Thermodynamic assessment of DNA mismatches in PCR and LAMP primers for SARS-CoV-2 detection and their effectiveness to variants

Abstract

Em 2020, a OMS (Organização Mundial da Saúde) declarou o surto global de uma nova doença causada pelo vı́rus SARS-CoV-2, a qual se tornou conhecida como COVID-19 (coronavirus disease 2019). A aplicação em ampla escala de testes de diagnóstico é uma das formas de controle em surtos similares a esse, evitando a disseminação da doença. Dentre os testes moleculares empregados estão os métodos baseados em PCR (reação em cadeia da polimerase) e LAMP (amplificação isotérmica mediada por loop), principalmente os que envolvem a etapa de transcrição reversa (RT), na qual o RNA viral é transcrito em DNA. Um dos elementos usados por essas técnicas são os primers, que são sequências curtas de DNA, em geral, dentro de 18–30 pares de bases. A função desses primers é reconhecer a região genômica do alvo para a qual foram desenhados e hibridizarem a ela, conduzindo à detecção do vı́rus. A temperatura de hibridização, ou melting, é um parâmetro crucial para o desenho de primers. Tanto em PCR quanto em LAMP, esse parâmetro contribui para que ocorra uma hibridização consistente entre primer e alvo, levando ao sucesso da técnica. Porém incompatibilidades, conhecidas como mismatches, podem surgir desestabilizando o duplexo primer-alvo, o que pode impedir a amplificação do alvo e, consequentemente, a não detecção do vı́rus. Contudo, a presença de mismatches pode ter o efeito inverso contribuindo para a estabilidade do primer com o alvo. Nesse trabalho, aplicamos um modelo de fı́sica estatı́stica para avaliarmos o impacto de mismatches de DNA em primers de PCR e LAMP desenhados para a detecção de SARS-CoV-2. Nós coletamos 19 e 18 conjuntos de primers publicados para PCR e LAMP, respectivamente, os alinhamos com genomas de SARS-CoV-2 e calculamos a cobertura para hibridizações completas (perfect match) e parciais (mismatch). Além disso, avaliamos reações cruzadas com genomas de outros seis coronavı́rus (229E, OC43, HKU1, NL63, MERS-CoV e SARS-CoV-1). Devido ao surgimento de novas variantes de SARS-CoV-2, incluı́mos a avaliação dos 42 conjuntos de primers, de forma completa e parcial, para sete variantes (Alpha, Beta, Gamma, Delta, Lambda, Mu e Omicron) e quatro subvariantes (BA.2, BA.3, BA.4 e BA.5). Nossos resultados mostraram que a maioria dos primers avaliados têm alta cobertura para alinhamentos completos e um número considerável obteve um aumento na cobertura considerando a presença de até três mismatches consecutivos, incluindo a avaliação para as variantes e subvariantes. Alguns primers, entretanto, não cobrem nem completa nem parcialmente os genomas coletados. Em relação à reação cruzada, um número pontual de primers cobrem alguns genomas de outros coronavı́rus e, em alguns casos, somente considerando a presença de mismatches.