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Type: Dissertação
Title: Avaliação de dois métodos de extração de DNA em amostras obtidas por swab associados às técnicas moleculares de PCR convencional, PCR em tempo real e LAMP para o diagnóstico da leishmaniose tegumentar
Authors: Verônica Cardoso Santos de Faria
First Advisor: Denise Utsch Gonçalves
First Co-advisor: Daniel Moreira de Avelar
Abstract: Introdução: A leishmaniose tegumentar (LT) possui um arsenal diagnóstico limitado e envolve o uso de amostras coletadas de forma invasiva. A pesquisa de DNA de Leishmania no material coletado por swab pode ser uma estratégia minimamente invasiva e precisa para o diagnóstico molecular da LT. A acurácia dos ensaios moleculares pode variar dependendo do tipo de amostra e do método de extração de DNA utilizado. Os parâmetros de qualidade e rendimento do DNA extraído são pontos críticos para a detecção e a identificação de espécies de Leishmania por amplificação de ácidos nucleicos. Objetivo: Avaliar comparativamente dois métodos de extração de DNA: PureLink™ Genomic DNA mini kit e a técnica Direct Boil (DB) em amostras obtidas por swab de pacientes com leishmaniose cutânea (LC) e leishmaniose mucosa (LM) e avaliar a aplicabilidade dessas amostras para detecção molecular e genotipagem de Leishmania. Métodos: Vinte e seis pacientes confirmados para LT (13 LC e 13 LM) oriundos dos ambulatórios do Instituto René Rachou/FIOCRUZ e do Hospital das Clínicas/UFMG foram avaliados. Todos tiveram o diagnóstico confirmado por cPCR kDNA em amostras obtidas por biópsia. O rendimento e a qualidade do DNA, em amostras obtidas por swab e biópsia, foram medidos por espectrofotometria e a integridade do DNA foi avaliada por eletroforese em gel de poliacrilamida. O DNA extraído foi avaliado através de quatro testes moleculares de diagnóstico (cPCR kDNA, qPCR TaqMan® SSU rRNA; qPCR SYBR® Green kDNA; e LAMP-RT 18S) e uma técnica molecular para genotipagem (hsp70 PCR-RFLP). Para quantificação indireta da carga parasitária foi realizada a análise dos valores de ciclo limiar (Ct) pelo qPCR SYBR® Green kDNA. Resultados: O protocolo DB resultou no maior rendimento de DNA (196 ng/µL – LM; 95,6 ng /µL – LC) em comparação ao kit comercial. O protocolo do kit comercial produziu a mais alta qualidade genômica usando a razão A260/A280 para a pureza do DNA (LM: 1,81 ng/µL; e LC: 1,93 ng/µL). Ambos os métodos de extração apresentaram valores de absorbância fora do padrão recomendado na análise da razão A260/A230 e a técnica DB teve o pior resultado (LM: 0,42; CL: 0,3). A integridade do DNA foi afetada em 92,3% das amostras (LC e LM) obtidas por swab e extraídas pela técnica DB. A integridade do DNA foi mantida na maioria das amostras obtidas por swab e extraídas pelo kit Purelink™, com desempenho idêntico ou mais alto em todas as técnicas moleculares realizadas na comparação com os testes com amostras obtidas por biópsia. Somente no cPCR kDNA com amostras de LC, o desempenho das amostras coletadas por swab e extraídas pela técnica DB foi idêntico quando comparado à extração do swab utilizando o kit comercial. O qPCR TaqMan® SSU rRNA realizado nas amostras obtidas por swab juntamente com a extração de DB mostrou os piores resultados de sensibilidade para LC (46%) e LM (23%). A única espécie encontrada em todas as amostras analisadas foi a Leishmania braziliensis, e a caracterização genotípica teve o melhor resultado em amostras coletadas por swab e extraídas pelo kit comercial para LC e em amostras obtidas por biópsia para LM. Conclusão: O uso do swab como método de amostragem minimamente invasivo pode ser uma alternativa de baixo custo para o diagnóstico molecular da LT, tendo grande aplicabilidade para regiões remotas. Para a LC, o uso do swab associado à extração por kit comercial apresentou elevado desempenho independente da técnica molecular utilizada; enquanto que para a LM esta associação apresentou melhor sensibilidade na cPCR kDNA. A utilização da técnica DB para extração de swabs requer atenção, pois a sensibilidade das técnicas moleculares avaliadas apresentou grande variação. A precisão geral dos métodos de extração e técnicas moleculares usando swab deverá ser analisada em maior grupo amostral, o que poderá confirmar a aplicabilidade dessa estratégia não invasiva para o diagnóstico e caracterização das espécies causadoras da doença.
Abstract: Background: Tegumentary leishmaniasis (TL) has a limited diagnostic arsenal and involves the use of invasively collected specimens. The Leishmania DNA search on swab-collected material may be a minimally invasive and accurate strategy for the molecular diagnosis of TL. The accuracy of molecular assays can be affected depending on the type of sample and the DNA extraction method used. The extracted DNA quality and yield parameters are critical points for detection and identification of Leishmania species by nucleic acid amplification. Objective: To compare two DNA extraction methods (PureLink™ Genetic DNA Mini-Kit and Direct Boil - DB technique) in swab samples from patients with CL and ML, and the use of these samples for molecular detection and genotyping of Leishmania. Methods: Twenty-six patients with TL (13 CL and 13 ML) coming from outpatient clinics of the Instituto René Rachou /FIOCRUZ and the Hospital das Clínicas/UFMG were evaluated. All cases had their diagnosis confirmed by kDNA cPCR in biopsy samples. DNA yield and quality in swab samples were measured by spectroscopy and DNA integrity was assessed by polyacrylamide gel electrophoresis. The extracted DNA was tested by four molecular diagnostic tests (kDNA cPCR, SSU TaqMAN qPCR; kDNA SYBR-qPCR; and rRNA LAMP-RT 18S) and a molecular test for genotyping (hsp70 PCR-RFLP). For indirect quantification of parasitic load, an analysis of threshold cycle (CT) values was performed by SYBR qPCR kDNA. Results: The DB protocol resulted in the highest DNA yield (196 ng/µL - ML; 95.6 ng /µL - CL) as compared to the commercial kit. The commercial kit protocol gave the highest genetic quality using an A260/A280 ratio for DNA purity (ML: 1.81 ng / µL; and CL: 1.93 ng/µL). Both extraction methods presented non-standard absorbance values recommended in the A260/A230 ratio analysis, and DB technique had the worst result (ML: 0.42; CL: 0.3). The DNA integrity was affected in 92.3% of swab samples (CL and ML) extracted by DB technique. The DNA integrity was maintained in most samples obtained by swab and extracted by the Purelink ™ kit, with identical or higher performance in all molecular techniques performed in comparison with tests with samples obtained by biopsy. Only in kDNA cPCR with samples from CL cases, the performance of samples collected by swab and extracted by the DB technique was identical when compared to swab extraction using the commercial kit. TaqMan SSU rRNA qPCR performed using swab together with DB extraction showed the worse sensitivity results for CL (46%) and ML (23%). Leishmania braziliensis was the only specie found in all analyzed samples, and the genotypic characterization have a best performance in samples collected by swab and extracted by the commercial kit for CL and in biopsy samples for ML. Conclusion: The use of swab as a minimally invasive sampling method can be a low-cost alternative for the molecular diagnosis of TL, having great applicability to remote regions. For CL, the use of swab coupled with extraction by commercial kit showed high performance regardless of the molecular technique used; while for ML this association showed better sensitivity in cPCR kDNA. The use of the DB technique for swab extraction requires attention, as the sensitivity of the molecular techniques evaluated varied widely. The general precision of the extraction methods and molecular techniques using swab should be analyzed in a larger sample group, which may confirm the applicability of this non-invasive strategy for the diagnosis and characterization of the species causing the disease.
Subject: Leishmaniose Cutânea
Leishmaniose Tegumentar Difusa
Técnicas de Diagnóstico Molecular
DNA
Dissertação Acadêmica
language: por
metadata.dc.publisher.country: Brasil
Publisher: Universidade Federal de Minas Gerais
Publisher Initials: UFMG
metadata.dc.publisher.department: MEDICINA - FACULDADE DE MEDICINA
metadata.dc.publisher.program: Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde - Infectologia e Medicina Tropical
Rights: Acesso Aberto
URI: http://hdl.handle.net/1843/61865
Issue Date: 17-Feb-2020
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