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Type: Tese de Doutorado
Title: Estrutura e atividade da proteína 2-hidroximuconato semialdeído desidrogenase (NahI) de Pseudomonas putida G7, uma enzima da via de degradação do naftaleno
Authors: Simara Semíramis de Araújo
First Advisor: Ronaldo Alves Pinto Nagem
First Referee: Lucas Bleicher
Second Referee: Tiago Antonio da Silva Brandao
Third Referee: Marcos Vicente de Albuquerque Salles Navarro
metadata.dc.contributor.referee4: Mario de Oliveira Neto
Abstract: Os Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos (HAPs), um grupo de compostos orgânicos formados por anéis benzênicos fusionados, são contaminantes ambientais amplamente distribuídos tanto devido a fontes naturais quanto antropogênicas, sendo as atividades de produção de carvão vegetal e mineral, de refino e transporte de petróleo os principais contribuintes para o despejo localizado de HAPs. Devido à sua ocorrência ubíqua , potencial de bioacumulação e atividade carcinogênica, vários HAPs foram listados como poluentes prioritários para a remediação destacando a importância da sua remoção do meio ambiente. Diversos microrganismos têm sido extensamente estudados em virtude de sua versatilidade em degradar uma gama de compostos aromáticos. A bactéria Pseudomonas putida G7 possui um plasmídeo associado ao metabolismo do naftaleno, o mais simples e abundante HAP, cuja degradação ocorre através de duas vias catabólicas ditas superior e inferior. NahI, uma 2- hidroximuconato semialdeído desidrogenase (2-HMSD) atuante na via inferior, converte 2- hidroximuconato semialdeído (2-HMS) a 2-hidroximuconato (2-HM) na presença de NAD+. Mesmo a despeito da baixa identidade de sequencia, uma característica comum entre enzimas aldeído desidrogenases (ALDHs) é a manutenção de um enovelamento estrutural semelhante, salvas as inúmeras particularidades concernentes ao estado de oligomerização e às interações específicas estabelecidas entre enzima, substrato e cofator. Assim, este trabalho se propôs a caracterizar cinética e estruturalmente a enzima NahI, uma vez que, através da elucidação de sua estrutura tridimensional e comparação com as de outras ALDHs, possibilita-se inferir distinções no sítio catalítico responsáveis por mudanças sistemáticas nas propriedades cinéticas destas enzimas sobre uma variedade de substratos aldeídos. Após purificação por cromatografia de afinidade e de exclusão molecular, ensaios de espalhamento dinâmico de luz (DLS) e espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) foram realizados para analisar o estado oligomérico da enzima em solução, identificada como um tetrâmero. No que diz respeito à estrutura cristalográfica, NahI apresentou o enovelamento / típico da superfamília ALDH organizado em domínio de oligomerização e domínios de ligação ao dinucleotídeo e ao substrato, este último também conhecido como catalítico. Através de operações de simetria cristalográfica, observou-se o tetrâmero de NahI formado por um dímero de dímeros. Ensaios de cinética confirmaram a preferência da enzima para o substrato alifático 2-HMS, porém não se observou qualquer atividade sobre salicilaldeído, substrato aromático natural de NahF, uma ALDH pertencente à mesma via de degradação do naftaleno. Mutações foram propostas para NahI a fim de aumentar o volume do bolso catalítico, uma vez que resíduos de cadeia lateral volumosa poderiam dificultar a atividade desta enzima sobre substratos aromáticos. Surpreendentemente, as formas mutantes não apresentaram atividade sobre salicilaldeído. Além disso, o alargamento da entrada do bolso catalítico afetou ligeiramente a afinidade da enzima para o seu substrato natural, 2-HMS. Sugere-se ainda que o resíduo L156 parece ser crucial para a oxidação do substrato. Os resultados desta investigação apresentam, pela primeira vez, características estruturais e cinéticas em relação à enzima NahI e favorecem futuros estudos sobre a identidade e função de resíduos cruciais para a catálise e a descrição de como a reação se processa.
Abstract: The Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs), a group of organic compounds consisting of fused benzene rings, are contaminants widely distributed in the environment due to natural as well as anthropogenic sources. Activities of production of coal, refining and transportation of oil are the major contributors to the contamination with PAHs. Due to their ubiquitous occurrence, potential to bio-accumulate and carcinogenic activity, a number of PAHs were listed as priority pollutants for remediation highlighting the importance of their removal from the environment. Several microorganisms have been extensively studied because of its versatility to degrade a wide range of aromatic compounds. The bacterium Pseudomonas putida G7 has a plasmid associated with the metabolism of naphthalene, the simplest and most abundant PAH. Its degradation by P. putida occurs through the upper and the lower catabolic pathways. NahI, a 2-hydroxymuconate semialdehyde dehydrogenase (2-HMSD) belonging to the lower pathway, converts 2-hydroxymuconate semialdehyde (2-HMS) to 2- hydroxymuconate (2-HM) in the presence of NAD+. A common feature among aldehyde dehydrogenases (ALDHs) is the similar scaffold, even despite their overall low sequence identity, modes of oligomerization and substrate specificity. Thus, this study was proposed to characterize the structure and kinetics of NahI. By elucidation of its three-dimensional structure and comparison with other ALDHS, it becomes possible to infer distinctions in the catalytic site that are responsible for systematic changes in the kinetic properties of these enzymes within a variety of aldehyde substrates After purification by affinity and sizeexclusion chromatography, dynamic light scattering (DLS) and small-angle X-ray scattering (SAXS) experiments were conducted to analyze the oligomeric state of the enzyme in solution, which was identified as being a tetramer. With regard to the crystal structure, NahI displayed a typical / aldehyde dehydrogenase superfamily fold with three well defined domains: the oligomerization domain, the nucleotide binding and the catalytic domains. Through crystallographic symmetry operations, the NahI tetramer formed by a dimer of dimers was observed. Kinetic assays confirmed the preference of the enzyme for the aliphatic substrate 2-HMS. On the other hand, NahI showed no activity with salicylaldehyde, the natural substrate for NahF enzyme, another ALDH belonging to the same naphthalenedegradation pathway. Mutations have been proposed for NahI in order to increase the volume of the catalytic pocket, since bulky side chain residues could hinder the activity of this enzyme with aromatic substrates. Surprisingly, the mutant forms showed no activity with salicylaldehyde. Moreover, the enlargement of the catalytic pocket entrance slightly affected the affinity of the enzyme for its natural substrate, 2-HMS. It also suggests that the L156 residue appears to be crucial for the oxidation of the substrate. For the first time, these findings show the structural and kinetic properties relative to the NahI enzyme and highlights further studies concerning the identity and function of critical residues for catalysis and description of how the reaction proceeds.
Subject: Bioquímica e imunologia
language: Português
Publisher: Universidade Federal de Minas Gerais
Publisher Initials: UFMG
Rights: Acesso Aberto
URI: http://hdl.handle.net/1843/BUBD-9ZJFV9
Issue Date: 30-Jun-2015
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