Plataforma de Nanopartículas Lipídicas Ionizáveis Visando Imunoterapia do Câncer
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Resumo
A imunoterapia antitumoral representa um avanço importante no tratamento de
neoplasias. Nesse contexto, plataformas de nanopartículas lipídicas ionizáveis (LNP) são
alternativas para a entrega de ácidos nucleicos. Na produção de células CAR T, ex vivo,
as LNPs podem ser utilizadas para induzir a expressão transiente do receptor, seja
entregando DNA ou mRNA. Assim, oferecem uma alternativa para superar efeitos
adversos observados com o uso de vetores virais. LNPs também podem ser otimizadas e
funcionalizadas para entrega de ácidos nucleicos com alta especificidade para células de
interesse. Além de oferecer uma alternativa para a produção de células CAR T in vivo,
LNPs funcionalizadas encapsulando mRNA podem ser utilizadas como plataformas de
vacinas terapêuticas contra câncer, promovendo uma resposta contra antígenos tumorais.
Neste trabalho abordamos diferentes aplicações de uma plataforma de LNPs, como a
otimização para a entrega de DNA e mRNA para produção de células CAR T in vitro, e
também sua funcionalização para entrega direcionada a células mieloides. Na primeira
parte deste trabalho, demonstramos que o aumento da razão molar de DOPE favorece a
entrega de DNA para linfócitos T humanos. Identificamos uma formulação capaz de
transfectar células Jurkat para expressão de CAR anti-CD19. Células transfectadas com
a LNP aumentavam a expressão de marcadores de ativação (CD69 e PD1) quando cocultivadas
com células Raji (CD19+). Utilizando essa LNP, transfectamos linfócitos T
humanos primários e demonstramos o potencial citotóxico dessas células contra células
alvo CD19+. Demonstramos que a transfecção com a LNP otimizada nesse trabalho foi
maior em células Jurkat do que a transfecção com a formulação sintetizada com lipídeos
ionizáveis aprovados para uso em humanos. Utilizamos essa plataforma para entregar
mRNA para expressão de CAR contra tumores sólidos, utilizando Claudina 6 como alvo
(CAR-CLDN6). Para isso, sintetizamos o mRNA modificado com pseudouridina (ψUTP)
e entregamos esse mRNA para linfócitos T com a LNP otimizada. Demonstramos a
transfecção em células Jurkat, e posterior ativação em co-cultura com células de
carcinoma colorretal Colo-205 (CLDN6+). Linfócitos T humanos primários transfectados
com a LNP encapsulando mRNA para CAR-CLDN6 foram efetivos contra células
CLDN6+. Isso indica que a plataforma de LNPs pode ser utilizada também para a
produção de células CAR T com mRNA. Por fim, funcionalizamos a LNP otimizada nos
estudos in vitro com um anticorpo para CD11b para direcionar a entrega de mRNA-OVA
para células mieloides in vivo. Para testar a plataforma funcionalizada utilizamos uma
abordagem de vacina terapêutico, imunizando animais com a LNP antes da inoculação de
células de melanoma expressando OVA (B16F10-OVA). Os dados do estudo in vivo
demonstram que a vacina induziu resposta celular, com ativação de linfócitos e produção
de citocinas, além de induzir um aumento na frequência de células mieloides
apresentando MCH-II. Apesar de não ter controlado o crescimento do tumor, essa
abordagem terapêutica abre novas possibilidades para a funcionalização e uso das LNPs
entregando mRNA, sendo necessários mais estudos para ajuste de doses e utilização de
novos alvos específicos para tumores sólidos.
Abstract
Antitumor immunotherapy is a hallmark in the treatment of cancer. In this context,
ionizable lipid nanoparticle (LNP) platforms are alternatives for the delivery of nucleic
acids. In the production of CAR T cells, ex vivo, LNPs can be used to induce transient
expression of the receptor, whether delivering DNA or mRNA. Thus, they offer an
alternative to overcome adverse effects observed with the use of viral vectors. LNPs can
also be optimized and functionalized to deliver nucleic acids with high specificity to cells
of interest. In addition of being an alternative for the production of CAR T cells in vivo,
functionalized LNPs encapsulating mRNA can be used as therapeutic vaccine platforms
against cancer, inducing an immune response against tumor antigens. In the present work
we addressed different applications of an LNP platform, such as optimization for the
delivery of DNA and mRNA for the production of CAR T cells in vitro, and also its
functionalization for targeted delivery to myeloid cells. In the first part of this work, we
demonstrated that increasing the molar ratio of DOPE favors the delivery of DNA to
human T lymphocytes. We identified a formulation capable of transfecting Jurkat cells
for anti-CD19 CAR expression. Cells transfected with LNP increased the expression of
activation markers (CD69 and PD1) when co-cultured with Raji cells (CD19+). Using this
LNP, we transfected primary human T lymphocytes and demonstrated the cytotoxic
potential of these cells against CD19+ target cells. We demonstrated that transfection with
the LNP optimized in this work was greater in Jurkat cells than transfection with the
formulation synthesized with ionizable lipids already approved for use in humans. We
used this platform to deliver mRNA for CAR expression against solid tumors, using
Claudin 6 as a target (CAR-CLDN6). To achieve this, we synthesized mRNA modified
with pseudouridine (ψUTP) and delivered this mRNA to T lymphocytes with the
optimized LNP. We demonstrated transfection in Jurkat cells, and subsequent activation
in co-culture with Colo-205 (CLDN6+) colorectal carcinoma cells. Primary human T
lymphocytes transfected with the LNP encapsulating mRNA for CAR-CLDN6 were
effective against CLDN6+ cells. This indicates that the LNP platform can also be used to
produce CAR T cells with mRNA. Finally, we functionalized the LNP optimized in the
in vitro studies with a CD11b antibody for targeted delivery of OVA mRNA to myeloid
cells in vivo. To test the functionalized platform, we used a therapeutic vaccine approach,
immunizing animals with LNP prior to inoculation of OVA-expressing melanoma cells
(B16F10-OVA). Data from the in vivo study demonstrate that the vaccine induced a
cellular response, with activation of lymphocytes and production of cytokines, in addition
to inducing an increase in the frequency of myeloid cells presenting MCH-II. Despite not
having controlled tumor growth, this therapeutic approach opens up new possibilities for
the functionalization and use of LNPs delivering mRNA, requiring further studies to
adjust doses and use new specific targets for solid tumors.
Assunto
Patologia, Nanopartículas, Ácidos Nucleicos, Linfócitos T., Vacinas, Imunoterapia
Palavras-chave
Nanopartículas lipídicas ionizáveis, Entrega de ácidos nucleicos, Células CAR T, Imunoterapias, Vacinas terapêuticas