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http://hdl.handle.net/1843/BUBD-9WHF7N| Type: | Dissertação de Mestrado |
| Title: | Papel das glicoproteínas-p (PGPS) na resistência de helmintos à ivermectina: uma abordagem experimental |
| Authors: | Luiza Almeida de Figueiredo |
| First Advisor: | Ricardo Toshio Fujiwara |
| First Co-advisor: | Ricardo Nascimento Araujo |
| First Referee: | Rafaela Magalhães Macedo Paim |
| Second Referee: | Walter dos Santos Lima |
| Abstract: | O uso inadequado de drogas para o controle das doenças parasitárias induz a seleção genética de subpopulações de parasitos resistentes. As glicoproteínas P (Pgps) são transportadores ABC cujas variações alélicas e de expressão gênica estão envolvidas com a resistência a drogas anti-helmínticas. O Caenorhabditis elegans é um nematódeo de vida livre que apresenta alta similaridade fisiológica, molecular e morfológica com os nematódeos parasitas. A interferência genética mediada por RNA fita-dupla (dsRNA) é uma ferramenta valiosa na análise da função de genes em C.elegans. O projeto propõe induzir a resistência ao anti-helmintico ivermectina em C.elegans, e avaliar as diferenças de expressão gênica quando realizado o silenciamento em relação aos vermes selvagens. A linhagem resistente foi obtida utilizando-se subdosagens crescentes de ivermectina durante sucessivas passagens in vitro. Após 48 semanas de seleção induzida foi obtida linhagem resistente a 30 ng/mL de ivermectina. Os RNAs de C.elegans resistentes e susceptíveis foram extraídos e os cDNAs produzidos. Doze genes de Pgps foram selecionados e a partir deles desenhados primers para amplificação das sequências gênicas pela técnica de PCR e qPCR. A análise das alterações nas expressões gênicas foram executadas por qPCR comparando-se a linhagem resistente em relação à selvagem. Os resultados mostram que apenas 16.66% dos genes estão positivamente regulados em relação ao selvagem. Posteriormente essas sequências foram clonadas em vetor e transformadas em cepa bacteriana adequada. O ensaio de silenciamento baseou-se em alimentar os vermes com bactérias produtoras do dsRNA e alterações na expressão desses genes foram analisadas pela qPCR. Foram obtidos uma redução de 97% da Pgp 4 e 93% da Pgp 12, para as linhagens selvagem e resistente respectivamente; ensaios biológicos de fenótipo avaliando a motilidade e morte celular após o silenciamento mostraram que a Pgp 4 está diretamente relacionada ao fenótipo de susceptibilidade e a Pgp 12 relacionada ao fenótipo de resistência à ivermectina. Além disso, foi feito um estudo comparativo da distância de glicoproteínas-P de nematódeos evidenciando que as Pgps de C. elegans são muito próximas das glicoproteínas de diversos nematódeos parasitos, permitindo uma possível extrapolação dos dados. Este estudo contribuiu para a compreensão dos mecanismos envolvidos na resistência a anti-helmínticos em nematódeos. |
| Abstract: | Improper use of drugs for parasitic diseases control induces genetic selection of resistant parasites subpopulations. The P-glycoproteins (PGPS) are ABC transporters whose allelic variations and gene expression are involved in resistance to anthelmintic drugs. Caenorhabditis elegans is a free-living nematode that has high physiological, molecular and morphological similarity with nematode parasites. The genetic interference mediated by double-stranded RNA (dsRNA) is a valuable tool in the analysis of gene function in C.elegans. The project aimed to induce resistance using anthelmintic ivermectin in C.elegans, and evaluate the differences in gene expression and phenotyping applying Pgp silencing in wild-type and resistant worms. The resistant strain was obtained using increasing doses of ivermectin during successive passages in vitro. After 48 weeks of selection it was obtained a resistant strain (30 ng/ml of ivermectin). The RNAs were extracted from resistant and susceptible C.elegans and converted in cDNAs. It was designed primers for amplification of 12 Pgps gene sequences by PCR and qPCR. The analysis in gene expression changes were performed by qPCR comparing the resistant and wild-type strains. The results showed that only 16.66% of the genes are up-regulated in resistant group compared to the wild-type. Subsequently, these sequences were cloned into vectors and transformed in suitable bacterial strain. After that, the worms were feeding with this transformed bacterial and expression changes of these genes were analyzed by qPCR. It was obtained silencing of 99% for Pgp 4 and 94% for Pgp 12 in the resistant strains, in comparison to wild-type (97% and 93%, respectively). Phenotype assays evaluating motility and cell death after the silencing showed that Pgp 4 is related to the susceptibility of ivermectin and Pgp 12 related to resistant phenotype. In addition, it was performed a study comparing the distance of P-glycoproteins in nematodes showing that C. elegans Pgps are very close to those of various parasitic nematodes, allowing a possible extrapolation of data. This study contributed to the understanding of the mechanisms involved in anthelmintic resistance in nematodes. |
| Subject: | Parasitologia |
| language: | Português |
| Publisher: | Universidade Federal de Minas Gerais |
| Publisher Initials: | UFMG |
| Rights: | Acesso Aberto |
| URI: | http://hdl.handle.net/1843/BUBD-9WHF7N |
| Issue Date: | 27-Feb-2015 |
| Appears in Collections: | Dissertações de Mestrado |
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