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http://hdl.handle.net/1843/74373
Tipo: | Dissertação |
Título: | Terapia gênica neuroprotetora e regenerativa para a neurodegeneração glaucomatosa baseada na superexpressão do miR-17 |
Título(s) alternativo(s): | Neuroprotective and regenerative gene therapy for glaucomatous neurodegeneration based on miR-17 overexpression |
Autor(es): | Raquel Alves de Almeida |
primer Tutor: | Vinicius de Toledo Ribas |
Resumen: | O glaucoma, um distúrbio neurodegenerativo multifatorial, é caracterizado pela degeneração progressiva dos axônios que compõem o nervo óptico e posterior perda lenta das células ganglionares da retina (CGRs). É atualmente, a principal causa de cegueira irreversível em todo mundo, com mais de 60 milhões de pessoas afetadas. Os tratamentos atuais se concentram em diminuir a pressão intraocular. Apesar do tratamento, em um determinado grupo de pacientes, a doença continua a progredir. Diante disso, torna-se imperativo o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, focadas em proteger as CGRs da morte, os seus axônios da degeneração e simultaneamente ser capaz de promover a regeneração de axônios lesados. Sendo assim, esse trabalho testou a eficácia da terapia gênica neuroprotetora e regenerativa para o glaucoma, baseada na expressão forçada do miR-17. Vetores de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) superexpressando o miR-17 (rAAV.miR-17) e expressando a proteína mCheerry (rAAV.CTRL) foram utilizados para transduzir neurônios corticais in vitro e CGRs in vivo de ratos Wistar. O vetor de rAAV apresentou elevada eficiência de transdução em ambos os neurônios in vitro e in vivo. A cultura neuronal foi submetida à lesão do tipo “scratch” e feita avaliação da regeneração neurítica in vitro. O vetor rAAV.miR-17 foi capaz de aumentar significativamente a regeneração de neuritos nesse modelo. Nas análises in vivo, as CGRs foram transduzidas com os vetores virais, marcadas retrogradamente por FluoroGold e posteriormente feita a lesão do nervo óptico por esmagamento. Foi observada neuroproteção das CGRs pela superexpressão do miR-17, com um aumento significativo na sobrevivência das CGRs 28 dias após a lesão nas três regiões da retina quantificadas. Marcações contra neurofilamento H, GFAP e Iba1 foram feitas em cortes do nervo óptico. A marcação de axônios com anticorpo contra neurofilamento H e pela expressão de mCherry revelou uma maior preservação dos axônios do nervo óptico nas partes proximal e distal à lesão. Não foram observadas alterações nas marcações para astrócitos e microglia no nervo óptico pela marcação de GFAP e Iba1, respectivamente. Análises de bioinformática usando as plataformas miRWalk e miRTarBase permitiu identificar alvos preditos e validados do miR-17, respectivamente. Análises funcionais de ontologia gênica dos genes alvos preditos do miR-17 revelaram que o miR-17 possui diferentes genes alvos preditos envolvidos com processos de regeneração, degeneração e morte celular. Em conclusão, o presente estudo demonstra um efeito neuroprotetor e regenerativo da terapia gênica baseada na superexpressão do miR-17 em modelos de neurodegeneração. |
Abstract: | Glaucoma, a multifactorial neurodegenerative disorder, is characterized by progressive degeneration of the axons that make up the optic nerve and subsequent loss of retinal ganglion cells (RGCs). It is currently the leading cause of irreversible blindness worldwide, with more than 60 million people affected. Current treatments focus on lowering intraocular pressure. Despite treatment, in a given group of patients, the disease continues to progress. Given this, it is imperative to develop new therapeutic strategies, focused on protecting the RGCs from death, their axons from degeneration and simultaneously being able to promote the regeneration of injured axons. Therefore, this work tested the effectiveness of neuroprotective and regenerative gene therapy for glaucoma, based on the forced expression of miR-17. Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors overexpressing miR-17 (rAAV.miR-17) and expressing the mCherry protein (rAAV.CTRL) were used to transduce cortical neurons in vitro and RGCs in vivo of Wistar rats. The rAAV vectors showed high transduction efficiency both in vitro and in vivo. The culture was subjected to a scratch lesion and evaluation of neuritic regeneration was performed. The rAAV.miR-17 was able to significantly increase neurite regeneration in vitro. For the in vivo analysis, RGCs were transduced with rAAV vectors, retrogradely traced by FluoroGold and subsequently an optic nerve crush was performed. Neuroprotection of RGCs was observed by overexpression of miR-17, with a significant increase in RGCs survival 28 days after the lesion in the three regions of the retina quantified. Immunostaining for neurofilament, GFAP and Iba1 was performd in optic nerve cryosections. Axonal staining by antibody against neurofilament and by the expression of mCherry revealed axonal protection in the optic nerve in the proximal and distal regions to the lesion. There was no change in astrocytes and microglia in the optic nerve by GFAP and Iba1 satining, respectively. Bioinformatics analysis using the miRWalk and miRTarBase platforms allowed the identification of predicted and validated miR-17 targets, respectively. Functional analysis of gene ontology of the predicted target genes of miR-17 showed that miR-17 has several predicted target genes involved with regeneration, degeneration and cell death. In conclusion, the present study demonstrated the neuroprotective and regenerative effect of the gene therapy based in the overexpression of miR-17 in models of neurodegeneration. |
Asunto: | Biologia Celular Glaucoma Terapia Genética Neuroproteção Regeneração MicroRNAs |
Idioma: | por |
País: | Brasil |
Editor: | Universidade Federal de Minas Gerais |
Sigla da Institución: | UFMG |
Departamento: | ICB - DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA |
Curso: | Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular |
Tipo de acceso: | Acesso Aberto |
metadata.dc.rights.uri: | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/pt/ |
URI: | http://hdl.handle.net/1843/74373 |
Fecha del documento: | 16-dic-2020 |
Aparece en las colecciones: | Dissertações de Mestrado |
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Terapia gênica neuroprotetora e regenerativa para a neurodegeneração glaucomatosa baseada na superexpressão do miR-17.pdf | 4.42 MB | Adobe PDF | Visualizar/Abrir |
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