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Type: Tese de Doutorado
Title: Aspectos parasitológicos, imunológicos e moleculares da resposta dependente do receptor do tipo Toll 9 na infecção experimental por cepas de diferentes linhagens de Trypanosoma cruzi
Authors: Rodrigo de Almeida e Lourdes
First Advisor: Daniella Castanheira Bartholomeu
First Referee: Andre Luiz Barbosa Bafica
Second Referee: Ester Roffê Santiago
Third Referee: Aristobolo Mendes da Silva
metadata.dc.contributor.referee4: Erika Martins Braga
Abstract: Receptores do tipo Toll (TLR) são importantes componentes do sistema imune inato, responsáveis pelo reconhecimento de Padrões Moleculares Associados a Patógenos (PAMPs). TLR9 foi inicialmente identificado como responsável pelo reconhecimento de motivos CpG não metilados derivados do DNA genômico de bactéria e vírus. Mais recentemente, também foi demonstrado que o DNA genômico de alguns tripanosomatídeos, como Trypanosoma cruzi, apresenta atividade imunoestimulatória TLR9 dependente, e que este receptor é essencial no reconhecimento dos parasitos e na resistência do hospedeiro em infecções experimentais. Estudos prévios realizados pelo nosso grupo permitiram a identificação de sequências imunoestimulatórias contendo motivos CpG no genoma da cepa CL Brener de T. cruzi. Estas sequências não estão distribuídas aleatoriamente no genoma, mas enriquecidas em regiões contendo clusters gênicos codificadores de proteínas de superfície e outras sequências T. cruzi específicas. Estas regiões são altamente polimórficas nos dois haplótipos da cepa híbrida CL Brener, o que nos levou a especular que a abundância destes motivos CpG poderia variar no genoma das diferentes cepas de T. cruzi, podendo assim contribuir para uma ativação diferencial de TLR9 e, por consequência, um padrão diferencial de resposta imune, importantes no controle de parasitemia. A fim de testar esta hipótese, no presente trabalho, estudamos a importância de TLR9 na infecção causada por cepas de T. cruzi pertencentes a diferentes linhagens evolutivas: Colombiana (TcI), Y (TcII) e CL Brener (TcVI). Estas cepas foram selecionadas para este estudo por apresentarem padrão de parasitemia e virulência bastante distintos na infecção experimental. Nossos resultados indicam uma menor importância de TLR9 no controle da infecção com a cepa Colombiana, quando comparado com as infecções com CL Brener e Y, visto que camundongos TLR9-/- infectados com as duas últimas, apresentaram aumento da parasitemia e maior mortalidade quando comparados aos animais selvagens, o que não foi visto nas infecções com a cepa Colombiana. Ensaios imunoestimulatórios usando macrófagos e células dendríticas de camundongos C57BL/6 e TLR9-/- com quantidades iguais de DNA genômico das diferentes cepas não revelaram diferenças na produção de óxido nítrico e IL-12 entre as cepas. Entretanto, ensaios de estimulação com células dendríticas incubadas com o mesmo número de formas tripomastigotas vivas das três cepas de T. cruzi mostraram que a diferença da produção de TNF- e IL-12 entre células provenientes de camundongos selvagens e células de TLR9-/- foi menor para a cepa Colombiana do que para outras cepas. Estes resultados corroboram a hipótese de que a cepa Colombiana possui menores quantidades de motivos CpG imunoestimulatórios em seu genoma, quando comparadas as cepas CL Brener e Y e sugerem possíveis diferenças no tamanho dos genomas das três cepas. Esta hipótese foi confirmada através do sequenciamento do genoma das cepas Y e Colombiana e análises comparativas com o genoma da cepa CL Brener. As cepas CL Brener e Y apresentam uma maior abundância de motivos CpG que apresentam alta capacidade imunoestimulatória, enquanto que o genoma de Colombiana é enriquecido com motivos CpG com menor capacidade imunoestimulatória. Análises comparativas incluindo os genomas das cepas Sylvio (TcI), Arequipa (TcI), Esmeraldo (TcII) e Tulahuén (TcVI) revelam que o padrão de abundância deste motivos CpG imunoestimulatórios é conservado dentro das diferentes linhagens evolutivas do parasito. Em conjunto estes resultados revelam que a infecção causada por diferentes cepas de T. cruzi promove uma ativação diferencial do receptor TLR9, gerando uma produção variável de citocinas pró-inflamatórias que são necessárias para a diminuição de parasitemia. O conteúdo de motivos CpG imunoestimulatórios nos genomas das diferentes cepas de T. cruzi é, portanto, um importante fator que afeta a virulência, patogênese, e adaptação do parasito ao hospedeiro vertebrado.
Abstract: Toll-like receptors (TLR) are important components of the innate immune system, responsible for the recognition of Pathogen Associated Molecular Patterns (PAMPs). TLR9 was initially identified as responsible for the recognition of unmethylated CpG motifs derived from genomic DNA of bacteria and viruses. More recently, it was demonstrated that the genomic DNA of trypanosomatids, such as Trypanosoma cruzi, exhibits a TLR9-dependent immunostimulatory activity and that this receptor is essential in the recognition of the parasite and host resistance in experimental infections. Previous studies by our group have identified immunostimulatory CpG motifs in the genome of T. cruzi CL Brener strain. These sequences are not randomly distributed in the genome, but instead are enriched in regions containing gene clusters encoding surface proteins and other T. cruzi specific sequences. These regions are highly polymorphic in the two haplotypes of the hybrid CL Brener strain, which led us to speculate that the abundance of these CpG motifs could vary in the genome of different T. cruzi lineages, and if so, contribute to a differential activation of TLR9. To test this hypothesis, in this work, we studied the role of TLR9 in infections caused by T. cruzi strains that belong to different evolutionary lineages: Colombiana (TcI), Y (TcII) and CL Brener (TcVI). These strains were selected for this study because they display a distinct pattern of parasitaemia and virulence in experimental infections. Experimental infections of wild type and TLR9-/- mice with Colombiana, Y and CL Brener strains revealed a lower importance of TLR9 in controlling parasitemia and mortality in infections with Colombiana, when compared with infections with CL Brener and Y strains. Immunostimulatory assays using dendritic cells and macrophages from C57BL/6 and TLR9 -/- incubated with equal amounts of genomic DNA of different strains revealed no difference in the production of nitric oxide and IL-12 among the strains. However, assays using dendritic cells incubated with the same number of live trypomastigotes of the three strains of T. cruzi revealed a lower ratio of the TNF- and IL-12 production by dendritic cells from C57BL/6 and TLR9-/- mice for Colombiana compared with those values for the other strains. These results support the hypothesis that Colombiana strain has lower abundance of CpG motifs in its genome compared with CL Brener and Y strains, and suggest possible differences in the size of the genomes of these strains. This hypothesis was confirmed by sequencing the genomes of Y and Colombiana strains and by performing comparative analysis with the genome of CL Brener. CL Brener and Y strains have a higher abundance of CpG motifs that have high immunostimulatory activity, whereas the genome of Colombiana is enriched with CpG motifs with lower immunostimulatory properties. Comparative analyzes including the genomes of Sylvio (TcI), Arequipa (TcI), Esmeraldo (TcII) and Tulahuén (TcVI) revealed that this profile is conserved within T. cruzi phylogenetic lineages. Our results reveal that infection caused by distinct T. cruzi strains promotes a differential activation of the TLR9 receptor, leading to variable production of proinflammatory cytokines that are necessary for parasite clearance. The content of CpG motifs in the genome of different T. cruzi strains is therefore an important factor affecting virulence, pathogenesis and parasite adaptation to the vertebrate host.
Subject: Parasitologia
language: Português
Publisher: Universidade Federal de Minas Gerais
Publisher Initials: UFMG
Rights: Acesso Aberto
URI: http://hdl.handle.net/1843/BUBD-9DKDWW
Issue Date: 31-Oct-2013
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