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http://hdl.handle.net/1843/BUBD-A2GGBL| Type: | Tese de Doutorado |
| Title: | Avaliação da atividade biológica do peptídeo 3 semelhante à insulina (INSL3) nos testículos de zebrafish (Danio rerio) adultos |
| Authors: | Luiz Henrique de Castro Assis |
| First Advisor: | Luiz Renato de Franca |
| metadata.dc.contributor.advisor2: | Rudiger W. Schulz |
| First Referee: | Sergio Ricardo Batlouni |
| Second Referee: | José Enemir dos Santos |
| Third Referee: | Jose Dias Corrêa Junior |
| metadata.dc.contributor.referee4: | Jose Carlos Nogueira |
| Abstract: | A espermatogênese é um processo cíclico e organizado que resulta na formação do gameta masculino, o espermatozoide, a partir de células espermatogoniais indiferenciadas. Estas espermatogônias indiferenciadas podem sofrer divisões que resultarão na produção de células comprometidas com o desenvolvimento da espermatogênese (diferenciação) ou na produção de novas espermatogônias indiferenciadas (auto renovação), sendo o balanço entre estes dois tipos de divisão crucial para a manutenção da espermatogênese ao longo da vida reprodutiva do animal. A regulação do equilíbrio entre a auto renovação e a diferenciação das espermatogônias indiferenciadas em peixes adultos é um processo ainda pouco conhecido, particularmente nos aspectos relacionados à influência de fatores parácrinos. O INSL3 (peptídeo 3 semelhante à insulina) é membro da família relaxina de peptídeos expresso pelas células de Leydig nos testículos dos vertebrados. Em mamíferos, é sabido que o INSL3 é importante no processo de descenso testicular durante o desenvolvimento e para a sobrevivência de células germinativas durante a vida adulta. Em peixes, embora não ocorra processo de descenso testicular, o gene insl3 é altamente expresso pelas células de Leydig, não somente durante o desenvolvimento mas também durante a vida adulta, indicando a existência de potenciais funções biológicas ainda não identificadas conservadas ao longo do processo evolutivo. Estudos anteriores demonstraram que o hormônio anti-mülleriano (Amh), além de inibir a diferenciação espermatogonial e a produção de andrógenos, foi capaz de reduzir o efeito estimulatório do hormônio Folículo estimulante (Fsh) sobre a transcrição do gene insl3 nos testículos de zebrafish. Neste contexto, decidimos investigar se o Insl3 em zebrafish teria uma função antagônica àquela observada para o Amh. Assim, nossos estudos envolvendo cultura de testículo de zebrafish demonstraram que o INSL3 humano (hINSL3) aumentou o índice de proliferação de espermatogônias do tipo A indiferenciadas (Aund), ao mesmo tempo em que reduziu o índice de proliferação das células de Sertoli associadas a este tipo espermatogonial quando estas células germinativas apresentavam-se em proliferação. Ainda, experimentos em cultura utilizando-se testículos de zebrafish com espermatogônias pré-marcadas com BRdU in vivo mostraram que o hINSL3 reduziu a área e o número de cistos de espermatogônias do tipo Aund no parênquima testicular, enquanto a área ocupada por cistos de espermatogônias do tipo A diferenciadas (Adiff) mostrou-se aumentada. Estas análises morfométricas foram confirmadas pelas análises moleculares, nas quais o PCR quantitativo demonstrou que o hINSL3 reduziu de forma significativa a transcrição do gene nanos2, que é um marcador de espermatogônias indiferenciadas em zebrafish e outros vertebrados. Desta forma, concluímos que o hINSL3 promoveu a diferenciação das espermatogônias do tipo Aund em cultura de testículos de zebrafish. No entanto, nossos estudos não demonstraram ação moduladora do hINSL3 na produção e liberação de andrógenos. Finalmente, estudo utilizando-se animais com deficiência androgênica e de gonadotrofinas, em decorrência do tratamento in vivo com o hormônio 17-estradiol, mostrou que a transcrição do gene insl3 é drasticamente reduzida em condições favoráveis a auto renovação e, ainda, que a recuperação parcial da espermatogênese observada após a introdução do hormônio 11- cetoandrostenediona no tratamento in vivo foi independente da elevação dos níveis de transcrição do gene insl3. Neste contexto, nossos resultados indicam que o hINSL3 estimula a proliferação e diferenciação de espermatogônias do tipo Aund nos testículos de zebrafish sexualmente maduros independentemente da participação de andrógenos, potencialmente como um mediador dos efeitos do Fsh na espermatogênese. |
| Abstract: | Spermatogenesis is a cyclical and organized process that leads to the production of male gamete, the spermatozoa, from undifferentiated spermatogonia. Undifferentiated spermatogonia have the capacity to produce, by cell division, either more undifferentiated spermatogonia (self-renewal) or germ cells committed to the development of spermatogenesis (differentiation). Therefore, the balance between self-renewal and differentiation is crucial for the maintenance of spermatogenesis during the reproductive life. Nevertheless, the regulation of this balance in adult fish still needs to be elucidated, particularly the aspects involving paracrine regulation. INSL3 (insulin-like peptide 3) is a relaxin peptide family member produced by Leydig cells in vertebrate testes. In mammals, it is known that INSL3 has a crucial role on testicular descent during development and also on germ cell survival during adult life. In teleosts, although the testes remain inside the body cavity, the gene insl3 is highly expressed during development and also during the adult life, potentially indicating evolutionary older functions yet undiscovered. Previous observations showed that Amh (anti-müllerian hormone), in addition to inhibiting spermatogonial differentiation and androgen release, inhibited Fsh (follicle-stimulating hormone)-induced increase in insl3 transcript levels in zebrafish testis. Therefore, we investigated if the two growth factors might have antagonistic effects. Ex vivo studies indicated that hINSL3 increased the proliferation of type A undifferentiated (Aund) spermatogonia, while reducing proliferation of Sertoli cells associated with proliferating Aund. Moreover, ex vivo experiments using zebrafish testes with in vivo pre-labeled type Aund spermatogonia showed that hINSL3 decreased the number and area of testicular parenchyma occupied by cysts of type Aund spermatogonia, and increased the area occupied by cysts of type A differentiating (Adiff) spermatogonia. Corroborating the morphometric data, quantitative PCR analyses showed that hINSL3 decreased the transcription of nanos2 gene, a marker for type Aund spermatogonia in zebrafish and other vertebrates. Hence, we conclude that hINSL3 promoted differentiation of type Aund spermatogonia in zebrafish testes culture. However, our investigations did not indicate effects of hINSL3 on androgen release. Finally, the investigations using animals with androgens and gonadotropins deficiency, due to an in vivo exposure to 17-estradiol, showed that mRNA levels for insl3 gene were drastically reduced in this pro self-renewal condition. Additionally, the partial recovery of spermatogenesis observed after the introduction of 11-ketoandrostenedione on the in vivo treatment was not related to the recovery of insl3 transcription. In this context, our data corroborate the hypothesis that hINSL3 recruited Aund spermatogonia into differentiation without androgen participation, potentially mediating an Fsh effect on spermatogenesis. |
| Subject: | Citologia |
| language: | Português |
| Publisher: | Universidade Federal de Minas Gerais |
| Publisher Initials: | UFMG |
| Rights: | Acesso Aberto |
| URI: | http://hdl.handle.net/1843/BUBD-A2GGBL |
| Issue Date: | 17-Jul-2015 |
| Appears in Collections: | Teses de Doutorado |
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