Please use this identifier to cite or link to this item:
http://hdl.handle.net/1843/BUBD-936HJ4| Type: | Tese de Doutorado |
| Title: | Sequenciamento completo e estrutura cristalográfica da metaloprotease leucurolisina-a purificada do veneno de Bothrops leucurus |
| Authors: | Rodrigo Novaes Ferreira |
| First Advisor: | Adriano Monteiro de Castro Pimenta |
| First Co-advisor: | Eladio Oswaldo Flores Sanchez |
| metadata.dc.contributor.advisor-co2: | Ronaldo Alves Pinto Nagem |
| First Referee: | Gloria Regina Franco |
| Second Referee: | Marcelo Matos Santoro |
| Third Referee: | Ana Maria Moura da Silva |
| Abstract: | Leucurolisina-a (leuc-a) e uma metaloprotease de veneno de serpente (SVMP) de classe P-I presente no veneno de Bothrops leucurus. A leuc-a teve sua estrutura primaria completamente sequenciada, apresentando uma unica cadeia polipeptidica com 202 residuos de aminoacidos e alta similaridades com outras SVMPs de classe P-I ja descritas. A leuc-a, mesmo em altas concentracoes, nao provoca hemorragia, apresentando apenas atividade proteolitica em proteinas de matriz extracelular. Essa enzima foi cristalizada, pelo metodo de difusao de vapor, e dois conjuntos de dados de difracao de raios-x, um a 1,8 eoutro a 1,6 A, foram coletados. Os dados mostraram que os cristais pertencem ao grupo espacial P212121, com parametros de celula unitaria muito similares A estrutura cristalografica da leuc-a foi resolvida pelo metodo de substituicao molecular usando o modelo da metaloproteinase BaP1 (PDB code 1ND1) purificada do veneno da serpente Bothrops asper. O modelo da leuc-a, a 1,8 A de resolucao, foi refinado ate um Rfator final = 0,168 e Rlivre = 0,235. A estrutura apresenta o conservado motivo de ligacao ao zinco H142E143XXH146XXG149XXH152 assim como o motivo gmet turn h C164I165M166, caracteristico da superfamilia metzincina. Um atomo de zinco foi observado no sitio catalitico da enzima sendo estabilizado pelos NÃ2 dos tres aneis imidazolicos dos residuos de histidinas H142H146H152 e uma molecula de agua entre o espaco do atomo de zinco e a cadeia lateral do residuo E143. Um ion calcio tambem foi observado unido das extremidades N e C-terminais da estrutura. Esse atomo e estabilizado por duas moleculas de agua e cinco atomos presentes nas cadeias laterais de residuos conservados: o oxigenio da carbonila do residuo Glu9; os dois oxigenios do carboxilato do residuo Asp93, o oxigenio da carbonila do residuo Cys197 e o oxigenio da carboxamida do residuo Asn200. A leuc-a possui seis residuos de cisteina (Cys117-Cys197, Cys157-Cys164, and Cys159-Cys181) envolvidos na formacao de pontes dissulfeto. A resolucao de outro conjunto de dados, com 1,6 A de resolucao, apresentou uma densidade eletronica desconhecida no sitio catalitico da enzima. Esse ligante foi identificado, sintetizado e utilizado com sucesso em ensaios de inibicao da atividade proteolitica da leuc-a. |
| Abstract: | Leucurolysin-a (leuc-a) is a P-I class snake venom metalloproteinase (SVMP) from the venom of Bothrops leucurus, a poisonous snake which is responsible for the majority of snakebites in the northeast of Brazil. It has been shown that leuc-a degrades fibrin clots directly in vitro without activating plasminogen (Pg), and does not elicit any hemorrhagic response. Leuc-a is a single chain zinc binding endopeptidase composed of 202 amino acids residues, which shows high similarity with other P-I SVMPs. In this work, leuc-a was crystallized using the hanging-drop vapour-diffusion method. Two data set were collected,one with 1.8 A, and other with 1.6 A. Data sets showed that the crystals belongs to the orthorhombic P212121 space group, with unit-cell parameters very similar. The crystallographic structure of leuc-a was solved by Molecular Replacement technique using the Bothrops asper metalloproteinase (BaP1) structure (PDB code 1ND1) as template.Leuc-a model was refined to a final Rfactor of 0.168 and Rfree of 0.235 against diffraction data of 1.80 A of resolution. The structure displayed the zinc binding motif H142E143XXH146XXG149XXH152 as well as the C164I165M166 motif ( gMet-turn h), which characterize the metzincin superfamily of metalloproteinases. A Zn2+ ion was observed inthe active site cleft of the enzyme and one structural Ca2+ ion was assigned on the molecular surface close to its C-terminal. The Zn2+ ion was tetra-coordinated by three imidazole NÃ2 atoms from H142, H146 and H152 and one catalytic water molecule anchored to the side-chain carboxyl group of E143. Leuc-a has six cysteine residues involved in threedisulfide bridges (Cys117-Cys197, Cys157-Cys164, and Cys159-Cys181). The other data set, with 1.6 A of resolution, was was refined to a final Rfactor of 0.178 and Rfree of 0.231. This model showed a unknown electron density at active site. This ligand was identified, synthesized and tested with leuc-a. The results showed a inhibition of proteolitic activity leuc-a over dimethyl casein. |
| Subject: | Bioquímica e imunologia |
| language: | Português |
| Publisher: | Universidade Federal de Minas Gerais |
| Publisher Initials: | UFMG |
| Rights: | Acesso Aberto |
| URI: | http://hdl.handle.net/1843/BUBD-936HJ4 |
| Issue Date: | 13-Oct-2009 |
| Appears in Collections: | Teses de Doutorado |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| tese_de_doutorado.pdf | 16.81 MB | Adobe PDF | View/Open |
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.