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http://hdl.handle.net/1843/BUBD-ABZFTW| Tipo: | Dissertação de Mestrado |
| Título: | Condições de uso do eDNA (environmental DNA) no monitoramento de Prochilodus argenteus |
| Autor(es): | Camila Guimarães Dergam |
| primer Tutor: | Evanguedes Kalapothakis |
| primer Co-tutor: | Anderson Oliveira do Carmo |
| Resumen: | O DNA ambiental ou eDNA permite a caracterização e o monitoramento da composição 2 de espécies em ambientes de difícil coleta, como em ambiente aquáticos. Embora a técnica 3 seja potencialmente muito informativa, existem questões relacionadas à quantidade e qualidade 4 de eDNA que pode ser recuperada, envolvendo fatores como a degradação do DNA, inibidores 5 da reação de PCR, captação de DNA, contaminação, etc. Esse trabalho tem como objetivo 6 estabelecer um protocolo em um ambiente tropical controlado: aquários com espécimes da 7 espécie Prochilodus argenteus. Fragmentos da região de controle D-loop do DNA mitocondrial 8 foram amplificados com primers desenhados especificamente para espécies de Prochilodus em 9 duas fases: uma primeira reação simples e uma segunda reação com primers amplicando um 10 fragmento interno (Nested-PCR). As amostras foram extraídas com o kit QIAamp Stool Mini Kit 11 e DNA foi amplificado através da reação de PCR Nested com primers que amplificam DNA da 12 região mitocondrial D-loop. Os protocolos utilizados visaram o teste com águas de diferentes 13 origens para avaliar a ação dos possíveis inibidores na reação de PCR, a eliminação de 14 inibidores da PCR através do uso de purificadores e o teste de filtragem para capturar eDNA de 15 água de um aquário. As águas de diferentes origens resultaram em diferentes interações com a 16 PCR. A PCR feita com 1l de DNA com água ultrapura amplificou até 0,00015 ng/ l de DNA 17 enquanto que as águas dos aquários amplificaram até 0,015 ng/l de DNA e água da Lagoa da 18 Pampulha amplificou 15 ng/l de DNA. Os purificadores usados foram carvão ativado e Chelex 19 100, porém os resultados não foram consistentes ao longo do experimento. O facilitador de 20 PCR BSA 1% foi eficiente pois melhorou a amplificação da banda. Com base nesses 21 resultados, conclui-se que o kit de extração de DNA QIAamp Stool mini kit, desenvolvido para 22 extrair DNA de fezes, foi eficiente na recuperação de eDNA de P. argenteus em condições de 23 aquário e que os inibidores são fatores importantes e devem ser eliminados para evitar uma 24 subdetecção de eDNA. A metodologia de captura de DNA por filtragem aliada à extração feita 25 pelo QIAamp Stool Mini Kit e o uso de primers específicos da região de D-loop de DNA 26 mitocondrial permitiram detecção específica de eDNA da espécie de curimba P. argenteus. |
| Abstract: | The environmental DNA or eDNA is a promising tool to detect species in environments 34 such as aquatic systems, where specimen capture can demand effort and time. Although eDNA 35 can be substantially informative, many factors may affect the quantity and quality of eDNA. Such 36 factors involve DNA degradation, DNA contamination, DNA collecting protocols, and PCR 37 inhibitors, etc. The purpose of this dissertation is to establish a protocol in a controlled tropical 38 environment: aquariums that contain the target fish Prochilodus argenteus. The water from the 39 aquarium was filtered and the DNA was extracted with the QIAamp DNA Stool Mini Kit and 40 Species-specific primers for P. argenteus were tested to amplify fragments of the D-loop region 41 of the mitochondrial DNA using two reactions: a direct or simple PCR and a Nested PCR with 42 internal primers, using products of the direct reaction as template. Other protocols involved 43 testing the effect of possible inhibitors from different water sources on the PCR, eliminating PCR 44 inhibitors through DNA purification protocols and testing DNA yield through filtration. Our results 45 suggest that the different types of water influence PCR results. The PCR using target DNA and 46 ultrapure water amplified from 1L of 15 ng/L of DNA to 0.00015 ng/L of DNA while the 47 reactions tested with water from the tropical aquariums amplified from 15 ng/L of DNA to 0.015 48 ng/L of DNA, whereas water from Pampulha lake amplified successfully only using 15 ng/L of 49 DNA. Protocols that included activated charcoal and Chelex 100 for DNA purification gave 50 inconsistent results and could not be replicated. Our results indicate that BSA is an efficient PCR 51 inhibitor blocker. We conclude that the water filtration protocol using GL filter allied to DNA 52 extraction through the QIAamp Stool Mini Kit was efficient to concentrate and eliminate inhibitors 53 that might cause under detection of eDNA. |
| Asunto: | Genética |
| Idioma: | Português |
| Editor: | Universidade Federal de Minas Gerais |
| Sigla da Institución: | UFMG |
| Tipo de acceso: | Acesso Aberto |
| URI: | http://hdl.handle.net/1843/BUBD-ABZFTW |
| Fecha del documento: | 26-feb-2016 |
| Aparece en las colecciones: | Dissertações de Mestrado |
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