Papel do fator de troca de nucleotídeos guanina RASGEF1B na regulação da expressão de SCHLAFEN-4 e SERPINB2 em macrófagos
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Resumo
Slfn4 e Serpinb2 são genes expressos em macrófagos que podem ter seus níveis de mRNA
aumentados em resposta à estimulação por agonistas inflamatórios de receptores do tipo Toll. Em
análises de sequenciamento global de RNAs, um cluster contendo Slfn4 e Serpinb2 indica que a
expressão desses encontra-se reduzida na ausência do fator de troca de nucleotídeos guanina
RasGEF1b em macrófagos derivados da medula óssea de camundongos estimulados com LPS. No
entanto, não se encontra completamente estabelecido como a expressão de Slfn4 é regulada em
macrófagos condições de repouso ou inflamatórias, enquanto que Serpinb2 não possui evidências
conclusivas. Ademais, permanece por ser estabelecida a caracterização do promotor de Slfn4 com
os seus sítios de ligação para fatores de transcrição e sua consequente ativação transcricional, e o
papel de RasGEF1b sobre a regulação transcricional de Serpinb2. Baseado nesses
questionamentos, nós testamos a hipótese que o RasGEF1b regula a expressão de Slfn4 e Serpinb2
em macrófagos. Análises por RT-qPCR confirmam que os níveis do Slfn4 e Serpinb2 são reduzidos
em macrófagos RasGEF1b-KO não tratados ou tratados com LPS, e o efeito da ausência de
RasGEF1b sob a expressão gênica observada em células não estimuladas é mantido após o
tratamento com LPS. A expressão de Slfn4, Serpinb2 e genes do cluster também foram reduzidos
em níveis basais em macrófagos RAW264.7 silenciados para RasGEF1b tratados e não tratados
com LPS. Porém, em Ch25h foi identificado o efeito reverso. Análises dos motivos de ligação para
fatores de transcrição específicos na região promotora putativa de Slfn4, Serpinb2 e de genes do
mesmo cluster revelaram a presença dos motivos para os fatores reguladores IRFs, AP-1, STATs,
ATF e GATA. De acordo, os níveis de Slfn4 e Serpinb2 em macrófagos de RasGEF1b-KO ativados
com LPS e IFN mantiveram-se em níveis reduzidos e comparáveis aos de células não estimuladas.
A super expressão de RasGEF1b induziu a atividade transcricional de Serpinb2, enquanto a mesma
foi reduzida em macrófagos RAW264.7 silenciados para RasGEF1b. A mutação nos sítios de
ligação para os fatores de transcrição CEBP e AP-1 reduziu a atividade de luciferase do promotor
de Serpinb2 em células HEK293 super expressando RasGEF1b por 24 horas, mas não em 48 horas
para o sitio mutado de CEBP. Nossos resultados sugerem que RasGEF1b facilita a transcrição
gênica de Slfn4 e Serpinb2 em níveis suficientes para permitir sua expressão em níveis máximos
após a ativação celular por agentes inflamatórios.
Abstract
Slfn4 and Serpinb2 are genes expressed in macrophages that can have their mRNA levels increased
in response to stimulation by inflammatory agonists of Toll-like receptors. In analyzes of global
sequencing of RNAs, a cluster containing Slfn4 and Serpinb2 indicates that their expression is
reduced in the absence of the guanine nucleotide exchange factor RasGEF1b in stimulated mouse
bone marrow-derived macrophages with LPS. However, it is not fully established how Slfn4
expression is regulated in macrophages at rest or under inflammatory conditions, while Serpinb2
lacks conclusive evidence. Furthermore, the characterization of the Slfn4 promoter with its binding
sites for transcription factors and its consequent transcriptional activation, and the role of
RasGEF1b on the transcriptional regulation of Serpinb2 remains to be established. Based on these
questions, we tested the hypothesis that RasGEF1b regulates the expression of Slfn4 and Serpinb2
in macrophages. RT-qPCR analyzes confirm that Slfn4 and Serpinb2 levels are reduced in untreated
or LPS-treated RasGEF1b-KO macrophages, and the effect of the absence of RasGEF1b on gene
expression observed in unstimulated cells is maintained after LPS treatment. Expression of Slfn4,
Serpinb2, and cluster genes were also reduced from baseline levels in LPS-treated and untreated
RAW264.7 macrophages silenced to RasGEF1b. However, at Ch25h the reverse effect was
identified. Analysis of the binding motifs for specific transcription factors in the putative promoter
region of Slfn4, Serpinb2 and genes from the same cluster revealed the presence of motifs for the
interferon regulatory factors IRFs, AP-1, STATs, ATF and GATA. Accordingly, Slfn4 and
Serpinb2 levels in RasGEF1b-KO macrophages activated with LPS and IFN remained at low
levels, comparable to those of unstimulated cells. Overexpression of RasGEF1b induced
transcriptional activity of Serpinb2, whereas it was reduced in RAW264.7 macrophages silenced
for RasGEF1b. Mutation in the binding sites for the CEBP and AP-1 transcription factors reduced
the luciferase activity of the Serpinb2 promoter in HEK293 cells overexpressing RasGEF1b for 24
hours, but not at 48 hours for the mutated CEBP site. Our results suggest that RasGEF1b facilitates
gene transcription of Slfn4 and Serpinb2 at sufficient levels to allow their expression at maximum
levels after cellular activation by inflammatory agents.
Assunto
Biologia Celular, Fatores de Troca do Nucleotídeo Guanina, Proteínas ras, Macrófagos, Expressão Gênica
Palavras-chave
RASGEF1B, MACRÓFAGOS, EXPRESSÃO GENICA