Lopes Bueno
Fernanda Gonçalves de Oliveira
Graciela Kunrath Lima
Antônio Augusto Fonseca Junior
Telissa Cunha Kassar
Rebeca Câmara
Rômulo Cerqueira Leite
Jenner Karlisson Pimenta Dos Reis
Abstract: Equine infectious anemia virus (EIAV) infection often results in an initial febrile response, followed by recurrent cycles of the disease and finally, a prolonged asymptomatic period. These variations in clinical signs are due to a number of factors, including virus strain, equid species and differences in susceptibility among animals. As a consequence of the close relation between viral strain and disease, studies about in-vitro replication and fitness of EIAV in macrophages, which are the target cells of the virus, depend on accurate measurement of viral load throughout the infection period. We developed a method to quantify EIAV in-vitro using a one-step RT-qPCR system from a control RNA synthesized for this purpose. Designed primers amplified a 520 base pair fragment from the gag gene region that was inserted into a pGEM-T Easy Vector plasmid and propagated in Escherichia coli DH5-α. The bacteria with the construct were propagated and sufficient quantities of the template DNA were produced. The RNA was synthesized in-vitro from the plasmid linearization product and was used for standardization of a one-step RT-qPCR system with a minimum detection limit of 10 to 15 molecules. The efficiency of the reaction was 101%, with r2 equal to 0.997. This new method can be used for the determination of virus titer in EIAV replication studies in-vitro.
Abstract: A infecção pelo vírus da anemia infecciosa equina (EIAV) geralmente resulta em uma resposta febril inicial, seguida por ciclos recorrentes da doença e, finalmente, um período assintomático prolongado. Essas variações nos sinais clínicos são devidas a vários fatores, incluindo cepa do vírus, espécies de equídeos e diferenças de suscetibilidade entre os animais. Como consequência da estreita relação entre cepa viral e doença, estudos sobre replicação in vitro e adequação de EIAV em macrófagos, que são as células-alvo do vírus, dependem da medição precisa da carga viral ao longo do período de infecção. Desenvolvemos um método para quantificar o EIAV in vitro usando um sistema de RT-qPCR de uma etapa a partir de um RNA de controle sintetizado para essa finalidade. Os primers projetados amplificaram um fragmento de 520 pares de bases da região do gene gag que foi inserido em um plasmídeo pGEM-T Easy Vector e propagado em Escherichia coli DH5-α. As bactérias com a construção foram propagadas e foram produzidas quantidades suficientes do DNA molde. O RNA foi sintetizado in vitro a partir do produto de linearização do plasmídeo e foi usado para padronização de um sistema de RT-qPCR de uma etapa com um limite mínimo de detecção de 10 a 15 moléculas. A eficiência da reação foi de 101%, com r2 igual a 0,997. Este novo método pode ser usado para a determinação do título do vírus em estudos de replicação de EIAV in vitro.
Subject: Saúde Coletiva
RNA
EIAV
language: eng
metadata.dc.publisher.country: Brasil
Publisher: Universidade Federal de Minas Gerais
Publisher Initials: UFMG
metadata.dc.publisher.department: ICB - INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLOGICAS
Rights: Acesso Aberto
metadata.dc.identifier.doi: 10.4238 / gmr18027
URI: http://hdl.handle.net/1843/43485
Issue Date: 2018
metadata.dc.url.externa: https://www.geneticsmr.com/articles/one-step-rt-qpcr-assay-detection-and
metadata.dc.relation.ispartof: Genetics and molecular research
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