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http://hdl.handle.net/1843/74233
Type: | Dissertação |
Title: | O papel da PTX3 na modulação do perfil de expressão de miRNAs e na liberação de vesículas extracelulares em modelo de câncer de mama triplo negativo |
Authors: | Diogo Gomes da Costa |
First Advisor: | Adriana Abalen Martins Dias |
First Co-advisor: | Letícia da Conceição Braga |
metadata.dc.contributor.advisor-co2: | Fábio Ribeiro Queiroz |
First Referee: | Helton da Costa Santiago |
Second Referee: | Adriano de Paula Sabino |
Third Referee: | Erika Cristina Jorge |
Abstract: | Segundo estimativas da Organização Mundial da Saúde (OMS), é crescente o número de novos casos de câncer em todo o mundo. O câncer de mama é o tumor mais comum entre as mulheres, sendo o subtipo triplo negativo (CMTN) o mais agressivo e hiporresponsivo ao tratamento, em parte devido à ausência de receptores para estrogênio, progesterona e HER2 (fator de crescimento epidérmico humano), que são alvos da quimioterapia. Portanto, torna-se importante investigar novos alvos terapêuticos para CMTN. A Pentraxina 3 (PTX3) é uma proteína de fase aguda cuja expressão ocorre principalmente em resposta a estímulos inflamatórios, como as citocinas TNFA e IL1B. Alterações nos níveis de PTX3 estão associadas à gravidade de várias doenças. No câncer de mama, PTX3 apresenta papel dual, atuando em alguns casos como supressor de tumor e em outros como oncogênico. A hipótese desse trabalho é de que a expressão de PTX3 esteja relacionada à desregulação de miRNAs e vesículas extracelulares (VEs) no CMTN. Nesse sentido, o presente estudo tem como objetivo investigar o papel da proteína PTX3 recombinante humana (rhPTX3) na modulação da expressão de miRNAs e da liberação de VEs em um modelo in vitro de CMTN. A expressão gênica basal de PTX3 na linhagem MDA-MB-231 foi avaliada por RT-qPCR bem como a cinética da expressão gênica de PTX3 e TNFA após o tratamento com a proteína rhPTX3 por 3, 6, 12 e 24 horas. O Sequenciamento de Nova Geração (NGS) dos pequenos RNAs das células MDA-MB-231 tratadas ou não com rhPTX3 por 3 horas foi realizado para avaliação da modulação de miRNAs por rhPTX3 e das redes de interações dos miRNAs diferencialmente expressos (DEMs). A liberação das VEs pelas células MDA-MB-231 tratadas por 24 horas com rhPTX3 também foi analisada por meio do rastreamento de nanopartículas, citometria de fluxo e quantificação de proteínas. Os resultados mostraram que a PTX3 é expressa constitutivamente na linhagem celular de adenocarcinoma de mama MDA-MB-231 e que o tratamento com rhPTX3 leva a um significativo aumento de sua expressão, com um pico no tempo de 6 horas na linhagem MDA-MB-231. Os resultados mostraram que TNFA não é expresso constitutivamente nas células MDA-MB-231 e nem em resposta ao tratamento com rhPTX3. PTX3 alterou o perfil de expressão gênica de 142 miRNAs, sendo 112 modulados positivamente e 30 negativamente. In silico foi identificado que os DEMs possuem 12.894 alvos e que 29 vias canônicas foram enriquecidas. Nesse primeiro momento, o estudo focou em 3 destas vias: sinalização ERK/MAPK, regulação do câncer de mama por Stathmin1 e via do microambiente tumoral. Foi identificado nessas vias a inibição de moléculas relacionadas com a inflamação no câncer: IL6 e IL4; inibição de moléculas que regulam a quimiotaxia: CXCL8, CXCR4 e CXCL12; ativação de molécula pró-apoptótica (BAD) e inibição de molécula antiapoptótica (BCL2); além de inibição de moléculas relacionadas com adesão celular (ICAM1, CD44 e CRK). As análises de biofunções no software IPA dos DEMs identificaram 5 atividades: sinalização e interação célula a célula, movimento celular, sobrevivência celular, lesões e anormalidades organísticas e morfologia celular. Por fim, as análises da liberação de VEs mostraram que apesar de no grupo tratado com rhPTX3 ter havido um aumento da liberação de VEs, houve redução da liberação de VEs CD44+. Os achados iniciais deste trabalho mostraram que PTX3 modula o perfil de expressão de miRNAs e aumenta a liberação de VEs, diminuindo a população VEs CD44+, atuando, dessa forma, como uma proteína supressora de tumor na linhagem de CMTN. Sabendo do conhecimento limitado das vias moleculares do CMTN, nossos resultados apresentam a PTX3 e suas atividades subsequentes como possíveis alvos terapêuticos. |
Abstract: | According to estimates from the World Health Organization (WHO), the number of new cases of cancer worldwide is increasing. Breast cancer is the most common tumor among women, with the triple-negative subtype (TNBC) being the most aggressive and less responsive to treatment, partly due to the absence of receptors for estrogen, progesterone and HER2 (human epidermal growth factor), which are targets of chemotherapy. Therefore, it becomes important to investigate new therapeutic targets for TNBC. Pentraxin 3 (PTX3) is an acute phase protein whose expression mainly occurs in response to inflammatory stimuli, such as TNFA and IL1B cytokines. Changes in PTX3 levels are associated with the severity of various diseases. In breast cancer, PTX3 plays a dual role, acting in some cases as a tumor suppressor and in others as an oncogenic agent. The hypothesis of this work is that PTX3expression of is related to the deregulation of miRNAs and extracellular vesicles (EVs) in TNBC. In this sense, the present study aims to investigate the role of human recombinant PTX3 protein (rhPTX3) in modulating miRNAs expression and EVs release in an in vitro model of TNBC. Basal gene expression of PTX3 in the MDA-MB-231 cell line was evaluated by RT-qPCR as well as the kinetics of PTX3 and TNFA gene expression after treatment with the rhPTX3 for 3, 6, 12 and 24 hours. Next Generation Sequencing (NGS) of small RNAs from rhPTX3- treated or untreated MDA- MB-231 for 3 hours was performed to assess miRNAs modulation by rhPTX3 and the interaction networks of differentially expressed miRNAs (DEMs). EVs release by MDA-MB- 231 cells treated for 24 hours with rhPTX3 was also analyzed through nanoparticle tracking, flow cytometry and protein quantification. The results showed that PTX3 is constitutively expressed in the MDA-MB-231 breast adenocarcinoma cell line and that treatment with rhPTX3 leads to a significant increase in its expression, with peaking at 6 hours in the MDA- MB-231 cell line. . The results also showed that TNFA is not constitutively expressed in MDA- MB-231 cells nor in response to rhPTX3 treatment. PTX3 altered the gene expression profile of 142 miRNAs, with 112 being positively modulated and 30 negatively modulated. In silico analysis identified that 12,894 targets for DEMs, and 29 canonical pathways were enriched. In this initial phase, the study focused on 3 of these pathways: ERK/MAPK signaling, regulation of breast cancer by Stathmin1, and the tumor microenvironment pathway. Inhibition of molecules related to cancer inflammation (IL6 and IL4) molecules regulating chemotaxis (CXCL8, CXCR4 and CXCL12); activation of pro-apoptotic molecule (BAD), inhibition of anti-apoptotic molecule (BCL2), and inhibition of molecules related to cell adhesion (ICAM1, CD44 and CRK) were identified in these pathways. Biofunction analyzes in IPA software of DEMs identified 5 activities: cell signaling and cell-to-cell interaction, cell movement, cell survival, tissue injuries and organ abnormalities, and cell morphology. Finally, analyzes of EVs release showed that although there was an increase in EV release in the rhPTX3 treated group, there was a reduction in of CD44+ EVs release. The initial findings of this work showed that PTX3 modulates miRNAs expression profile and increases EV release, decreasing the CD44+ EV population, thus acting as a tumor suppressor protein in the TNBC lineage, thus acting as a tumor suppressor protein in the CMTN lineage. Giving the limited knowledge of TNBC molecular pathways, our results present PTX3 and its subsequent activities as potential therapeutic targets. |
Subject: | Genética Neoplasias da Mama Neoplasias de Mama Triplo Negativas Vesículas Extracelulares |
language: | por |
metadata.dc.publisher.country: | Brasil |
Publisher: | Universidade Federal de Minas Gerais |
Publisher Initials: | UFMG |
metadata.dc.publisher.department: | ICB - INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLOGICAS |
metadata.dc.publisher.program: | Programa de Pós-Graduação em Genética |
Rights: | Acesso Restrito |
URI: | http://hdl.handle.net/1843/74233 |
Issue Date: | 26-Apr-2024 |
metadata.dc.description.embargo: | 26-Apr-2025 |
Appears in Collections: | Dissertações de Mestrado |
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